重组人白蛋白-人粒细胞集落刺激因子融合蛋白的新稳定制剂的制作方法

专利名称：重组人白蛋白-人粒细胞集落刺激因子融合蛋白的新稳定制剂的制作方法
重组人白蛋白-人粒细胞集落刺激因子融合蛋白的新稳定
制剂本申请要求2009年1月16日提交的美国临时申请第61/145，440号以及2009年 1月16日提交的美国临时专利申请第61/145，436号的权益。美国临时申请第61/145，440 号以及美国临时专利申请第61/145，436号的全文通过引用纳入本文。
背景技术：
白细胞减少症是指循环白细胞(WBC)的减少，通常定义为WBC计数< 4000/mL。白细胞减少症中涉及的主要细胞是嗜中性粒细胞。但是，淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞或嗜碱性粒细胞数量减少可能对总细胞计数减少也有影响(Merck Manual (默克手册)，第 17 版)。嗜中性白细胞减少症的特征为血液嗜中性粒细胞计数的减少，通常引起对细菌和真菌感染易感性的提高。根据嗜中性粒细胞计数和感染的相对风险将嗜中性白细胞减少症分类轻度(1000-1500/mL)、中度(3级，500-1000/mL)或重度G级，< 500/mL)。急性和重度嗜中性白细胞减少症由于使患者易患迅速致死感染而是一种危及生命的病症(默克手册，第17版)。嗜中性白细胞减少症可由骨髓中嗜中性粒细胞生成受损或嗜中性粒细胞加速破坏引起。当嗜中性粒细胞快速使用而其生成严重受损时，急性嗜中性白细胞减少症可能在数天内发作。慢性嗜中性白细胞减少症可能持续数月，并通常由脾脏中嗜中性粒细胞的生成减少或隔离引起。嗜中性白细胞减少症可以根据其是骨髓细胞外源因子的次生结果还是存在于骨髓祖细胞的内源性缺损进行分类(默克手册，第17版)。嗜中性白细胞减少症及其感染性并发症是细胞毒性化疗和其它肿瘤治疗如放疗、 生物治疗和骨髓移植中最为常见和严重的副作用之一。细胞毒性化疗通过找出并破坏快速生长的细胞来发挥作用，由于嗜中性粒细胞前体的高增殖率和血液嗜中性粒细胞的快速代谢回转而引发嗜中性白细胞减少症(默克手册，第17版)。化疗患者中，嗜中性白细胞减少症的最常见症状包括发热、口疮和耳感染。显著嗜中性白细胞减少症的患者常发生化脓性感染，例如败血症、皮肤蜂窝组织炎、肝脓肿、疔疮、肺炎、口腔炎、牙龈炎、围直肠炎、结肠炎、鼻窦炎和中耳炎。化疗可能被迫延迟直至身体能产生更多的嗜中性粒细胞，可能必须采用较低的剂量，导致治疗效果较低。发明概述本发明涉及用于治疗、预防或减轻以白细胞计数低于正常为特征的疾病或病症， 如白细胞减少症和嗜中性白细胞减少症的组合物及方法。在一些实施方式中，所述组合物和方法包括图9所示的重组人白蛋白-人粒细胞集落刺激因子，或其变体或片段。在一些实施方式中，所述组合物和方法用于治疗、预防或减轻嗜中性白细胞减少症和/或白细胞减少症，例如，可用本发明的组合物治疗因给予药物如为治疗癌症所给化疗药物引起的嗜中性白细胞减少症。在一些实施方式中，所述组合物是药物制剂，包括图9所示的重组人白蛋白-人粒细胞集落刺激因子，或其变体或片段。在一些实施方式中，所述药物制剂包括至少一种药学上可接受的载体，且PH在约5-8. 0之间、约5-7. 5之间、约5-7. 2之间、约5-7. 0之间、 约5-6. 8之间、约5-6. 6之间、约5-6. 4之间、约5-6. 2之间、约5_6之间、约6-7. 5之间、约 6-7. 2之间、约6-7之间。在其它实施方式中，所述pH为约4、约4. 2、约4. 4、约4. 5、约4. 6、 约 4. 8、约 5、约 5. 2、约 5. 4、约 5. 5、约 5. 6、约 5. 8、约 6. 0、约 6. 2、约 6. 4、约 6. 5、约 6. 6、约 6. 8、约 7. 0、约 7. 2、约 7. 4、约 7. 5、约 7. 6、约 7. 8 或约 8. 0。在一些实施方式中，所述药物制剂包括重组人白蛋白-人粒细胞集落刺激因子， 其浓度为约 2. 5-240mg/ml、约 30_120mg/ml、约 60_120mg/ml、约 5mg/ml、约 10mg/ml、约 15mg/ml、约 20mg/ml、约 25mg/ml、约 30mg/ml、约!35mg/ml、约 40mg/ml、约 45mg/ml、约 50mg/ ml、约 55mg/ml、约 60mg/ml、约 70mg/ml、约 80mg/ml、约 90mg/ml、约100mg/ml、约120mg/ml、 约 150mg/ml、约 100mg/ml、约 150mg/ml、约 200mg/ml、约 240mg/ml 或约 250mg/ml。在一些实施方式中，所述药物组合物包括至少一种药学上可接受的盐。在一些实施方式中，所述组合物中盐的浓度为约5-50mM、约10-40mM、约15_30mM、约20_25mM。在一些实施方式中，所述组合物中盐的浓度为约5mM、约10mM、约15mM、约20mM、约25mM、约30mM、 约 35mM、约 40mM、约 45mM 和约 50mM。在一些实施方式中，所述药物组合物包括至少一种药学上可接受的缓冲剂。在一些实施方式中，所述组合物中缓冲剂存在的浓度为约5-50mM、约10-50mM、约15_50mM、约 5-10mM、约10-20mM、约20_30mM、约15_25mM或约20mM。在一些实施方式中，所述组合物中缓冲剂存在的浓度为约5mM、约10mM、约15mM、约20mM、约25mM、约30mM、约；35福、约40mM、约 45mM、约50mM、约55mM或约60mM。在一些实施方式中，所述缓冲剂是磷酸盐、柠檬酸盐、或其组合。在一些实施方式中，所述缓冲剂包括磷酸钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、或其组合。在一些实施方式中，所述药物组合物包括冻干稳定剂。在一些实施方式中，所述冻干稳定剂是二水海藻糖。在一些实施方式中，所述二水海藻糖的浓度约20-100mM、约 40-80mM、约50-70mM、或约60mM。在一些实施方式中，所述稳定剂的浓度为约20mM、约30mM、 约 40mM、约 50mM、约 60mM、约 70mM、约 80mM、约 90mM、约 100mM、约 IlOmM 或约 120mM。在一些实施方式中，所述药物组合物包括膨胀剂。在一些实施方式中，所述膨胀剂是多醇。在一些实施方式中，所述多醇是甘露醇。在进一步的实施方式中，所述药物组合物包括药学上可接受的载体。在一些实施方式中，所述载体是聚山梨酯。本文所述药物组合物可配制用于以多种形式给药。例如，在一些实施方式中，所述药物组合物制备用于经口、肺、静脉内、肌肉内、皮下、经直肠、眼部、结肠、胃肠外、脑池内、 阴道内、腹膜内、眼部、耳部、局部、颊、鼻、或局部给药。组合物还可以配制用于特定剂型。例如，在一些实施方式中，所述药物组合物可以配制成液体、凝胶、气溶胶、油膏、乳膏、冻干制剂、粉末、块、片或胶囊。在其它实施方式中，所述药物组合物配制成控释制剂、速融制剂、延迟释放制剂、缓释制剂、脉冲释放制剂、和混合的立即释放制剂。在一些实施方式中，所述药物组合物以液体提供。在其它实施方式中，所述药物组合物以冻干粉末提供。在其它实施方式中，所述药物组合物以冻干块提供。本文所述药物组合物可以多种方式储存。在一些实施方式中，所述药物组合物储存在小瓶中，在其它实施方式中，所述药物组合物储存在注射器中。在一些实施方式中，所述药物组合物包含重组人白蛋白-人粒细胞集落刺激因子，至少一种缓冲剂和/或PH调节剂，和可选地至少一种额外药学上可接受载体，其中重组人白蛋白-人粒细胞集落刺激因子溶液的单体纯度在25°C孵育M小时后减少低于10%。 在一些实施方式中，所述缓冲剂与PH调节剂相同。在一些实施方式中，在25°C孵育M小时后所述溶液中的单体纯度减少低于约1%、低于约5%、低于约15%、低于约20%或低于约 25%。在其它实施方式中，所述药物组合物包含重组人白蛋白-人粒细胞集落刺激因子、约20mM磷酸钠、约180mM甘露醇、约60mM 二水海藻糖、约0. 01% (w/v)聚山梨酯80， PH约为6.0，其中所述重组人白蛋白-人粒细胞集落刺激因子的浓度为约2. 5-120mg/ml、 或约30-60mg/ml。在一些实施方式中，重组人白蛋白-人粒细胞集落刺激因子的浓度为约 5mg/ml、约 10mg/ml、约 15mg/ml、约 20mg/ml、约 25mg/ml、约 30mg/ml、约 35mg/ml、约 40mg/ ml、约 45mg/ml、约 50mg/ml、约 55mg/ml、约 60mg/ml、约 70mg/ml、约 80mg/ml、约 90mg/ml、约 100mg/ml、约 120mg/ml、约 150mg/ml、约 100mg/ml、约 150mg/ml、约 200mg/ml、约 240mg/ml 或约 250mg/ml.在其它实施方式中，所述药物组合物包含重组人白蛋白-人粒细胞集落刺激因子和PMTT20/6. 0，其中重组人白蛋白-人粒细胞集落刺激因子的浓度为约2. 5-120mg/ml或约 30-60mg/mL·在一些实施方式中，重组人白蛋白_人粒细胞集落刺激因子的浓度为约5mg/ ml、约 10mg/ml、约 15mg/ml、约 20mg/ml、约 25mg/ml、约 30mg/ml、约 35mg/ml、约 40mg/ml、 约 45mg/ml、约 50mg/ml、约 55mg/ml、约 60mg/ml、约 70mg/ml、约 80mg/ml、约 90mg/ml、约 100mg/ml、约 120mg/ml、约 150mg/ml、约 100mg/ml、约 150mg/ml、约 200mg/ml、约 240mg/ml 或约 250mg/ml。上述总体说明和以下的附图简要说明与详细说明都是示范性和说明性的，并旨在为本发明要求保护的范围提供进一步说明。通过本发明的以下详细描述，本发明的其它目的、优势和新特征对于本领域技术人员将是显而易见的。附图简要说明

图1显示rHSA-G-CSF浓度升高降低了单体纯度。2. 5-240mg/ml浓度范围内的rHSA-G-CSF样品在PMTT10/7. 2中25°C孵育M小时后，通过体积排阻高效液相色谱 (“SE-HPLC”)测定单体纯度。图 2 显示 pH升高增强了 rHSA-G-CSF聚集。15mg/ml 或 60mg/ml 浓度的 rHSA-G-CSF 在25°C下在pH 6. 0、6. 8、7. 2或8. O的PMTTlO中孵育7天后，通过SE-HPLC测定聚集。图3显示温度升高增强了 rHSA-G-CSF聚集。15mg/ml或60mg/ml浓度的 rHSA-G-CSF在4°C、25°C或40°C下在PMTT10/7. 2中孵育M小时后，通过SE-HPLC测定聚集。图4显示pH升高增强了 rHSA-G-CSF聚集。浓度为48mg/ml的rHSA-G-CSF在 25°C下在pH 5. 8,6. 3,6. 4或7. O的PMTTlO或pH为6. 2的CMMTlO中孵育最多3天后，通过SE-HPLC测定聚集。顶部线条是IOmMPMTT pH 7. O ；顶部数起第二条线是IOmM PMTT pH 6. 4 ；顶部数起第三条线是IOmm PMTT pH 6. 3 ；最底部较暗的线条是IOmM PMTT pH 5. 8，最底部较亮的线条是IOmM CMTT pH 6. 2。图5显示盐浓度增加降低了 rHSA-G-CSF聚集。60mg/ml浓度的rHSA-G-CSF在 25 0C /60%相对湿度下在PMTT10/7. 2和5mM、10mM、20mM或50mM氯化钠浓度中孵育1天后，通过SE-HPLC测定聚集。图6显示磷酸盐浓度增加降低了 rHSA-G-CSF聚集。60mg/ml浓度的rHSA-G-CSF 在 25°C /60%相对湿度(“RH，，)下在 PMTT/7. 2 及 l5mM、20mM、25mM、30mM、40mM 或 5OmM 磷酸盐浓度中孵育1天后，通过SE-HPLC测定聚集。图7显示浓度高至120mg/ml的rHSA-G-CSF在PMTT20/6. 0制剂缓冲液中保持的纯度。浓度范围在2. 5-120mg/ml的rHSA-G-CSF样品在PMTT10/7. 2 (旧缓冲液)或 PMTT20/6. 0 (新缓冲液)中25°C孵育M小时后，通过SE-HPLC测定单体纯度。图8显示pH和磷酸盐浓度如何影响rHSA-G-CSF聚集。浓度为60mg/ml的 rHSA-G-CSF 在 4°C或 25°C /60%相对湿度下在 PMTT10/7. 2 (旧缓冲液)或 PMTT20/6. 0 (新缓冲液)中孵育最多14天后，通过SE-HPLC测定聚集。图9A-C。图9A显示称为Neugranin ( “NEUG”)的rHSA-G-CSF融合多肽的核酸和氨基酸序列；图9B显示人G-CSF的氨基酸序列；图9C显示人血清白蛋白的氨基酸序列。图10列表显示浓度为48mg/ml的rHSA-G-CSF在不同pH中25°C孵育最多3天后通过SE-HPLC测得的聚集。图11列表显示rHSA-G-CSF在不同pH、蛋白浓度和温度下通过SE-HPLC测得的聚集。表格顶部(头3条)为15mg/ml rHSA-G-CSF。表格底部(最后3条)为60mg/ml rHSA-G-CSFο图12列表显示rHSA-G-CSF在不同pH、温度和浓度下孵育后的活性。图13显示生产NEUG的示范性概况的流程图。图 14A 和 14B 分别显示 SEC-HPLC 和 RP-HPLC 比较 NEUG-1 (“ IP")和 NEUG-2 (“2P，，) 的结果。图 15A 和 15B 分别显示 NEUG-1 ( “ IP")禾Π NEUG-2 ( “2P”)之间由 IEC-HPLC 得到的电荷异质性可比性和由肽作图得到的身份可比性。图16显示NEUG-I与NEUG-2在SDS-PAGE凝胶上用考马斯蓝染色的可比纯度。图17A和17B列表小结了为人体临床应用所制备的3个不同批号NEUG-I和5个不同批号NEUG-2的测试结果。图18显示批号为2378-R的NEUG-I参比标准品的考马斯染色SDS-PAGE分析(还原)。图19A和19B显示批号为2378-R的NEUG-1参比标准品的SE-HPLC和RP-HPLC色谱图。图20小结了对代表性开发批号的NEUG-2最终药物产品进行分析的结果。图21显示经过氧化氢和TBO或TBP处理的NEUG的反相(“RP”)、离子交换(“IE”) 和体积排阻(“SEC”)色谱的色谱图；进行研究以监控NEUG的氧化。NEUG对照=中灰色； 经过氧化氢处理的NEUG =浅灰色；经TBP处理的NEUG =黑色图22列表显示经过氧化氢和TBO或TPB处理NEUG的结果。进行研究以监控NEUG 的氧化。图23显示在化疗前(疗程0)接受NEUG-I的对象从治疗到第14天的嗜中性粒细胞绝对计数(ANC)的中位数。在第4天，图中线条由高到低分别是300yg/kg NEUG、 450 μ g/kg NEUG、150 μ g/kg 和 50 μ g/kg NEUG。
图24A和24B显示了在化疗疗程前以及化疗M小时后接受NEUG-I的对象的ANC 和白细胞("WBC")计数。NEUG 剂量如下50 μ g/kg ；150 μ g/kg ；300 μ g/kg 或 450 μ g/kg。 3级和4级嗜中性白细胞减少症的嗜中性粒细胞临界值在图24A中显示为虚线；图24A和 24B还显示了正常嗜中性粒细胞范围。图25显示在第1疗程化疗后约M小时接受300 μ g/kg NEUG、450 μ g/kgNEUG或 6mg聚乙二醇化非格司亭(Neulasta. )的对象的嗜中性粒细胞绝对计数(ANC)。图沈为I期研究化疗疗程的示意图。图27显示了 I期研究中人对象内NEUG的药代动力学。在患有乳腺癌没有化疗的对象中，侧链指定剂量NEUG (450 μ g/kg,300 μ g/kg或150 μ g/kg)皮下给药的血清NEUG浓度。方形450 μ g/kg疗程0 ；三角形300 μ g/kg疗程0 ；圆形150 μ g/kg疗程0。图观显示I期对象的嗜中性粒细胞绝对计数(“ANC”)图。对象在研究化疗后的疗程 ι 中接受 300 μ g/kg NEUG (η = 19)，450 μ g/kg NEUG (η = 20)或 6mg 聚乙二醇非格司亭(Neulasta ) (η = 9)。图四显示NEUG在化疗疗程1中的药代动力学/药效学(“PK/PD”)(I期研究)。 患者在疗程1给药多柔比星/多西他赛后1天接受450 μ g/kg NEUG0 ANC显示为空心菱形； NEUG浓度显示为实心方形。3级和4级嗜中性白细胞减少症的临界值用虚线显示。NEUG的定量下限(“LL0Q”)显示为6ng/ml处的点线。图30A和30B显示I期B部分治疗的各对象的曲线下面积(AUC)，基于第0_15天获得的ANC数值。图30A为图表；图23A中的数据总结在表30B中。发明详述本文公开了用于治疗、预防和减轻以白细胞计数减低为特征的症状和疾病的组合物和方法。本文所述的组合物和方法包括由人血清白蛋白(“HSA”)和人粒细胞集落刺激因子(“G-CSF”)形成的融合多肽。在本发明的一种实施方式中，所述融合多肽长度为759 个氨基酸；融合体中的1-585位氨基酸对应于成熟形式HSA的氨基酸，而融合体的586-759 位氨基酸对应于成熟形式人G-CSF的氨基酸。图9A-9C显示了融合蛋白的氨基酸序列。本文所述的组合物和方法还包括含重组HSA-G-CSF多肽的治疗制剂和药物组合物。在一些实施方式中，这些制剂和组合物设置为施用较低剂量的多肽，而在其它实施方式中，所述制剂设置为施用较高剂量的多肽。本发明还包括含G-CSF变体或片段的融合蛋白，和含白蛋白或其片段或变体的融合蛋白。本发明还包括编码本发明治疗性白蛋白融合蛋白的多核苷酸、治疗性白蛋白融合蛋白、组合物、药物组合物、制剂和试剂盒。本发明也包括用治疗性白蛋白融合蛋白的编码多核苷酸转化的宿主细胞，和采用这些多核苷酸和/或宿主细胞制备本发明的白蛋白融合蛋白的方法。在一个实施方式中，本发明所述的白蛋白融合蛋白具有延长的保存期限。在第二个实施方式中，本发明所述的白蛋白融合蛋白比未融合的G-CSF分子更稳定。本发明还包括经修饰以包含本发明所述核酸分子的转基因生物，优选修饰成表达本发明的白蛋白融合蛋白。本发明一般涉及编码白蛋白融合蛋白的多核苷酸；白蛋白融合蛋白；和采用白蛋白融合蛋白或白蛋白融合蛋白的编码多核苷酸治疗、预防或改善疾病或紊乱。如本文所用，“白蛋白融合蛋白”是指通过将至少一分子白蛋白(或其片段或变体)与至少一分子 G-CSF(或其片段或变体)融合形成的蛋白质。本发明的白蛋白融合蛋白包含G-CSF的至少一个片段或变体和人血清白蛋白的至少一个片段或变体，两者通过基因融合(即，所述白蛋白融合蛋白通过核酸的翻译产生，该核酸中编码全部或部分G-CSF的多核苷酸与编码全部或部分白蛋白的多核苷酸在读框内连接)彼此结合。G-CSF和白蛋白一旦成为白蛋白融合蛋白的部分，就可各自称作白蛋白融合蛋白的“部分”、“区段”或“组成”(例如，“G-CSF蛋白部分”或“白蛋白蛋白部分”)。在一个高度优选的实施方式中，本发明的白蛋白融合蛋白包含至少一分子的G-CSF或其片段或变体(包括但不限于，G-CSF蛋白质的成熟形式)和至少一分子的白蛋白或其片段或变体(包括但不限于白蛋白的成熟形式)。在进一步优选的实施方式中，本发明的白蛋白融合蛋白通过宿主细胞加工并分泌到周围的培养基中。在表达用宿主的分泌途径中发生的初生白蛋白融合蛋白的加工可包括但不限于，信号肽切割；二硫键形成；适当折叠；碳水化合物的添加和加工(例如，N-和 0-连接糖基化)；特异性蛋白水解切割；和装配成多聚体蛋白。本发明的白蛋白融合蛋白优选为已加工形式的。在一个最优选的实施方式中，所述“白蛋白融合蛋白的已加工形式” 是指经过N末端信号肽切割的白蛋白融合蛋白产物，本文中也称为“成熟的白蛋白融合蛋白”。在一个实施方式中，本发明提供了包含G-CSF和血清白蛋白或由其组成的白蛋白融合蛋白的编码多核苷酸。在进一步实施方式中，本发明提供了包含G-CSF和血清白蛋白， 或由其组成的白蛋白融合蛋白。在其它实施方式中，本发明提供了包含G-CSF蛋白的生物活性和/或治疗活性片段和血清白蛋白，或由其组成的白蛋白融合蛋白。在其它实施方式中，本发明提供了包含G-CSF蛋白的生物活性和/或治疗活性变体和血清白蛋白，或由其组成的白蛋白融合蛋白。在优选的实施方式中，所述白蛋白融合蛋白的血清白蛋白组成是血清白蛋白的成熟部分。本发明还包括编码这些白蛋白融合蛋白的多核苷酸。在进一步的实施方式中，本发明提供的白蛋白融合蛋白包含G-CSF蛋白和血清白蛋白的生物活性和/或治疗活性片段，或由其组成。在进一步的实施方式中，本发明提供的白蛋白融合蛋白包含G-CSF蛋白和血清白蛋白的生物活性和/或治疗活性变体，或由其组成。在优选的实施方式中，所述白蛋白融合蛋白的G-CSF蛋白部分是G-CSF蛋白的成熟部分。在进一步的优选实施方式中，所述白蛋白融合蛋白的G-CSF蛋白部分是G-CSF蛋白的胞外可溶结构域。在替代的实施方式中，所述白蛋白融合蛋白的G-CSF蛋白部分是G-CSF 蛋白的活性形式。本发明还包括编码这些白蛋白融合蛋白的多核苷酸。在进一步的实施方式中，本发明提供的白蛋白融合蛋白包含G-CSF蛋白的生物活性和/或治疗活性片段或变体和血清白蛋白的生物活性和/或治疗活性片段或变体，或由其组成。在优选的实施方式中，本发明提供的白蛋白融合蛋白包含G-CSF蛋白的成熟形式和血清白蛋白的成熟形式，或由其组成。本发明还包括编码这些白蛋白融合蛋白的多核苷酸。I.定义本文所述发明使用许多定义，如下文和说明书通篇所述。如本文所用，“多核苷酸”是具有编码融合蛋白的核苷酸序列的核酸分子，包含在读框内连接的至少一分子白蛋白(或其片段或变体)与至少一分子粒细胞集落刺激因子 (G-CSF)(或其片段或变体)、或由其组成。如本文所用，“白蛋白融合构建物”是指包含在读框内连接的编码至少一分子白蛋白(或其片段或变体)的多核苷酸与编码至少一分子G-CSF (或其片段或变体)的至少一个多核苷酸、或由其组成的核酸分子；以及还包含，例如一种或多种下列元件(1)功能性自我复制载体(包括但不限于，穿梭载体、表达载体、整合载体和/或复制系统)，(2)转录起始区(例如，启动子区如可调节或可诱导的启动子、组成型启动子)，C3)转录终止区，(4) 前导序列，和(5)选择性标记。编码G-CSF和白蛋白的多核苷酸一旦成为白蛋白融合构建物的部分，就可各自称作白蛋白融合构建物的“部分”、“区段”或“组成”。所述显示“治疗活性”的G-CSF多肽或具有“治疗活性”的G-CSF蛋白是指具有一种或多种已知的G-CSF蛋白相关生物学和/或治疗活性的G-CSF多肽。作为非限制性示例， "G-CSF治疗蛋白”是可用于治疗、预防或改善疾病、症状或紊乱的G-CSF蛋白。作为非限制性示例，‘‘G-CSF治疗蛋白”可以与特定细胞类型(正常(如淋巴细胞)或非正常(如癌细胞))特异性结合并因此可用于将化合物(药物或细胞毒剂)特异性靶向到该细胞类型。如本文所用，术语“对象”是指动物，优选哺乳动物，更优选人。术语“对象”和“患者”可以互换使用。术语“药学上可接受的载体”是指给予个体时基本没有长期或永久性不良作用的任何载体。药学上可接受的载体包括稀释剂、填料、盐、分散介质、包衣、乳化剂、 润湿剂、甜味剂或风味剂、张力调节剂、吸收延迟剂、防腐剂、抗菌和抗真菌剂、缓冲剂、 PH调节剂、抗氧化剂、稳定剂、膨胀剂、冷冻保护剂、聚集抑制剂或任何类型的制剂佐剂。 Remington' s Pharmaceutical Sciences (《雷明顿药物科学》，2000，第 20版，Lippincott， ffilliams&ffilkins)中描述了合适的载体，其通过引用纳入本文。这些载体或稀释剂的优选示例包括但不限于，水、氯化钠、甘露醇、无水海藻糖、聚山梨酯如聚山梨酯80、各种调节pH 的药学上可接受的缓冲剂(例如，磷酸盐缓冲剂、柠檬酸盐缓冲剂、乙酸盐缓冲剂和硼酸盐缓冲剂)。术语“药学上可接受的盐”包括与阴离子形成的盐，例如衍生自氢氯酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的盐，以及与阳离子形成的盐，例如衍生自钠、钾、铵、钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的盐。术语“冻干稳定剂”是指保护冻干材料并降低其化学和/或物理不稳定性的分子。 冻干稳定剂的优选示例包括但不限于，蔗糖、海藻糖、谷氨酸单钠、组氨酸、甜菜碱、硫酸镁、 甘油、赤藓糖醇、丙三醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇、甘露醇丙二醇、聚乙二醇、普流罗尼及其组合。优选的冻干稳定剂是非还原糖，如二水海藻糖或蔗糖。术语“膨胀剂”是指给冻干混合物添加质量并对冻干块的物理结构有作用的化合物。示范性膨胀剂包括山梨糖醇、甘氨酸、甘露醇和聚乙二醇。术语“PMTT20/6. 0”是指含有磷酸二氢钠(2. 42mg/mL, 17. 4mM)、磷酸氢二钠 (0. 35mg/mL, 2. 5mM)、甘露醇(32. 79mg/mL, 180mM)、无水海藻糖 70mg/mL、60mM)、聚山梨酯80(0. lmg/mL，0.01% )的组合物，组合物的最终pH是6. 0。它也称为“新缓冲液”、 “新PMTT”或“新制剂缓冲液”，并描述为包括20mM磷酸盐、ISOmM甘露醇、60mM无水海藻糖、 0. 01% (w/v)聚山梨酯 80，pH 6.0。
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术语“PMTT10/7. 2”是指含有IOmM磷酸盐、190mM甘露醇、60mM二水海藻糖、0. 01% (W/V)聚山梨酯80的组合物，所述组合物的最终PH为7. 2。它也称为“旧缓冲液”、“旧PMTT” 或“旧制剂缓冲液”。术语“ PMTT，，是指含有磷酸盐、甘露醇、无水海藻糖和聚山梨酯的组合物。术语“CPMTT10”是指含有IOmM柠檬酸盐、190mM甘露醇、60mM无水海藻糖、0. 01% (W/V)聚山梨酯80的组合物，缓冲液的PH为6. 2。II.粒细胞集落刺激因子粒细胞集落刺激因子(G-CSF)是刺激嗜中性粒细胞生成的造血生长因子。给予 G-CSF可快速诱导嗜中性粒细胞性白细胞增多。G-CSF的另一重要体内活性是移动造血祖细胞进入外周血液(Duhrsen等，1988，Molineux等，1999 ；Roberts等，1994)。该效应不但包括嗜中性粒细胞谱系，还扩展到其它单谱系与多谱系祖细胞和多能造血干细胞(Molineux 等，1999)。G-CSF通过激发嗜中性粒细胞来增强作为抗感染的防御机制部分的细胞事件，从而增强其针对经调理金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus)的吞噬和抗菌活性。G-CSF 还引起嗜中性粒细胞与单核细胞的趋化性和嗜中性粒细胞的附着(You等，1989 ；Wang等， 1988)。目前已批准重组G-CSF产品用于多种临床症状以刺激嗜中性粒细胞的增殖和分化。在临床试验中，非格司亭(重组甲硫氨酰基人G-CSF ;Neupogen. ，Amgen, Thousand Oaks, CA)提高了外周嗜中性粒细胞数量，从而缩短了骨髓抑制化疗后的嗜中性白细胞减少症的持续时间。非格司亭通过每日皮下(SC)注射给药。聚乙二醇化非格司亭是一种聚乙二醇偶联的rG-CSF (Neulasta )，用其每疗程一次替代每日一次rG-CSF疗法来降低接受骨髓抑制性抗癌药患者的发热性嗜中性白细胞减少症发病率已被证明是安全有效的 (Holmes, 0' Shaughnessy 等，2002 ；Green 等，2003 ；Neulasta φ SmPC 2007)。III.人血清白蛋白人血清白蛋白(HSA)是人循环系统中自然产生的最常见血液蛋白，测得为约40克白蛋白/升并在循环中保持逾20天。HSA缺乏酶或免疫功能，在体内分布广泛，且已知是血液中治疗性物质的载体。白蛋白是载体蛋白，在生理浓度下具有最小活性。HSA和重组人白蛋白(rHSA)在人体中都具有同样的长循环半衰期。研究显示，与人白蛋白遗传融合的治疗蛋白能获得白蛋白的循环半衰期特征(Syed等，1997)。例如，在兔中的研究显示，与白蛋白融合的⑶4半衰期是未融合⑶4的140倍(Yeh等，1992)。人血清白蛋白负责血清渗透压的显著部分以及作为内源和外源配体载体起作用， 其成熟形式是有585个氨基酸的蛋白质(如美国专利第7，592，010号的图1所示)。目前， 临床应用的HA通过从人血中提取制得。在EP 330 451和EP 361 991中公开了微生物中重组HSA(rHSA)的生成。IV.用 G-CSF 治疗在基于年龄、医疗记录、疾病特征和化疗方案的骨髓毒性确定的高风险患者中，为预防发热性嗜中性白细胞减少症推荐用粒细胞集落刺激因子(G-CSF)进行初步预防。美国临床肿瘤学会(ASCO)和欧洲癌症研究和治疗组织(EORTC)推荐当发热性嗜中性白细胞减少症风险达约20%时采用G-CSF。美国国家综合性癌症中心网络(NCCN)推荐的G-CSF预防的可选指标为发热性嗜中性白细胞减少症风险是10-20%，G-CSF预防的确定性指标为发热性嗜中性白细胞减少症风险至少是20% (Smith等，2006、Vogel等2005，Timmer-Bonte 等 2OO6，NCCN 指南)。推荐用集落刺激因子(CSF)预防以减轻某些化疗方案的毒性。但是，这些治疗的附加成本在美国和特别是欧洲部分地区是重要考虑因素，可能引起预防性G-CSF治疗的应用不足，也可能限制患者进行强剂量化疗方案的资格(Timmer-Bonte等，2006 ；Adams等， 2006，NCCN 指南)。V.多肽和多核苷酸的片段和变体A.片段本发明还涉及本发明中G-CSF蛋白、白蛋白和/或白蛋白融合蛋白的片段。本发明还涉及本发明中编码G-CSF蛋白、白蛋白和/或白蛋白融合蛋白片段的多核苷酸。尽管从蛋白的N末端删除一个或多个氨基酸会引起本发明中G-CSF蛋白、白蛋白和/或白蛋白融合蛋白的一种或多种生物学功能的改变或丧失，其它治疗活性和/或功能活性(例如，生物活性、多聚体化的能力、结合配体的能力)仍可以保持。例如，当从N末端去除的残基少于完整多肽的主要残基时，N末端缺失多肽对识别所述多肽完整或成熟形式的抗体的诱导和/或结合能力一般仍被保留。通过本文所述的以及本领域已知的常规方法，可容易确定缺少完整多肽的N末端残基的特定多肽是否保留该免疫活性。缺失大量N末端氨基酸残基的突变蛋白保留某些生物或免疫活性并非不可能。事实上，由少至6个氨基酸残基组成的肽常能引起免疫反应。因此，对应于本发明白蛋白融合蛋白中G-CSF蛋白部分的G-CSF片段包括全长蛋白和从参比多肽(即，G-CSF蛋白、或由多核苷酸或白蛋白融合构建物编码的白蛋白融合蛋白的G-CSF蛋白部分)氨基酸序列的氨基末端缺失一个或多个残基的多肽。具体地，可以用通式m至q描述N末端缺失，其中q是表示参比多肽(例如，G-CSF蛋白、或本发明的白蛋白融合蛋白的G-CSF蛋白部分)的氨基酸残基总数的整数，m限定为从2到q减6范围内的任何整数。本发明也包括编码这些多肽的多核苷酸。此外，对应于本发明白蛋白融合蛋白中自蛋白部分的血清白蛋白多肽片段包括全长蛋白和从参比多肽(即，血清白蛋白、或白蛋白融合蛋白的血清白蛋白部分)氨基酸序列的氨基末端缺失一个或多个残基的多肽。在优选的实施方式中，可以用通式m至585描述 N末端缺失，其中585是成熟人血清白蛋白的氨基酸残基总数，m限定为2到579范围内的任意整数。本发明也包括编码这些多肽的多核苷酸。在补充实施方式中，可以用通式m至 609描述N末端缺失，其中609是表示全长人血清白蛋白的氨基酸残基总数的整数，m限定为2到603范围内的任意整数。本发明也包括编码这些多肽的多核苷酸。此外，本发明的白蛋白融合蛋白片段包括全长白蛋白融合蛋白和在所述白蛋白融合蛋白的氨基末端有一个或多个残基缺失的多肽。具体地，可以用通式m至q描述N末端缺失，其中q是表示白蛋白融合蛋白氨基酸残基总数的整数，m限定为2到q减6范围内的任意整数。本发明也包括编码这些多肽的多核苷酸。如上所述，尽管从参比多肽(例如，G-CSF蛋白；血清白蛋白；或本发明的白蛋白融合蛋白)的N末端或C末端删除一个或多个氨基酸会引起该蛋白的一种或多种生物学功能的改变或丧失，但其它功能活性(例如，生物活性、多聚体化的能力、结合配体的能力)和/ 或治疗活性仍可以保持。例如，当从C末端去除的残基少于完整或成熟多肽的主要残基时，C末端缺失多肽对识别所述多肽完整或成熟形式的抗体的诱导和/或结合能力一般仍被保留。通过本文所述的和/或本领域已知的常规方法，可容易确定缺少参比多肽的N末端残基和/或C末端残基的特定多肽是否保留治疗活性。本发明还提供了在对应于本发明白蛋白融合蛋白中G-CSF蛋白部分的G-CSF蛋白氨基酸序列的羧基末端有一个或多个残基缺失的多肽。具体地，可以用通式1至η描述C末端缺失，其中η是从6到q减1范围内的任何整数，而其中q是表示参比多肽(例如，G-CSF 蛋白、或由多核苷酸或白蛋白融合构建物编码的白蛋白融合蛋白的G-CSF蛋白部分)的氨基酸残基总数的整数。本发明也包括编码这些多肽的多核苷酸。此外，本发明提供了在对应于本发明白蛋白融合蛋白中白蛋白部分的白蛋白氨基酸序列的羧基末端有一个或多个残基缺失的多肽。具体地，可用通式1至η描述C末端缺失，其中η是从6到584范围内的任意整数，其中584表示成熟人血清白蛋白的氨基酸残基总数减1的整数。本发明也包括编码这些多肽的多核苷酸。具体地，可用通式1至η描述 C末端缺失，其中η是从6到608范围内的任意整数，其中608是表示血清白蛋白的氨基酸残基总数减1的整数。本发明也包括编码这些多肽的多核苷酸。此外，本发明提供了在本发明的白蛋白融合蛋白羧基端缺失一个或一个以上残基的多肽。具体地，可用通式1至η描述C末端缺失，其中η是从6到q减1范围内的任意整数，其中q是表示本发明白蛋白融合蛋白的氨基酸残基总数的整数。本发明也包括编码这些多肽的多核苷酸。此外，上述的任何N或C末端缺失可以组合产生N和C末端缺失的参比多肽。本发明还提供了在氨基和羧基末端都缺失有一个或一个以上氨基酸的多肽，可通常表示为具有参比多肽(例如，G-CSF蛋白、或本发明白蛋白融合蛋白的G-CSF蛋白部分、或血清白蛋白、或本发明白蛋白融合蛋白的白蛋白部分、或白蛋白融合蛋白、或由本发明的多核苷酸或白蛋白融合构建物编码的白蛋白融合蛋白)的m至η残基，其中η和m为如上所述的整数。 本发明也包括编码这些多肽的多核苷酸。本申请还涉及所含多肽与本文提出的参比G-CSF多肽或参比白蛋白多肽或其片段有至少约80%、约85%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约 97%、约98%或约99%相同的蛋白质。在优选的实施方式中，本申请涉及的蛋白质所含多肽与上述缺失氨基酸序列N和C末端的参比多肽至少有约80 %、约85 %、约90 %、约91 %、 约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%相同。本发明也包括编码这些多肽的多核苷酸。本发明优选的多肽片段包含显示G-CSF蛋白或血清白蛋白多肽序列的治疗活性和/或功能活性(例如生物活性)的氨基酸序列，或者由其组成，该氨基酸序列是片段。其它优选的多肽片段是生物活性片段。生物活性片段是那些展示的活性与本发明多肽的活性相似，但不必需相同的片段。片段的生物活性可包括所需活性的改善或不良活性的减弱。B.变体“变体”是指与参比核酸或多肽不同但保留其基本性质的多核苷酸或核酸。通常， 变体总体上与参比核酸或多肽密切相似并在很多区段与之相同。本文所用“变体”是指在序列上分别与G-CSF蛋白、白蛋白和/或白蛋白融合蛋白不同，但仍保留其如本文另述或本领域已知的至少一种功能和/或治疗性质的本发明的白蛋白融合蛋白的G-CSF蛋白部分、本发明的白蛋白融合蛋白的白蛋白部分、或本发明的白蛋白融合蛋白。通常，变体与白蛋白融合蛋白的G-CSF蛋白部分所对应的G-CSF蛋白、白蛋白融合蛋白的白蛋白部分所对应的白蛋白、和/或白蛋白融合蛋白的氨基酸序列在整体上非常相似，并在很多区段相同。本发明也包括编码这些变体的核酸。本发明还涉及包含，与例如本发明的白蛋白融合蛋白的G-CSF蛋白部分所对应的 G-CSF蛋白、本发明的白蛋白融合蛋白的白蛋白部分所对应的白蛋白和/或白蛋白融合蛋白至少约80 %、约85 %、约90 %、约91 %、约92 %、约93 %、约94 %、约95 %、约96 %、约 97%、约98%、约99%或约100%相同的氨基酸序列，或由其组成的蛋白质。还提供了这些多肽的片段。本发明进一步包括的多肽是由在严谨杂交条件(例如，在6x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中以约45°C杂交从而过滤结合的DNA，然后在0. h SSC，0. 1 % SDS中以约 50-65°C清洗一次或多次)、在高度严谨条件(例如，在6x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中以约 45°C杂交从而过滤结合的DNA，然后在0. IxSSC, 0. 2% SDS中以约68°C清洗一次或多次)或者在本领域技术人员已知的其它严谨杂交条件(参见，例如，Ausubel, F.M.等编著，1989， Current protocol in Molecular Biology (Mifif，Green publishing associates, Inc.和 John ffiley&Sons Inc.，New York，见 6. 3. 1-6. 3. 6 禾口 2. 10. 3 各页) 下与本发明白蛋白融合蛋白的编码核酸分子的补体杂交的多核苷酸编码的多肽。本发明也包括编码这些多肽的多核苷酸。所述多肽的氨基酸序列与查询氨基酸序列至少，例如95% “相同”，意在表示查询氨基酸序列的每100个氨基酸中对象多肽的序列中可包括最多5个氨基酸变化，除此之外对象多肽的氨基酸序列与查询序列相同。换而言之，为得到氨基酸序列与查询氨基酸序列至少95%相同的多肽，对象序列中最多有5%的氨基酸残基可被插入、缺失或用其它氨基酸取代。参比序列的这些变化可以发生在参比氨基酸序列的氨基或羧基末端或这些末端位置之间的任何地方，可以散布于参比序列上各残基间，或者在参比序列内的一个或一个以上相邻基团中。作为实践问题，可以采用已知的计算机程序来常规确定任何特定多肽是否与例如本发明的白蛋白融合蛋白的氨基酸序列或其片段(例如所述白蛋白融合蛋白的G-CSF蛋白部分或所述白蛋白融合蛋白的白蛋白部分)具有至少约80%、约85%、约90%、约91%、 约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%相同。确定查询序列(本发明的某序列)与对象序列之间的最佳总体匹配的优选方法可以采用基于Brutlag 等(Comp. App. Biosci. 6 :237-245(1990))的算法的FASTDB计算机程序，该方法也称为整体序列比对。在序列比对中，查询和对象序列或者都是核苷酸序列，或者都是氨基酸序列。 整体序列比对的结果表示为相同百分数。FASTDB氨基酸比对中所用的优选参数为矩阵 (Matrix) = PAM 0，k_ 元组(k-tuple) = 2，错配罚分(Mismatch Penalty) = 1，连接罚分 (Joining Penalty) =20，随机分组长度(Randomization Group Length) =0,临界分值 (Cutoff Score) = 1，窗口尺寸(Window Size)=序列长度，缺口罚分(Gap Penalty) =5， 缺口尺寸罚分(Gap Size Penalty) = 0. 05，窗口尺寸=取500或对象氨基酸序列长度中较短者ο若对象序列比查询序列短是由于N或C末端缺失而非内部缺失，必须对结果进行人工校正。这是因为FASTDB程序在计算整体相同百分数时并不考虑对象序列的N和C末端截断。对于相对查询序列在N和C末端有截断的对象序列，通过计算查询序列中是对象序列N和C末端而不与相应的对象残基匹配/对齐的残基数占查询序列总碱基数的百分比来校正相同百分数。通过FASTDB序列比对的结果确定残基是否匹配/对齐。然后从上述 FASTDB程序采用特定参数计算所得相同百分数中减去该百分值，获得最终的相同百分数得分。该最终相同百分数得分用于本发明目的。为了人工调整相同百分数得分，仅考虑对象序列N和C末端与查询序列不匹配/对齐的残基。即，只查询对象序列N和C末端残基最远端外侧的残基位置。例如，将90个氨基酸残基的对象序列与100个残基的查询序列比对以确定相同百分数。缺失发生在对象序列的N末端，因此FASTDB比对并不显示N末端最初10个残基的匹配/对齐。这10个未配对残基代表序列的10% (N和C末端未匹配残基数/查询序列的总残基数)，因此从FASTDB程序计算得到的相同百分数得分中减去10%。若其余90个残基为理想匹配，则最终的相同百分数将是90%。在另一个例子中，比较90个残基的对象序列与100个残基的查询序列。这次缺失为内部缺失，因此对象序列的N或C末端没有与查询不匹配/对齐的残基。该情况下，FASTDB计算所得相同百分数不用人工校正。再次，只对在FASTDB比对中显示为对象序列N和C末端外侧，未与查询序列匹配/对齐的残基位置进行人工校正。没有为本发明目的进行其它人工校正。变体通常和与变体具有相同长度的正常HA或G-CSF蛋白长度具有至少约75% (在其它实施方式中，至少约80%、约85%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、 约95%、约96%、约97%、约98%或约99% )的序列相同性。通过BLAST (Basic Local Alignment Search Tool (基础本地比对搜索工具))分析，采用为序列相似性搜索调整过的 blastp、blastn、blastx、tblastn 禾口 tblastx 程序所用算法(Karlin 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA87 :2264-2268(1990)和 Altschul，J. Mol. Evol. 36 :290-300 (199 ，通过引用全文纳入)确定核苷酸或氨基酸序列水平的同源性或相同性。BLAST程序所用方法首先考虑查询序列和数据库序列之间的相似区段，然后评估所有一致匹配的统计学显著性，最后仅总结出那些满足预选的显著性阈值的匹配者。关于序列数据库相似性搜索的基本问题的讨论，参见Altschul等(Nature Genetics 6 119-1^(1994))，其全文通过引用纳入本文。直方图、描述、对齐、预期(即，针对数据库序列报告匹配者的统计学显著性)、临界值、矩阵和筛选的搜索参数采用默认设置。Blastp、 blastx、tblastn 和 tblastx 采用的默认计分矩阵是 BL0SUM62 矩阵(Henikoff 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 10915-10919 (1992)，通过引用全文纳入)。对于 blastn,计分矩阵用M( S卩，匹配残基配对的奖励计分)与N(S卩，错配残基的罚分)的比值设定，其中M和N的默认值分别为5和-4。四项blastn参数可作如下调整Q-10(缺口产生罚分)；R=10(缺口延伸罚分)；wink= 1(在沿查询序列的各wink. sup. th位置产生字命中)；以及gapw = 16(设定产生带缺口对齐的窗口宽度)。Blastp的相应参数设定为Q = 9 ;R = 2 ；wink = 1和gapw = 32。在GCG包1. 0版中可在序列间进行Bestfit比较，采用DNA参数GAP = 50(缺口产生罚分)和LEN= 3(缺口延伸罚分)，蛋白质比较中的相应设定为GAP = 8和 LEN = 2。本发明的多核苷酸变体可含有在编码区、非编码区或两者内的变化。特别优选的多核苷酸变体包含产生沉默取代、添加或缺失的变化，但不改变所编码多肽的性质或活性。 优选因遗传密码简并性导致的沉默取代所产生的核苷酸变体。此外，也优选多肽变体中低于50个、低于40个、低于30个、低于20个、低于10个、或5-50个、5-25个、5-10个、1-5个或1-2个氨基酸被以任意组合取代、缺失或添加。可以为多种原因产生多核苷酸变体，例如为优化特定宿主中密码子的表达(将人mRNA中的密码子变成细菌宿主如酵母或大肠杆菌中优选的密码子)。在一个优选的实施方式中，本发明中编码白蛋白融合蛋白的白蛋白部分的多核苷酸优化以在酵母或哺乳动物细胞中表达。在进一步优选的实施方式中，本发明编码白蛋白融合蛋白的G-CSF蛋白部分的多核苷酸优化以在酵母或哺乳动物细胞中表达。在更进一步优选的实施方式中，本发明中编码白蛋白融合蛋白的多核苷酸优化以在酵母或哺乳动物细胞中表达。在另一实施方式中，在本文所述严谨杂交条件下，编码白蛋白融合蛋白G-CSF蛋白部分的密码子优化多核苷酸不和编码G-CSF蛋白的野生型多核苷酸杂交。在进一步的实施方式中，在本文所述严谨杂交条件下，编码白蛋白融合蛋白的白蛋白部分的密码子优化多核苷酸不和编码白蛋白的野生型多核苷酸杂交。在另一个实施方式中，在本文所述严谨杂交条件下，编码白蛋白融合蛋白的密码子优化多核苷酸不和编码G-CSF蛋白部分或白蛋白部分的野生型多核苷酸杂交。在另外的实施方式中，编码白蛋白融合蛋白的G-CSF蛋白部分的多核苷酸不包含该G-CSF蛋白的天然产生序列，或不由其组成。在进一步实施方式中，编码白蛋白融合蛋白的白蛋白部分的多核苷酸不包含该白蛋白的天然产生序列，或不由其组成。在另外的实施方式中，编码白蛋白融合蛋白的多核苷酸不包含G-CSF蛋白部分或白蛋白部分的天然产生序列，或不由其组成。采用已知的蛋白质工程和重组DNA技术的方法，可以产生变体以改善或改变本发明多肽的特性。例如，可以从本发明多肽的N或C末端删除一个或多个氨基酸而不显著损失生物学功能。在优选的实施方式中，本发明的变体具有保守取代。“保守取代”是指在组内交换， 例如脂族或疏水氨基酸Ala、Val, Leu和Ile的取代；羟基残基Ser和Tar的取代；酸性残基Asp和Glu的取代；酰胺残基Asn和Gln的取代；碱性残基Lys、Arg和His的取代；芳香族残基Wie、Tyr和Trp的取代；以及小尺寸氨基酸Ala、kr、Hir、Met和Gly的取代。提供了关于如何制备表型沉默的氨基酸取代的指南，例如，Bowie等， "Deciphering the Message in Protein Sequences :Tolerance to Amino Acid Substitutions (解码蛋白质序列的信息对氨基酸取代的容差)，，，Science247 1306-1310(1990)，其中作者表明有两种主要策略研究氨基酸序列对变化的容差。第一种策略通过进化过程中的自然选择探索氨基酸取代的容差。通过比较不同物种间的氨基酸序列鉴别保守氨基酸。这些保守氨基酸可能对于蛋白质功能很重要。相反， 其取代为自然选择容忍的氨基酸位置表明这些位置对于蛋白质功能并非关键。因此，容忍氨基酸取代的位置可被改变而仍保持所述蛋白质的生物活性。第二种策略采用遗传工程在克隆基因的特定位置引入氨基酸变化以鉴别蛋白质功能的关键性区域。例如，可采用定点突变或丙氨酸扫描突变(在分子的各残基处引入单
16个丙氨酸突变)。参见 Cunningham 和 Wells，ScienceM4 1081-1085 (1989)。然后，可测试所得突变分子的生物学活性。如作者所指出，这两种策略揭示了蛋白质对氨基酸取代的惊人容差。作者进一步指出，在蛋白质的某些氨基酸位置哪些氨基酸变化是可能允许的。例如，大多数被包埋(在蛋白质三级结构中)的氨基酸残基要求非极性侧链，而通常表面侧链的特性极少是保守的。此外，可容忍的保守氨基酸取代涉及脂族或疏水氨基酸Ala、Val、LeU和Ile的取代；羟基残基Ser和Thr的取代；酸性残基Asp和Glu的取代；酰胺残基Asn和Gln的取代；碱性残基Lys、Arg和His的取代；芳香族残基Wie、Tyr和Trp的取代；以及小尺寸氨基酸Ala、 Ser, Thr、Met和Gly的取代。除了保守氨基酸取代，本发明的变体包括(i)含一个或一个以上非保守氨基酸残基取代的多肽，其中被取代的氨基酸残基可以由或不由该遗传密码编码，或者(ii)含有一个或一个以上具取代基团的氨基酸残基取代的多肽，或(iii)与另一化合物例如提高多肽稳定性和/或溶解度的化合物(如聚乙二醇)融合或化学偶联的多肽，(iv)包含补充氨基酸，例如IgG Fc融合区肽的多肽。本领域技术人员在本文教导下认为这些多肽变体是在本文范围内的。例如，包含带电氨基酸被其它带电或中性氨基酸取代的多肽变体可产生特性改善的蛋白质，例如较少聚集。药物制剂的聚集减低活性并因聚集体的免疫原活性提高了清除。参见 Pinckard 等，Clin. Exp. Immunol. 2 :331-340 (1967) ；Robbins 等，Diabetes 36 :838-845 (1987) ；Cleland 等，Crit. Rev. Therapeutic Drug Carrier Systems 10: 307-377(1993)。在特定的实施方式中，本发明的多肽包含白蛋白融合蛋白氨基酸序列、G-CSF蛋白和/或人血清白蛋白的氨基酸序列的片段或变体，或由其组成，其中所述片段或变体与参比氨基酸序列相比，具有1-5、5-10、5-25、5-50、10-50或50-150个氨基酸残基的添加、取代和/或缺失。在优选的实施方式中，所述氨基酸取代是保守的。本发明也包括编码这些多肽的核酸。本发明的多肽可以由通过肽键或修饰的肽键，即肽等排物彼此连接的氨基酸组成，并可包含20种基因编码的氨基酸以外的氨基酸。所述多肽可以通过天然过程修饰， 例如翻译后加工，或者通过本领域熟知的化学修饰技术修饰。这些修饰在基础文章和更具体的专著以及大量研究文献中已详尽描述。修饰可发生在多肽的任何地方，包括肽主链、氨基酸侧链和氨基或羧基末端。应当了解相同类型的修饰可以在给定多肽的多个位置以相同或不同程度出现。并且，给定多肽也可包含许多类型的修饰。多肽可以是分支的，例如因泛素化造成，它们可以是含有或不含分支的环状。环状、分支和分支环状多肽可以由翻译后的天然过程造成也可通过合成方法产生。修饰包括乙酰化、酰基化、ADP-核糖基化、酰胺化、共价结合黄素、共价结合血红素部分、共价结合核苷酸或核苷酸衍生物、 共价结合脂质或脂质衍生物、共价结合磷脂酰肌醇、交联、环化、二硫键形成、去甲基化、形成共价交联、形成半胱氨酸、形成焦谷氨酸、甲酰化、Y -羧化、糖基化、GPI锚体形成、羟基化、碘化、甲基化、十四烷基化、氧化、聚乙二醇化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊二烯化、外消旋化、硒化、硫化、转移RNA介导的蛋白质氨基酸加成如精氨酰化、以及泛素化。(参见， 例如 PROTEINS—STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES (蛋白质结合和分子性质)，第 2 版，Τ· E. Creighton，W. H. Freeman and Company, New York (1993) ；P0ST-TRANSLATI0NALCOVALENT MODIFICATION OF PROTEINS (蛋白质翻译后的共价修饰)，B. C. Johnson 编著，Academic Press, New York,第 1—12 页(1983) ；Seifter 等，Meth. Enzymol. 182 626-646 (1990) ；Rattan 等，Ann. N. Y. Acad. Sci. 663 :4862 (1992))。C.功能活性“具功能活性的多肽”是指能显示与G-CSF蛋白的全长、前蛋白、和/或成熟形式相关的一种或一种以上已知功能活性的多肽。这些功能活性包括但不限于，生物学活性、抗原性[与抗多肽抗体结合(或与多肽竞争结合)的能力]、免疫原性(产生结合本发明特定多肽的抗体的能力)、与本发明的多肽形成多聚体的能力、和与多肽的受体或配体结合的能力。“具生物学活性的多肽”是指如特定生物学实验所检测，剂量依赖或不依赖性地， 显示与本发明的G-CSF蛋白包括其成熟形式相似，但未必相同活性的多肽。在优选的实施方式中，本发明的白蛋白融合蛋白具有未与白蛋白融合的G-CSF蛋白部分(或其片段或变体)相关的至少一种生物学和/或治疗活性。可以采用本领域已知试验和本文所述试验或对它们作常规改良以试验其本发明的白蛋白融合蛋白的功能活性(例如，生物学活性)。另外，本领域技术人员可以对白蛋白融合蛋白的G-CSF蛋白部分所对应的G-CSF蛋白片段进行常规试验。此外，本领域技术人员可以采用本领域已知试验和/或下文实施例部分所述试验对白蛋白融合蛋白的白蛋白部分所对应的白蛋白片段进行常规试验分析活性。例如，在一个实施方式中，试验白蛋白融合蛋白结合或与G-CSF蛋白竞争结合抗 G-CSF多肽抗体和/或抗白蛋白抗体的能力，可以采用本领域已知的各种免疫试验，包括但不限于，使用例如放射免疫试验、ELISA(酶联免疫吸附测定)、“夹心”免疫试验、免疫放射试验、凝胶扩散沉淀反应、免疫扩散试验、原位免疫试验(例如，采用胶体金、酶或放射性同位素标记)Jestern印迹、沉淀反应、聚集试验(例如凝胶聚集试验、血凝试验)、补体固定试验、免疫荧光试验、蛋白质A试验和免疫电泳试验等技术的竞争性和非竞争性试验系统。 在一个实施方式中，通过检测初次抗体上的标记测得抗体的结合。在另一实施方式中，通过检测二次抗体或试剂与初次抗体的结合测得初次抗体。在另一实施方式中，标记所述二次抗体。本领域已知并在本发明范围内有多种方法用于在免疫试验中检测结合。在一个优选实施方式中，识别了 G-CSF蛋白质的结合伴侣(例如，受体或配体)，例如，可以通过本领域熟知的方法如还原和非还原性凝胶层析、蛋白亲和层析及亲和印迹法， 分析白蛋白融合蛋白与该结合伴侣的结合，所述融合蛋白包含G-CSF蛋白作为对融合体的 G-CSF 蛋白部分。一般参见 Phizicky 等，Microbiol. Rev. 59 :94-123(1995)。在另一实施方式中，可采用本领域已知技术常规分析白蛋白融合蛋白与融合体G-CSF蛋白部分所对应 G-CSF多肽的受体结合的生理关联能力。在另一实施方式中，评估白蛋白融合蛋白形成多聚体的能力，可以通过本领域熟知的方法，例如还原和非还原性凝胶层析、蛋白亲和层析及亲和印迹分析多聚体与其它组分的结合。通常参见Wiizicky等，同上。可用于分析结合和交叉反应性及确认HSA-G-CSF融合体特性的免疫学测定包括但不限于使用诸如Western印迹、放射性免疫实验、ELISA(酶联免疫吸附测定)、“夹心” 免疫实验、免疫沉淀实验、沉淀素反应、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散实验、凝集实验、补体结合实验、免疫放射分析、荧光免疫分析、蛋白A免疫实验等技术的竞争性和非竞争性测定系统。这类实验是本领域熟知的常规实验(参见例如，Ausubel等编，1994，Current Protocols in Molecular Biology (《新编分子生物学实验》)，第1卷，纽约约翰韦利父子公司(John ffiley&Sons, Inc.，New York)，通过引用全文纳入本文)。与白蛋白融合蛋白的G-CSF蛋白部分所对应的G-CSF蛋白结合的抗体也可就其对给定蛋白或抗原的结合亲和性加以描述或限定，优选其特异性结合的抗原。优选的结合亲和力包括解离常数或Kd低于5x10_2M、10_2M、5x10_3M、10_3M、5x10_4M、10_%。更优选的结合亲和力包括解离常数或 Kd 低于 5χ1(Γ5Μ、1(Γ5Μ、5χ1(Γ6Μ、1(Γ6Μ、5χ1(Γ7Μ、1(Γ7Μ，5χ1(Γ8Μ 或 1(Γ8Μ。 更优选的结合亲和力包括解离常数或Kd低于5x10-、、10_9Μ、5x10、、10_1(ιΜ、5Χ10_"Μ、 1(Γ"Μ、5χIOl 1(Γ12Μ、5x101 10 Μ、5Χ10 Μ、10 Μ、5X10、、或 IO-15M0 此外，本文所述和本领域已知的试验可以常规应用于检测白蛋白融合蛋白及其片段、变体、衍生物引起所述白蛋白融合蛋白的G-CSF蛋白部分和/或白蛋白部分相关的生物学活性和/或G-CSF活性 (体内或体外)的能力。其它方法会是本领域技术人员已知的，并在本发明范围内。VI. HSA-G-CSF 融合蛋白重组人白蛋白-人粒细胞集落刺激因子(rHSA-G-CSF)是G-CSF类似物。 rHSA-G-CSF的例子描述于美国专利第5，665，863号以及美国专利第7，041，478号，两者都通过引用纳入本文。rHSA-G-CSF的另一例子是美国特华生物药物有限公司(Teva Biopharmaceuticals USA LTD.)开发的 Neugranin ( “NEUG”)。Neugranin ( "NEUG")是单链连接759个氨基酸的融合多肽，分子量约85kDa。残基1-585对应成熟形式HSA，残基 586-759对应成熟形式的人G-CSF。Neugranin 融合蛋白如图9所示。VII 产生融合蛋白生产rHSA-G-CSF的合成过程的示例见美国专利申请第11/929，828号的描述，其全文通过引用纳入本文。在一些实施方式中，采用遗传工程改造的表达NEUG融合蛋白的酵母(例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))宿主系统生产NEUG。采用本领域熟知的方法(例如通过一系列层析和过滤步骤，例如亲和层析及离子交换层析)从酵母培养的发酵培养基中收集并纯化NEUG。在一个非限制性的例子中，如下开发NEUG融合构建物。从英国牛津大学 F. E. Baral 1 e博士实验室的人cDNA文库中分离出全长白蛋白cDNA。该克隆作为质粒 PAT153ALB送往英国诺丁汉的Delta Biotechnology Limited。此外，修饰6氨基酸的HSA 前肽(RGVFRR)以促进酵母中的更有效加工(RSLDKR)。Neugranin生产质粒是基于野生型酿酒酵母中发现的2_μ质粒。基于pSAC35的表达载体(专利EP 286 424 B,US 5，637，504)含有来自酿酒酵母的LEU2基因作为选择标记，该基因补充所述生产宿主中的亮氨酸缺陷。该生产质粒还包含强酵母启动子PRB1，和来自质粒PUC9的可在大肠杆菌中克隆和增殖的序列。此外，所述质粒显示的独特属性在于， 它一旦转化到酵母中就会去除在大肠杆菌中增殖所需的PUC9衍生序列。这通过侧接FLP 识别靶标和进入酵母后质粒表达酵母FLP重组酶而实现。因此，用于生成NEUG的生物体中没有细菌DNA存在。这通过在产生主细胞库后从酵母中取出2 μ m质粒并测序得到证实。如上所述，名为CID1643(pSAC35 :HSA. GCSF(T31-P204))的 NEUG 生产质粒是从基于PSAC35的表达载体衍生得到。通过PCR扩增与人G-CSFT31-P204对应的区段，添加适当的5’和3’限制性位点以允许与HSA开放读框3’末端的无缝融合。在马里兰州罗克维尔(Rockville，MD)的Human Genome Sciences(HGS)公司用 NEUG种子瓶制备cGMP主细胞库(MCB)。NEUG MCB的测试和鉴定在美国宾夕法尼亚州马尔文的 Charles River Laboratories (Malvern, PA, USA)和美国得克萨斯州休斯敦的 Lark Technologies (Houston, TX, USA),遵照 ICH 指南 Q5D (Derivation and Characterization of Cell Substrates Used for Production of Biotechnological/Biologicals Products (用于生产生物技术/生物产品的细胞基质的产生和鉴定))进行。随后在美国宾夕法尼亚州马尔文的Charles River Laboratories产生并检测从该MCB衍生的cGMP工作细胞库(WCB)。生产NEUG细胞系库的所有培养基成分都是合成、生物合成或植物来源。在细胞系或细胞库制备过程中没有使用动物来源或人源的成分。所述细胞库在< _135°C下保存在预灭菌的1. SmL带内螺口封盖Nunc聚丙烯管内的冻存培养基中。下文的实验实施例中提供了分离、纯化和制备药用rHSA-G-CSF融合蛋白的非限制性示范方法。VIII.制备治疗蛋白天然状态或重组生成的治疗蛋白，例如干扰素和生长激素，通常是保质期短的不稳定分子，特别是当配制成水性溶液时。这些分子在配制用于给药时的不稳定性使许多所述分子必需冻干并在保存期间的所有时间均冷藏，因此致使所述分子难以运输和/或保存。当药物制剂必需在医院环境外保存并分配时，保存问题尤为迫切。包含治疗蛋白的白蛋白融合蛋白已显示比未融合白蛋白的相同治疗蛋白有延长的保存期。保存期一般指溶液或在其它保存制剂中的治疗蛋白的治疗活性稳定而没有治疗活性不当损失的时间段。即便如此，聚集和化学不稳定性还是含治疗蛋白的白蛋白融合蛋白的开发中的主要障碍。药物制剂的聚集可以是非常有害的，因为它降低了活性并因聚集体的免疫原活性而提高了药物清除(Pinckard 等，1967 ；Robbins 等，1987 ；Cleland 等，1993)。下文给出了说明本文所述方法和组合物不同方面的一些非限制性实施例。IX.实验实施例给出以下实施例以阐述本发明。然而应当了解，本发明不限于这些实施例所述的特定条件和细节。本文参考的所有公开可得的文献，包括但不限于美国专利，都通过引用纳入本文。在实施例1、2和6中，介绍了药用NeugraninTM( “NEUG”)组合物的3种不同的非限制性制剂。各制剂包含图9所示的NEUG融合多肽。A部分所述的方法和所得组合物统称为“NEUG-0”。B部分所述的方法和所得组合物统称为“NEUG-1 ”，而E部分所述的方法和所得组合物统称为“NEUG-2”。NEUG是分子量约85kDa、单链连接的融合多肽，包含对应于HSA成熟形式的1_585 位残基和对应于人G-CSF成熟形式586-759位残基。图9显示了 NEUG融合蛋白的氨基酸序列。实施例1 制备治疗用NEUG-O
生产NEUG-O用于毒理学实验。所述制剂包括在IOmM柠檬酸盐、75mM氯化钠、IOOmM 蔗糖、0. 01%聚山梨酯80中的4. Omg/ml NEUG并缓冲至ρΗ6· 5。安全性/毒理学在猴中评估NEUG的非临床安全性。100、500、1000μ g/kg NEUG的重复接触(每周 1次共4周)耐受良好，没有发病和死亡或者体重或食物消耗的改变。没有可认为是不良毒性的总体或微观变化。治疗相关观察限于预期的G-CSF给药药理学(例如，嗜中性粒细胞增多，脾脏重量稍有增加，髓质增生)，不认为是毒性。在猴中的NOAEL为> 1毫克/公斤/ 周，比下列观察的人体中0. 45mg/kg的剂量高约12倍。经治疗动物也显示了 ANC和WBC的提高。(数据未显示)。实施例2 制备治疗用NEUG-I生产NEUG-I用于人体临床研究。所述制剂在PMMT10/7. 2 (IOmM磷酸钠、200mM甘露醇、60mM无水海藻糖、0. 01% (W/V)聚山梨酯-80，pH 7. 2的溶液中含15. Omg/ml NEUG0下表1提供了 NEUG-I的组成。
权利要求
1.一种药物组合物，包含重组人白蛋白-人粒细胞集落刺激因子和至少一种药学上可接受的载体，其中所述组合物的PH为约4-6. 8。
2.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述组合物的PH约为6.0。
3.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述重组人白蛋白-人粒细胞集落刺激因子的浓度为约2. 5-240mg/ml。
4.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述重组人白蛋白-人粒细胞集落刺激因子的浓度为约30-120mg/ml。
5.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述重组人白蛋白-人粒细胞集落刺激因子的浓度为约60-120mg/ml。
6.如权利要求1-5中任一项所述的药物组合物，其特征在于，所述组合物包含至少一种药学上可接受的盐。
7.如权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述盐的浓度为约5-50mM。
8.如权利要求1-7中任一项所述的药物组合物，其特征在于，所述组合物包含至少一种药学上可接受的缓冲剂。
9.如权利要求8所述的药物组合物，其特征在于，所述缓冲剂的浓度为约15-50mM。
10.如权利要求8所述的药物组合物，其特征在于，所述缓冲剂的浓度约为20mM。
11.如权利要求8-10中任一项所述的药物组合物，其特征在于，所述缓冲剂是磷酸盐或柠檬酸盐。
12.如权利要求8-11中任一项所述的药物组合物，其特征在于，所述缓冲剂是磷酸钠。
13.如权利要求12所述的药物组合物，其特征在于，所述缓冲剂包含磷酸二氢钠或磷酸氢二钠。
14.如权利要求1-13中任一项所述的药物组合物，其特征在于，所述组合物包含冻干稳定剂。
15.如权利要求14所述的药物组合物，其特征在于，所述冻干稳定剂包含二水海藻糖。
16.如权利要求15所述的药物组合物，其特征在于，所述二水海藻糖的浓度约为60mM。
17.如权利要求1-16中任一项所述的药物组合物，其特征在于，所述组合物包含膨胀剂。
18.如权利要求17所述的药物组合物，其特征在于，所述膨胀剂包含多醇。
19.如权利要求18所述的药物组合物，其特征在于，所述多醇包含甘露醇。
20.如权利要求1-19中任一项所述的药物组合物，其特征在于，所述组合物为冻干粉末形式。
21.如权利要求20所述的药物组合物，其特征在于，所述粉末保存在小瓶中。
22.如权利要求1-19中任一项所述的药物组合物，其特征在于，所述组合物是液体形式。
23.如权利要求22所述的药物组合物，其特征在于，所述液体保存在注射器中。
24.如权利要求1-23中任一项所述的药物组合物，包含(a)重组人白蛋白-人粒细胞集落刺激因子，和(b)至少一种缓冲剂；其中在25°C孵育M小时后溶液中重组人白蛋白-人粒细胞集落刺激因子的单体纯度降低小于10%。
25.如权利要求1所述的药物组合物，其包含(a)重组人白蛋白-人粒细胞集落刺激因子，(b)20mM磷酸钠，(c)180mm甘露醇，(d)60mM 二水海藻糖，(e)0.01%(ff/V)聚山梨酯 80，其中所述组合物的PH约6. 0，其中所述重组融合蛋白的浓度在2. 5-120mg/ml之间。
26.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述祖合物包含重组人白蛋白-人粒细胞集落刺激因子和PMTT20/6. 0，其中所述重组融合蛋白的浓度为约2. 5-120mg/ml。
全文摘要
本文描述了用于治疗、预防和减轻以低于正常白细胞计数为特征的症状和疾病如白细胞减少症和嗜中性白细胞减少症的组合物和方法。所述组合物和方法包括重组人白蛋白-人粒细胞集落刺激因子。也描述了包括重组融合蛋白的药物制剂和制备所述制剂的方法。
文档编号A61K47/48GK102395379SQ201080012749
公开日2012年3月28日 申请日期2010年1月15日 优先权日2009年1月16日
发明者J·B·博克, X·罗 申请人:特瓦制药工业有限公司