基于作为细胞因子活性的活化剂或抑制剂的硫酸化透明质酸的新的用于局部应用的药剂的制作方法

专利名称：基于作为细胞因子活性的活化剂或抑制剂的硫酸化透明质酸的新的用于局部应用的药剂的制作方法
技术领域：
许多年来，科学/专利文献已经研究和描述了硫酸化透明质酸，其以透明质酸 (HA)为原料按照现有技术(EP0940410B1和EP0702699B1)中所述的那样适宜硫酸化而获得，抗凝作用归因于此。HAS还可以通过使HA的葡糖胺脱乙酰化、随后硫酸化而获得 (定义为HA-赂)(EP0971961B1)，用于生产手术物品和药物组合物。专利EP0754460B1和 EP1385492B1也是已知的，其中描述了 HAS在病理学情况如ARDS(严重的呼吸功能不全)、 风湿关节病和类风湿性关节炎中的用途。本发明的目的涉及MS作为细胞因子活性调节剂的新的和出人意料的皮肤应用，因为申请人已经发现了 HAS调节特定细胞因子(促炎和抗炎)的活性的独特能力，它已经研究了其作用机制并揭示了两类硫酸化产品(HAS和HA-NS) 之间的主要差异，但最重要的是，申请人已经出人意料地发现了对不同类型和品系的疱疹病毒、巨细胞病毒和水泡性口炎(vesicular stomatitis)病毒的出乎意料高的活性。最后，本发明的另一个目的涉及HAS作为具有抗炎和激素性质的药物的皮肤吸收促进剂的用途。自1970年以来，科学家已经理解选择的淋巴样细胞群体可以产生不可同化为抗体的蛋白质性质的分子并将其释放入循环床(circulatory bed)中，其用术语“细胞因子” 进行定义。它们代表了一类新的能够作用于身体多个区域中不同细胞靶标的“激素”。有关这些蛋白质的合成和生物/生化功能的科学知识的进展已经改变了同一科学世界的免疫系统(I.S.)的“旧”观点并已经开启了在理解其大量功能方面的新眼界，由此创造了局部和/或全身治疗不同病理学情况的新前途，也包括有关癌症免疫疗法的新的治疗可能性。I. S.的中央细胞是淋巴细胞，它占全部白细胞的约20%，根据其不同功能形成了 3组B淋巴细胞、T淋巴细胞和杀伤性淋巴细胞。许多细胞因子是淋巴细胞和/或单核细胞产生的可溶性蛋白质，能够对抗其它也远离其产生部位的细胞/组织起作用。事实上它们具有免疫功能，并且就不同I. S.细胞或在由I. S.引发的反应级联中所涉及的靶细胞而言在其它细胞因子的合成中还具有调节功能。迄今为止已经研究了大量不同的细胞因子，它们还具有大量不同的简称，但是申请人所具体研究的那些是白细胞介素1和2、白细胞介素6、7和12，下文定义为IL-1、 IL-2、IL-6、IL-7和IL-12，它们和TNF—起被定义为具有炎性性质的细胞因子，而白细胞介素IO(IL-IO)相反，其为具有强抗炎特性的细胞因子。所研究的第一种细胞因子明确地是IL二1:其以两种形式α和β存在，它是促炎过程(全身和/或皮肤)的有力诱导物。它主要由B淋巴细胞、T淋巴细胞和巨噬细胞在细菌刺激物或就其它因子、包括其它细胞因子而言的刺激后产生；它也从外周嗜中性粒细胞、 内皮、上皮和平滑肌细胞、成纤维细胞、皮肤朗格汉斯细胞、破骨细胞、滑膜细胞和许多其它类型的细胞中分泌。这两种形式均与相同的受体结合并具有极为类似(如果不等同的话) 的生物活性。其促炎功能的多数与其它细胞因子如IL-6和IL-8的刺激相关，其本身的合成可以由细胞因子如TNF、干扰素、细菌内毒素、病毒和不同类型的其它抗原所诱导。它在败血症性休克中有涉及，但是还应当指出近期研究已经证明IL-I能够激活一些癌基因的表达，因而能够参与瘤形成的发病。因此，IL-I与其它细胞因子联合代表了炎性过程的主要介质之一它实际上刺激T-细胞产生IL-2和刺激B-细胞产生免疫球蛋白。它还在类风湿性关节炎和关节病的发病中有涉及实际上已经在类风湿性关节炎和/或骨关节病患者的滑液中发现了大量IL-1。它还在大量具有普遍皮肤性质的病理学情况如通常的皮炎、特应性皮炎和银屑病中具有活性。最后，它参与血管损害如静脉血栓形成的建立，并且存在于具有动脉/动脉硬化(arterioschlerotic)类型病理学情况的所有血管中。对于该细胞因子，受体拮抗剂目前已经用于临床(并且还处于实验中)，因为阻断该受体被证明是治疗其中IL-I是主角之一的这些病理学情况的有效方式。TNF:坏死因子是促讲急件全身炎件期的细胞因子集合的一部分。因此，TNF在极大量的过程如细胞增殖、分化和凋亡、癌发生和病毒复制中有涉及。它主要由巨噬细胞和一系列其它细胞类型、包括肥大细胞、淋巴样细胞、肌细胞和内皮细胞、成纤维细胞和神经细胞产生。其合成可以由细菌内毒素、其它细胞因子如IL-2、 干扰素和IL-I刺激并可以被类固醇抑制。通过作用于多种器官和系统(通常与其它细胞因子一起)，其参与多种发病过程的建立和调节-它调节许多蛋白质和重要细胞因子如IL-I和IL-6的表达，由此导致在皮肤病理学情况如白斑、湿疹、银屑病和通常的皮炎中有涉及；-它刺激滑膜细胞中胶原酶的合成，并且由于此原因，已经在患有关节病和类风湿性关节炎的患者的滑液中发现了大量TNF ；-它激活破骨细胞并因此诱导骨重吸收(骨质疏松症)；-它强烈吸引嗜中性粒细胞并帮助它们将自身附着在内皮细胞上以外渗；-它刺激具有氧化作用的分子的巨噬细胞产生；-它在参与形成静脉血栓形成、动脉硬化和脉管炎的发病的心循环系统的特定病理学情况中有涉及。TNF能够使其自身与在除红细胞以外的所有体细胞中表达的两种受体TNF-Rld 型TNF的受体)和TNF-R2 (2型TNF的受体)结合。简言之，TNF促进全身和皮肤二者的炎性应答，由此激发大量也具有自身免疫性质的病理学情况，例如类风湿性关节炎、节段性回肠炎、银屑病和哮喘。迄今为止，科学研究已经试图使抑制TNF合成和/或阻断其受体的 “生物”药物(例如单克隆抗体)完美。IL-2 这是一种高度促炎的致动脉粥样化的细胞因子，主要由T淋巴细胞产生，其合成被类固醇和环胞菌素抑制。IL-2在调节免疫应答中具有重要作用它实际上刺激外周白细胞中的IFN合成并诱导IL-I和TNF产生。IL-2还可以破坏血脑屏障和脑血管内皮的完整性，从而引起神经精神障碍如定向障碍和抑郁。因此，有大量已经与IL-2的异常产生相关的病理学情况，例如霍奇金淋巴瘤、多发性硬化、类风湿性关节炎和红斑狼疮。IL-6 由许多细胞类型、尤其是I. S.产生，它与TNF是炎性过程急性期的化学介质集合的最重要成员之一，因此在具有强炎性组分的病理学情况如哮喘(其中它参与炎性过程的出现和维持)、慢性肠炎(节段性回肠炎)、类风湿性关节炎和关节病中有涉及。实际上，正如以前所确定的那样，细胞因子如TNF、IL-1和IL-6已经证明在变性关节性骨关节病过程中有高度涉及，因为它们在调节金属蛋白酶(负责软骨降解)的表达、前列腺素的产生和破骨活化中起主要作用，并且由于此原因，在患有关节病和类风湿性关节炎(R.A.)的患者的滑液中已经记录到了高水平的细胞因子。这些发现已经刺激了上述白细胞介素的抑制剂和/或受体拮抗剂作为关节病病理学情况的新治疗策略的用途。最后，近期研究已经将癌症与寿命相联系，并揭示了一些肿瘤是如何受到患者的细胞因子蛋白质的类型/数量情况的影响的简言之，近期证据已经将IL-10的低产生特性和IL-6的高分泌与受肿瘤病理学情况侵害的患者的临床存活的恶化联系，而能够产生和维持高水平IL-10的基因型可以有利于存活(Caruso C.等人，Ann N. Y. Acad. SCI.，2004， 1028 :1-13)。ILzZ 主要由骨髓基质细胞产生的细胞因子，它也由胸腺和角质形成细胞分泌。 IL-7诱导炎性细胞因子如IL-l、IL-6和TNF的合成，由此参与一些皮肤疾病(例如银屑病和皮肤淋巴瘤)和骨关节系统的发病，实际上已经在患有R.A.的患者中发现了高水平的 IL-7。IL-12 这种蛋白质还在调节I. S.功能中起重要作用。实际上，它对淋巴细胞的分化起作用，它诱导干扰素和TNF的合成，并且其产生可以被IL-10抑制。该蛋白质的过度产生引起了具有自身免疫性质的疾病如结肠炎、关节炎、胰岛素依赖性糖尿病、脑脊髓炎、银屑病和多发性硬化的发病(Brahmachari S.等人，Minerva Med. ,2008,99(2) :105-118)。IL-10 主要由淋巴细胞产生，它是具有抗炎性质的细胞因子，能够抑制由T淋巴细胞产生的IL-2和干扰素的合成。IL-10的抗炎作用还通过在用细菌内毒素刺激的巨噬细胞中抑制IL-1、IL-6、IL-8、IL-12和TNF合成的能力而显示出来。IL-10缺乏与诸如糖尿病和慢性肠炎如节段性回肠炎的病理学情况相关。近期研究已经使得IL-10还作为治疗红斑狼疮的新治疗手段进行了实验。在患有诸如白斑、银屑病、湿疹和皮炎的病理性情况的患者的皮肤组织中已经观察到低的IL-10水平。应当指出在用于治疗炎症和器官排斥的常规免疫抑制治疗期间，皮质类固醇和环胞菌素均增加这种白介素的产生和/或从相关感受态细胞中的释方文(Zhou X.等人，Current Drug Targets-Immune, Endocrine & Metabolic Disorders，2005，5 065475)。实验数据还已经证明了在人滑膜细胞上其有效减少由TNF 体外所诱导的前列腺素和环加氧酶的释放，由此显示了 IL-10减轻牵涉受骨关节性变性 (osteoarthrosic degeneration)影响的关节的炎性过程的能力(Alaaeddine N.等人， Arthritis & liheumatism，1999，42 :710-718)。近期研究已经证实了其在支气管高反应性实验动物模型中对哮喘病理学情况的治疗功效，显示了该细胞因子是如何在减轻炎症(其表征哮喘患者的气道)中具有高治疗潜能的，其中已经在支气管清洗液中和/或在血清水平和/或组织水平上发现了高浓度的1顺、11^-1、11^-5、11^-6和IL-8 (Stankiewicz W.等人， Mediators of Inflammation，2002，11 :307-312)。对该白细胞介素而言，因此已经推定了维持免疫自稳的调节剂细胞因子的重要作用。哮喘可以是一种使人极度无力的疾病，世界上有大约2亿人患有该疾病，其中每年有超过5，000人死亡。它是一种基于I. S.对环境因素的扭曲应答、因而与用于肥大细胞和嗜酸细胞以及I. S.的其它类型细胞的生长和分化的促炎细胞因子的加剧产生相关的
5病理学情况。这种免疫系统活性失衡的原因仍然无法完全知晓，但是，存在遗传因素、环境因素、病毒因素和其它营养因素，它们以不同方式导致该病理学情况的发展。因此，发现一种用于其预防和/或治疗的、允许中止或减少类固醇使用(常规的治疗疗法)的有效治疗 (全身和/或局部治疗)可以代表用于更严重形式(因为其无论如何将能够减少类固醇的使用)和较不严重情况(因为可以完全中止类固醇治疗)的有效解决方案。发明详述本发明的目的是HAS作为细胞因子活性调节剂的新的和出人意料的局部用途，因为申请人已经发现了其调节特定细胞因子的活性的独特能力，它已经研究了其作用机制并揭示了现有技术状态中已知的各类硫酸化产品之间的主要差异，但最重要的是，申请人已经发现了对不同类型和品系的疱疹病毒、巨细胞病毒和水泡性口炎病毒的出乎意料的活性。最后，本发明的另一个目的涉及HAS作为具有普遍抗炎性质的药物的皮肤吸收促进剂、 作为纤维蛋白溶解剂以及作为高度水化剂(hydrating agent)用于所有以干燥、刺激和发红、炎症和脱皮为特征的皮肤病理学情况的治疗疗法的用途。按照EP 702699 Bl中所述的方法制备了适于本发明的目的的硫酸化透明质酸 硫酸化以HA为原料通过复合物S03_吡啶进行并涉及多糖链中存在的醇羟基，所述HA来自任意来源，例如通过从鸡冠花中经发酵或生物技术而提取，并且具有400-3X 106Da、 特别是 1 X IO4Da-I X IO6Da,甚至更特别是 10，000-50，OOODa, 150，000-250, OOODa 和 500，000-750, OOODa 的分子量。所获得的衍生物维持了未经改变的原料聚合物的所有物理特征，特别是原料HA 的分子量没有因硫酸化过程而降低，因而使得原料多糖的所有物理化学特征得以维持。硫酸化涉及二糖单元的各个羟基，因此能够通过改变现有技术状态中作为已知介绍的so3_吡啶的量来获得从0. 5至3. 5的不同的硫酸化度(指就每个二糖单元而言的硫酸基的数目)。在所有所进行的实验中使用的衍生物通常具有的硫酸化度为1或3，在下文中定义为HASl和HAS3。HA的所有游离羧基可以与有机和/或无机来源的阳离子成盐。两种硫酸化度的HAS均溶于水，它们还可以用本领域技术人员已知的常规技术进行灭菌，虽然采用高压灭菌器的灭菌是优选的。申请人:描述和要求保护了 HAS在制备用于局部应用的药剂中的新用途，所述药剂 用于预防和/或治疗与免疫缺陷和特别是IL-10缺乏相关的皮肤病理性情况， 例如白斑、湿疹、银屑病和通常的皮炎，刺激抗炎细胞因子的合成； 用于通过吸入来预防和/或局部治疗与IL-I、IL-6和TNF活化相关的哮喘； 用于预防和/或治疗与血管内皮和/或血管壁损害相关的皮肤病理学情况和随后的凝块和水肿形成，所述血管内皮和/或血管壁损害归因于例如创伤、表面性质和/或中等深度的血管出血； 用于预防和/或皮肤治疗与IL-1、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-12和TNF增加/ 活化相关的皮肤疾病，例如皮炎、特应性皮炎、银屑病、白斑、日光性皮炎、荨麻疹、所有的皮肤刺激(还包括齿龈的)和湿疹； 用于预防和/或治疗具有自身免疫性质的疾病，例如银屑病、哮喘以及系统性 (LES)和盘状红斑狼疮的皮肤表现；
用于预防和/或局部治疗皮肤瘤形成，例如基底细胞癌、卡波西肉瘤、鳞状细胞癌、皮肤淋巴瘤、蕈样真菌病(mycosis fungoides)和光化性角化病； 用于预防和/或局部治疗与TNF、IL-I和IL_6活化相关的血管病理学情况，例如脉管炎和硬皮病；申请人:实际上还已经在下文所述的实验中证实了 · HAS能够刺激新mRNA的产牛和具有抗炎件质的细胞因子(例如IL-10)的蛋白质合成，由此增加了细胞和因而整个生物体的免疫防御能力。上述细胞因子的抗炎作用通过抑制IL-1、IL-6、IL-8、IL-12和TNF合成的能力而显示出来，IL_1、IL_6、IL_8、IL-12和 TNF是在各种皮肤病理学情况中涉及的高度促炎蛋白质。 在其中未引起免疫应答的情况中和特别是其中细胞通过产生细胞因子级联来应答的炎性应激事件中，HAS在减少新mRNA的合成和显著减少IL_2、IL_7和IL-12的蛋白质合成方面是有效的尤其在这种情况中，所提供的数据显示了 HAS的较高作用。· HAS有效抑制了 TNF、IL-I和IL-6与其警体的结合。这些结果具有基础重要性，因为它们证明了硫酸化产品的行为与对上述促炎蛋白质的受体具有特异性的单克隆抗体的行为完全相似，因此，能够阻断它们的功能但同时不具有这种抗体特异性。这种受体阻断代表了拮抗TNF、IL-I和IL-6因子的促炎和肿瘤效应的最有效方式，从而开启了临床实验的新眼界，考虑到TNF、IL-I和IL-6在大量系统性和皮肤疾病的出现和进展中所起的作用，使得能够将治疗和/或预防极大量病理学情况的新治疗手段变得完美。申请人:还描述和要求保护了 HAS在制备用于局部应用的药剂中的新用途，所述药剂 用于预防和/或治疗唇单纯性疱疹和生殖器疱疹； 用于预防和/或治疗水泡性口炎病毒； 用于预防和/或治疗巨细胞病毒。申请人:实际上已经在下文所述的实验中证实了 HAS对不同类型病毒的强效抗病
毒作用 实验数据证明了 HASl和HAS3对1型和2型单纯疱疹病毒和对水泡性口炎病毒 (VSV)的抗病毒作用。第一种形式(极其广泛)负责通常影响面部皮肤(唇、鼻孔)的特征性发热小囊泡的出现它还称作唇单纯性疱疮。由唇疱疹引起的感染可以容易地再次出现，因为病毒在细胞内存活并且无法用有效的药物来确切清除。第二种形式是生殖器感染， 也称作生殖器疱疮。两种形式都通过身体或性接触而感染。由于病毒体位于神经节中，在神经节中它们可以长期保持休眠，所以疱疹感染具有与免疫系统的应激事件对应的复发特征并且通常在原发部位再次出现。水泡性口炎病毒是RNA-病毒，它攻击哺乳动物并在实验室中用于研究RNA-病毒生命周期的发展。HA-NSl与HASl之间的比较再次显示并非所有的硫酸化透明质酸都是等效的，因为已经证明HA-NSl完全没有活性，而HASl和3均显示出对单纯疱疹和对VSV的非常强的抗病毒活性。所测试的样品中没有一者被证明对宿主细胞具有细胞毒性，实际上，所得的最低细胞毒性浓度等于在临床实践中通常用于治疗疱疹的参比药物的最低细胞毒性浓度，并且在平均水平上已经证明比在抑制病毒复制中被揭示具有活性的那些高100倍。 对HASl和HAS3获得的实验数据已经揭示了清楚的和显著的对巨细胞病毒的抗病毒结果这是一种特殊类型的病毒，其进入我们生物体的一些类型的细胞中，在那里它寄生性地自我复制，导致它们死亡。它与唇疱疹和生殖器疱疹、水痘和传染性单核细胞增多属于同一科。上皮细胞、粘膜、淋巴结是多发性原发感染的部位。它终生以潜伏态保留在外周血、肾小管上皮和唾液腺上皮中。在免疫受损的患者(例如受AIDS侵害的那些以及处于免疫抑制疗法中的移植患者)中发现了严重形式。治疗疗法在于施用药物如更昔洛韦、缬更昔洛韦和膦甲酸(病毒DNA合成抑制剂)。同样在这种情况中，已经证明HA-NSl在抑制病毒增殖方面是无活性的，由此证实了两种类型的硫酸化产品之间抗病毒能力的绝对多样性。本发明的另一个目的涉及HAS作为纤维蛋白溶解剂用于降解纤维蛋白凝块的用途，纤维蛋白凝块在毛细血管和/或小血管的内皮和/或壁由于中/小实体的机械创伤和 /或出血而破损后在皮肤水平(表面和/或深部)上形成。在下述实验中，申请人实际上已经证明了 · HAS在凝块和血栓的纤维蛋白溶解/清创术中与纤溶酶一样有效。纤溶酶是一种重要的塵，其属于能够降解许多血浆蛋白质、特别是血栓和凝块中的纤维蛋白的水解酶集合。纤维蛋白的降解称作纤维蛋白溶解。纤溶酶缺乏可导致血栓形成，因为血栓未足够地降解。应当沣意抗凝过稈与纤维蛋白溶解过稈之间的巨大差异在前一种情况中，抗凝剂必须防止凝结物形成，在后一种情况中，纤维蛋白溶解剂在另一方面必须介入凝结物已经存在并且因此必须降解以使其完全消除的情况。本发明的另一个目的涉及HAS作为药物、例如具有抗炎性质的药物的皮肤吸收促进剂以及最后作为高度水化剂用于所有以干燥、苔癣化、刺激、瘙痒和发红、炎症和脱皮为特征的皮肤病理学情况的治疗疗法的新用途。申请人:实际上已经证明了 透明质酸的硫酸化显著增加了皮肤吸收，因此，· HAS的水化能力已经被证明显著高于未硫酸化HA的水化能力，因此就HA和局部用对照制剂而言使得经处置皮肤表面的粗糙度显著减轻，由此揭示了其有效治疗和保护以干燥、刺激、苔癣化、瘙痒和发红、炎症和脱皮为特征的皮肤表面以及所有其它使皮肤对外部物质更加敏感的皮肤病理学情况的能力。· HAS是强有力的和有效的药物皮肤吸收促进剂。HAS如此有效地穿透皮肤厚度的能力是这种令人惊奇的和出人意料的新性质得以建立的科学基础，这使得能够将其含有具有不同性质的药理学物质如非类固醇抗炎类型(特别是双氯芬酸、酮洛芬和布洛芬)或类固醇类型、激素、血管扩张剂、胆碱能药、抗生素等的制剂配制成各种形式，优选凝胶剂、 霜剂或贴剂，用于皮肤和/或透皮吸收。最后，申请人描述了含有作为唯一活性成分的或与其它药理学和/生物学活性剂如类固醇、激素、蛋白质、营养因子、维生素、非类固醇抗炎药(FANS)如双氯芬酸、酮洛芬或布洛芬或其盐、局部用化疗药、抗生素、抗病毒药、局部麻醉药、抗凝血药和/或纤维蛋白溶解剂和/或酶如胶原酶和/或透明质酸酶和/或其它蛋白酶联合的HAS的各种局部药物制剂/组合物的制备；其可以用聚合物如透明质酸及其衍生物、羧甲基纤维素(CMC)和/或其它天然(例如胶原蛋白)或合成性质的聚合物来配制。所述药物组合物可以配制成软膏剂、脂质体凝胶剂(Iipogel)、水凝胶、唇膏、霜剂、阴道珠和探条、泡沫剂、粘膜凝胶剂、眼用制剂、阴道灌洗液、漱口液、用于皮肤和/或透皮吸收的贴剂(尤其是FANS和激素的)、溶液剂，因此可以通过局部应用或通过吸入施用它来治疗呼吸系统病理学情况如哮喘。特别关注在用于治疗皮肤血肿的药剂的配方中含有酶如透明质酸酶的组合物以及含有非类固醇抗炎药或激素的那些，它们是凝胶剂、霜剂和用于药物皮肤和/或透皮吸收的贴剂。纯粹为了描述和非限制性的目的，提供了 1度和3度HAS的制备和含有其的药物制剂的一些实施例以及通过体外实验获得的结果。实施例1平均分子量等于200KD(范围为150, 000至250, OOODa)的诱明质酸(HA)的四丁某铵盐的制各将5. OOg发酵来源的透明质酸钠盐O00KD)溶于250ml水中，将所得溶液渗滤通过预填充有IOOcm3四丁基铵(TBA)形式的Dowex树脂的玻璃柱。收集HA-TBA盐的洗脱溶液并冷冻干燥。得到7. 50g产物。实施例2以平均分子量为200KD和硫等干毎个 单元3个硫酸某的HA为原料合成硫酸化HA方法A将10. Og按照实施例1制备的平均分子量为200KD的透明质酸的TBA盐溶于300ml 二甲亚砜(DMSO)中；将沈· Og复合物S03_吡啶(三氧化硫和吡啶，下文缩写为PySO3)分散于150ml DMSO中，然后加入到HA的溶液中。于21°C机械搅拌20小时后，通过添加0. 1体积的水中止反应；通过在添加2体积乙醇后沉淀分离粗反应产物。将所得固体分散于150ml 水中，用NaOH IM使pH呈中性。通过截断值为12-14，OOODa的膜使混合物中的水彻底透析出。将经透析的产物冷冻干燥。得到9. 7g硫酸化度等于每个重复单元3个硫酸基的产物 (收率=88% )。方法B将32. Og按照实施例1制备的平均分子量为200KD的透明质酸的TBA盐溶于900ml N-甲基-吡咯烷酮(NMP)中；将IOOg PySO3分散于600mlNMP中，然后加入到HA的溶液中。 于21 士 1°C机械搅拌20小时后，通过添加0. 5体积的水中止反应；pH开始低于2. 5，通过添加NaOH(溶液)使pH呈中性。通过添加2. 5体积甲醇沉淀分离反应粗产物，用2体积的甲醇/水混合物8/2洗涤。将固体再次溶解，采用截断值为12-14，OOODa的膜使水彻底透析出。得到30. 4g硫酸化度等于每个重复单元3个硫酸基的产物(收率=86% )。实施例3以平均分子量为200KD和硫酸化度等于每个重复单元1个硫酸基的HA为原料合成硫酸化HA采用实施例1中所述的操作，制备10. Og HA的TBA盐，将其溶于350mlDMS0中。将 10. Og复合物PySO3分散于100ml DMSO中，然后加入到HA的溶液中。于21 °C机械搅拌20小时后，通过添加0. 1体积的水中止反应；通过在添加2. 5体积乙醇后沉淀分离粗反应产物。 将所得固体分散于150ml水中，用lmoles/1 NaOH使pH呈中性。通过截断值为12-14，OOODa的膜使混合物中的水彻底透析出。将经透析的产物冷冻干燥。得到7. Mg硫酸化度等于每个重复单元1. 0个硫酸基的产物(收率=93% )。实施例4以具有低分子量(平均MW为IOKD,范围为5, 000至30, OOODa)和硫酸化度等于每个 单元3个硫_某的HA力原料合成硫HA采用实施例1中所述的操作，制备12. 4g低分子量HA的TBA盐，将其溶于300ml NMP中。将40g PySO3分散于100ml NMP中，然后加入到HA的溶液中。于21°C机械搅拌20 小时后，通过添加0.5体积的水中止反应。pH开始低于2. 5，通过添加4M NaOH使pH呈中性。通过添加2.5体积甲醇沉淀分离反应粗产物，用2体积的甲醇/水混合物8/2洗涤。将固体再次溶解，采用截断值为3，500Da的膜使水彻底透析出。得到12. Og硫酸化度等于每个重复单元3. 0个硫酸基的产物(收率=85% )。实施例5■棚好影口蘭仆庶軒■ 前标1赖醜白句HA力臓☆成細化HA采用实施例1中所述的操作，将12. 4g HA的TBA盐溶于300ml DMSO中。将16. Og PySO3分散于100ml DMSO中，然后加入到HA的溶液中。于21°C机械搅拌20小时后，通过添加0. 1体积的水中止反应；通过在添加2. 5体积乙醇后沉淀分离反应粗产物。将所得固体分散于150ml水中，用lmoles/1 NaOH使pH呈中性。通过截断值为3，500Da的膜使混合物中的水彻底透析出。将经透析的产物冷冻干燥。得到9.0 硫酸化度等于每个重复单元 1. 0个硫酸基的产物(收率=90% )。实施例6以分子量为500-730KD和硫酸化度等于每个重复单元3个硫酸基的HA为原料合成硫酸化HA将21. Og提取来源的透明质酸钠盐(500-730KD)溶于1. 5升水中，将所得溶液渗滤通过预填充有450cm3TBA形式的Dowex树脂的玻璃柱。收集HA-TBA盐的洗脱溶液并冷冻干燥。得到32. Og产物，将其溶于1. 35升NMP中；将IOOg PySO3分散于650ml NMP中，然后加入到HA的溶液中。于23士 1°C机械搅拌20小时后，通过添加0. 5体积的水中止反应。 PH开始低于2. 5，通过添加NaOH(浓度为4moles/l的溶液)使pH呈中性。通过添加2. 5 体积甲醇沉淀分离反应粗产物，用3. 5体积的甲醇/水混合物8/2洗涤。将固体再次溶解， 采用截断值为12-14，OOODa的膜使水彻底透析出。得到30. 3g硫酸化度等于每个重复单元 3个硫酸基的产物(收率=83% )。实施例7以分子量为500-730KD和硫酸化度等于每个重复单元1个硫酸基的HA为原料合成硫酸化HA将21. Og提取来源的透明质酸钠盐(500-730KD)溶于1. 5升水中，将所得溶液渗滤通过预填充有450cm3TBA形式的Dowex树脂的玻璃柱。收集HA-TBA盐的洗脱溶液并冷冻干燥。得到32. Og产物，将其溶于1. 65升NMP中；将40g PySO3分散于350ml NMP中，然后加入到HA的溶液中。于25士 1°C机械搅拌20小时后，通过添加0. 5体积的水中止反应。 PH开始低于2. 5，通过添加NaOH(浓度为4moles/l的溶液)使pH呈中性。通过添加3. 5体积甲醇沉淀分离反应粗产物，用3. 5体积的甲醇/水混合物8/2洗涤。将固体再次溶解， 采用截断值为12-14，OOODa的膜使水彻底透析出。得到22. 5g硫酸化度等于每个重复单元 1. 0个硫酸基的产物(收率=87% )。实施例81度和3度HAS对IL-10和IL-12基因表汰的调节作用的评价以20，000个细胞/孔的浓度将以前在体外扩展并于37°C用含有10% FCS的DMEM 介质维持在培养物中的人滑膜细胞进行接种(滑膜细胞是能够产生不同类型细胞因子的细胞，因此通常用于这种类型的实验测试)。然后将如实施例1-3中所述制备的1度硫酸化 HA (HASl)和3度硫酸化HA (HAS3)以0. 1和0. 5mg/ml的浓度(对两种样品而言)加入到培养介质中，而对照处理通过平均分子量(MW)为200KD的未硫酸化HA表示。处理3天后，进行实时PCR来评价IL-10和IL-12的基因表达采用“Trizol ”方法按照供应商(TRIZ0L试剂，LIFE Techonologies,GIBCO BRL)的指示提取细胞RNA。简言之，通过添加1. Oml Trizol 裂解细胞，通过测定其在260nm的吸光度对总RNA进行定量。采用软件ft~imer3 (Roche Molecular Diagnostics,Pleasanton,CA,USA)针对每种待扩增的基因选择适当的引物。通过采用 Rotor-gene TM5500 (Corbett research，Sydney，澳大利亚)进行的实时 PCR评价了基因表达。采用引物在 300nm 和 SYBR Green (Invitroge, Carlsbad, CA, USA)以在 95°C 15 秒和在60°C 1分钟后的40个循环进行了 PCR反应。通过软件自动测定了“荧光阈值(Ct) ” 的值，评价了 92-110%的所研究基因的扩增系数。对每种cDNA样品而言，基因表达值以管家基因(即代表对照基因的肌动蛋白的基因，因为它存在于每个细胞中并且不受HAS 的影响)的ct与所关注基因(即IL-10和IL-12的基因)的ct的比表示，因此，管家基因 ct/基因ct倌表示在纵坐标轴上，其因此表示所研究的基因表达的mRNA的量。所得结果显示在

图1和2中ai 用HASl和HAS3处理人滑膜细胞导致细胞因子IL-10的基因表达相对于用未硫酸化HA处理的对照而言显著增加。图 2 仍然是在本实验中，HAS的两种硫酸化度(1度和3度)被证明能够显著减少IL-12 的基因表达，相对于用未硫酸化HA处理的对照而言使其mRNA合成减半。因此，硫酸化透明质酸被证明 对以前所述的其中IL-10被证明对疾病(如哮喘、白斑和其中牵涉IL-10的所有炎症)的解决和/或改善具有基础重要性的那些病理学情况而言，能够刺激用于合成抗炎细胞因子的新mRNA产生，因而增加细胞和由此整个生物体的防御能力。眷有效减少高度促炎细胞因子IL-12的新mRNA合成，证明是能够干预在使人无力的疾病如银屑病和所有以前描述的那些的发病中有牵涉的蛋白质的表达的有效抗炎剂。实施例9TNF与其在单核细胞系中表达的受体结合的抑制不同丽倌的1度和3度HAS的功效评价进行这些实验以评价测试样品(按照实施例1-4制得)在抑制TNF与其通过通常在体外用于该类型实验的I. S.细胞表达的受体结合的能力方面的功效，该实验采用碘化细胞因子组分进行以便在放射性配体结合分析中进行评价。
11
如Baglioni C.等人，J Biol Chem，1985，260 :13395-13397 中所述进行了实验操作。简言之，使用淋巴瘤U937的人组织细胞系，其特征是对TNF的细胞毒活性敏感和表达其相关受体的单核细胞。最初将细胞与125I-TNFO. 028nM(携带在水中)、同时与待分析样品(lmg/ml的浓度，该浓度被证明是引起最大抑制的最低浓度)一起在温育缓冲液中于 4°C温育3小时，所述温育缓冲液由50mM Tris-HCL pH 7. 4,0. 5mM EDTA组成。在温育结束时，将细胞与酞酸二丁酯/酞酸二壬酯2/1—起离心，将所得沉淀物在 Y-计数器中进行计数。所得结果显示在图3中所得结果显示了对1度和3度二者而言具有中和低丽的HAS在完全(100% )抑制TNF与其受体结合方面的功效。这些结果具有基础重要性，因为它们证明了硫酸化产物的行为与对TNF受体具有特异性的单克隆抗体完全相似，因此能够阻断其功能。这种受体阻断因此代表了拮抗TNF因子的促炎和肿瘤效应的最有效方式。实施例10
_4] 细胞,因子IL-I在成纤维细胞,系中表汰的等体结合的抑制不同MW倌的3度 HAS的功效评价进行这些实验以评价测试样品(按照实施例1-3和4制得)在抑制IL-I与其通过通常在体外用于该类型实验的小鼠3T3细胞表达的受体结合的能力方面的功效，该实验采用碘化细胞因子组分进行以便在放射性配体结合分析中进行评价。如Chin J等人，J Exp Med, 1987，165 :70-86中所述进行实验操作。简言之，使用鼠成纤维细胞3T3细胞系，它对IL-I的细胞毒活性敏感并表达其相关受体。最初将细胞与125I-IL-IlOpM(携带在水中)、同时与待分析样品(lmg/ml的浓度， 该浓度被证明是引起最大抑制的最低浓度)一起在温育缓冲液中于37°C温育2小时，所述温育缓冲液由含有20mM HEPESpH 7. 2和BSA的RPMI 1640组成。在温育结束时，将细胞用磷酸盐缓冲液洗涤，然后溶于2. 5M NaOH中，在Y -计数器中进行计数。所得结果显示在图4中所得结果显示了 HAS(具有中和低MW)在以30%抑制IL-I与其受体结合方面的功效。这些结果是极其重要的，因为它们证明了硫酸化产物的行为与对所讨论细胞因子的受体具有特异性的单克隆抗体完全相似，因此能够阻断其功能。这种受体阻断代表了拮抗 IL-I的促炎和肿瘤效应的最有效方式，如前文所述的那样。实施例11细朐,因子IL-6不同丽倌的3 it HAS
的功效评价进行这些实验以评价测试样品(按照实施例1-3和4制得)在抑制IL-6与其在通常在体外用于该类型实验的人骨髓瘤U266中表达的受体结合的能力方面的功效，该实验采用碘化细胞因子组分进行以便在放射性配体结合分析中进行评价。如Taga T.等人，J Exp Med, 1987，166 :967-981 中所述进行实验操作。简言之，使用人骨髓瘤U266细胞系，它对IL-6的细胞毒活性敏感并表达其相关受体。最初将细胞与125I-IL-60.08nM(携带在水中)、同时与待分析样品(lmg/ml的浓度，该浓度被证明是引起最大抑制的最低浓度)一起在温育缓冲液中于4°C温育16小时，所述温育缓冲液由含有25mM HEPESpH 7. 1和10% BSA的RPMI 1640组成。在温育结束时，将细胞用磷酸盐缓冲液洗涤，于9，OOOrpm离心，将沉淀物在Y -计数器中进行计数。所得结果显示在图5中所得结果显示了具有中和低MW的HAS在完全(100%)抑制IL-6与其受体结合方面的功效。这些结果因此证明了硫酸化产物的行为在这种情况中也是与对所讨论细胞因子的受体具有特异性的单克隆抗体完全相似的，因此能够阻断其功能。这种受体阻断代表了拮抗IL-6的促炎效应的最有效方式。实施例12在人PBMC中1度和3度HAS对细胞因子IL_2、IL_7、IL-10和IL-12的蛋白质合成的抑制作用评价对这些实验而言，采用来自各供体的人外周血单核细胞(PBMC)用于评价HAS对上文所列细胞因子产生的作用，使用了 -未硫酸化HA (平均 MW :200KD)；-HASl和HAS3 (如实施例1-3中所述制得)。采用产品Ficoll-Paque PLUS(GE Healthcare)并按照供应商指示的方案进行了 PBMC 分离(BeyumA.，Scand J Clin Lab Invest 21 Suppl，1968，97 :77-89)。在第 0 天，将100，000个细胞在每孔200 μ 1培养基RPMI 1640中铺板(使用96孔板)，所述培养基中已经加入了 10%胎牛血清、HEPES 10mM、谷氨酰胺2mM、1 %青霉素-链霉素100U/ml。 在未经处理或用脂多糖LPS (10 μ g/ml)(高度促炎)或用植物凝集素PHA (10 μ g/ml)(能够刺激淋巴细胞自身分裂的物质)刺激的PBMC上评估了所有样品的作用，上述两种试剂均能够刺激细胞因子合成。将细胞单独地用三种化合物以0. lmg/ml或lmg/ml的浓度处理。于 370C (5% CO2)温育24小时后，从各孔取100 μ 1上清液以分析IL-2、IL-7、IL-10和IL-12 的产生。通过技术、采用Custom Human 9-Plex Array培养板按照供应商
在技术卡片中指示的方案对炎症介质进行定量。所得结果显示在图6-9中这些图清楚地显示当未刺激细胞时和当与之相反通过特异性的和强有力的炎性因子和/或有丝分裂原刺激它们时，1度和3度HAS能够显著减少IL-2、IL-7和IL-12就单核细胞而言的合成。因此，HAS被证明是具有精确药理学特征的分子，在其中免疫应答未受刺激的情况中和特别是其中免疫细胞通过产生细胞因子级联进行应答的炎性应激事件中能够调控/调节具有显著抗炎活性的细胞因子的合成，尤其是，在这种情况中，所呈现的数据显示了较强的HAS调控作用。另一方面，图9证实了用于IL-10产生的明显刺激物也是用于属于免疫系统的细胞的。因此，再次证实HAS能够调控细胞因子合成、刺激抗炎细胞因子和抑制促炎细胞因子的合成。实施例131度和3度HAS相对于HA-NS的抗病毒作用的评价1型单纯疱疮病毒、2型单纯疱疮病毒、水疱性口炎病毒
通过在来自肌肉/皮肤胚胎组织成纤维细胞中评价1型单纯疱疹病毒 (HSV-1 :K0S,F和McIntyre品系)和2型单纯疱疹病毒(HSV-2 =G, 196和Lyons品系)所导致的致细胞病性的抑制测定了所测试样品的活性。而且，相对于受水泡性口炎病毒(水疱性口炎病毒VSV)感染的&SM细胞再次测试了抗病毒活性。HSV-I是优先感染口腔粘膜的病毒，而 HSV-2 攻击生殖器粘膜。如 Baba M.等人，ANTIMICROB. AGENTS CHEMOTHER.，1988， 32 :1742-1745中所述进行了实验操作。简言之，使汇合的细胞培养物在样品HS-NSl (EP0971961)、如实施例1_3中所述制备的HASl和HAS3的存在下与感染剂量的上文列出的病毒接触。于37°C温育1小时后，将培养介质用仅含有待测试样品的新鲜介质替换。在温育的第2天测试病毒的致细胞病性。通过测定“受感染”细胞中DNA和RNA合成的抑制评价了病毒致细胞病原性的抑制的测定，接受如上文所述的处置将细胞接种在微孔中含有不同浓度的待测试样品和2. 5 μ Ci 3Η-胸苷和3Η-尿苷/ml的培养基中。于37°C 1 后，将细胞用三氯乙酸处理，在乙醇中洗涤，放置干燥，在7. 5ml闪烁液中进行计数。测试样品的抗病毒活性表示为50%抑制病毒致细胞病性所需的最低浓度_。而且，还为了评价测试样品的细胞毒性，测定了对所用细胞导致形态损害(可用光学显微镜观察到)所必需的最低浓度。相对于硫酸葡聚糖(DS)和药物阿昔洛韦(两种分子均具有已知的抗病毒功效，因此用作阳性对照)进行了比较。所得结果显示在图10中实验数据证实了 HASl和HAS3 二者的强有力的抗病毒作用HA_NS1与HASl之间的比较显示并非所有的硫酸化透明质酸都是等效的，因为HA-NSl未被证明具有活性，并且， 这种功效上的差异不依赖于透明质酸的分子量或硫酸化度，因此它取决于HA-NSl相对于 HASl的确切结构。实际上，HAS显示出与硫酸葡聚糖的功效相等并与用于治疗单纯疱疹的参比药物阿昔洛韦的功效相当的功效。而且，应当指出，阿昔洛韦对VSV而言是无活性的， 而1度和3度HAS对VSV具有非常强有力的抗病毒活性。所有测试样品对宿主细胞均无细胞毒性，所得的最低细胞毒性浓度实际上等于在临床实践中通常用于治疗疱疹的参比药物的最低细胞毒性浓度，并且被证明在病毒复制的抑制中比证明具有活性的那些平均高100倍。巨细胞病毒通过采用上述方案评价巨细胞病毒(CMV :AD-169和Davis品系)测定的致细胞病性的抑制测定了测试样品的活性。相对于HEL细胞(肺胚细胞)测试了抗病毒活性，其表示为50%抑制上述病毒形成的噬斑数所需的浓度。所得结果显示在图11中:表格显示了 HASl和HAS3获得的清楚和显著的阳性结果，这再次证实它们是有效的抗病毒剂。而且，在这种情况中，HA-NSl未被证明在抑制病毒增殖中具有活性，这证实了两种类型的1度硫酸化产物之间在抗病毒能力方面的绝对多样性。实施例14具有不同MW倌的酸度为3的HAS的纤维蛋白溶解特性的体外评价将接受测试的产品的纤维蛋白溶解性质的评价与纤溶酶的已知纤维蛋白溶解活性进行比较。具体而言，评价了纤维蛋白网状结构的溶出速率和可溶性纤维蛋白降解产物 (FDP)的形成。
所用血浆样品来自无任何进行中的药理学治疗的健康受试者的全血。为了测试接受测试的产品的纤维蛋白溶解功效，将血样分配入各测试管中，在各测试管中诱导了血块形成。然后在添加如下物质后评价了 FDP的形成 纤溶酶，作为对照治疗 按照实施例1和2制备的HAS3 按照实施例4制备的HAS3实验研究将新鲜取出的血样分配入各测试管中，各测试管以9 1的比例含有柠檬酸钠。立即将测试管以3，OOOrpm离心5分钟。将所得血浆转入新的测试管中，立即用于进行FDP评价。将预热至37°C的凝血酶(300mU/ml)加入到血浆样品中，作为诱导血块形成的纤维蛋白原的活化剂。将下列成分加入到含有纤维蛋白凝块的不同比色杯中-纤溶酶溶液0. 5mU、5mU、50mU、500mU 和 IU-浓度为 25mg/ml、50mg/ml、100mg/ml、150mg/ml 和 200mg/ml 的 HAS3 溶液。通过分光光度计评价每个比色杯在405nm的60秒的吸光度变化。使反应继续进
行直至凝块完全溶解。将凝固的血浆、纤溶酶溶液和HAS3 200KD和HAS3 20KD溶液以1 lv/v的比例混合，于37°C的操作温度下维持。表1.纤溶酶的纤维蛋白溶解活性表格显示了在已经加入了不同浓度纤溶酶的含有凝固血浆的比色杯中记录的 mAbs/min均值。所示的值显示了纤维蛋白凝块溶解的速率，因而显示了产生FDI3s的速率。 纤溶酶的纤维蛋白溶解活性与其浓度成正比。随后将针对每个纤溶酶浓度记录的mAbs/min均值对各自的酶单位作图，以建立将mAbs/min值与酶单位关联的数学函数。纤溶酶纤维蛋白溶解活性(mAbs/min)
IU500mU50mU5mU0. 5mU190178126681表2.不同丽值的HAS3的纤维蛋白溶解活性计算在已经加入了不同浓度HAS3的含有凝固血浆的比色杯中记录的mAbs/min 值。该值显示了纤维蛋白凝块溶解的速率，因而显示了产生FDR的速率。HAS3的纤维蛋白溶解活性与其浓度成正比。在表格中，HAS3的纤维蛋白溶解活性表示为纤溶酶的单位当量。HAS3 (200KD)纤维蛋白溶解活性(以mU纤溶酶当量表示)
200mg/ml150mg/ml100mg/ml50mg/ml25mg/ml
权利要求
1.用于局部应用来预防和/或治疗炎性/刺激性皮肤疾病如皮炎、特应性皮炎、日光性皮炎、荨麻疹、白斑、湿疹、银屑病、所有与促炎细胞因子如IL-1、IL-2、IL-6、IL_7、IL-8、 IL-12和TNF活化相关的皮肤刺激的硫酸化透明质酸。
2.用于局部应用来作为水化剂用于以干燥、苔癣化、刺激、瘙痒和发红、炎症和脱皮为特征的皮肤病理学情况的治疗疗法的硫酸化透明质酸。
3.用于局部应用来预防和/或治疗与血管内皮和/或血管壁损害相关的皮肤病理学情况和用于治疗在皮肤水平上形成的纤维蛋白凝块和血栓的硫酸化透明质酸。
4.用于局部应用来作为药理学和/或生物学活性剂的皮肤吸收促进剂的硫酸化透明质酸。
5.用于局部应用来预防和/或治疗唇单纯性疱疹和生殖器疱疹、水泡性口炎病毒和巨细胞病毒的硫酸化透明质酸。
6.用于局部应用来预防和/或治疗与IL-10的免疫防御缺乏相关的皮肤病理学情况如白斑、湿疹、银屑病和皮炎、刺激抗炎细胞因子合成的硫酸化透明质酸。
7.用于局部应用来通过吸入预防和/或治疗与IL-1、IL-6和TNF活化相关的哮喘的硫酸化透明质酸。
8.用于局部应用来预防和/或治疗具有自身免疫性质的疾病如银屑病、哮喘以及系统性和盘状红斑狼疮的皮肤表现的硫酸化透明质酸。
9.用于局部应用来预防和/或治疗皮肤瘤形成的硫酸化透明质酸。
10.用于局部应用的药物组合物，其含有可能与药理学和/或生物学活性剂联合的上述权利要求的硫酸化透明质酸。
11.上述权利要求10的药物组合物，含有类固醇、激素、蛋白质、营养因子、维生素、非类固醇抗炎药、局部用化疗药、抗生素、抗病毒药、局部麻醉药、抗凝血药和/或纤维蛋白溶解剂、酶和/或其它蛋白酶。
12.权利要求11的药物组合物，含有透明质酸酶。
13.权利要求12的药物组合物，含有聚合物如透明质酸及其衍生物、羧甲基纤维素和/ 或天然或合成来源的其它聚合物。
14.权利要求10-13的药物组合物，其为软膏剂、脂质体凝胶剂、水凝胶、唇膏、霜剂、贴剂、阴道珠和探条、泡沫剂、粘膜凝胶剂、眼用制剂、阴道灌洗液、漱口剂、用于局部应用或吸入的溶液剂的形式。
15.权利要求14的药物组合物，含有作为药物的皮肤吸收促进剂的硫酸化透明质酸， 为软膏剂、脂质体凝胶剂、水凝胶、唇膏、霜剂、贴剂、阴道珠和探条、泡沫剂、粘膜凝胶剂、眼用制剂、阴道灌洗液、漱口剂、溶液剂的形式。
16.权利要求15的药物组合物，为含有硫酸化透明质酸与非类固醇抗炎药的贴剂形式。
17.权利要求16的药物组合物，含有双氯芬酸。
全文摘要
本发明的目的涉及硫酸化透明质酸(HAS)作为细胞因子活性(促炎和抗炎)调节剂的新的和出人意料的用途以及因此涉及HAS在制备用于局部应用来预防和治疗与具有促炎和抗炎性质的细胞因子的活化和/或缺乏相关的病理学情况的新药剂的用途。申请人实际上已经发现了HAS调节这些特定蛋白质的活性的独特能力，它已经研究了其作用机制并证明了现有技术状态中已知的不同硫酸化类型之间的主要差异，但最重要的是，它已经证明了HAS对不同类型和品系的疱疹病毒、巨细胞病毒和水泡性口炎病毒的出乎意料高的活性。最后，本发明的另一个目的涉及HAS作为具有抗炎性质的药物的皮肤吸收促进剂的用途。
文档编号A61K45/06GK102427808SQ201080020708
公开日2012年4月25日 申请日期2010年5月14日 优先权日2009年5月14日
发明者G·盖恩纳里, M·戴斯特 申请人:菲迪雅制药股份公司