用于促进细胞-介导的免疫应答的方法和组合物的制作方法

专利名称：用于促进细胞-介导的免疫应答的方法和组合物的制作方法
技术领域：
本申请概括地涉及用于将外源蛋白递送至细胞的胞质溶胶的组合物及其方法。相关申请的交叉引用本申请在35U.S.C. § 119(e)下要求2009年6月12日提交的美国临时申请 61/186,440的利益，其整个内容通过引用并入本文。
背景技术：
疫苗疫苗接种是施用抗原物质(疫苗)以产生对疾病的免疫。疫苗可以用于预防(即预防性使用)或改善(即治疗性使用)病状的效应，例如病原体的感染。疫苗接种被认为是最有效的且节省成本的预防感染性疾病的方法。作为免疫原施用的物质通常是病原体 (细菌或病毒)的活的、但是减弱的或减毒的形式，这些病原体的杀死的或灭活的形式，或纯化的物质诸如蛋白。在初次施用以后以及在将来遇到病原体时，抗原物质(也称作免疫原)会在动物中刺激针对各种病原体的应答，从而在将来暴露时提供针对病原体感染的保护。天花是通过人们尝试通过故意给他们自己接种其它类型的传染物来进行预防的第一种疾病。例如， 在1769年，英国医师Edward Jenner使用牛痘疫苗作为人天花的免疫。但是，并非所有疫苗和免疫原自身会同样有效地刺激有效的免疫应答。例如，已经报道可得到的针对结核(TB)、链球菌性肺炎(SP)、麻疹病毒Edmoston-hgreb菌株(EZMV)、 脑膜炎球菌、流感病毒的血凝素(HA)和乙型肝炎病毒的疫苗的差免疫原性。此外，有些疫苗需要长期疫苗接种方案才能成功地诱导免疫。例如，针对炭疽芽孢杆菌的最初基础疫苗接种需要6次给药在零时、2周时和4周时分3次皮下注射在三角肌中，在6个月时、12个月时和18个月时进行3次疫苗接种，然后每年增强。对于延长的保护，需要每年增强。引起有些疫苗的差免疫原性的一个原因是，有些免疫原不能进入胞质溶胶和主要组织相容性复合物途径中，也就不能刺激细胞-介导的免疫应答。许多细菌毒素含有能够接近宿主细胞胞质溶胶的结构域，它们可以在所述胞质溶胶处发挥它们的作用。尽管每种毒素的进入胞质溶胶的机理或途径可能不同，总的效应是“分子注射器”效应，其能够将毒蛋白注射进细胞中。几种细菌毒素(包括白喉毒素(DT)、假单胞菌外毒素A(PE)、百日咳毒素和百日咳腺苷酸环化酶)已经被用于尝试将肽表位(作为内部或氨基端融合体)递送给细胞胞质溶胶。这些系统的应用限于作为潜在的疫苗，因为它们的递送更大蛋白抗原的能力受到限制，许多个体已经针对载体毒素进行了免疫。尽管肽能够刺激细胞的免疫应答，由于2个原因，整个蛋白抗原可以更好地适用于有效的疫苗中。首先，可以证实，在一个遗传背景中保护所必需的表位在不同的遗传背景中是无关的。因此，有益地，广泛应用的T细胞疫苗使用各种相关表位的来源全长蛋白。其次，由细胞毒性的T淋巴细胞识别的肽通过专门的降解机制(包括蛋白酶体复合物)从整个蛋白进行加工。在某些情况下，有关的肽表位的加工依赖于侧接氨基酸序列。但是，侧接残基不总是对于适当加工而言是重要的。因为目前不可能准确地预测哪些表位的适当加工依赖于它们的背景，重要的是，递送整个抗原给细胞胞质溶胶，以进行最佳加工和呈递。因此，需要具有更高免疫原性的新疫苗/免疫原(例如由整个多肽或其更大部分组成的免疫原)和/或用于将疫苗/免疫原导入细胞中以引起免疫应答的新颖策略。佐剂经常通过在佐剂中施用疫苗来增加疫苗的有效性。针对恶性肿瘤和针对几种传染性病原体的有效免疫应答是由T细胞介导。具体地，T辅助细胞表位对于高效价的抗原特异性的IgG抗体的诱导而言是必要的。佐剂或免疫刺激剂可以用于增强体液免疫或细胞免疫或二者。结果，标准疫苗需要更少的重组抗原，或低应答者有效地应答，无需增加抗原剂量。佐剂的主要目的是，增强对特定目标抗原的免疫应答。在用于研究目的的抗体生产背景下，佐剂会刺激具有高亲合力的高效价抗体的快速且持续的生产。这允许容易地回收抗体，用于其它体外研究。佐剂具有影响细胞-介导的免疫的效价、应答持续时间、同种型、亲合力和某些性质的能力。许多自身是弱免疫原性的抗原需要使用佐剂。佐剂可以通过3个基础机理来增加对特定目标抗原的免疫应答。第一个机理是， 通过起贮库的作用，增加抗原的长期释放。长期暴露于抗原会增加给免疫系统呈递抗原进行加工的时间长度以及抗体应答的持续时间。第二个机理是，佐剂具有与免疫细胞的相互作用。通过刺激或调节免疫细胞，佐剂可以起免疫细胞功能的非特异性介质的作用。在结合抗原微粒(载体/媒介物功能)以后，佐剂也可以增强巨噬细胞吞噬。就最终结果方面(高抗体应答)以及免疫的动物的幸福而言，适当佐剂的选择是极其重要的。许多佐剂具有在动物中造成炎症、组织坏死和疼痛的能力，因而不适合用于人疫苗接种。通常，佐剂的选择是基于抗原特征(大小、净电荷和极性基团的存在与否)以及使不适最小化。多年来，唯一可利用的有效佐剂是完全弗氏佐剂(CFA)。在过去，还已经基于要免疫的物种来选择佐剂，因为有些佐剂会比其它佐剂更好地起作用，这取决于物种。但是，佐剂选择仍然主要依靠经验。可容易地纯化或可大量得到的抗原，就用于免疫时具有最小炎症的佐剂而言可能是良好的起始选择。难以获得的抗原(例如，可以得到非常小量)以及小分子量化合物或弱免疫原性的抗原，对于与佐剂的组合而言是更合适的候选物，以增加免疫应答。通常，佐剂会减慢抗原释放以实现更持久的免疫刺激，结合在巨噬细胞和树突细胞上的toll-样受体以刺激炎症性细胞因子的生产，和/或活化抗原呈递细胞以表达刺激T 细胞活化的因子(包括IL-10)。IL-10涉入人的适应性免疫应答，具体地，涉入促进从首次用于试验的(ThO)细胞形成Th2-淋巴细胞。Th2-淋巴细胞会识别由B-淋巴细胞呈递的抗原。Th2细胞又生成细胞因子，包括白介素2、4、5、10和13，它们促进抗体生成。另外，Th2 细胞的IL-4生产，使动物能够做出快速的抗体应答，所述抗体应答是对致病抗原的抗性所必需的。共同地，这些细胞因子使活化的B-淋巴细胞能够增殖，并刺激活化的B-淋巴细胞合成和分泌抗体，促进B-淋巴细胞分化成分泌抗体的浆细胞，并使抗体生产细胞转换生产的抗体的类型。因而，佐剂是对在疫苗中呈递的抗原的良好免疫应答的重要要素。
多年来，完全弗氏佐剂(CFA，一种矿物油乳液佐剂)是选择的佐剂，这是因为CFA 在疫苗接种以后增强抗体生产的能力。但是，CFA尽管是免疫原性地有效的，其经常产生脓肿、肉芽肿和组织腐肉。另外，已知多次暴露于CFA会造成严重的超敏反应，且人员对CFA 的意外暴露可以导致对相关抗原的致敏。另一种经常用于疫苗抗原递送的常见佐剂是铝盐 (“铝”)。大多数铝佐剂通常是比乳液佐剂更弱的佐剂，并通常仅造成轻度炎症反应。但是，铝最好与强免疫原性的抗原一起使用，因而并非总是适当的。此外，为了产生CMI应答，必须将抗原递送至细胞的内部。外源蛋白难以被细胞摄入。因此，优选的方法是使用这样的规程，诸如病毒载体、脂质体、裸DNA或类似的方案。但是，这样的方案具有许多缺点。例如，许多重组病毒在重复施用以后其本身会产生抗原反应。由于产生免疫反应的标准形式通常需要最初注射(称作激发)和后续注射(称作强化)来实现令人满意的免疫，这可能成为一个严重的问题。此外，尽管大量注意力已经被放在提高病毒载体的安全性上，存在存在某些风险。例如，许多靶群体(诸如被HIV感染的那些)可能具有减弱的免疫系统。因而，在许多个体中非常安全的某些病毒载体可能对这些个体产生某些程度的风险。希望使用这样的佐剂其辅助促进抗原递送进细胞内部中，以便产生CMI应答。

发明内容
发明人以前已经确立，炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis，B. anthracis)的致死因子(LF)多肽的片段可以将融合的靶抗原递送至完整细胞的胞质溶胶。具体地，发明人以前已经证实，在没有PA存在下，与LF多肽(诸如Un或其片段)共价地结合(即通过共价键或融合)的靶抗原可以用于将抗原递送至完整活细胞的胞质溶胶，并引起对融合的抗原的CTL应答。发明人在这里已经令人惊讶地发现，在没有PA存在下，没有必要使靶抗原与要递送至细胞胞质溶胶和/或促进细胞-介导的免疫应答的LF多肽融合。因而，发明人现在已经令人惊讶地发现，在没有PA存在下，LF多肽(诸如LFn和其片段或变体)可以用于促进细胞-介导的免疫应答。因此，本文所述的发明的一个方面涉及LF多肽(诸如1^11或 LFn的片段或变体)作为免疫佐剂来促进细胞-介导的免疫应答的应用，不需要使LFn多肽与抗原共价相连。在一个方面，可用于本文所述的方法和组合物中的LF多肽没有与靶抗原多肽物理地连接或结合，或至少没有实质上物理地结合。在一个替代方面，LF多肽与靶抗原肽物理地结合，例如通过与靶抗原多肽形成非共价地结合的复合物。本发明的一个方面提供了用于将靶抗原递送至细胞的胞质溶胶的组合物及其应用。具体地，一个方面涉及包含LF多肽和靶抗原的组合物，以及使用这样的组合物指导针对抗原的免疫应答的方法，其中所述组合物包含LF多肽和未共价连接LF多肽的靶抗原。 LF多肽或其片段的功能是，增强疫苗抗原的指导针对靶抗原的免疫应答的效能。具体地，在一个方面，组合物可以包含至少一种LF多肽(例如，二分外毒素(诸如炭疽芽孢杆菌)的 N-端致死因子(LFn)或其片段或变体)和至少一种没有共价地连接所述LF多肽的靶抗原。因此，本发明的一个方面涉及一种组合物，其基本上由LF多肽(例如，二分外毒素 (诸如炭疽芽孢杆菌)的N-端致死因子(LFn))和靶抗原组成，其中所述Un没有共价地连接所述靶抗原，且所述组合物不包含炭疽芽孢杆菌的保护抗原(PA)。本发明的一个方面提供了引起对靶抗原的特异性免疫应答(尤其是CMI应答)的方法，其中使用组合物将靶抗原递送至细胞的胞质溶胶，所述组合物基本上由LF多肽(例如，N-端致死因子(LFn)多肽或其片段或变体)和至少一种靶抗原组成，所述靶抗原没有连接或没有共价地连接所述LF多肽。在有些实施方案中，优选的将抗原递送至细胞的胞质溶胶的蛋白是致死因子的 N-端片段，在本文中称作“LFn”，并对应SEQ ID NO :1。SEQID NO 1的LFn是致死因子(LF) 的N-端片段，其包含结合保护抗原(PA)的结合区。本发明的其它方面涉及包含LF多肽和靶抗原的组合物的应用，所述靶抗原没有共价地连接本文所述的LF多肽。在一个方面，包含LF多肽和没有共价地连接所述LF多肽的靶抗原的组合物可以用于疫苗组合物中，所述疫苗组合物用于针对特定靶抗原(诸如病原体)来免疫受试者(保护性或预防性疫苗接种)，或用于治疗性地处理疾病，诸如癌症或涉及错误折叠的蛋白、功能蛋白的获得(包括例如聚谷氨酰胺疾病)、聚集的蛋白(即涉及淀粉样蛋白的疾病)的疾病以及特定疾病，包括但不限于阿尔茨海默氏病、克雅氏病 (CJD)、变体克雅氏病(vCJD)、‘库鲁病’或羊瘙痒症。在该方面的一个实施方案中，包含LF多肽和没有共价地连接所述LF多肽的靶抗原的组合物可以用于筛查向病原体的暴露，例如，在CMI应答试验中。LF多肽和非共价地连接的靶抗原会提供将抗原导入完整细胞中的策略。LF多肽和非共价地连接的靶抗原也会提供在受试者中诱导免疫应答的策略。在有些实施方案中，LF多肽和非共价地连接的靶抗原允许抗原进入细胞中，促进MHC分子对抗原或其片段的展示，从而在受试者中诱导免疫应答，并由此产生针对具有该抗原的病原体的免疫。本发明的另一个方面涉及将细胞内病原体靶抗原多肽导入哺乳动物细胞中的方法，所述方法包括使LF多肽(诸如LFn)和没有共价地连接本文所述的LF多肽的靶抗原接触哺乳动物细胞。在有些实施方案中，LF多肽和非共价地连接的靶抗原并存地(即同时地或同时)接触细胞，或者，可以使细胞接触LF多肽，并随后在特定时间范围内接触非共价地连接的靶抗原，或反之。使细胞接触LF多肽和非共价地连接的靶抗原之间的适当时间范围，可以是允许所述LF多肽促进非共价地连接的靶抗原跨膜递送进完整细胞的胞质溶胶中的任意时间段。这样的时间段可以是，例如，几纳秒、几毫秒、几秒或甚至几分钟。在该方面的一个实施方案中，所述LF多肽(诸如与靶抗原非共价地连接的LFn) 会促进跨膜递送至完整细胞的胞质溶胶。在一个实施方案中，所述细胞是在体内的哺乳动物细胞，且所述方法包括将LF多肽和没有共价地连接所述LF多肽的靶抗原施用给哺乳动物。靶抗原多肽自己通常不会穿过质膜并进入完整细胞中。存在几个促成因素多肽的大小等等。在水性溶液中的蛋白倾向于使它们的极性氨基酸残基处于折叠的结构的外侧、 使非极性氨基酸残基处于内侧。不带电荷的质膜的脂质双层会排斥外部带电荷的蛋白，阻止蛋白的跨膜迁移。蛋白可以通过多种方式进入细胞中经由需要消耗能量的蛋白通道，或经由特定细胞表面受体介导的吞噬作用和/或胞吞作用，后二者也需要消耗能量。LF多肽 (诸如Un)自己可以穿过质膜，并自己进入完整细胞。已知，与LF多肽物理地连接(即通过肽键或作为融合蛋白)的靶抗原可以转移进完整细胞的胞质溶胶中。发明人在这里已经令人惊讶地发现，与Un非共价地连接的靶抗原多肽也可以被递送进完整细胞中。该方法适用于任意非共价地连接的靶抗原多肽，包括但不限于任意细胞内病原体抗原多肽。换而言之，只要想将蛋白递送进完整细胞中，该方法可以用于实现该目的，即在有LF多肽(诸如LFn)存在下，使细胞接触靶抗原，所述LF多肽可以促进非共价地连接的靶抗原跨膜递送至完整细胞的胞质溶胶。不需要关于靶抗原多肽的特定蛋白通道或特定细胞表面受体的特殊知识。在一个实施方案中，LF多肽(诸如LFn)是N-糖基化的。为了将抗原多肽导入哺乳动物细胞中，简单地混合LF多肽和没有共价地连接所述LF多肽的靶抗原，并接触哺乳动物细胞。在哺乳动物受试者中，可以将LF多肽(诸如LFn)和非共价地连接的靶抗原施用给受试者。局部的和全身的施用途径是可能的，例如肠胃外的、鼻吸入、气管内的、鞘内的、颅内的、肌肉内的、腹膜内的、脑脊髓内的、皮下的、动脉内的、滑膜内的、经口的和直肠内的。本发明的另一个方面涉及产生对靶抗原多肽的CMI应答的方法，所述方法包括 给哺乳动物施用LF多肽(诸如LFn)和非共价地连接的靶抗原，其中所述LF多肽促进非共价地连接的靶抗原跨膜递送至完整细胞的胞质溶胶。优选地，将本文所述的LF多肽(诸如 LFn)和非共价地连接的靶抗原配制成用于施用给哺乳动物的疫苗组合物。在有些方面，本文所述的任意LF多肽(诸如LFn)和非共价地连接的靶抗原可以用于疫苗组合物中，所述疫苗组合物用于针对特定病原体免疫受试者。Plotkin和Mortimer (见‘Vaccines，，1994， W. B. Saunders Company ；第2版(1994))提供了可以用于接种动物或人以诱导对特定病原体特异性的免疫应答的抗原，以及制备抗原的方法，测定抗原的合适剂量的方法，测定免疫应答的诱导的方法，和治疗病原体(例如，细菌、病毒、真菌或寄生物)感染的方法。在有些实施方案中，所述靶抗原是任意病理学靶抗原。在有些实施方案中，LF多肽(诸如UnS 肽)可以促进没有共价地连接的靶抗原(它是整个病毒或减毒病毒)的跨膜递送，其中所述LF多肽起佐剂的功能，以促进递送至病毒的胞质溶胶，以及促进对整个病毒或减毒病毒的CMI应答的诱导。本发明的另一个方面涉及疫苗组合物，其包含LF多肽(诸如LFn)和非共价地连接的靶抗原，其中所述LF多肽促进非共价地连接的靶抗原(诸如整个病毒或减毒病毒)跨膜递送至完整细胞的胞质溶胶。本发明的另一个方面涉及产生对靶多肽的CMI应答的方法，其中所述方法包括给哺乳动物施用LF多肽(诸如LFn)和非共价地连接的靶抗原，其中所述LF多肽促进非共价地连接的靶抗原(诸如整个病毒或减毒病毒)跨膜递送至完整细胞的胞质溶胶。本发明的另一个方面涉及包含LF多肽(诸如LFn)的疫苗组合物，所述LF多肽从昆虫细胞表达和纯化。也包括疫苗组合物，其中LF多肽和靶抗原都在昆虫细胞中表达，例如使用杆状病毒(bacliovirus)表达系统。在一个实施方案中，所述疫苗组合物包含许多 LF多肽(诸如LFn)和许多非共价地连接的靶抗原，它们从昆虫细胞表达和纯化，其中所述靶抗原多肽是不同的，但是都来自单个细胞内病原体。在一个实施方案中，所述多种靶抗原多肽都来自源自单个细胞内病原体的单一多肽。在一个实施方案中，所述疫苗组合物包含许多LF多肽和许多非共价地连接的靶抗原。在有些实施方案中，所述LF多肽和许多非共价地连接的靶抗原从昆虫细胞表达和纯化，其中每种靶抗原多肽是不同的，但是都来自几种细胞内病原体。例如，产生对腮腺炎、麻疹和风疹病毒的细胞-介导的免疫(CMI)应答的疫苗组合物可以具有至少3种不同的非共价地连接的靶抗原，各自对腮腺炎、麻疹和风疹病毒是特异性的。在一个方面，本文描述了用于促进对靶抗原的细胞介导的免疫(CMI)应答的组合物，所述组合物包含至少一种分离的靶抗原和缺少LF酶活性的致死因子(LF)多肽的一部分，其中所述LF多肽部分没有共价地连接到靶抗原上，且其中所述组合物不包含外毒素二分蛋白的保护抗原(PA)。在一个实施方案中，所述LF多肽部分包含SEQ ID NO 3的至少60个羧基端氨基酸或其促进对靶抗原的CMI应答的保守置换变体。在另一个实施方案中，所述LF多肽部分包含SEQ ID NO 3的至少80个羧基端氨基酸或其促进对靶抗原的CMI应答的保守置换变体。在另一个实施方案中，所述LF多肽部分包含SEQ ID NO 3的至少104个羧基端氨基酸或其促进对靶抗原的CMI应答的保守置换变体。在另一个实施方案中，所述LF多肽部分包含与SEQ ID NO :3相对应的氨基酸序列或其促进对靶抗原的CMI应答的保守置换变体。在另一个实施方案中，所述LF多肽部分不结合PA多肽。在另一个实施方案中，所述LF多肽部分基本上缺少SEQ ID NO 3的氨基酸1_33。在另一个实施方案中，所述LF多肽部分由SEQ ID NO 4或其促进对靶抗原的CMI 应答的保守置换变体组成。在另一个实施方案中，所述LF多肽部分由SEQ ID NO 5组成。在另一个实施方案中，所述细胞是在体内或存在于生物体中。在另一个实施方案中，所述细胞是在体外。在另一个实施方案中，当所述细胞在有靶抗原存在下且在没有外毒素保护抗原 (PA)存在下接触组合物时，所述组合物诱导细胞对靶抗原的应答。在另一个实施方案中，所述靶抗原选自病原体抗原、肿瘤抗原或内源的错误折叠的蛋白。在另一个实施方案中，所述病原体抗原选自甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、禽流感病毒、埃波拉病毒、西尼罗病毒、流感病毒、单纯疱疹病毒1、单纯疱疹病毒2、HIV2、HIVl 和其它HIVl菌株。在另一个实施方案中，所述病原体抗原不是由炭疽芽孢杆菌表达的抗原。在另一个实施方案中，所述组合物任选地包含至少一种佐剂。在另一个实施方案中，所述佐剂选自完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、CM-CSF、QS21、CpG、RIBI Detox、of ； IL-2、Ig-IL-2、B7、ICAM、LFS、葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、多糖、淀粉、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、 聚乙二醇(PEG)、聚(烯烃氧化物)、单甲氧基-聚乙二醇聚丙二醇、聚乙二醇的嵌段共聚物、聚丙二醇。在另一个方面，本文描述了促进对细胞的细胞-介导的免疫应答的方法，所述方法包括在有缺乏LF酶活性的炭疽芽孢杆菌LF多肽部分存在下，使所述细胞接触靶抗原， 其中所述缺乏LF酶活性的炭疽芽孢杆菌LF多肽部分没有共价地连接到靶抗原上，且其中所述细胞没有接触外毒素二分蛋白的保护抗原(PA)，由此促进针对靶抗原的细胞-介导的免疫应答。在另一个方面，本文描述了用于将靶抗原递送给细胞的组合物，所述组合物包含至少一种靶抗原和缺乏LF酶活性的炭疽芽孢杆菌LF多肽部分，其中所述炭疽芽孢杆菌LF 多肽部分没有共价地连接到靶抗原上，且其中所述组合物不包含炭疽芽孢杆菌外毒素二分蛋白的保护抗原。在一个实施方案中，所述炭疽芽孢杆菌LF多肽部分包含SEQ ID NO :3的至少60个羧基端氨基酸或其促进跨膜递送的保守置换变体。在另一个实施方案中，所述炭疽芽孢杆菌LF多肽部分包含SEQ ID NO :3的至少80 个羧基端氨基酸或其促进跨膜递送的保守置换变体。在另一个实施方案中，所述炭疽芽孢杆菌LF多肽部分包含SEQ ID NO :3的至少 104个羧基端氨基酸或其促进跨膜递送的保守置换变体。在另一个实施方案中，所述炭疽芽孢杆菌LF多肽部分包含与SEQ ID NO 3相对应的氨基酸序列或其促进跨膜递送的保守置换变体。在另一个实施方案中，所述炭疽芽孢杆菌LF多肽部分不结合炭疽芽孢杆菌PA多肽。在另一个实施方案中，所述炭疽芽孢杆菌LF多肽部分基本上缺少SEQ ID N0:3的氨基酸1-33。在另一个实施方案中，所述炭疽芽孢杆菌LF多肽部分由SEQ ID NO :4或其促进跨膜递送的保守置换变体组成。在另一个实施方案中，所述炭疽芽孢杆菌LF多肽部分由SEQ ID NO 5组成。在另一个实施方案中，所述细胞是在体内或存在于生物体中。在另一个实施方案中，所述细胞是在体外。在另一个实施方案中，当所述细胞在有靶抗原存在下且在没有外毒素保护抗原 (PA)存在下接触组合物时，所述组合物诱导细胞对靶抗原的应答。在另一个实施方案中，所述靶抗原选自病原体抗原、肿瘤抗原或内源的错误折叠的蛋白。在另一个实施方案中，所述病原体抗原选自甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、禽流感病毒、埃波拉病毒、西尼罗病毒、流感病毒、单纯疱疹病毒1、单纯疱疹病毒2、HIV2、HIVl 和其它HIVl菌株。在另一个实施方案中，所述病原体抗原不是由炭疽芽孢杆菌表达的抗原。在另一个实施方案中，所述组合物任选地包含至少一种佐剂。在另一个实施方案中，所述佐剂选自完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、CM-CSF、QS21、CpG、RIBI Detox、of ； IL-2、Ig-IL-2、B7、ICAM、LFS、葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、多糖、淀粉、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、 聚乙二醇(PEG)、聚(烯烃氧化物)、单甲氧基-聚乙二醇聚丙二醇、聚乙二醇的嵌段共聚物、聚丙二醇。在另一个方面，本文描述了将靶抗原递送至细胞的胞质溶胶的方法，所述方法包括在有缺乏LF酶活性的炭疽芽孢杆菌LF多肽部分存在下，使所述细胞接触靶抗原，其中所述缺乏LF酶活性的炭疽芽孢杆菌LF多肽部分没有共价地连接到靶抗原上，且其中所述细胞没有接触外毒素二分蛋白的保护抗原(PA)，由此将靶抗原递送至细胞的胞质溶胶。在一个实施方案中，所述靶抗原的递送会诱导所述细胞对所述靶抗原的细胞-介导的免疫(CMI)应答。在另一个实施方案中，所述LF多肽部分对应SEQ ID NO 5或其功能片段。在另一个实施方案中，所述炭疽芽孢杆菌LF多肽部分包含SEQ ID NO :3的至少60 个羧基端氨基酸或其促进跨膜递送的保守置换变体。在另一个实施方案中，所述炭疽芽孢杆菌LF多肽部分包含SEQ ID NO :3的至少80个羧基端氨基酸或其促进跨膜递送的保守置换变体。在另一个实施方案中，所述炭疽芽孢杆菌LF多肽部分包含SEQ ID NO :3的至少 104个羧基端氨基酸或其促进跨膜递送的保守置换变体。在另一个实施方案中，所述炭疽芽孢杆菌LF多肽部分包含与SEQ ID NO 3相对应的氨基酸序列或其促进跨膜递送的保守置换变体。在另一个实施方案中，所述炭疽芽孢杆菌LF多肽部分不结合炭疽芽孢杆菌PA多肽。在另一个实施方案中，所述炭疽芽孢杆菌LF多肽部分基本上缺少SEQ ID N0:3的氨基酸1-33。在另一个实施方案中，所述炭疽芽孢杆菌LF多肽部分由SEQ ID NO :4或其促进跨膜递送的保守置换变体组成。在另一个实施方案中，所述炭疽芽孢杆菌LF多肽部分由SEQ ID NO 5组成。在另一个实施方案中，所述细胞是在体内或存在于生物体中。在另一个实施方案中，所述细胞是在体外。在另一个实施方案中，所述方法另外包括给所述细胞施用至少一种其它佐剂，其中所述佐剂不包含SEQ ID NO :3或SEQ ID NO :4。在另一个实施方案中，所述佐剂选自完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、CM-CSF、QS21、CpG、RIBI Detox,of ；IL_2、Ig-IL_2、B7、ICAM、 LFS、葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、多糖、淀粉、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、聚乙二醇(PEG)、聚(烯烃氧化物)、单甲氧基-聚乙二醇聚丙二醇、聚乙二醇的嵌段共聚物、聚丙二醇。在另一个实施方案中，所述靶抗原选自病原体抗原、肿瘤抗原或内源的错误折叠的蛋白。在另一个实施方案中，所述病原体抗原选自甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、禽流感病毒、埃波拉病毒、西尼罗病毒、流感病毒、单纯疱疹病毒1、单纯疱疹病毒2、HIV2、HIVl 和其它HIVl菌株。在另一个实施方案中，所述病原体抗原不是由炭疽芽孢杆菌表达的抗原。在另一个方面，本文描述了本文所述的组合物用于诱导细胞对靶抗原的细胞介导的应答的应用，其中在有靶抗原存在下，且在没有外毒素保护抗原(PA)存在下，使所述细胞接触组合物。所述组合物可以是，例如，包含至少一种分离的靶抗原和缺少LF酶活性的致死因子(LF)多肽的一部分的组合物，其中所述LF多肽部分没有共价地连接到靶抗原上， 且其中所述组合物不包含外毒素二分蛋白的保护抗原(PA)。在一个实施方案中，所述组合物另外包含至少一种额外的免疫佐剂。在另一个实施方案中，所述免疫佐剂选自铝、完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、CM-CSF、QS21、CpG、RIBI Detox。在另一个实施方案中，所述免疫佐剂是选自下述的细胞因子IL_2、Ig-IL-2。在另一个实施方案中，所述免疫佐剂是选自下述的辅刺激分子B7、ICAM、LFS。在另一个实施方案中，所述免疫佐剂是选自下述的非抗原聚合物质葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、多糖、淀粉、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、聚乙二醇(PEG)、聚(烯烃氧化物)、单甲氧
基-聚乙二醇聚丙二醇、聚乙二醇的嵌段共聚物、聚丙二醇。在另一个方面，上述任一种方法使用SEQ ID NO :3或SEQ ID NO 4的LF多肽，其针对在细菌细胞中的生产进行了密码子优化。


图1的图描绘了 PA-介导的Un进入细胞中(经由胞吞作用)，并随后被MHC I类分子呈递。图2A-E显示了各种致死因子(LF)多肽(SEQ ID NO 1)的氨基酸序列。图2A显示了 LF的全长氨基酸序列。图2B显示了 Un的前288个氨基酸的氨基酸序列(SEQ ID NO :2)。图2C显示了致死因子的氨基酸185488的序列(SEQ ID NO :3)，其有时称作片段 3。图2D显示了缺少氨基端信号肽的Un的氨基酸序列(SEQ ID NO :4)。图2E显示了 LFn 的功能片段的一个实例的氨基酸序列，其跨靶细胞膜运输抗原或增加抗原的跨靶细胞膜运输。所述片段是C-端片段(SEQ ID NO :5)。图3显示了炭疽芽孢杆菌致死因子多肽的结构域和二级结构，其基于来自Andrew D. Pannifer等人，(2001). Nature 414,229-233的X-射线晶体学数据。没有显示N-端1_33 氨基酸残基。连续的变化的灰色区域代表从N-端至C-端的结构域I-IV。
具体实施例方式本发明的一个方面提供了用于将靶抗原递送至细胞的胞质溶胶的组合物及其应用。具体地，一个方面涉及包含LF多肽和靶抗原的组合物，和使用这样的组合物指导对抗原的免疫应答的方法，其中所述组合物包含LF多肽和未连接的或非共价地连接的抗原。所述LF多肽或其片段的功能是，增强抗原的指导针对靶抗原的免疫应答的效能。具体地，本发明的组合物包含至少一种LF多肽(例如，二分外毒素(诸如炭疽芽孢杆菌)的N-端致死因子(LFn)或其片段或变体)和至少一种未连接的或非共价地连接的靶抗原。因此，本发明的一个方面涉及一种组合物，其基本上由LF多肽组成，所述LF多肽例如二分外毒素(诸如炭疽芽孢杆菌)的N-端致死因子(LFn)，其中所述Un没有共价地连接所述靶抗原，且所述组合物不包含炭疽芽孢杆菌的保护抗原(PA)。本发明的一个方面提供了引起对靶抗原的特异性免疫应答(尤其是CMI应答)的方法，其中使用组合物将靶抗原递送至细胞的胞质溶胶，所述组合物基本上由LF多肽(例如，N-端致死因子(LFn)多肽或其片段或变体)和没有共价地连接所述LF多肽的靶抗原组成。在该方面的有些实施方案中，所述组合物包含LF多肽(诸如Un)和未连接的或非共价地连接的靶抗原，这表示，所述LF多肽(诸如LFn)没有通过任何共价键连接到靶抗原上。在一个方面，所述LF多肽在主题组合物中没有物理地结合靶抗原，或者，基本上没有物理地连接靶抗原多肽。在替代实施方案中，LF多肽可以与靶抗原形成非共价地连接的复合物。例如，且如下文更详细地讨论的，在有些实施方案中，组合物可以形成LFn:靶抗原复合物。在有些实施方案中，所述组合物包含LFn:靶抗原复合物，其中Un多肽或其片段通过非共价相互作用结合靶抗原，所述非共价相互作用例如范德华力或其它相互作用，诸如静电相互作用、亲水相互作用、疏水相互作用和技术人员已知的任意非共价键结合。在另一个实施方案中，所述组合物包含LFn:靶抗原复合物，其中LF多肽(诸如 LFn)和非共价地连接的靶抗原与至少一个额外部分(例如，连接的多肽)形成复合物，其中
14所述靶抗原和所述LF多肽与所述额外部分相互作用。这样的相互作用可以是技术人员已知的任意非共价键结合，包括但不限于、范德华力、亲水相互作用、疏水相互作用和其它非共价相互作用。定义为了方便，在这里收集了在整个申请(包括说明书、实施例和所附的权利要求书) 中采用的某些术语。除非另外定义，在本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解相同的含义。本文使用的术语“包含”是指，除了所述的确定的要素以外，其它要素也可以存在。 “包含”的使用指示“包括但不限于”。术语“由......组成”表示本文所述的组合物、方法和其各种组分，它们排除在实
施方案的描述中没有列出的任何要素。本文使用的术语“基本上由......组成”表示，给定的实施方案需要的那些要素。
该术语允许存在不会实质上影响本发明的实施方案的基础的和新颖的或功能的特征的要
O本文使用的术语“融合多肽”是指，通过将2个多肽编码序列连接到一起所形成的蛋白。可以如下形成融合多肽连接一种多肽的编码序列与第二种多肽的编码序列，以形成融合编码序列。所述融合编码序列在被转录和翻译时，会表达融合多肽。本文使用的术语“促进跨膜递送”表示第一种多肽的促进第二种多肽穿过完整活细胞的膜的能力。如在本文所述的组合物和方法中所使用的，第二种蛋白(即靶抗原)是未连接的，或非共价地连接至第一种多肽(即LF多肽)上。本文使用的术语“胞质溶胶”表示完整细胞的内部。“胞质溶胶”包括在细胞内的细胞质和细胞器。本文使用的术语“完整细胞“表示这样的活细胞其具有未破损的、未受损的质膜，并具有跨膜的膜电位差，细胞的内侧相对于细胞的外侧是负的。本文使用的术语“佐剂”表示会增加细胞或受试者对靶抗原的抗原应答的任意药剂或实体。在本文所述的LF多肽的背景下，本文使用的术语“基本上缺少氨基酸1-33”表示缺少信号肽活性的LF多肽。本文使用的术语“细胞内病原体”表示可存在于完整细胞内的病原体或其组分。本文使用的术语“病原体”表示在受试者中造成疾病或障碍的生物体或分子。例如，病原体包括、但不限于病毒、真菌、细菌、寄生物和其它传染性的生物体或源自它的分子，以及在分类藻类、真菌、酵母和原生动物等内的分类学上有关的大型生物体。本文使用的术语“原核病原体”表示细菌病原体。本文使用的术语“病毒病原体”表示造成患病或疾病的病毒，诸如HIV。本文使用的术语“寄生病原体”表示这样的微生物它是寄生性的，在宿主细胞或宿主生物体内长期存活，其从宿主获益，并同时造成患病或疾病。寄生病原体可以是细菌、 病毒、真菌和原生生物。“抗原呈递细胞”是这样的细胞其表达主要组织相容性复合物(MHC)分子，且可以在它的表面上展示与MHC复合的外来抗原。抗原展示细胞的实例是树突细胞、巨噬细胞、B细胞、成纤维细胞(皮肤)、胸腺上皮细胞、甲状腺上皮细胞、胶质细胞(脑)、胰腺β细胞和血管内皮细胞。术语“保护抗原”或“ΡΑ”在本文中可互换地用于表示炭疽芽孢杆菌外毒素二分蛋白的一部分，其通过细胞受体结合到哺乳动物细胞的表面上。使用的术语“PA”具有它的完整的且有功能的受体结合位点。美国专利5，591，631和5，677，274(通过引用作为整体并入)描述了这样的PA融合蛋白其将PA靶向特定细胞，诸如癌细胞和HIV-感染的细胞，使用靶向的细胞上的受体的配体作为融合配偶体。本文使用的术语“致死因子”或“LF”泛指二分炭疽芽孢杆菌外毒素的非-PA多肽。野生型的、完整的炭疽芽孢杆菌LF多肽具有在GenBank登录号Μ29081 (基因ID No 143143)中所述的氨基酸序列，其对应SEQ ID NO :1。SEQ ID NO 1对应这样的LF 所述LF 具有位于它的N-端的残基1-33处的信号肽。换而言之，未成熟的野生型LF对应809氨基酸蛋白，该蛋白包括在N-端处的33氨基酸信号肽。含有以粗体突出显示的信号肽的未成熟的野生型LF的氨基酸序列(SEQ ID NO 1)如下MNIKKEFIKVISMSCLVTAITLSGPVFIPLVQG AGGHGDVGMHVKEKEKNKDENKRKDEERNKTQEEHLKEIMKHIVKIEVKGEEAVKKEMEKLLEKVPSDVLEMYKAIGGKIYIVDGDITKHISLEALSEDKKKIKDIYGKDALLHEHYVYAKEGYEPVLVIQSSEDYVENTEKALNVYYEIGKILSRDILSKINQPYQKFLDVLNTIKNASDSDGQDLLFTNQLKEHPTDFSVEFLEQNSNEVQEVFAKAFAYYIEPQHRDVLQLYAPEAFNYMDKFNEQEINLSLEELKDQRMLSRYEKWEKIKQHYQHWSDSLSEEGRGLLKKLQIPIEPKKDDIIHSLSQEEKELLKRIQIDSSDFLSTEEKEFLKKLQIDIRDSLSEEEKELLNRIQVDSSNPLSEKEKEFLKKLKLDIQPYDINQRLQDTGGLIDSPSINLDVRKQYKRDIQNIDALLHQSIGSTLYNKIYLYENMNINNLTATLGADLVDSTDNTKINRGIFNEFKKNFKYSISSNYMIVDINERPALDNERLKWRIQLSPDTRAGYLENGKLILQRNIGLEIKDVQIIKQSEKEYIRIDAKVVPKSKIDTKIQEAQLNINQEWNKALGLPKYTKLITFNVHNRYASNIVESAYLILNEWKNNIQSDLIKKVTNYLVDGNGRFVFTDITLPNIAEQYTHQDEIYEQVHSKGLYVPESRSILLHGPSKGVELRNDSEGFIHEFGHAVDDYAGYLLDKNQSDLVTNSKKFIDIFKEEGSNLTSYGRTNEAEFFAEAFRLMHSTDHAERLKVQKNAPKTFQFINDQIKFIINS(SEQ ID NO 1)未成熟的LF蛋白的切割，会产生长度为776个氨基酸的成熟的野生型LF多肽。成熟的野生型LF多肽(即缺少N-端信号肽)的776个氨基酸多肽序列对应下述的SEQ ID NO 2 AGGHGDVGMHVKEKEKNKDENKRKDEERNKTQEEHLKEIMKHIVKIEVKGEEAVKKEAAEKLLEKVPSDVLEMYKAIGGKIYIVDGDITKHISLEALSEDKKKIKDIYGKDALLHEHYVYAKEGYEPVLVIQSSEDY
VENTEKALNVYYEIGKILSRDILSKINQPYQKFLDVLNTIKNASDSDGQDLLFTNQLKEHPTDFSVEFLEQNSNEVQEVFAKAFAYYIEPQHRDVLQLYAPEAFNYMDKFNEQEINLSLEELKDQRMLSRYEKWEKIKQHYQHffSDSLSEEGRGLLKKLQIPIEPKKDDIIHSLSQEEKELLKRIQIDSSDFLSTEEKEFLKKLQIDIRDSLSEEEKELLNRIQVDSSNPLSEKEKEFLKKLKLDIQPYDINQRLQDTGGLIDSPSINLDVRKQYKRDIQNIDALLHQSIGSTLYNKIYLYENMNINNLTATLGADLVDSTDNTKINRGIFNEFKKNFKYSISSNYMIVDINERPALDNERLKWRIQLSPDTRAGYLENGKLILQRNIGLEIKDVQIIKQSEKEYIRIDAKVVPKSKIDTKIQEAQLNINQEWNKALGLPKYTKLITFNVHNRYASNIVESAYLILNEWKNNIQSDLIKKVTNYLVDGNGRFVFTDITLPNIAEQYTHQDEIYEQVHSKGLYVPESRSILLHGPSKGVELRNDSEGFIHEFGHAVDDYAGYLLDKNQSDLVTNSKKFIDIFKEEGSNLTSYGRTNEAEFFAEAFRLMHSTDHAERLKVQKNAPKTFQFINDQIKFIINS
(SEQ ID NO 2)术语“LF多肽”不仅适用于全长野生型LF (具有或没有信号序列)，而且适用于其片段，所述片段介导非共价地连接的多肽向细胞的细胞内递送。术语“LF多肽”也包括LF 的保守置换变体，包括介导这种细胞内递送的保守置换变体。当提及肽时，术语“置换”表示用氨基酸替换不同的氨基酸部分。置换可以是保守的或非保守的置换，如下文进一步所述。术语“LFn多肽”表示这样的炭疽芽孢杆菌LF的N-端片段其没有表现出锌金属蛋白酶活性、促分裂原活化的激酶活性或二者，但是介导非共价地连接的多肽的细胞内或跨膜递送。因而，Un多肽是LF多肽的子集。预见到本文所述的每个方法和/或试剂盒使用一种或多种LF多肽，和未连接的或非共价地连接的靶抗原。在本文中定义和描述的LFn 多肽是优选的。在一个方面，"Un多肽”包括SEQ ID NO :3，其对应288氨基酸未成熟的LFn 蛋白；该Un蛋白是“未成熟的”，因为它包括位于N-端的残基1-33处的信号肽。换而言之，未成熟的Un对应288氨基酸蛋白，其包括在N-端处的33氨基酸信号肽。SEQ ID NO 3的未成熟的Un蛋白的信号肽切割，会产生长度为255个氨基酸的成熟的LFn多肽。应当强调的是，为了本文所述的方法和组合物的目的，LF和/或LFn多肽可以包括或缺少信号肽——也就是说，预期信号肽的存在或缺失不会影响LF多肽在本文所述的方法中作为跨膜运输促进剂的活性。含有以粗体突出显示的信号肽的未成熟的Un的氨基酸序列(SEQ ID NO 3)如下MNIKKKHKVISMSCLVTAITLSGPVFIPLVOO AGGHGDVGMHVKEKEKNKDENKRKDEERNKTQEEHLKEIMKHIVKIEVKGEEAVKKEMEKLLEKVPSDVLEMYKAIGGKIYIVDGDITKHISLEALSEDKKKIKDIYGKDALLHEHYVYAKEGYEPVLVIQSSEDYVENTEKALNVYYEIGKILSRDILSKINQPYQKFLDVLNTIKNASDSDGQDLLFTNQLKEHPTDFSVEFLEQNSNEVQEVFAKAFAYYIEPQHRDVLQLYAPEAFNYMDKFNEQEINLS(SEQ ID NO 3)成熟的LFn多肽(其缺少N-端信号肽)的多肽序列的长度是255个氨基酸，并对应下述的SEQ ID NO 4 AGGHGDVGMHVKEKEKNKDENKRKDEERNKTQEEHLKEIMKHIVKIEVKGEEAVKKEAAEKLLEKVP
SDVLEMYKAIGGKIYIVDGDITKHISLEALSEDKKKIKDIYGKDALLHEHYVYAKEGYEPVLVIQSSEDYVENTEKALNVYYEIGKILSRDILSKINQPYQKFLDVLNTIKNASDSDGQDLLFTNQLKEHPTDFSVEFLEQNSNEVQEVFAKAFAYYIEPQHRDVLQLYAPEAFNYMDKFNEQEINLS(SEQ ID NO 4)在“LFn的功能片段”的背景下使用的术语“功能片段”表示这样的LFn多肽的片段其介导、实现或促进跨完整的活细胞的膜的抗原运输。这样的LFn多肽片段的一个实例是Un的104氨基酸C-端片段，其对应下述的SEQ ID NO :5 (该序列也在美国专利申请 10/473190中公开为SEQ ID NO :3，所述美国专利申请通过引用并入本文)GKILSRDILSKINQPYQKFLDVLNTIKNASDSDGQDLLFTNQLKEHPTDFSVEFLEQNSNEVQEVFAKAFAYYIEPQHRDVLQLYAPEAFNYMDKFNEQEINLS(SEQ ID NO 5)本文使用的术语“LFn多肽”包括本文所述的每种“未成熟的”LFn和“成熟的”LFn 分子、以及它们的介导、实现或促进与LF多肽未连接的或非共价地连接的靶抗原跨完整的活细胞的膜的运输的片段、变体(包括保守置换变体)和衍生物。特别地预见到的用于本文所述的方法、组合物和试剂盒中的LFn多肽的其它片段包括这样的片段所述片段包含SEQID NO 3的C-端60、80、90、100或104个氨基酸或其保守置换变体，或任选地基本上由它们组成，所述保守置换变体介导、实现或促进未连接的或非共价地连接的靶抗原多肽跨完整活细胞的完整膜的转移。作为在本文中使用的术语，靶抗原的“片段”的长度是至少15个氨基酸，且可以是，例如，至少16、至少17、至少18、至少19、至少20或至少25个氨基酸或更大。因而，在例如制备靶抗原片段-LF多肽集合的情况下，靶抗原片段的长度是至少15个氨基酸。术语“细胞毒性的T淋巴细胞”或“CTL”表示诱导靶向的细胞的细胞凋亡的淋巴细胞。经由TCR与在靶细胞表面上的加工过的抗原(Ag)的相互作用，CTL与靶细胞形成抗原特异性的缀合物，导致靶向的细胞的细胞凋亡。凋亡小体被巨噬细胞消除。术语“CTL应答”用于表示由CTL细胞介导的初次免疫应答。本文使用的术语“细胞介导的免疫”或“CMI”表示这样的免疫应答其不涉及抗体或补体，但是涉及巨噬细胞、天然杀伤细胞(NK)、抗原特异性的细胞毒性的T-淋巴细胞 (T-细胞)的活化以及响应于靶抗原的各种细胞因子的释放。换而言之，CMI表示这样的免疫细胞(诸如T细胞和淋巴细胞)其结合到展示抗原的其它细胞(诸如抗原呈递细胞 (APS))的表面上，并触发应答。所述应答可能涉及其它淋巴细胞和/或任意其它白血细胞 (白细胞)以及细胞因子的释放。因此，细胞-介导的免疫(CMI)是这样的免疫应答其不涉及抗体，但是涉及巨噬细胞和NK-细胞的活化、抗原特异性的细胞毒性的T-淋巴细胞的生产以及响应于抗原的各种细胞因子的释放。细胞免疫通过下述机理保护身体(i)活化抗原特异性的细胞毒性的T-淋巴细胞(CTL)，其能够破坏在它们的表面上展示外来抗原的表位的身体细胞，诸如病毒感染的细胞、具有细胞内细菌的细胞和展示肿瘤抗原的癌细胞；(2)活化巨噬细胞和NK细胞，使它们能够破坏细胞内病原体；和(3)刺激细胞分泌多种细胞因子，所述细胞因子会影响适应性免疫应答和先天性免疫应答所涉及的其它细胞的功能。不希望受理论的约束，且作为背景，将免疫系统分成2个分支体液免疫，它的免疫保护功能存在于体液(无细胞的体液或血清)中；和细胞免疫，它的免疫保护功能与细胞有关。本文使用的术语“免疫细胞”表示可以响应于直接或间接的抗原刺激而释放出细胞因子的任意细胞。术语“免疫细胞”在本文中包括淋巴细胞，包括天然杀伤(NK)细胞、 T-细胞(⑶4+和/或⑶8+细胞)、B-细胞、巨噬细胞和单核细胞、Th细胞；Thl细胞；Th2 细胞；Tc细胞；基质细胞；内皮细胞；白细胞；树突细胞；巨噬细胞；肥大细胞和单核细胞， 以及能够响应于直接或间接的抗原刺激而生产细胞因子分子的任意其它细胞。通常，免疫细胞是淋巴细胞，例如T-细胞淋巴细胞。本文使用的术语“细胞因子”与术语“效应分子”互换使用，并表示免疫细胞响应于抗原刺激而释放出的分子。这样的细胞因子的实例包括，但不限于GM-CSF ;IL_1 α ； IL-I β ；IL-2 ；IL-3 ；IL-4 ；IL-5 ；IL-6 ；IL-7 ；IL-8 ；IL-10 ；IL-12 ；IFN-α ； IFN-β ； IFN-Y ；MIP-I α ；MIP-I β ；TGF-β ；TNF α 禾口 TNF3。术语“共价地键合”是指通过化学键直接地或间接地(例如，通过连接物)相连。 换而言之，共价键是2个或更多个原子之间的键，其由在原子核之间移动的电子提供，所述键使它们保持在一起，但是使它们保持间隔稳定的距离。共价键共有2个或更多个原子之间的电子。本文使用的术语“复合物”表示2个或更多个分子的集合，所述分子通过除了共价相互作用以外的方式彼此物理地结合；例如，它们可以通过静电相互作用(诸如范德华力等)来连接。本文使用的术语“融合蛋白，，表示通过肽键相连的2个或更多个蛋白的重组蛋白。 可以如下生产融合蛋白例如，将编码一种蛋白的核酸序列连接到编码另一种蛋白的核酸序列上，使得它们构成单个开放读码框，该开放读码框可以翻译成包含所有目标蛋白的单个多肽。术语“转移进细胞”表示，将部分(诸如靶抗原和任选的LFruLFn同源物或模仿物或它们的变体)从在细胞外的位置跨过质膜移动至细胞的内部。术语“转导”表示将核酸导入细胞中的任意方法，例如，通过转染、脂转染、电穿孔、 基因枪法、被动吸收、脂质核酸复合物、病毒载体转导、注射、接触裸DNA等。术语“体内”表示在动物中发生的试验或过程。术语“离体”表示使用在体外的具有完整膜的活细胞进行的试验，所述活细胞例如外植体、培养的细胞(包括原代细胞和细胞系、转化的细胞系)和提取的组织或细胞(包括血细胞)以及其它。术语“体外”表示不需要存在具有完整膜的细胞的试验。“癌细胞”表示癌性的、癌前的或转化的细胞，无论是在体内、离体还是在组织培养物中，其具有自发的或诱导的表型变化，所述变化不一定涉及新遗传物质的摄入。尽管转化可以源自转化病毒的感染和新基因组核酸的掺入或外源性核酸的摄入，它也可以自发地产生，或在暴露于致癌物以后产生，由此突变一个内源基因或多个基因。转化/癌症与体外、体内和离体的合适动物宿主(诸如裸鼠等)中的下述现象有关例如，形态学变化、细胞的永生化、异常的生长控制、灶性形成、锚着非依赖性、增殖、恶性肿瘤、生长的接触抑制和密度限制、生长因子或血清非依赖性、肿瘤特异性的标志物水平、侵袭力、肿瘤生长或抑制 (也参见 Freshney, Culture of Animal Cells :A Manual of Basic Technique (1994 年第 3 版))。术语“哺乳动物”意图包括包括单个“哺乳动物”和多个“哺乳动物”、且包括但不限于人类；灵长类动物诸如猿、猴、猩猩和黑猩猩；犬科动物诸如狗和狼；猫科动物诸如猫、 狮子和虎；马科动物诸如马、驴和斑马、食物动物诸如牛、猪和绵羊；有蹄动物诸如鹿和长颈鹿；啮齿类动物诸如小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠；和熊。在有些实施方案中、哺乳动物是人。 在替代实施方案中，哺乳动物不是人。本文使用的术语“受试者”表示这样的任意动物其中向细胞的胞质溶胶递送外源蛋白或诊断CMI应答是有用的，例如用于诊断受试者是否具有疾病或病症，或可能发展疾病或病症。所述受试者可以是哺乳动物例如人，或可以是野生动物、驯养动物、商业动物或伴侣动物。尽管在一个实施方案中，预见到，CMI试验适用于在人类中的诊断用途，它也适用于所有脊椎动物，例如哺乳动物(诸如非人灵长类动物(具体地，高等灵长类动物)、绵羊、 狗、啮齿动物(例如小鼠或大鼠)、豚鼠、山羊、猪、猫、兔、牛)以及非哺乳动物(诸如鸡)、 两栖动物、爬行动物等。在一个实施方案中，所述受试者是人。在另一个实施方案中，所述受试者是野生动物，例如鸟，诸如用于诊断禽流感。在有些实施方案中，所述受试者是作为疾病模型的实验动物或动物代用品。所述受试者可以是需要兽医治疗的受试者，包括治疗伴侣动物(诸如狗和猫)和驯养动物(诸如马、矮马、驴、骡、美洲驼、羊驼、猪、牛和绵羊)或动物园动物(诸如灵长类动物、猫科动物、犬科动物、牛科动物和有蹄动物)或家畜动物 (诸如猪、牛和绵羊)，其中对病原体的CMI应答的检测可用于预防疾病和/或控制疾病的传播，所述疾病例如SIV、STLU SFV，或在家畜的情况下，口蹄疫和其它这样的疾病。在有些实施方案中，受试者不是人受试者。术语“生物样品”表示生物组织、细胞或流体的样品，其处于健康和/或病理状态， 含有本文所述的免疫细胞以及能够加工和展示细胞内多肽抗原的细胞。这样的样品包括、 但不限于全血、培养的细胞、原代细胞制品、痰、羊水、组织或细针吸活组织检查样品、腹膜液和胸膜液以及其它。在有些实施方案中，生物样品取自人患者，在替代实施方案中，生物样品取自任意哺乳动物诸如啮齿类动物、疾病的动物模型、商业动物、伴侣动物、狗、猫、绵羊、牛和猪等。生物样品可以在必要时预处理用于保藏或储存，如果需要，在适当的缓冲液中稀释或浓缩。但是，样品必须含有活细胞。可以采用许多标准的水性缓冲液中的任一种， 所述缓冲液采用生理PH多种缓冲剂(诸如磷酸盐、Tris等)之一，处于生理pH。在某些情况下，在用于本文公开的试验之前，可以将生物样品储存。这样的储存可以是在+4°C或冷冻，例如在_20°C或_80°C，条件是，使用合适的冷冻保存剂来维持细胞生存(在细胞解冻以后)。术语“组织”表示类似地专门化的细胞的群或层，所述细胞一起执行某些特殊功能。术语“组织-特异性的”表示来自特定组织的细胞源。术语“组织”意图包括，血液、血液制品诸如血浆和血清、骨、关节、肌肉、平滑肌和器官。术语“野生型”分别表示天然存在的、正常的编码蛋白的多核苷酸序列或其一部分、或蛋白序列或其一部分，它通常存在于体内。因此，如本文公开的，Un蛋白的野生型氨基酸序列对应SEQ ID N0:3(具有信号肽)和/或SEQ ID NO 4 (没有信号肽)，其对应来自炭疽芽孢杆菌的致死因子(LF)的N-端片段。术语“突变体”表示这样的生物体或细胞它的遗传物质具有任何变化，尤其是相对于野生型多核苷酸序列的变化(即、删除、置换、添加或改变)，或相对于野生型蛋白序列的任何变化。术语“变体”与“突变体”互换使用。尽管经常假定遗传物质的变化会导致蛋白的功能的变化，术语“突变体”和“变体”表示野生型蛋白的序列的变化，无论该变化是否改变蛋白的功能(例如，增加、减少、赋予新功能)，或该变化是否对蛋白的功能没有影响(例如，突变或变异是沉默的)。术语“多肽”和“蛋白”互换地用于表示通过肽键相连的氨基酸残基的聚合物，且对于要求保护的发明的目的，具有至少15个氨基酸的最小长度。寡肽、寡聚体、多聚体等通常表示更长的氨基酸链，且也由通过肽键相连的线性排列的氨基酸组成，无论是生物地、重组地还是合成地生产的，也无论是由天然存在的氨基酸还是由非天然存在的氨基酸组成，都包括在该定义中。该定义包括全长蛋白和其片段。该术语也包括多肽的共翻译的修饰(例如，信号肽切割)和翻译后的修饰，例如，二硫键形成、糖基化、乙酰化、磷酸化、蛋白水解性裂解(例如，由弗林蛋白酶或金属蛋白酶切割)等。此外，本文使用的“多肽”表示这样的蛋白其包括对天然序列的修饰，诸如删除、添加和置换(通常在性质上是保守的，如本领域技术人员已知的)，只要所述蛋白维持希望的活性。这些修饰可以是故意的(如通过定点诱变)，或可以是意外的，诸如通过生产蛋白的宿主的突变，或由PCR扩增或其它重组DNA 方法引起的错误。对于本文所述的方法、试剂盒和组合物，术语“肽”表示肽连接的氨基酸序列，其长度含有至少2个且小于15个氨基酸。应当理解，蛋白或多肽经常含有除了通常称作20种天然存在氨基酸的20种氨基酸以外的氨基酸，可以修饰给定的多肽中的许多氨基酸(包括末端氨基酸)，无论是通过天然的过程诸如糖基化和其它翻译后修饰，还是通过本领域众所周知的化学修饰技术。可以存在于本文所述多肽中的已知修饰包括、但不限于乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、 黄素的共价连接、血红素部分的共价连接、多核苷酸或多核苷酸衍生物的共价连接、脂质或脂质衍生物的共价连接、磷脂酰肌醇的共价连接、交联、环化、二硫键形成、脱甲基化、共价交联的形成、胱氨酸的形成、焦谷氨酸盐的形成、制剂、Y-羧基化、糖化、糖基化、GPI锚点形成、羟基化、碘化、甲基化、肉豆蔻酰化、氧化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊烯化、外消旋化、硒化、硫酸化、转移-RNA介导的氨基酸向蛋白的添加诸如精氨酰化和泛素化。术语“同源性”、“同一性”和“相似性”表示2个肽之间或2个最佳比对的核酸分子之间的序列相似性程度。同源性和同一性各自可以如下测定对比每个序列中的位置，所述位置可以为了对比目的而比对。例如，可以基于使用处于默认设置的标准同源性软件，诸如 BLAST2. 2. 14版。当对比的序列中的等同位置被相同碱基或氨基酸占据时，则所述分子在该位置是同一的；当等同位置被类似氨基酸残基占据时(例如，在空间和/或电子性质方面类似，例如保守氨基酸置换)，则所述分子可以称作在该位置是同源的(相似的)。同源性 /相似性或同一性的百分比表述表示在对比的序列各自共有的位置处类似或同一氨基酸的数目的函数。“无关的”或“非同源的”序列与本文公开的序列具有小于40%同一性，尽管优选地小于25%同一性。本文使用的术语“实质的同一性”表示多核苷酸或氨基酸序列的特征，其中所述多核苷酸或氨基酸包含这样的序列在至少18个核苷酸(6个氨基酸)位置的对比窗内，经常在至少24-48个核苷酸(8-16个氨基酸)位置的对比窗内，所述序列与参照序列相比，具有至少85%序列同一性、优选至少90%-95%序列同一性、更通常至少99%序列同一性，其中如下计算所述序列同一性百分比在对比窗内对比参照序列和所述序列，所述序列可以包括占参照序列的共20%或更小的删除或添加。参照序列可以是更大序列的子集。当用于描述多肽时，通过对比一种多肽的氨基酸序列和保守氨基酸置换与第二种多肽的序列，确定术语“相似性”。本文使用的术语“同源的”或“同源物”互换使用，且当用于描述多核苷酸或多肽时，表示2个多核苷酸或多肽或其指定的序列在最佳比对和对比时(例如使用BLAST 2. 2. 14版，使用默认参数进行比对(参见本文))在至少60%的核苷酸、通常约75% -99% 和更优选至少约98-99%的核苷酸中是同一的。本文使用的术语“同系物”或“同源的”也表示关于结构和/或功能的同源性。关于序列同源性，如果它们具有至少60%、至少70%、 至少80%、至少90%、至少95%同一性、至少97%同一性或至少99%同一性，序列是同系物。技术人员可以容易地确定本发明的基因或肽的同系物的测定。为了序列对比，通常，一个序列作为参照序列，将测试序列与其对比。当使用序列对比算法时，将测试序列和参照序列输入计算机中，如果必要，指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。然后，序列对比算法基于指定的程序参数，计算测试序列相对于参照序列的序列同一性百分比。在必要时或希望时，可以进行对比的序列的最佳比对，例如，通过Smi th和Waterman的局部同源性算法(Adv. Appl. Math. 2 :482 (1981)，它通过引用并入本文)，通过 Needleman 和 Wunsch 的同源性比对算法(J. Mol. Biol. 48 :443-53 (1970)，它通过引用并入本文)，通过Pearson和Lipman的搜索相似性方法(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 :2444-48 (1988)，它通过引用并入本文)，通过这些算法的计算机化的执行(例如、在 Wisconsin Genetics 软件包中的 GAP、BESTFIT、FASTA 和 TFASTA，Genetics Computer Group, 575 Science Dr.，Madison，Wis.)，或通过目检(通常参见 Ausubel 等人(编)， Current Protocols in Molecular Biology, 第 4 版，John Wiley and Sons, New York (1999))ο有用的算法的一个实例是PILEUP。PILEUP采用渐进的逐对比对，产生来自一组相关序列的多重序列比对，以显示序列同一性百分比。它也绘出一个树(tree)或枝叉图 (dendogram)，显示用来产生所述比对的成簇关系。PILEUP采用！^ng和Doolittle的渐进比对法的简化方法(J. Mol. Evol. 25 :351-60(1987)，它通过引用并入本文)。所用的方法类似于 Higgins 和 Sharp 描述的方法(Comput. Appl. Biosci. 5 :151-53 (1989)，它通过引用并入本文)。该程序可以比对最多达300个序列，每个序列的最大长度为5，000个核苷酸或氨基酸。多重序列对比法从两个最相似的序列的逐对比对开始，产生一组(cluster)两个比对的序列。然后将该组与下一个最相关的序列或下一组比对的序列进行比对。通过简单地延伸两个单独序列的逐对比对，将两组序列进行比对。通过一系列渐进的逐对比对，得到最后的比对。通过指定序列对比区的特定序列及其氨基酸或核苷酸坐标，并且指定该程序的参数，运行该程序。例如，可以将参照序列与其它测试序列对比，采用以下参数，测定序列同一性百分比关系默认间隙加权值(3. 00)、默认间隙长度加权值(0. 10)和加权的末端间隙。适用于测定序列同一性和序列相似性百分比的算法的另一实例是BLAST算法，其在Altschul等人(J. Mol. Biol. 215 :403-410 (1990)，它通过引用并入本文)中有描述。(也参见 Zhang 等人，Nucleic Acid Res. 26 :3986-90(1998) ；Altschul 等人，Nucleic Acid Res. 25 :3389-402 (1997)，它们通过引用并入本文)。公众可从国家生物技术信息中心互联网网址得到进行BLAST分析的软件。该算法包括，通过在查询序列中鉴别长度为W的短字 (short words)，首先鉴别高计分序列对(HSP)，当与数据库序列中相同长度的字进行比对时，它们或者匹配或者满足某些阳性值的阈值计分Τ。T称为相邻字计分阈值(Altschul等人(1990)，同上)。这些起始的相邻字命中用作种子，用于起始搜寻，以寻找含所述字命中的更长HSP。然后，只要可以增加累积的比对计分，则所述字命中在两个方向上沿每个序列延伸。在以下情况下，每个方向上所述字命中的延伸停止由于来自其最大得到的数值的数量X，累积的比对计分下降；由于一个或多个负计分的残基比对的累积，累积计分转为零或零以下；或达到两个序列之一的末端。BLAST算法的参数W、T和X决定比对的灵敏度和速度。BLAST程序使用下述默认值字长(W)为11，BL0SUM62计分矩阵(参见HenikofT和 Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 :10915-9 (1992)，它通过引用并入本文)比对(B) 为50，期望值(E)为10，M = 5，N = -4，并且对比两条链。除了计算序列同一性百分比外，BLAST算法也进行两个序列之间相似性的统计学分析(参见，例如，Karlin和Altschul，Proc. Natl.Acad. Sci. USA 90 :5873-77 (1993)，它通过引用并入本文)。BLAST算法提供的相似性的一种度量是最小总和概率(P(N))，这提供偶然发生两个核苷酸序列或氨基酸序列之间匹配的概率的指标。例如，如果在测试氨基酸与参照氨基酸的对比中，最小总和概率小于约0. 1、更通常小于约0. 01、最通常小于约0. 001， 则认为该氨基酸序列与参照氨基酸序列相似。本文使用的术语“序列同一性”是指，2个多核苷酸或氨基酸序列在对比窗内是同一的(即，在逐个核苷酸或逐个残基的基础上)。术语“序列同一性百分比1Π下计算在对比窗内对比2个最佳比对的序列，测定在两个序列中存在相同核酸碱基(例如、A、T.C、G、U 或I)或氨基酸残基的位置的数目，以产生匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以对比窗中的位置总数(S卩，窗大小)，并将结果乘以100，得到序列同一性百分比。本文使用的术语“变体”表示这样的多肽或核酸其与天然存在的多肽或核酸相差一个或多个氨基酸或核酸删除、添加、置换或侧链修饰，仍然保留天然存在的分子的一种或多种特定功能或生物活性。氨基酸置换包含这样的改变其中将一个氨基酸替换为不同的天然存在的或非常规的氨基酸残基。这样的置换可以归类为“保守的”，在该情况下，在多肽中包含的氨基酸残基被替换为在极性、侧链功能或大小方面具有类似特性的另一个天然存在的氨基酸。本文所述的变体包括的置换也可以是“非保守的”，其中在肽中存在的氨基酸残基被置换为具有不同性质的氨基酸(例如，用丙氨酸置换带电荷的或疏水的氨基酸)，或者，其中天然存在的氨基酸被置换为非常规氨基酸。当关于多核苷酸或多肽来使用时，术语 “变体”也包括，分别与参照多核苷酸或多肽相比(例如，与野生型多核苷酸或多肽相比)， 一级、二级或三级结构的变异。Un多肽的“变体”表示在结构和功能方面与SEQ ID NO 3 的多肽基本上类似的分子，其中所述功能是介导、实现或促进未连接的或非共价地连接的多肽跨活细胞或存在于受试者中的活细胞的细胞膜的运输的能力。在有些实施方案中，SEQ ID NO 3或SEQ ID NO 4的变体是本文公开的SEQ ID NO :3或4的片段，诸如SEQ ID NO 5。在下述情况下，称一个分子与另一个分子“基本上类似”两个分子具有基本上类似的结构(即，通过设定在默认参数的BLASTp比对测得，它们的氨基酸序列具有至少50% 相似性)，且在至少一种有关的功能方面基本上类似(在这里，例如，在介导、实现或促进非共价地连接的多肽跨完整活细胞的膜的运输中，具有至少50%活性)。可以测量跨膜运输， 例如，如 Kushner 等人，2003，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100 (11) :6652-6657 (它通过引用并入本文)所述。当提及LF多肽的变体(例如，⑶！！或⑶！!的功能衍生物)来使用时，术语与由SEQ ID NO 3编码的LFn蛋白相比“基本上类似”是指，特定主题序列(例如，LFn片段或LFn变体或LFn衍生序列)与由SEQ ID NO 3编码的LFn多肽的序列相差相对于SEQ ID NO 3的一个或多个置换、删除或添加，但是保留由SEQ ID NO :3的Un蛋白表现出的跨膜运输促进活性的至少50 %，且优选更高，例如至少60 %、70 %、80 %、90 %或更高(已经公认，LFn不会天然存在——“天然的”或“自然的”LFn序列意图表示，该序列与在本文中命名为LFn的天然存在的LF多肽部分是相同的)。在测定多核苷酸序列时，所有能够编码基本上类似的氨基酸序列的主题多核苷酸序列，都被视作与参照多核苷酸序列基本上类似，不论密码子序列中的差异。在下述情况下，核苷酸序列与给定的Un核酸序列“基本上类似”(a)所述核苷酸序列与天然Un序列的编码区特异性地杂交，或(b)所述核苷酸序列能够在中等严谨条件下与由SEQ ID NO :1编码的Un的核苷酸序列杂交，并具有与天然Un蛋白类似的生物活性；或(C)作为遗传密码的结果，所述核苷酸序列相对于在(a)或(b)中定义的核苷酸序列是简并的。通常，基本上类似的蛋白与天然蛋白的对应序列具有大于约80%相似性。变体可以包括保守或非保守的氨基酸变化，如下所述。多核苷酸变化可以导致由参照序列编码的多肽的氨基酸置换、添加、删除、融合和截短。变体也可以包括氨基酸的插入、删除或置换(包括氨基酸和其它分子的插入和置换)，它们通常不发生于作为变体基础的肽序列中，例如但不限于在鸟氨酸的插入，这通常不发生于人蛋白中。“保守氨基酸置换” 源自将一个氨基酸置换为另一个具有类似结构和/或化学性质的氨基酸。提供功能上类似的氨基酸的保守置换表，是本领域众所周知的。例如，下面的6个组各自含有彼此为保守置换的氨基酸1)丙氨酸㈧、丝氨酸⑶、苏氨酸⑴；2)天冬氨酸⑶、谷氨酸(E) ；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q) ；4)精氨酸(R)、赖氨酸⑷；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；和6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸⑴、色氨酸(W)。(也参见Creighton， Proteins, W. H. Freeman and Company(1984).)基于多肽中要置换的氨基酸的位置，例如如果所述氨基酸是在多肽的外表上并暴露于溶剂，或在内部且不暴露于溶剂，可以选择保守氨基酸。这样的保守氨基酸置换的选择，属于本领域普通技术人员的技能，且描述在，例如Dordo等人，J.Mol Biol, 1999,217, 721-739，和 Taylor 等人，J. Theor. Biol. 119(1986) ；205-218，和 S. French 和 B. Robson, J.Mol. Evol. 19(1983) 171。因此，可以选择适合在蛋白或多肽的外表上的氨基酸(即暴露于溶剂的氨基酸)的保守氨基酸置换。这些置换包括、但不限于下述的用F置换Y，用S 或K置换T，用A置换P，用D或Q置换E，用D或G置换N，用K置换R，用N或A置换G，用S 或K置换T，用N或E置换D，用L或V置换I，用Y置换F，用T或A置换S，用K置换R，用 N或A置换G，用R置换K，用S、K或P置换A。在替代实施方案中，也可以选择适合在蛋白或多肽的内部的氨基酸的保守氨基酸置换。例如，对于在蛋白或多肽的内部的氨基酸(即所述氨基酸不暴露于溶剂)，可以使用合适的保守置换。例如，可以使用下述的保守置换其中用F置换Y，用A或S置换T，用L 或V置换I，用Y置换W，用L置换M，用D置换N，用A置换G，用A或S置换T，用N置换D， 用L或V置换I，用Y或L置换F，用A或T置换S，和用S、G、T或V置换A。在有些实施方案中，在术语“变体”内也包括含有非保守氨基酸置换的LF多肽。Un多肽的变体(例如 SEQ ID NO :3或4的变体)意在表示在结构(即，通过使用默认参数的BLASTp分析测得， 具有至少50%同源性)和功能(即，在跨膜运输方面，具有SEQ ID NO 3的多肽的有效性的至少50% )上与SEQ ID NO :3或4的分子基本上类似的任意分子。本文使用的术语“非保守的”表示用一个氨基酸残基置换具有基本上不同化学性质的不同氨基酸残基。非保守置换的非限制性实例包括用甘氨酸(G)置换天冬氨酸(D)； 用赖氨酸(K)置换天冬酰胺(N)；和用精氨酸(R)置换丙氨酸(A)。本文使用的术语“衍生物”表示已经化学修饰的肽，例如通过泛素化、标记、聚乙二醇化(用聚乙二醇衍生化)或添加其它分子。当一个分子含有通常不是该分子的一部分的额外化学部分时，它也是另一个分子的“衍生物”。这样的部分可以改善分子的溶解度、吸收、生物半衰期等。或者，所述部分会降低分子的毒性，或消除或减弱分子的不希望的副作用等。能够介导这类效应的部分,公开在Remington，s Pharmaceutical Sciences，第18 版，A. R. Gennaro,编，MackPub 1. , Easton, PA(1990)。
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当与“衍生物”或“变体”结合使用时，术语“有功能的”表示这样的蛋白分子其生物活性与实体或分子的生物活性基本上类似，且其是所述实体或分子的衍生物或变体。 在该背景下，“基本上类似”是指，所述生物活性(例如，结合的多肽的跨膜运输)是参照物 (例如，对应的野生型多肽)的活性的至少50%，优选至少60%活性，70%活性，80%活性， 90%活性，95%活性，100%活性或甚至更高(即，所述变体或衍生物具有比野生型更大的活性)，例如，110%活性、120%活性或更高。在本文中使用的术语“插入”或“删除”通常是在约1-5个氨基酸的范围内。在必要的情况下，考虑到维持功能所允许的变异可以实验地确定，其中合成地生产多肽，同时使用重组DNA技术，在序列中系统地产生核苷酸的插入、删除或置换。术语“特异性地结合”表示，以10微摩尔或更小、优选1微摩尔或更小、更优选 IOOnM或更小、IOnM或更小或InM或更小的Kd进行结合。“基本上纯的”是指这样的核酸、多肽或其它分子其已经与天然地伴随它的组分分离开。通常，当多肽去除了至少约60 %或至少约70 %、至少约80 %、至少约90 %、至少约 95%或甚至至少约99% (按重量计算)的天然地伴随它的蛋白和天然存在的有机分子时， 多肽基本上是纯的。可以如下得到基本上纯的多肽例如，通过从天然来源提取，通过在通常不表达该蛋白的细胞中表达重组核酸，或通过化学合成。 本文使用的术语“减少的”或“减小”或“降低”通常是指，与参照相比统计上显著的量的减少。但是，为了避免疑惑，“减少的”或“降低的”是指，与参照水平相比统计上显著地减少了至少10 %，例如减少了至少20 %、至少30 %、至少40 %、至少50 %或至少60 %或至少70%或至少80%、至少90%或更多，最多达到且包括100%减少(即与参照样品相比不存在水平)，或与参照水平(例如对照样品，诸如没有传染物或没有病症(诸如没有LF多肽)的阴性对照)相比在10-100%之间的任何减少。本文使用的术语“低”通常是指，减少了统计显著的量；为了避免疑惑，“低”是指比参照水平降低了至少10%的统计上显著的值，例如比参照水平低至少20%的值、比参照水平低至少30%的值、比参照水平低至少40%的值、比参照水平低至少50%的值、比参照水平低至少60%的值、比参照水平低至少70%的值、比参照水平低至少80%的值、比参照水平低至少90%的值，最多达到且包括比参照水平低100% (即与参照样品相比不存在水平)，其中所述参照水平可以是对照样品，诸如阴性对照样品，诸如没有传染物或没有病症 (诸如没有LF多肽)的样品。本文使用的术语“增加的”或“增加”通常是指，增加了统计显著的量；为了避免疑惑，“增加的”是指，与参照水平相比统计上显著地增加了至少10%，包括增加了至少20%、 至少30 %、至少40 %、至少50 %、至少60 %、至少70 %、至少80 %、至少90 %、至少100 %或更多，包括例如与参照水平(作为在本文中定义的该术语)相比增加至至少2倍、至少3倍、 至少4倍、至少5倍、至少10倍或更多，所述参照水平例如对照病症，诸如阴性对照或没有病症(诸如没有LF多肽)。本文使用的术语“高”通常是指，与参照水平相比增加了统计显著的量；为了避免疑惑，“高”是指比参照水平高了至少10%的统计上显著的值，例如与参照水平相比高了至少20%、高了至少30%、高了至少40%、高了至少50%、高了至少60%、高了至少70%、高了至少80%、高了至少90%、高了至少100%、为至少2倍高、为至少3倍高、为至少4倍高、为至少5倍高、为至少10倍高或更多，所述参照水平例如对照病症，诸如阴性对照或没有病症(诸如没有LF多肽)。本文用于描述核酸分子的术语“重组的”是指，基因组的、cDNA、病毒的、半合成的和/或合成的起源的多核苷酸，因为它的起源或操作，所述多核苷酸不结合在自然界中它与之结合的多核苷酸序列的全部或一部分。关于蛋白或多肽所使用的术语“重组的”是指， 通过重组多核苷酸的表达所生成的多肽。关于宿主细胞所使用的术语“重组的”是指，其中已经导入了重组多核苷酸的宿主细胞。当提及物质(例如，细胞、核酸、蛋白或载体)时，重组也在本文中用于表示，该物质已经通过导入异源物质(例如，细胞、核酸、蛋白或载体)而进行了修饰。术语“载体”表示这样的核酸分子其能够运输其已经连接的异源核酸，或介导所述异源核酸的表达；质粒是被术语“载体”包括的属的一个种。术语“载体”通常表示这样的核酸序列其含有在宿主细胞中复制和/或维持所必需的复制起点和其它实体。能够指导它们可操作地连接的基因和/或核酸序列的表达的载体，在本文中称作“表达载体”。一般而言，有用的表达载体经常是“质粒”的形式，所述质粒是指环状双链DNA环，当处于它们的载体形式时，它们不会结合染色体，且通常包括用于稳定或短暂表达的实体或编码的DNA。 在本文公开的方法中可以使用的其它表达载体包括、但不限于质粒、附加体、细菌人工染色体、酵母人工染色体、噬菌体或病毒载体，且这样的载体可以整合进宿主的基因组中，或自主地在特定细胞中复制。载体可以是DNA或RNA载体。也可以使用本领域技术人员已知的起等效功能的其它形式的表达载体，例如自主复制的染色体外载体或整合进宿主基因组中的载体。优选的载体是能够自主复制和/或表达它们所连接的核酸的那些。本文使用的术语“治疗”表示治疗性处理和预防性措施，其中目标是，预防或减慢疾病的发展。不希望受实例的限制，如果所述疾病是癌症，减慢肿瘤的发展、癌症的扩散，或减少与不适当的增殖或细胞群有关的病症、疾病或障碍(例如癌症)的至少一种效应或症状，应当视作治疗。在疾病是例如感染(诸如HIV感染)的情况下，病毒滴度的降低，或白血细胞的增加，或改善，或减弱自身免疫疾病综合征(AIDS)的症状，应当视作治疗。如果一种或多种症状或临床标志物减少(作为本文定义的术语)，治疗通常是“有效的”。或者，如果疾病的进展减少或停止，治疗是“有效的”。也就是说，“治疗”不仅包括症状或标志物的改善，而且包括停止或至少减慢在没有治疗存在下预期的症状的进展或恶化。有益的或希望的临床结果包括、但不限于减轻一种或多种症状，减小疾病的程度，稳定(即不恶化)疾病的状态，延迟或减慢疾病进展，改善或减轻疾病状态，和减轻(部分地或完全地)，无论是可检测的还是不可检测的。“治疗”也可以是指，与如果不接收治疗所预期的存活相比，延长存活。需要治疗的受试者包括已经诊断出癌症的那些，以及可能由于转移而发展继发性肿瘤的那些。本文使用的术语“有效量”表示，减轻靶向的疾病或障碍的至少一种或多种症状的治疗剂或药物组合物的量，并涉及足以提供希望的效果的药理学组合物的量。或者，该术语表示将外源蛋白或多肽递送至细胞的胞质溶胶所需的量。本文使用的短语“治疗有效量”(例如本文公开的任意组合物的治疗有效量)是指，以适用于任何医学治疗的合理收益 /风险比，足以治疗障碍的组合物的量。术语“治疗有效量”因此表示这样的本文公开的组合物的量其足以实现与疾病有关的症状或临床标志物的治疗上或预防上显著的减少。
症状的治疗上或预防上显著的减少是，与对照或未治疗的受试者相比，测量的参数减小了例如至少约10%、至少约20%、至少约30%、至少约40%、至少约50%、至少约 60 %、至少约70 %、至少约80 %、至少约90 %，最多达到且包括至少约100 %或更多。测量的或可测量的参数包括临床上可检测的疾病标志物，例如，升高的或下降的生物标志物水平， 以及与临床上接受的疾病或障碍的症状或标志物量级有关的参数。但是，应当理解，本文公开的组合物和制剂的总日用量由主治医师在合理的医学判断范围内决定。需要的确切量随诸如要治疗的疾病的类型等因素而变化。关于治疗具有癌症的受试者，术语“治疗有效量”表示这样的量其是安全的，且足以预防或延迟肿瘤的发展和进一步生长或转移灶在癌症患者中的传播。所述量因而可以治愈癌症或造成癌症减轻，减慢癌症进展的病程，减慢或抑制肿瘤生长，减慢或抑制肿瘤转移，减慢或抑制继发肿瘤在转移部位处的建立，或抑制新肿瘤转移灶的形成。癌症治疗的有效量取决于要治疗的肿瘤、肿瘤的严重性、肿瘤的抗药性水平、要治疗的物种、受试者的年龄和一般状况、给药模式等。因而，指定确切的“有效量”是不合理的。但是，对于任意给定的情况，本领域普通技术人员仅使用例行试验，可以确定适当的“有效量”。普通技术人员可以判断治疗的效能。例如，可以在癌症和肿瘤的动物模型中评估效能，例如具有实验癌症的啮齿动物的治疗，和导致癌症的至少一种症状的减少的组合物或制剂的任何治疗或施用，例如肿瘤尺寸的减小，或减慢或停止肿瘤生长速率，会指示有效的治疗。在使用组合物来治疗癌症的实施方案中，使用癌症的实验动物模型(例如，小鼠或大鼠)，或例如，肿瘤细胞的移植，例如异种移植物动物癌症模型，或已经被遗传修饰成发展癌症的动物模型，可以判断组合物的效能。此外，在有些实施方案中，实验模型可以是体外模型，诸如器官培养物、 细胞或细胞系。当使用实验动物模型时，当癌症的症状减轻时(例如肿瘤的尺寸减小)，或当治疗的动物与未治疗的动物相比更早发生肿瘤的生长速率减慢或停止时，证实了治疗的效能。“更早”是指，例如肿瘤尺寸的减小的发生早了至少5%，但是优选地更多，例如，早了 1天、早了 2天、早了 3天或更多。 本文使用的术语“施用，，和“导入”互换使用，并表示通过导致这样的药剂在目标部位处的递送的方法或途径，将本文公开的药剂放入受试者中。通过在受试者中产生有效治疗的任意适当途径，可以施用化合物。术语“组合物”或“药物组合物”在本文中互换地用于表示这样的组合物或制剂其包含LF多肽和至少一种没有共价地连接所述LF多肽的靶抗原。在有些实施方案中，药物组合物也可以任选地包含赋形剂，诸如药学上可接受的载体，所述载体是本领域常规的，且适合施用给哺乳动物，优选人或人细胞。这样的组合物可以具体地配制成通过许多途径中的一种或多种来施用，所述途径包括但不限于口服、眼的、肠胃外的、静脉内的、动脉内的、 皮下的、鼻内的、舌下、椎管内的、脑室内的等。另外，用于局部(例如，口腔粘膜、呼吸道粘膜)和/或口服给药的组合物可以形成溶液、混悬液、片剂、丸剂、胶囊、持续释放制剂、口服灌洗剂或散剂，如本领域已知的或本文所述的。组合物也可以包括稳定剂和防腐剂。关于载体、稳定剂和佐剂的实例，参见University of the Sciences in Philadelphia (2005) Remington :The Science and Practice of Pharmacy with Facts and Comparisons,第21 版。本文使用的短语“肠胃外施用”和“肠胃外地施用”是指除了肠和局部施用以外的施用模式，通常通过注射，包括但不限于静脉内的、肌肉内的、动脉内的、鞘内的、心室内的、囊内的、眶内的、心内的、真皮内的、腹膜内的、经气管的、皮下的、表皮下的、关节内的、 囊下的、蛛网膜下的、椎管内的、脑脊髓内的和胸骨内的注射和输注。本文使用的短语“全身施用”、“全身地施用”、“周边施用”和“周边地施用”是指除了直接进入肿瘤以外施用治疗组合物，使得它进入动物的系统，并因而进行代谢和其它类似的过程。短语“药学上可接受的”在本文中用于表示这样的化合物、物质、组合物和/或剂型其在合理的医学判断范围内，适用于接触人类和动物的组织，没有过度的毒性、刺激、变应性应答或其它问题或并发症，与合理的收益/风险比相称。本文使用的短语“药学上可接受的载体”是指药学上可接受的物质、组合物或媒介物，诸如液体或固体填充剂、稀释剂、 赋形剂、溶剂或包囊材料，其参与维持主题药剂的活性或溶解度，或将主题药剂从一个器官或身体部分携带或运输至另一个器官或身体部分。除了“药学上可接受的”(作为本文定义的术语)以外，每种载体也必须是“可接受的”，其含义是，与制剂的其它成分相容。药物制剂含有与一种或多种药学上可接受的成分相组合的本发明化合物。载体可以是固体、半固体或液体稀释剂、乳膏剂或胶囊的形式。这些药物制剂是本发明的另一个目的。通常，活性化合物的量是制剂的0. 1-95重量％，优选地在肠胃外使用的制剂中占0. 2-20重量％，且优选地在口服给药的制剂中占1-50重量％。关于本发明方法的临床应用，靶向的递送组合物可以配制成用于肠胃外施用的药物组合物或药物制剂，例如，静脉内的；粘膜的，例如，鼻内的；肠的，例如，口服；局部的，例如，透皮的；眼的，例如，通过角膜划纹或其它给药模式。所述药物组合物包含LF多肽和至少一种没有共价地结合所述LF多肽的靶抗原，且在有些实施方案中，它们与一种或多种药学上可接受的成分相组合。所述载体可以是固体、半固体或液体稀释剂、乳膏剂或胶囊的形式。本文使用的术语“完整细胞“表示这样的活细胞其具有未破损的、未受损的质膜，所述细胞具有跨膜的膜电位差，细胞的内侧相对于细胞的外侧是负的。本文使用的术语“N-糖基化的”或“N-糖基化”表示糖部分与多肽中的天冬酰胺残基的共价连接。糖部分可以包括、但不限于葡萄糖、甘露糖和N-乙酰基葡糖胺。也包括聚糖的修饰，例如，唾液酸化。Un多肽具有3个N-糖基化位点在809氨基酸多肽中的天冬酰胺位置62、212和286。本文使用的术语“N-糖基化的Un-融合多肽”、“N-糖基化的LF-融合多肽”或 “N-糖基化的融合多肽”表示如本文定义的融合多肽其具有至少一个与天冬酰胺残基共价地结合的糖部分。例如，Asn-62、Asn-212和Asn-286可以在N-糖基化的LF-融合多肽中
被糖基化。冠词“一个”和“一种”在本文中用于表示一个或超过一个(即，至少一个)该冠词的语法对象。作为实例，“一个元件”是指一个元件或超过一个元件。本文使用的术语“基本上由......组成”表示给定的实施方案必需的那些要素。
该术语允许存在这样的要素所述要素不会实质上影响本发明的实施方案的基本和新颖或功能的特征。术语“由......组成”表示这样的本文所述的组合物、方法和其各个组分其不含
有在实施方案的描述中没有列举的任何要素。除了在工作实施例中以外，或在另外指出的情况下，在本文中使用的表示成分或反应条件的量的所有数字，应当理解为在所有情况下被术语“约”修饰。当与百分比一起使用时，术语“约”可以表示士 1%。下面的内容进一步详细解释了本发明，但是本发明的范围不限于它们。应当理解，本发明不限于本文描述的具体方法学、方案和试剂等，且它们可以变化。本文使用的术语仅用于描述具体实施方案的目的，无意限制本发明的范围，所述范围仅由权利要求书限定。从下面的详细描述、附图和权利要求书中，可以明白本发明的其它特征和优点。包括LFN佐剂的方法和组合物在下面的部分中，描述了执行本文所述的方法所需的各种组分和所述方法和组合物的不同方面的考虑。I. LF 多肽作为背景且不希望受理论的限制，炭疽芽孢杆菌是炭疽在动物和人中的致病因子。由炭疽芽孢杆菌生产的毒素由2个二分蛋白外毒素(致死毒素(LT)和水肿毒素)组成。 LT由保护抗原(PA)和致死因子(LF)组成，而水肿毒素由PA和水肿因子(EF)组成。这三个组分PA、LF和EF单独都是无毒的。但是，一旦组合，水肿毒素会造成水肿，且LT会通过全身休克造成动物和人的死亡。与它在形成两种毒素中的关键作用相一致，已经将PA鉴别为针对炭疽的疫苗中的保护性组分。炭疽毒素作用的分子机制如下PA是通过细胞受体结合到哺乳动物细胞表面上的735-氨基酸多肽。一旦结合，PA会被细胞蛋白酶的蛋白水解性裂解活化成63-kDa分子，该分子能够在靶向的细胞的质膜中形成环形七聚体(图1) (Milne 等人，(1994) J. Biol. Chem. 269，20607-20612，Petosa，等人，(1997) Nature (London) 385, 833-838)。PA七聚体然后结合EF或LF，它们通过胞吞作用内化。在内体酸化以后，PA使 EF或LF能够进入胞质溶胶中，推测是借助于七聚体形成的孔。在胞质溶胶内，EF起腺苷酸环化酶的作用(L印pla，S. H. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79，3162-3166)，将 ATP 转化成cAMP。异常升高的cAMP水平会扰乱细胞的代谢。炭疽致死因子或LF是由GenBank登录号I\C9081 (GeneID No :1434 编码的蛋白， 其由炭疽芽孢杆菌天然地生成，且具有MAPKK蛋白酶活性。LF的删除分析表明，PA结合域位于LFn的氨基端内，且突变研究证实，PA结合域位于SEQ ID NO=I的LF多肽的34-2M 区域内和 SEQ ID NO 2 的 LF 多肽的 34-288 区域内(Arora 等人，J. Biol. Chem. 268 :3334 3341(1993) ；Milne，等人，(1995)Mol. Microbiol. 15，661-66)。LF在胞质溶胶中的作用会造成宿主细胞的死亡，其机理尚不很清楚。LF会诱导许多淋巴因子的过量生产(Klimpel，等人，(1994)Mol. Microbiol. 13，1093-1100)，促成宿主动物的致死性全身休克。最近的研究也证实，LF具有2种酶活性它可以起锌金属蛋白酶的作用(Duesbery，等人，(1998)kience 280，734-737)，且它会灭活促分裂原活化的蛋白激酶(Harma，等人，.(1994)Mol. Med. 1，7_18)。尽管尚不清楚LF的这两种酶活性如何关联， 二者都是LF毒性所必需的。以前已经报道，炭疽毒素B部分可以用于递送表位，后者又会在有PA存在下引起免疫系统的抗体应答(W0 97/23236)。炭疽芽孢杆菌LF是一种796氨基酸多肽，两种酶活性的功能结构域位于SEQ ID NO 1的氨基酸383和796之间。当与PA混合并添加给培养的巨噬细胞时，或当注射进动物中时，没有该催化结构域的N-端截短的LF完全丧失任何毒性效应。但是，它确实仍然有效地结合PA。Un的PA结合域存在于SEQ ID NO 2的残基；34_288内(Milne，等人，(1995)Mol. Microbiol. 15，661-66)。83kDa PA多肽在它的羧基端结合细胞表面受体，在这里它被蛋白酶(例如，弗林蛋白酶、梭菌蛋白酶或胰蛋白酶)特异性地切割。该酶切割会释放出20kDa氨基端PA片段，而63kDa羧基端PA片段保持结合在细胞表面受体上。63kDa片段也称作“加工过的保护抗原”。加工过的PA含有在它的羧基端的细胞表面受体结合位点和在它的新氨基端的致死因子结合位点(参见，例如，Singh等人，J.Biol. Chem. 264 :19103 19107(1989))。加工过的PA可以通过体外、离体或体内酶切割或作为重组蛋白来生产。本文使用的术语PA是指具有致死因子结合位点的PA分子，例如，重组PA，天然存在的PA，含有致死因子结合位点的PA的功能等效物以及含有致死因子结合位点的PA融合蛋白。II.包含LF多肽和靶抗原的组合物发明人已经确信，炭疽芽孢杆菌(B. anthracis)的致死因子(LF)多肽的片段可以将融合的靶抗原递送至完整细胞的胞质溶胶。具体地，发明人以前已经证实，在没有PA存在下，与LF多肽(诸如Un或其片段)共价地结合(即通过共价键，或融合)的靶抗原，可以用于将抗原递送至完整活细胞的胞质溶胶，并引起针对该融合抗原的CTL应答。令人惊奇地，发明人在此已经发现，在没有PA存在下，没有必要使靶抗原与要递送至细胞胞质溶胶的LF多肽融合。因而，发明人现在已经令人惊讶地发现，在没有PA存在下，LF多肽(诸如Un和其片段或变体)可以用于将未连接的(即未融合的)靶抗原递送至细胞的胞质溶胶。因此，本文所述的发明的一个方面涉及LF多肽(诸如LFn或LFn的片段或变体)作为免疫佐剂的应用，所述免疫佐剂将未连接的(即未融合的)抗原递送至细胞的胞质溶胶，以引起针对所述抗原的CMI应答。本文所述的方法、组合物和试剂盒采用LF多肽来将靶抗原递送至来自受试者的细胞的胞质溶胶。涉及的LF多肽组合物通常包含LF多肽和靶抗原，其中所述LF多肽(例如，LFn)没有共价地连接所述靶抗原。或者，在本文所述的该方面和其它方面的有些实施方案中，所述LF多肽可以以某些方式与靶抗原形成非共价地连接的复合物或结合，例如，形成LFn:靶抗原复合物，其中所述Un和靶抗原通过共价键以外的力(诸如范德华力、静电力等)而结合。在本文所述的该方面和其它方面的有些实施方案中，所述组合物包含LF多肽靶抗原复合物，其中所述LF多肽(例如，LFn)通过范德华力或其它非共价相互作用与靶抗原直接结合。在替代实施方案中，所述组合物包含LF多肽靶抗原复合物，其中所述LF多肽(例如，Un多肽) 与靶抗原间接结合，例如通过Un多肽与至少一个第三实体或部分的相互作用，且所述靶抗原也与第三实体(其与LFn多肽相互作用)的单独部分相互作用。在本文所述的该方面和其它方面的有些实施方案中，所述组合物包含LF多肽或 LFn多肽和靶抗原，其中所述LF多肽没有共价地连接到靶抗原上，但是所述LF多肽以某些方式与靶抗原非共价地结合或络合。例如，形成LFn:靶抗原复合物。在有些实施方案中，所述组合物包含LFn:靶抗原复合物，其中LFn(或其片段或变体)通过范德华力或其它非共价相互作用与靶抗原直接结合。在替代实施方案中，所述组合物包含LFn:靶抗原复合物， 其中所述LFn(或其片段或变体)与靶抗原间接结合，例如通过LFn(或其片段或变体)与至少一个第三部分的相互作用，且所述靶抗原与所述第三部分(其与Un多肽相互作用)相互作用。这样的相互作用可以是技术人员已知的任意非共价结合，例如，但不限于范德华力、亲水相互作用、疏水相互作用和其它非共价相互作用。在有些实施方案中，至少1个或至少2个或至少3或至少4或更多个第三实体可以用于使LFn(或其片段或变体)与靶抗原结合。例如，本发明包括组合物，其包含复合物，例如，LFn:部分靶抗原复合物、或Lfn: 部分部分靶抗原复合物、Lfn:部分部分部分靶抗原复合物、和诸如此类的复合物。在有些实施方案中，Un所结合的部分可以与靶抗原所结合的部分相同或不同，且所有部分可以在复合物内是相同的，或在复合物内是不同的。或者，在本文所述的该方面和所有其它方面，本发明也包括复合物，其中某部分共价地连接到LF多肽或靶物之一(但不是二者同时地)上。例如，靶抗原可以与某部分共价地键合(例如融合)，且所述部分可以通过非共价相互作用与LF多肽相互作用，使得靶抗原和LF多肽形成复合物。相反，LF多肽可以与某部分共价地键合(例如融合)，且所述部分可以通过非共价相互作用与靶抗原相互作用，使得靶抗原和LF多肽形成复合物。重要的是，尽管LF多肽和靶抗原不能共价地连接到相同部分上，但是它们可以共价地连接到不同的部分上，所述部分彼此非共价地相互作用，即，LF多肽可以共价地连接到部分A上，且靶抗原可以共价地连接到部分B上，且部分-A可以通过非共价相互作用与部分B相互作用， 形成LF-部分-A:部分-B-靶抗原复合物。A.炭疽芽孢杆菌的致死因子(LF)和N-端片段(Un)如上面简要地讨论的，炭疽致死因子或LF是由GenBank登录号M29081 (GeneID No :14343)编码的蛋白，其由炭疽芽孢杆菌天然地生成，且具有MAPKK蛋白酶活性。LF的删除分析表明，PA结合域位于Un的氨基端内。突变研究证实，PA结合域位于SEQ ID N0:1的 LF多肽的:34-2 区域内和SEQ ID NO :2的LF多肽的；34_288区域内(Arora等人，J. Biol. Chem. 268 :3334 3341(1993) ；Milne，等人，(1995)Mol. Microbiol. 15，661-66)。现在已经通过X-射线晶体学解决了 LF的三维原子分辨率结构。Andrew D. Parmifer等人在Nature 第414卷，第2四-233页Q001)中描述了 LF的晶体结构和它与16-氨基酸残基(16-聚体) 肽的复合物，所述肽代表它的天然的底物MAPKK-2的N-端，作为包含4个结构域的蛋白结构域I结合炭疽毒素的跨膜转移组分，即保护抗原(PA)；结构域II、III和IV —起形成长深沟，其容纳切割之前的MAPKK-2的16-残基N-端尾巴。结构域I位于另外3个结构域的上面，所述3个结构域紧密连接且构成单个折叠单元。结构域I和分子的剩余部分之间的唯一接触是与结构域II，并且这些主要涉及带电荷的极性的和水-介导的相互作用。界面的性质与要表达为可溶折叠结构域的重组N-端片段(残基1-254，不包括信号肽)的能力相一致，所述可溶折叠结构域维持结合PA的能力，并实现异源融合蛋白向胞质溶胶中的转移 (Ballard, J. D.，等人，1996，Proc. Natl Acad. Sci. USA 93,12531-12534 ；Goletz, T.J.等人，1997，Proc. Natl Acad. Sci. USA 94，12059-12064)。此外，LFn 的前 36 个残基的删除对它与PA的结合或LF的跨膜转移的能力没有影响(D. Borden Lacy,等人，2002，J. Biol. Chem.，277 :3006-3010)。结构域I由12-螺旋束组成，其靠在混合的4链β -折叠的一个面上包装，具有一个在第二链和第三链之间的大的(30-残基)有序环Li，在所述折叠的远端面上形成片状垂悬物(flap)(参见图1)。PA在结构域I上的确切停泊位点是未知的，但是，似乎需要折叠的结构域的完整性，因为推测会破坏折叠的埋入在结构域I中的残基的一系列插入和点突变体消除了 PA的结合和毒性(Quinn，C. P.，等人，1991，J. Biol. Chem.， 266 :20124-20130 ；Gupta, P.，等人，2001，Biochem. Biophys. Res. Comm.，280 :158-163)。另外，已经证实，在没有PA存在下，Un会递送外源蛋白抗原至B-细胞、CTL-细胞和巨噬细胞的胞质溶胶中的主要组织相容性复合物I类途径(Huyen Cao,等人，2002, The Journal of Infectious Diseases ；185 :244-251 ；N. Kushner，等人，2003，Proc Natl Acad Sci U S A. 100 :6652-6657)。独立于PA的LFn介导的靶抗原多肽递送取决于功能性的运输相关的蛋白，所述蛋白用于细胞内抗原加工和运输进内质网中以结合MHC I类分子。在结构域I的最后一个螺旋的末端处的一个突然转角，直接导致结构域II的第一个螺旋(残基沈3-四7和385-550)。尽管基于序列的对比没有产生任何同源性，与蜡状芽孢杆菌(B.cereus)毒素VIP2 (蛋白数据库登录代码1QS2)的催化结构域的结构相似性是显著的。结构域II和VIP2重叠，具有3.3人的RMSD，且具有15%的序列同一性，这通过DALI 测得(Holm，L. &Sander, 1997, Nucleic Acids Res. 25，231-234)。VIP2 含有一个 NAD-结合袋和参与NAD结合和催化的保守残基。结构域II缺少这些保守残基；此外，在ADP核糖基化毒素家族中保守的关键谷氨酸(Carroll, S. F. &Collier,R. J.，1984，Proc. Natl Acad. Sci. USA 81,3307-3311)被赖氨酸(K518)替换。我们因此预测，结构域II不具有ADP核糖基化活性。结构域III是一个具有疏水核心(残基303-382)的小α-螺旋束，其插入在结构域II的第二个和第三个螺旋的转角处。序列分析已经揭示101-残基区段的存在，所述区段包含5个串联重复序列(残基^2-38 ，并提示，重复序列2-5源自重复序列1的副本。 晶体结构揭示，重复序列1实际上形成结构域II的第二个螺旋-转角元件，而重复序列2-5 形成螺旋束的4个螺旋-转角元件，这提示通过母本结构域的短区段的重复复制而建立新的蛋白结构域的机理。LF活性需要结构域III，因为埋入在该结构域中的残基的插入诱变和点突变会消除功能(Quinn，C. P.，等人，1991，J. Biol. Chem. 266,20124-20130)。这造成与结构域II的有限接触，但是，与结构域IV共有疏水表面。它的位置使得，它严重地限制潜在底物(诸如球状蛋白的环)对活性部位的接近；也就是说，它促进蛋白底物的柔性“尾巴”的特异性。也通过与底物的特异性相互作用，促进序列特异性(参见下面)。结构域IV(残基552-776)由9_螺旋束组成，所述束靠着4链折叠而包装。序列对比没有检测到与除了 HExxH基序以外的已知结构的其它蛋白的任何同源性。三维结构揭示，β -折叠和前6个螺旋可以与金属蛋白酶嗜热菌蛋白酶的那些重叠，在131个残基内具
有4.9人的RMSD。大的插入和删除发生在连接这些元件的环内的别处，使得所述结构域的
总形状是非常不同的。具体地，插入在所述折叠的链42和43之间的大的有序环(U)会部分地遮蔽活性部位，靠着结构域II包装，并提供结构域III的支柱。锌离子( 2+)在四面与1个水分子和3个蛋白侧链配位，形成嗜热菌蛋白酶家族的典型排列。如预期的，2个配位残基是来自HExxH基序的组氨酸(His 686和His 690)， 它们位于一个螺旋G4)上。该结构揭示，第三个配位残基是来自螺旋46的Glu 735。来自 HExxH基序的Glu 687与水分子相距3.5 A,刚好定位成起在催化过程中活化锌-结合的水的一般碱的作用。酪氨酸残基(Tyr 728)的羟基与水分子形成强氢键(0-0距离为2.6人 )，在Glu 687的对侧，且可能起质子化胺离去基团的一般酸的功能。炭疽芽孢杆菌编码809氨基酸LF多肽。成熟的炭疽芽孢杆菌LF是通过切割 N-端前导肽而生成的796氨基酸多肽。两种酶活性的功能性结构域位于SEQ ID NO :1的氨基酸383和796之间。当与PA混合并添加给培养的巨噬细胞时，或当注射进动物中时， 没有该催化结构域的N-端截短的LF完全丧失任何毒性效应。但是，它确实仍然有效地结合PA。Un的PA结合域存在于SEQ ID NO :2的残基；34_288内(Milne，等人，(1995)Mol. Microbiol. 15,661-66)。所述基因编码的809氨基酸多肽炭疽芽孢杆菌LF具有7个潜在的N-糖基化位点， 它们位于天冬酰胺位置62、212、286、478、712、736和757处。在LFn (1-288)内，存在位于天冬酰胺位置62、212和286处的3个潜在的N-糖基化位点，它们都具有> 0. 51的电势， 这根据来自丹麦技术大学CTechnical University of Denmark)的NetNGlycl. 0预测软件测得。NetNglyc服务器使用人工神经网络来预测蛋白中的N-糖基化位点，所述人工神经网络会检查Asn-Xaa-Ser/Thr序列肽段(sequon)的序列背景。术语“Un多肽”包括由SEQ ID NO 3和4表示的LF多肽片段，以及保留将多肽靶抗原(它没有共价地连接所述Un多肽)递送至完整细胞(优选活细胞)的胞质溶胶的功能的重组LFn和功能性LFn等效物、片段和变体。术语“LFn多肽”因此包括功能性LFn 同源物诸如多态变体、等位基因、突变体和密切相关的物种间变体，它们与LFn具有至少约 60%氨基酸序列同一性，且具有将没有共价地连接LFn多肽的多肽靶抗原递送至细胞的胞质溶胶的功能(使用本文所述的试验测得)。在具体实施方案中，所述Un多肽与本文公开的SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4的LFn基本上相同。在有些实施方案中，通过在美国专利申请10/473，190(它通过引用并入本文)中公开的方法和试验，可以测定起将多肽靶抗原递送至完整细胞的功能的LFn的有些功能性多态变体、等位基因、突变体和密切相关的物种间变体。在有些实施方案中，LFn模仿物可用于本文所述的组合物和方法中。“LFn模仿物” 表示起LFn的功能将靶抗原递送至细胞的胞质溶胶以诱导针对该抗原的CMI应答的化合物或分子，例如，肽、多肽或小化学分子。Un模仿物因而包括Un同源物。Un模仿物也包括保留LFn的将多肽抗原(未连接LFn模仿物)递送至细胞的胞质溶胶的功能的小LFn 肽，及其保守置换变体，以及保留LFn的将多肽抗原(未连接LFn模仿物)递送至细胞的胞质溶胶的能力的截短形式的Un。如下测试Un模仿物使用在本文中和在美国专利申请 10/473，190(其通过引用整体并入本文)的实施例中公开的对靶抗原的CMI应答的测定法， 例如，对递送的靶抗原的CTL应答的诱导。当测试LFn模仿物时，LFn通常用作靶抗原向细胞的递送的阳性对照。尽管LF多肽的整个N-端氨基酸残基1488(即结构域I，参见图3)会促进其它蛋白的跨膜递送，应当理解，当非共价地连接LF多肽时，结构域I的更小片段可以足以跨细胞膜转移，并促进其它蛋白的跨膜递送。结构域I的X-射线晶体结构显示出12个α螺旋和 4个β折叠二级蛋白结构。LF多肽的结构域I的更小片段(其保留结构域I的α螺旋和 /或β折叠二级蛋白结构)可以用于跨细胞膜转移，并促进其它非共价地连接的蛋白(即靶抗原)的跨膜递送。使用本领域已知的方法，诸如圆二色性(CD)，本领域技术人员可以确定α螺旋和β折叠二级蛋白结构在LF多肽中的存在。本文描述的一个方面是，用于引起特定免疫应答、尤其是对靶抗原的细胞介导的细胞毒性的免疫应答(CMI)的方法，其中以非共价连接形式存在的组合物将靶抗原递送至细胞的胞质溶胶，所述组合物包含LF多肽，诸如LFn多肽或其片段或变体。在本文所述的该方面和其它方面的有些实施方案中，用于将未融合的(即非共价地连接的)靶抗原递送至细胞的胞质溶胶的优选蛋白是致死因子的N-端片段，在本文中称作“LFn”，并对应氨基酸 SEQ ID NO :4ο在有些实施方案中，本发明涉及引起对靶抗原的免疫应答的方法，其中所述靶抗原没有与LFn融合，且其中LFn接触靶抗原，并在没有PA存在下将靶抗原转导至细胞的胞质溶胶。本发明的一个方面涉及一种组合物，所述组合物包含LFn多肽或其同源物或片段和靶抗原，其中所述LFn没有共价地连接所述靶抗原，且所述LFn多肽或其片段没有直接地连接所述靶抗原。在有些实施方案中，所述组合物不包含ΡΑ。发明人已经发现，至少约250个氨基酸或更小、或至少约150个氨基酸或更小、或至少约104个氨基酸或更小的LFn片段能够将靶抗原递送给细胞，且可用于本文所述的方法和组合物中。在一个实施方案中，用于递送靶抗原多肽的LFn多肽包含SEQ. ID. No. 3的至少60 个羧基端氨基酸或其保守置换变体。在另一个实施方案中，所述Un多肽基本上由SEQ. ID. No. 3的60个羧基端氨基酸或其保守置换变体组成。在另一个实施方案中，所述LFn多肽由SEQ. ID. No. 3的60个羧基端氨基酸或其保守置换变体组成。在一个实施方案中，用于递送靶抗原多肽的LFn多肽包含SEQ. ID. No. 3的至少80 个羧基端氨基酸或其保守置换变体。在另一个实施方案中，所述Un多肽基本上由SEQ. ID. No. 3的80个羧基端氨基酸或其保守置换变体组成。在另一个实施方案中，所述LFn多肽由SEQ. ID. No. 3的80个羧基端氨基酸或其保守置换变体组成。在一个实施方案中，用于递送靶抗原多肽的Un多肽包含SEQ. ID. No. 3的至少104 个羧基端氨基酸或其保守置换变体。在另一个实施方案中，所述Un多肽基本上由SEQ. ID. No. 3的104个羧基端氨基酸或其保守置换变体组成。在另一个实施方案中，所述LFn多肽由SEQ. ID. No. 3的104个羧基端氨基酸或其保守置换变体组成。在一个实施方案中，用于递送靶抗原多肽的LFn多肽由与SEQ. ID. No. 5相对应的氨基酸序列或其保守置换变体组成。在另一个实施方案中，所述LFn多肽基本上由与SEQ. ID. No. 5相对应的氨基酸序列或其保守置换变体组成。在另一个实施方案中，所述Un多肽由与SEQ. ID. No. 5相对应的氨基酸序列或其保守置换变体组成。在一个实施方案中，用于递送靶抗原多肽的LFn多肽包含与SEQ. ID. No. 4相对应的氨基酸序列或其保守置换变体。在另一个实施方案中，所述Un多肽基本上由与SEQ. ID. No. 4相对应的氨基酸序列或其保守置换变体组成。在另一个实施方案中，所述Un多肽由与SEQ. ID. No. 4相对应的氨基酸序列或其保守置换变体组成。在一个实施方案中，用于递送靶抗原多肽的LFn多肽包含与SEQ. ID. No. 3相对应的氨基酸序列或其保守置换变体。在另一个实施方案中，所述Un多肽基本上由与SEQ. ID. No. 3相对应的氨基酸序列或其保守置换变体组成。在另一个实施方案中，所述Un多肽由与SEQ. ID. No. 3相对应的氨基酸序列或其保守置换变体组成。在有些实施方案中，本文所述的LFn多肽包含PA的非功能性结合位点，因而是不会产生与PA的功能性结合的LFn突变体。这样的突变体包括、但不限于在一个或多个与PA相互作用的关键残基处改变的突变体，诸如在一个或多个下述残基中的突变Y22 ；L188 ；D187 ；Y226 ；L235 ；H229(参见 Lacy 等人，J. Biol. Chem.，2002 ；277 ；3006-3010)； D106A ；Y108K ；E135K ；D136K ；N140A 和 K143A (参见 Melnyk 等人，J. Biol. Chem.，2006 ；281 ； 1630-1635和Cunningham等人，PNAS，2002 ；99 ；70497052，它们通过引用整体并入本文)。本文所述的LFn多肽或其保守置换变体，会促进没有共价地连接所述LFn多肽的靶抗原的跨膜递送。测定跨膜转移的方法是本领域众所周知的，描述在，例如，Wesche, J.,等人，1998，Biochemistry 37 15737-15746 和 kllman，B. R.，等人，2001 J.Biol. Chem. 276 :8371_8376。作为简单解释，在冰上冷冻在24-孔板中的CHO-Kl细胞，洗涤，并在冰上在体外转录/翻译系统(ftOmega)中用已经用[35S]甲硫氨酸标记的本文所述的任意 LF多肽(或其保守置换变体或结构域I的片段)和靶抗原温育池，然后用pH 5. 0或8. 0 的冰冷的PBS洗涤细胞，在37°C温育lmin，并用链霉蛋白酶处理以消化在细胞表面上残余的未转移的35S，或保留不处理作为对照。然后裂解细胞，测定释放进裂解缓冲液中的35S。 将易位百分比定义为被保护免于链霉蛋白酶的dpm/结合细胞的dpmXIOO。用促进跨膜递送的LF多肽或结构域I片段温育的细胞的细胞裂解物具有更高的易位百分比。或者，可以修饰或标记靶抗原和/或LFn多肽，以允许监视各自的跨膜递送。例如， LF多肽(诸如LFruLF或更小的结构域I片段)可以与荧光分子融合，所述荧光分子诸如可用于测定膜易位能力的绿荧光蛋白，这描述在N.Kushner，等人，2003 Jroc Natl Acad Sci USA. 100 :6652-6657。简而言之，在胶原处理过的室载玻片(BD Science)上培养HeLa细胞(美国典型培养物保藏中心)，以达到 80%汇合，并用40 μ g/ml纯化的GFP或LFn-GFP 在37°C温育1或浊。洗涤以后，对比GFP和GFP-LFn处理过的样品之间的GFP荧光。通过 LFn-GFP处理过的细胞中比用单独的GFP处理的细胞中更大的GFP信号，证实膜易位。也可以在有100 μ g/ml的作为胞吞途径标志物的得克萨斯红-缀合的转铁蛋白anvitrogen Inc. , Molecular Probes)存在下，进行有些温育。关于转铁蛋白实验，用冷的DMEM洗涤细胞4次，然后在4%低聚甲醛(在冷的PBS中)中固定15min。关于抗体标记，然后在冰上在50mM NH4Cl (在PBS中)中温育载玻片15min，再在冰上在含有0. 1 %皂苷的PBS中温育20min。在PBS中进一步洗涤以后，在控湿室中用含有4%驴血清和下述第一抗体的PBS 在室温温育载玻片1小时用于染色早期核内体的小鼠抗-早期核内体抗原l(EEA-l) (BD Laboratory)，用于染色晚期核内体和溶酶体的小鼠抗-Lampl和抗_Lamp2 (Developmental Studies Hybridoma Banks, University of Iowa, Iowa City),用于染色高尔基体的小鼠 Ab-I (癌基因)，来自Calbiochem的小鼠抗-线粒体抗体，和兔抗-钙网织蛋白(StressGen Biotechnologies，Victoria，Canada)。然后处理细胞，用于第二抗体染色和显微术。在细胞的内部，可以观察到促进跨膜递送的融合LFn-GFP。抗体标志物进一步指示转移的GFP的亚细胞定位。如上面简单地讨论的，在一个实施方案中，可用于本文所述的组合物和方法中的 Un多肽不结合炭疽芽孢杆菌保护抗原(PA)蛋白。所述PA蛋白是LF的天然结合配偶体， 它们形成二分蛋白外毒素，即致死毒素(LT)。所述PA蛋白是735-氨基酸多肽，即结合细胞表面受体的多功能蛋白，并介导复合物的装配和内化，将它们递送至宿主细胞核内体。一旦PA结合宿主受体，它会被宿主细胞表面(弗林蛋白酶家族)蛋白酶切割，然后它能够结合LF。PA的N-端的切割使得C-端片段自结合成环形七聚体复合物(pr印ore)，所述复合物可以结合LF，并将LF递送进胞质溶胶中。N-端片段(残基1188，结构域I)可以表达为可溶折叠结构域，其维持结合PA的能力，并实现非共价地连接的靶抗原蛋白易位进胞质溶胶中。已经证实，在没有PA存在下，该残基1-288N-端片段的更小片段也会将异源融合蛋白转移进胞质溶胶中。因此，在一个实施方案中，本文所述的LF的更小片段可以跨膜转移， 但是不结合PA。测量或检测蛋白-蛋白相互作用的方法是众所周知的。本领域技术人员可以测定PA结合活性，例如，通过与LFn —起混合和温育PA63 —段时间，化学交联形成的任意复合物，并通过凝胶电泳或通过放射性计数来分析共价连接的复合物，如Quirm CP.等人，1991，J. Biol. Chem. 266 :20124-20130所述。简而言之，通过与放射性标记的125I-LFn竞争，在5°C测定结合试验。使用Bolton-Hunter试剂(Amersham Corp)，放射性地标记( 7. 3X106Cpm/l·! g蛋白)天然的LF或全长N-端(氨基酸H88)Un。对于结合研究，如下冷却在孔组织培养板中培养的J774A. 1细胞在4°C温育60min，然后将平板放置在冰上。 然后用冷的)最低必需培养基替换培养基，所述最低必需培养基含有汉克盐(GIBCO/ BRL)，补充了 (w/v)牛血清白蛋白和25mM HEPES(结合培养基)。与放射性标记的天然 LF(125I-LF，0. 1μ g/ml，7. 3xl06cpm/y g) 一起，加入天然 PA (0. lg/ml)，将平板在湿冰上温育14h。测定处于不同浓度的突变型LF蛋白与天然125I-LF竞争的能力。为了定量结合的放射性标记的LF，在冷的结合培养基中轻轻洗涤细胞2次，在冷的汉克平衡盐溶液中洗涤1 次，溶解在0.50ml 0. IM NaOH中，并在γ计数器(Beckman Gamma 9000)中计数。在一个实施方案中，LFn多肽基本上缺少SEQ. ID. No. 3的氨基酸1-33。SEQ. ID. No. 3的氨基酸1-33包括预测会指导LF蛋白的翻译后运输的信号肽。在有些实施方案中，LFn多肽缺少起指导LF多肽的翻译后运输的功能的信号肽。在其它实施方案中，LFn多肽包含用于在ER上的共翻译的信号肽。信号肽也称作在N-端的前导肽，在穿过ER膜易位以后，其可以被切割掉或不被切割掉。信号肽的一个实例是MAPFEPLASGILLLLWLIAPSRA(SEQ ID NO :6)。信号肽的其它实例可以参见SPdb，即信号肽数据库，其可以参见环球网网址 http://proline, bic. nus. edu. sg/spdb/。在有些实施方案中，本文所述的LFn多肽是免疫沉默的，或基本上惰性的，这意味着，所述LFn多肽不起免疫原的功能(即它不是靶抗原)，且基本上不产生对它自身的CMI应答。在一个实施方案中，所述LF多肽是N-连接的糖基化的。N-糖基化对于有些真核蛋白的折叠而言是重要的，这会提供共翻译的和翻译后的修饰机制，所述机制调节膜和分泌的蛋白的结构和功能。糖基化是这样的酶促过程其连接糖以产生聚糖，并使它们结合蛋白和脂质。在N-糖基化中，聚糖在蛋白翻译过程中结合到天冬酰胺侧链的酰胺氮上。形成聚糖的3种主要的糖是葡萄糖、甘露糖和N-乙酰基葡糖胺分子。N-糖基化共有序列是 Asn-Xaa-Ser/Thr，其中Xaa可以是任意已知的氨基酸。本领域技术人员可以使用生物信息学软件(诸如来自丹麦技术大学的NetNGlyc 1. 0预测软件)，发现本发明的LF多肽中的N-糖基化位点。NetNglyc服务器使用人工神经网络来预测蛋白中的N-糖基化位点，所述人工神经网络会检查Asn-Xaa-Ser/Thr序列肽段的序列背景。可以在EXPASY万维网站上获得NetNGlyc 1. 0预测软件。在一个实施方案中，N-糖基化发生在本文所述的靶抗原多肽中。在另一个实施方案中，N-糖基化发生在LF多肽(诸如本文所述的Un多肽)中， 例如，在天冬酰胺位置62、212和/或286处，它们都具有> 0. 51的电势，这根据NetNGlyc 1.0预测软件测得。本发明的LF多肽中的N-糖基化的不同组合是可行的。在有些实施方案中，本文所述的LF多肽具有在这3个位点之一处的单个N-糖基化天冬酰胺位置62、212 和观6。在有些其它实施方案中，本文所述的LF多肽在这3个位点中的2个处被N-糖基化天冬酰胺位置62、212和观6。在另一个实施方案中，本文所述的LF多肽在所有3个位点处被N-糖基化天冬酰胺位置62、212和观6。在另一个实施方案中，N-糖基化发生在靶抗原多肽和LFn多肽中。在有些实施方案中，本文所述的LF多肽和/或靶抗原的聚糖被修饰，例如，唾液酸化或去唾液酸化。蛋白的糖基化分析是本领域已知的。例如，通过聚糖水解(使用酶诸如N-糖苷酶F、EndoS内切糖苷酶、唾液酸酶，或使用4N三氟醋酸)、衍生化和色谱分离诸如 LC-MS 或 LC-MS/MS(Pei Chen 等人，2008，J. Cancer Res. Clin. Oncology, 134 :851-860 ；Kainz, E.等人，2008，Appl Environ Microbiol.，74 :1076-1086)。根据来自丹麦技术大学的NetOGlyc 3. 1预测软件，预测基因编码的809-氨基酸多肽炭疽芽孢杆菌LF不具有任何0-糖基化位点。NetOglyc服务器产生蛋白中的粘蛋白型 GalNAc 0-糖基化位点的神经网络预测。但是，在有些实施方案中，在本文中使用的Un被 N-糖基化。在一个实施方案中，本文所述的LFn和/或抗原组合物包含糖基化的蛋白。换而言之，LF、LFn或靶抗原可以各自是糖基化的蛋白，例如，具有0-连接的糖基化或N-连接的糖基化。在另一个实施方案中，1^、1^11或靶抗原可以是0-连接的和N-连接的糖基化。在其它实施方案中，其它类型的糖基化是可能的，例如C-甘露糖基化。在本文所述的疫苗组合物的一个实施方案中，所述Un多肽被N-糖基化。蛋白的糖基化主要发生在真核细胞中。N-糖基化对于有些真核蛋白的折叠而言是重要的，这会提供共翻译的和翻译后的修饰机制，所述机制调节膜和分泌的蛋白的结构和功能。糖基化是这样的酶促过程其连接糖以产生聚糖，并使它们结合蛋白和脂质。在N-糖基化中，聚糖在蛋白翻译过程中结合到天冬酰胺侧链的酰胺氮上。形成聚糖的3种主要的糖是葡萄糖、甘露糖和N-乙酰基葡糖胺分子。 N-糖基化共有序列是Asn-Xaa-Ser/Thr，其中Xaa可以是任意已知的氨基酸。0_连接的糖基化发生在蛋白加工过程的晚期，可能是在高尔基体中。在0-连接的糖基化中，将N-乙酰基-半乳糖胺、0-岩藻糖、0-葡萄糖和/或N-乙酰基葡糖胺添加到丝氨酸或苏氨酸残基上。本领域技术人员可以使用生物信息学软件(诸如来自丹麦技术大学的NetNGlyc 1.0和 NetOGlyc预测软件)，发现本发明的多肽中的N-和0_糖基化位点。NetNglyc服务器使用人工神经网络来预测蛋白中的N-糖基化位点，所述人工神经网络会检查Asn-Xaa-Ser/Thr 序列肽段的序列背景。可以在EXPASY万维网站上获得NetNGlyc 1. 0和NetOGlyc 3. 1预测软件。在一个实施方案中，N-糖基化发生在本文所述的融合多肽的靶抗原多肽中。在另一个实施方案中，N-糖基化发生在本文所述的融合多肽的LFn多肽中，例如，在天冬酰胺位置62,212和/或286处，它们都具有> 0. 51的电势，这根据NetNGlyc 1. 0预测软件测得。本发明的融合多肽中的N-糖基化的不同组合是可行的。在有些实施方案中，本文所述的单个多肽和融合多肽具有在这3个位点之一处的单个N-糖基化LFn的天冬酰胺位置62、212和观6。在其它实施方案中，本文所述的单个多肽和融合多肽在这3个位点中的 2个处被N-糖基化丄而的天冬酰胺位置62、212和观6。在另一个实施方案中，本文所述的单个多肽和融合多肽在所有3个位点处被N-糖基化LFn的天冬酰胺位置62、212和观6。 在另一个实施方案中，N-糖基化发生在靶抗原多肽和Un多肽中。在有些实施方案中，本文所述的LFN和靶抗原多肽的聚糖被修饰，例如，唾液酸化或去唾液酸化。蛋白的糖基化分析是本领域已知的，例如，通过聚糖水解(使用酶诸如N-糖苷酶F、EndoS内切糖苷酶、唾液酸酶，或使用4N三氟醋酸)、衍生化和色谱分离诸如LC-MS或LC-MS/MS (Pei Chen等人， 2008, J. Cancer Res. Clin. Oncology, 134 :851-860 ；Kainz, Ε. 入，2008， Appl Environ Microbiol. ,74 :1076-1086)。预测LFn不具有> 0. 50电势的0-连接的糖基化位点。在一个实施方案中，由细菌细胞表达本文所述的Un多肽，并从使用选自下述宿主细胞的蛋白表达系统进行纯化哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞和植物细胞。重组蛋白的克隆、蛋白表达和纯化是已知的。本领域技术人员可以使用现代分子技术来构建编码本文所述的任意LF多肽的分离的多核苷酸，并将分离的多核苷酸连接进载体中以形成重组载体，其中所述重组载体是与使用选自下述宿主细胞的蛋白表达系统相容的表达载体: 细菌细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞和植物细胞。因而，哺乳动物细胞、昆虫细胞、 酵母细胞和植物细胞是优选的。优选地，所述宿主细胞可以N-糖基化重组LF多肽。表达载体存在许多选择，这取决于蛋白表达系统的选择和使用的宿主细胞的类型。在一个实施方案中，所述重组载体是病毒载体，例如，重组杆状病毒载体、腺伴随病毒(AAV)载体或慢病毒载体。病毒载体会提供将编码多核苷酸构建体导入希望的宿主细胞中的便利。例如， 腺伴随病毒(AAV)载体或慢病毒载体会感染哺乳动物细胞，杆状病毒载体会感染鳞翅类昆虫细胞，例如，草地贪夜蛾(Spodoptera frugipevda)细胞。本文所述的Un多肽在真核宿主细胞(例如哺乳动物细胞和昆虫细胞)中的表达，可以导致这样表达的Un多肽的N-糖基化。B. LF多肽的生产i.表达系统通过本领域普通技术人员已知的常规方法，诸如通过重组遗传学领域的常规技术，可以容易地生产重组蛋白(诸如本文所述的LF多肽)。公开了用于本发明中的一般方法的基本教科书包括Sambrook 等人，Molecular Cloning, A Laboratory Manual (第 2 版 1989) ；Kriegler, Gene Transfer and Expression :A Laboratory Manual(1990)；禾口 Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel 等人，编，1994))。根据 Beaucage&Caruthers，Tetrahedron Letts. 22 :1859 1862(1981)首次描述的固相亚磷酰胺三酯方法，使用如在Van Devanter等人，Nucleic Acids Res. 12 6159 6168(1984)中所述的自动化的合成仪，可以化学地合成编码不可商业得到的LF 多肽的核酸序列。可以纯化寡核苷酸，例如，通过天然丙烯酰胺凝胶电泳，或通过在 Pearson&Rcanier, J. Chrom. 255 137 149(1983)中所述的阴离子-交换 HPLC。在克隆以后，使用例如Wallace等人，Gene 16:21 26(1981)的用于测序双链模板的链终止方法，可以验证合成的寡核苷酸或克隆的编码LF多肽的基因的序列。A.用于分离编码LFn的核苷酸序列的克隆方法一般而言，从cDNA和基因组DNA文库，可以克隆编码LF多肽(诸如Un)的核酸序列，或者使用寡核苷酸引物使用扩增技术进行分离。例如，Un序列通常分离自炭疽芽孢杆菌核酸(基因组或cDNA)文库。通常将编码DNA序列克隆进中间载体中，然后转化进原核或真核细胞中，用于复制和/或表达。这些中间载体通常是原核生物载体，例如，质粒或穿梭载体，如下所述。使用引物的扩增技术也可以用于从DNA或RNA扩增和分离LFn编码序列(参见美国专利号 4,683，195 和 4,683,202 ；PCR Protocols :A Guide to Methods and Applications (Irmis等人，编，1990))。诸如聚合酶链式反应(PCR)和连接酶链式反应 (LCR)等方法可以用于直接地从mRNA、从cDNA、从基因组文库或cDNA文库和从质粒扩增LF 的核酸序列。简并的寡核苷酸可以用于扩增同源物。这些引物可以用于，例如，扩增几百个核苷酸的探针，然后将所述探针用于筛选全长LF的人文库，然后将所述文库用于制备LFn。 或者，可以直接地扩增LFn的核酸。使用抗体作为探针，也可以从表达文库分离出编码LF多肽(诸如LFn)的核酸。合成的寡核苷酸可以用于构建重组Un基因，其用作探针、用于表达蛋白和用于构建多态变体或突变体，诸如删除突变体。该方法如下实现使用一系列重叠寡核苷酸，它们的长度通常是40-120碱基对，代表基因的有义链和无义链。然后退火、连接和克隆这些DNA片段。在严谨的杂交条件下，使用LFn核酸探针和寡核苷酸，通过使用探针筛查文库，或使用上述的扩增技术，可以分离与Un基本上相同的多态变体、等位基因、和物种间同源物。或者，表达文库可以用于克隆多态变体、等位基因和物种间同源物，其中用抗血清或纯化的抗体(其也识别和选择性地结合同源物)免疫学地检测表达的同源物。已经克隆并测序了编码LF的基因，且已经指定Genebank登记号 M29081 (Robertson&Leppla，Gene 44:7178(1986) ；Bragg&Robertson，Gene 81:45 54 (1989)；也参见美国专利号5，591，631，美国专利号5，677，274 ；通常参见Leppla, Anthrax Toxins, Bacterial Toxins and Virulence Factors in Disease (Moss 等人，编， 199 )。通常将目标核酸克隆进中间载体中，然后转化进原核或真核细胞中，进行复制和/ 或表达。这些中间载体通常是原核生物载体，例如，如下所述的质粒或穿梭载体。为了得到克隆的基因(诸如编码LFn的那些cDNA)的高水平表达，通常将核酸亚克隆进含有指导转录的强启动子、转录/翻译终止子以及(对于编码蛋白的核酸)用于翻译起始的核糖体结合位点的表达载体中。合适的细菌启动子是本领域众所周知的，且描述在，例如，Sambrook等人和Ausubel等人。用于表达LFn蛋白的细菌表达系统可从例如大肠杆菌、芽孢杆菌属和沙门菌属得到(Palva等人，Gene 22:229235(1983) ；Mosbach等人， Nature 302 :543M5 (1983))。用于这样的表达系统的试剂盒是可商业得到的。用于哺乳动物细胞、酵母和昆虫细胞的真核表达系统是本领域众所周知的，且也是可商业得到的。用于指导异源核酸的表达的启动子取决于具体用途，且不是关键性的。示例性的启动子包括SV40早期启动子、SV40晚期启动子、金属硫蛋白启动子、鼠乳腺肿瘤病毒启动子、鲁斯肉瘤病毒启动子、多角体蛋白启动子或经证实对于在真核细胞中的表达有效的其它启动子以及原核启动子。优选地，启动子离异源转录起始位点的距离，与它在天然场合中离转录起始位点的距离大致相同。但是，如本领域已知的，可以调节该距离的有些变化，而不丧失启动子功能。除了启动子以外，表达载体通常含有转录单元或表达盒，其含有在宿主细胞中表达核酸必需的所有额外元件。一个典型的表达盒因而也含有转录物的有效聚腺苷酸化所需的信号、核糖体结合位点和翻译终止。编码选择的基因的核酸序列通常可以产生可切割的信号肽序列，以促进转化的细胞对编码的蛋白的分泌。这样的信号肽包括来自组织纤溶酶原活化剂、胰岛素和神经元生长因子和烟芽夜蛾的保幼激素酯酶的信号肽，以及其它。所述盒的额外元件可以包括增强子以及(如果基因组DNA用作结构基因)具有功能性剪接供体和受体位点的内含子。除了启动子序列以外，表达盒还应当含有在结构基因下游的转录终止区，以提供有效终止。终止区可以从与启动子序列相同的基因得到，或可以从不同的基因得到。通常包含在表达载体中的额外元件也包括在大肠杆菌中起作用的复制子，编码抗生素抗性的基因(以允许选择包含重组质粒的細菌)，在质粒的非必需区中的独特限制位点(以允许插入真核序列)。另外，有些表达系统具有提供基因扩增的标志物，诸如胸苷激酶、潮霉素B磷酸转移酶和ニ氢叶酸还原酶。选择的具体抗生素抗性基因不是关键的，本领域已知的的许多抗性基因中的任ー种都是适用的。如果必要的话，优选地选择原核序列， 使得它们不干扰DNA在真核細胞中的复制。用于将遗传信息运输进細胞中的具体表达载体不是特别关键的。可以使用用于在真核或原核細胞中表达的任意常规载体。标准的細菌表达载体包括质粒诸如基于PBR322 的质粒、pSKF、pET23D，和在有些情况下，融合表达系统诸如GST和LacZ。其它示例性的真核载体包括pMSG、pAV009/A+、ρΜΤΟΙΟ/Α+、pMAMneo_5、杆状病毒pDSVE。也可以将标签添加到重组蛋白上，以提供方便的分离方法，例如，c-myc或六组氨酸。使用标准的转染方法来生产表达大量Un蛋白的細菌、哺乳动物、酵母或昆虫细胞系，然后使用标准技术来纯化所述Un蛋白(參见例如Colley等人J. Biol. Chem. 264 17619 17622(1989) ；Guide to Protein Purification，见Methods in Enzymology，第 182卷(Deutscher，編，1990))。根据标准技术，进行真核和原核細胞的转化，所述标准技术例如磷酸钙转染、聚凝胺、原生质体融合、电穿孔、脂质体、显微注射、等离子体载体、 病毒载体(參见，例如，Morrison, J. Bact. 132 :349351 (1977) ；Clark-Curtiss&Curtiss， Methods in Enzymology 101 :347362 (Wu 等人，编，1983)。在将表达载体导入細胞中以后，在有利于表达选择的基因的条件下，培养转染的細胞，使用下面指出的标准技木，从培养物中回收所述細胞。通过本领域技术人员众所周知的蛋白和分子方法，可以合成和纯化本文公开的所有LF多肽(例如，Un多肽)。优选地，使用分子生物学方法和重组异源蛋白表达系统。例如，可以在哺乳动物、昆虫、酵母或植物細胞中表达重组蛋白。LF的重组克隆和截短、LFru它们的表达和特异位点突变和插入的有些实例描述在，例如，W0/2002/079417, W0/2008/04^89，美国专利号 20040166120，Huyen Cao,等入，2002， The Journal of Infectious Diseases ； 185 :244-251 ；N. Kushner, ^A, 2003, Proc Natl Acad Sci USA. 100 :6652-6657 ；Ballard, J. D.，等人，1996，Proc. Natl Acad. Sci.USA 93，12531-12534 ；和 Goletz，T. J.等人，1997，Proc. Natl Acad. Sci. USA 94， 12059-12064，它们通过引用整体并入本文。与在这些參考文献中描述的那些类似的方案可以用于生产LF多肽，诸如本文所述的LFn多肽。在一个实施方案中，通过本领域普通技术人员通常已知的常规聚合酶链式反应 (PCR)克隆技木，可以生产编码LF多肽(诸如本文所述的Un多肽)的分离的多核苷酸。在有些实施方案中，可以从相同的表达载体表达LF多肽和靶抗原，其中每个多核苷酸(即ー 个编码LF多肽，ー个编码靶抗原)被隔开，使它们表达为分开的(非共价地连接的)蛋白。 通常，编码LF多肽的多核苷酸和编码靶抗原的多核苷酸被IRES (内核糖体进入位点)核酸序列隔开。可以将编码LF多肽(和/或靶抗原多核苷酸)的多核苷酸克隆进一般用途克隆载体中，诸如 PUC19、pBR322、pBluescript 载体(Stratagene Inc.)或来自 Invitrogen Inc.的pCRTOPO 。得到的携帯编码LF多肽(诸如本文所述的Un多肽)的核酸的重组载体然后可以用于其它分子生物学操作诸如定点诱变，以产生本文所述的变体LF多肽，或可以亚克隆进蛋白表达载体或病毒载体中，用于在多种蛋白表达系统中的蛋白合成，其中使用选自下述的宿主細胞哺乳动物細胞系、昆虫細胞系、酵母、細菌和植物細胞。每个PCR引物应当具有至少15个与它的对应模板在要扩增的区域重叠的核苷酸。 用于PCR扩增中的聚合酶应当具有高保真度，诸如Mrategene的PfuUltra 聚合酶，以减少PCR扩增过程中的序列错误。为了容易地将几个単独的PCR片段连接到一起，例如在LF 多肽(诸如Un多肽)的构建中，井随后插入克隆载体中，所述PCR引物还应当在它们的侧接末端上具有単独的且独特的限制酶切消化位点，所述侧接末端在PCR扩增过程中不与 DNA模板对合。每对特异性引物的限制酶切消化位点的选择，应当使得编码LF多肽(诸如 Un多肽)的DNA序列位于框架内，并从开始至结束没有终止密码子地编码LF多肽。同吋， 选择的限制酶切消化位点应当不存在于编码LFn多肽的DNA序列内。可以将编码融合多肽的DNA序列连接进克隆载体pBR322或它的衍生物之一中，用于扩增、验证嵌合编码序列的保真度和真实性、LF多肽中的特定氨基酸突变和置換的置換/或特异性定点诱变。或者，使用例如hvitrogen的Τ0Ρ0 克隆方法，在拓扑异构酶-辅助的TA载体 (诸如 pCR -Τ0Ρ0、pCR -Blunt 11-TOPO, pENTR/D-TOPO 和 pENTR/SD/D-T0P0 )中， 可以将编码LF多肽(诸如LFn多肽)的DNA序列PCR克隆进载体中。pENTR/D-T0P0 和 pENTR/SD/D-TOPO 都是定向的Τ0Ρ0进入载体，它们允许以5，- 3，朝向将DNA序列克隆进(Gateway 表达载体中。以5’ヰ3’朝向的定向克隆会促进DNA序列单向插入蛋白表达载体中，使得启动子位于编码LF多肽的DNA序列的5’ ATG起始密码子的上游，实现启动子驱动的蛋白表达。可以将携带编码LF多肽的DNA序列的重组载体转染进普通的克隆大肠杆菌(诸如 XLlBlue、SURE (Stratagene)和 TOP-IO 细胞(Invitrogen))中，并繁殖。可以使用本领域技术人员已知的标准技木，将突变导入编码LFn多肽(例如，SEQ. ID. No. 3和4)的核苷酸序列中(以建立在LF多肽(例如，SEQ. ID. No. 3或4或5所述的 LFn多肽)中的多肽序列的氨基酸置換)，所述标准技术包括，例如，定点诱变和PCR-介导的诱变。优选地，所述变体LF多肽与LF或LFn多肽相比具有小于50个氨基酸置換、小于 40个氨基酸置換、小于30个氨基酸置換、小于25个氨基酸置換、小于20个氨基酸置換、小于15个氨基酸置換、小于10个氨基酸置換、小于5个氨基酸置換、小于4个氨基酸置換、小于3个氨基酸置換、或小于2个氨基酸置換。也可以在DNA编码序列中产生某些沉默的或中性的错义突变，它们不会改变编码的氨基酸序列或促进跨膜递送的能力。这些类型的突变可用于优化密码子选择，或改善重组蛋白表达和生产。载体中多肽的编码序列的特异性的定点诱变，可以用于建立特异性的氨基酸突变和置換。根据生产商的说明书，使用例如来自Mratagene的QUIKCHANGE 定点诱变试剂盒，可以进行定点诱变。在一个实施方案中，本文公开了包含本文所述的LF多肽(例如，Un多肽)的编码DNA序列的表达载体，用于表达和纯化使用选自下述的宿主细胞从蛋白表达系统生产的重组LF多肽例如，哺乳动物、昆虫、酵母或植物細胞。表达载体应当具有必要的5’上游和3’下游调控元件，诸如启动子序列、核糖体识别位点和TATA盒和3’ UTR AAUAAA(SEQ ID NO=Il)转录终止序列，以实现在它各自的宿主細胞中的有效基因转录和翻译。表达载体可以具有额外的序列，诸如6X-组氨酸、V5、硫氧还蛋白、谷胱甘肽-S-转移酶、c-Myc、VSV-G、 HSV, FLAG、麦芽糖结合肽、金属结合肽、HA和“分泌”信号(例如，蜜蜂蜂毒肽、PHO、Bip)， 它们掺入表达的LF多肽中。另外，可以存在掺入在这些序列以后的酶消化位点，以促进它们的酶去除(在不需要它们以后)。这些额外的序列可用于检测LF多肽表达，用于通过亲和色谱法进行蛋白纯化，用于增加重组蛋白在宿主细胞质中的溶解度，和/或用于将表达的LF多肽外泌到培养基中或分泌到酵母細胞的原生质球外。LF多肽的表达可以是在宿主細胞中组成型的，或它可以被下述因素诱导例如，硫酸铜、糖类诸如半乳糖、甲醇、甲胺、硫胺、四环素、杆状病毒的感染和(异丙基-β -D-硫代半乳糖苷)IPTG (即乳糖的稳定合成类似物)。在一个实施方案中，包含LF多肽(诸如本文描述的Un多肽)的重组载体是促进蛋白表达的表达载体。在另ー个实施方案中，包含本文描述的LF多肽的表达载体是病毒载体，诸如腺病毒、腺伴随病毒(AAV)、逆转录病毒、杆状病毒和慢病毒载体以及其它。所述表达载体可以是病毒载体或非病毒载体。重组病毒会提供用于基因表达研究和治疗用途的通用系统。LF多肽(例如，本文所述的LFn多肽)可以在多种表达宿主細胞中表达，例如，酵母、哺乳动物細胞、昆虫細胞和植物細胞(诸如衣藻属)，或甚至在无细胞的表达系统中表达。可以将所述核酸从克隆载体亚克隆进重组表达载体中，所述重组表达载体适合在哺乳动物、昆虫、酵母或植物細胞或无细胞的表达系统(诸如兔网织红细胞表达系统)中表达LF 多肽。可以如下实现亚克隆通过PCR克隆，限制酶切消化井随后连接，或重组反应诸如基于λ噬菌体的位点特异性的重组(使用GATEWAY LR和BP CL0NASE 酶混合物)的那些。亚克隆应当是单向的，使得核酸的5’ATG起始密码子位于表达载体中的启动子的下游。 将有些载体设计成转移编码核酸，用于在ー个单个重组反应中在哺乳动物細胞、昆虫細胞和酵母中表达。例如，将有些GATEWAY (Invitrogen)目标载体设计成用于构建杆状病毒、 腺病毒、腺伴随病毒(AAV)、逆转录病毒和慢病毒，它们在感染它们各自的宿主细胞以后，允许LF多肽在适当宿主細胞中的异源表达。根据生产商的说明书，在仅2个步骤中，将基因转移进目标载体中。存在用于在昆虫細胞、哺乳动物細胞和酵母中进行蛋白表达的GATEWAY 表达载体。在大肠杆菌中转化和选择以后，表达载体准备好用于在适当宿主中表达。其它表达载体和宿主細胞的实例是基于强CMV启动子的pcDNA3. 1 (Invitrogen) 和pCHneo载体(!Iomega)，它们用于在诸如CHO、COS、HEKJ93、Jurkat和MCF-7等哺乳动物细胞系中表达；不能复制的腺病毒载体pAdeno X、pAd5F35、pLP-Adeno-X-CMV (Clontech)、 pAd/CMV/V5-DEST、pAd-DEST载体(Invitrogen)，它们用于在哺乳动物細胞中的腺病毒介导的基因转移和表达；pLNCX2、pLXSN和pLAPSN逆转录病毒载体，它们与来自Clontech 的Retro-X 系统一起使用，用于在哺乳动物細胞中的逆转录病毒介导的基因转移和表达；pLenti4/V5-DEST 、pLenti6/V5-DEST 和 pLenti6. 2/V5-Gff/lacZ (Invitrogen)，它们用于在哺乳动物細胞中的慢病毒介导的基因转移和表达；腺病毒相关病毒表达载体诸如 pAAV-MCS、pAAV-IRES-hrGFP 和 pAAV-RC 载体(Stratagene)，它们用于在哺乳动物细胞中的腺伴随病毒介导的基因转移和表达；BACpali6杆状病毒(Clontech)和pFastBac HTanvitrogen)，它们用于在草地贪夜蛾 9(Sf9)、Sf 11、Tn_368 和 BTI-TN-5B4-1 昆虫细胞系中表达；pMT/BiP/V5-His anvitrogen)，其用于在 Drosophila Schneider S2 细胞中表达；毕赤酵母表达载体pP ICZ α、pP ICZ、pFLD α和pFLD (I η ν i tr ο gen)，它们用于在巴氏毕赤酵母中表达，和用于在甲醇毕赤酵母中表达的载体PMET α和ρΜΕΤ ； pYES2/GS和 pYDl (Invitrogen)载体，它们用于在酿酒酵母中表达。在莱氏衣藻中大规模表达异源蛋白的新近进展，描述在Griesbeck C.等人 2006 Mol. Biotechnol. 34 :213-33 和 Fuhrmann M. 2004，Methods Mol Med. 94 191-5。通过同源重组，将外来异源编码序列插入細胞核、叶绿体和线粒体的基因组中。叶绿体表达载体p64(其携帯大部分通用叶绿体选择标记氨基糖苷腺苷酰转移酶(aadA)，后者赋予对大观霉素或链霉素的抗性)可以用于在叶绿体中表达外来蛋白。生物射弹基因枪方法可以用于将载体导入藻类中。在它进入叶绿体以后，外源DNA从基因枪颗粒释放出来，并通过同源重组整合进叶绿体基因组中。在有些情况下，适用于表达LF多肽(诸如本文所述的Un多肽)的系统包括杆状病毒表达系统(即BEVS系统)。在这样的杆状病毒表达系统中，第一个步骤是，通过同源重组或通过位点特异性的转座，构建重组杆状病毒载体。为了通过同源重组得到重组杆状病毒载体，需要杆状病毒转移载体。杆状病毒转移载体是ー种暂时载体，其唯一目的是，使在适当基因启动子下的外源编码DNA插入杆状病毒基因组中不会影响正常病毒复制的位点处。杆状病毒转移载体包含杆状病毒基因组序列的一部分，该部分跨外源编码DNA的预期插入位点。大部分普通区域含有多角体蛋白或PlO基因。二者对于在細胞培养物和昆虫幼虫中的病毒复制和传染性胞外病毒的生产而言不是必要的。两种蛋白在病毒复制的非常晩期高度表达，并实现外源基因的高水平转录(当插回病毒基因组中时)。ー种典型的杆状病毒转移载体包含启动子、转录终止子和侧接启动子两侧的最常见的天然病毒序列和区域(它们与病毒基因组中的靶基因同源)。在启动子和转录终止子之间的区域可以具有多个限制性酶消化位点，用于促进外源编码序列的克隆，在该情况下，编码LF多肽(例如，LFn 多肽)和靶抗原的DNA序列。可以包括额外的序列，例如，信号肽和/或标签编码序列(诸如His-标签、MAT标签、FLAG标签)、肠激酶的识别序列、蜜蜂蜂毒肽分泌信号、β -半乳糖苷酶、在MCS上游的谷胱甘肽S-转移酶(GST)标签，用于促进重组病毒的分泌、鉴别、适当插入、阳性选择和/或重组蛋白的纯化。在构建杆状病毒转移载体以后，将它与AcNPV病毒 DNA混合，并共转染进昆虫細胞中，以实现感染。通过同源重组事件的双交叉，去除天然多角体蛋白基因，并用要在昆虫細胞中表达的外源编码序列替换。通过删除或插入实现的多角体蛋白基因的灭活，会产生不产生在感染的細胞中的包含体的突变体。这些包含体阴性的病毒形成的空斑不同于由野生型病毒生成的空斑，该特征性的空斑形态学可用作筛选重组病毒的工具。在一个实施方案中，通过从重组杆状病毒载体表达，可以生产本文所述的LF多肽。在另ー个实施方案中，由昆虫細胞表达本文所述的任意LF多肽。在另ー个实施方案中， 从昆虫細胞分离本文所述的任意LF多肽。在昆虫細胞中进行杆状病毒的蛋白表达存在几个益处，包括高表达水平、容易放大、生产具有翻译后修饰的蛋白、和简化的細胞生长。昆虫細胞的生长不需要CO2,且可以容易地适应用于大规模表达的高密度悬浮培养。在哺乳动物系统中存在的许多翻译后修饰途径也被用于昆虫細胞中，这允许生产在抗原性、免疫原性、 和功能性方面类似于天然哺乳动物蛋白的重组蛋白。仅作为背景，且不希望受理论的约束，杆状病毒是属于杆状病毒科的DNA病毒。已知这些病毒具有狭窄的宿主范围，主要限于昆虫的鳞翅类物种(蝴蝶和蛾)。杆状病毒苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)(其已经变成原型杆状病毒)在敏感的培养的昆虫細胞中有效地复制。AcNPV具有约130，000碱基对的双链闭环DNA基因組，并关于宿主范围、分子生物学和遗传学进行了确定表征。许多杆状病毒(包括AcNPV)在感染的細胞的核内形成大蛋白晶体包含体。称作多角体蛋白的単一多肽占这些包含体的蛋白质量的大约95%。 多角体蛋白的基因作为单个拷贝存在于AcNPV病毒基因组中。因为多角体蛋白基因不是培养的細胞中的病毒复制所必需的，可以将其容易地修饰成表达外源基因。将外源基因序列插入AcNPV基因中，刚好在多角体蛋白启动子序列的3'，使得它在多角体蛋白启动子的转录控制下。杆状病毒表达载体系统(BEVS)是安全且快速的在昆虫細胞和昆虫(在Max D. Summers博士的实验室中开发出来)中大量生产重组蛋白的方法。杆状病毒表达系统是在昆虫細胞中的高水平重组蛋白表达的有力且通用的系统。 使用杆状病毒表达系统，已经报道了高达500mg/l的表达水平，这使它成为高水平表达的理想系统。通过杆状病毒DNA和含有目标基因序列的嵌合质粒之间的同源重组，构建出表达外源基因的重组杆状病毒。借助于它们的独特的空斑形态学，可以检测重组病毒，并空斑纯化至同质性。杆状病毒特别适合用作真核克隆和表达载体。因为它们的狭窄宿主范围(限于节肢动物)，它们通常是安全的。美国环境保护部(EPA)已经批准3个杆状病毒种用于控制昆虫害虫的应用。在EPA实验应用许可下，AcNPV已经应用于农作物多年。AcNPV野生型和重组病毒在多种昆虫細胞中复制，包括从秋粘虫、草地贪夜蛾(鳞翅目；夜蛾科)衍生出的连续细胞系。草地贪夜蛾細胞具有18-24小时的群体倍増时间，且可以在单层中或在游离的悬浮培养物中繁殖。在本文所述的该方面和其它方面的一个实施方案中，本发明提供了一种组合物， 其用于产生或检测对靶抗原多肽的細胞-介导的免疫(CMI)应答，所述组合物包含LF多肽 (诸如LFn多肽或其片段)，所述LF多肽未与靶抗原连接或者与靶抗原非共价地连接，其中所述LF多肽会促进靶抗原跨膜递送至完整細胞的胞质溶胶。大量杆状病毒转移载体和对应的适当修饰的宿主细胞是可商业得到的，例如， 来自 BD Biosciences 的 pAcGP67、pAcSECG2TA、pVL1392、pVL1393、pAcGHLT 禾Π pAcAB4 ； 来自 Novagen 的 pBAC-3、pBAC-6、pBACgus-6 和 pBACsurf-1,和来自 Sigma Aldrich 的 pPolh-FLAG和pPolh-MAT。使用特別设计的寡核苷酸探针和本领域众所周知的聚合酶链式反应(PCR)方法，本领域技术人员能够克隆和连接炭疽芽孢杆菌致死因子N-端(LFn)部分或其片段的编码区。本领域技术人员还能够克隆和连接LF多肽的编码序列到选择的杆状病毒转移载体中。Un和靶抗原多肽或其片段的编码序列应当连接在框架中，且嵌合编码序列应当连接在启动子的下游，在启动子和转录终止子之间。此后，将重组杆状病毒转移载体转染进常规克隆大肠杆菌，诸如XLlBlue。然后通过抗生素抗性，选择重组转移载体DNA，以去除任何未重组的质粒DNA，井随后扩增和纯化，用于转染进草地贪夜蛾(SF)細胞中。作为ー个实例，使用寡核苷酸5' -GGAGGAACATATGGCGGGCGGTCATGGTGATG-3' (SEQ. ID. NO. 9)来导入NdeI位点，并用作扩增LFn-(氨基酸1-263)的编码DNA序列的正向引物，使用寡核苷酸 5 ‘ -CTAGGATCCTTACCGTTGATCTTTAAGTTCTTCC-3 ‘ (SEQ. ID. NO. 10)来导入BamHI位点，并用作反向引物。根据GenBank登记号iC9081，使用cDNA模板，进行PCR 扩增。可以相应地设计 LFn- (28-263)、LFn- (33-263)、LFn- (37-263)、LFn- (40-263)和 LFn-(43-263)的正向引物，以允许PCR扩增适当截短的LFn的编码序列，并也导入NdeI位点。因此，使用在5’末端的NdeI限制位点和在3’末端的BamHI限制位点，可以容易地生产多核苷酸编码序列，以允许单向克隆进适当的表达克隆载体，诸如杆状病毒表达载体。所述序列可以在LF序列的编码区后面导入终止序列(TAA)。在扩增的LF编码序列的末端处的共同BamHI位点会促进扩增的编码序列连接进适当表达载体中，诸如选择的杆状病毒转移载体，其含有具有适当朝向的NdeI和BamHI位点。可以将新构建的杆状病毒转移载体转化进大肠杆菌DH5中。通过消化，可以筛选大肠杆菌转化体，并通过测序进行验证。此后， 可以分离杆状病毒转移载体，用于共转染进昆虫細胞中实现同源重組。为了通过位点特异性的转座得到重组杆状病毒载体，例如使用Tn7将外源基因插入在大肠杆菌中繁殖的杆粒DNA，Invitrogen Inc.提供了 pFASTBAC 质粒和含有杆粒的 DH10BAC 感受态大肠杆菌，用于通过位点特异性的转座来构建重组杆状病毒载体。将编码序列克隆进pFASTBAC 质粒中，并使用微-attTn7靶位点和辅助质粒将所述重组质粒转化进包含杆粒(杆状病毒穿梭载体)的DH10BAC 感受态大肠杆菌中。在有辅助质粒提供的易位蛋白存在下，在pFASTBAC 质粒上的微-attTn7元件可以转座至杆粒上的微_attTn7靶位点。通过抗生素选择，并通过蓝/白筛查，鉴别含有重组杆粒的菌落，因为转座导致在杆粒上的微-attTn7靶位点所侧接的LacZ基因的破坏。然后收获杆粒，用于转染昆虫細胞。在有些情况下，可以进行杆状病毒转移载体中的嵌合编码序列的特异性的定点诱变，以建立特异性的氨基酸突变和置換，以进ー步促进跨膜递送、蛋白表达或蛋白折叠。氨基酸置換的实例包括用谷氨酸置換天冬氨酸。根据生产商的说明书或本领域已知的任意方法，例如，使用来自Mratagene的QUIKCHANGE 定点诱变试剂盒，可以进行定点诱变。使用标准的病毒DNA来共转染草地贪夜蛾(SF)細胞。从这些转染的单层細胞所表达的病毒中，分离出含有重组分子的假定的重组病毒。因为已经去除了多角体蛋白结构基因，可以容易地鉴别出含有重组病毒的空斑，因为它们缺少包含体。通过本领域众所周知的方法，诸如与特异性的基因探针杂交、空斑试验和终点稀释，证实这些重组体含有希望的嵌合编码序列。一种优选的用于从本文所述的重组杆状病毒生产蛋白的宿主細胞系是Sf900+。另一种优选的用于从重组杆状病毒生产蛋白的宿主細胞系是Sf9。Sf900+和Sf9是源自秋粘虫、草地贪夜蛾(鳞翅目；夜蛾科)的未转化的、非致瘤性连续細胞系。在观士2で繁殖Sf900+和Sf9細胞。不进行ニ氧化碳补充。为Sf9細胞使用的培养基是TNMFH，即盐、维生素、糖和氨基酸的简单混合物，补充了 10%胎牛血清。除了胎牛血清以外，在細胞繁殖中不使用其它动物衍生产物(即，胰蛋白酶等)。无血清的培养基(可作为Sf900培养基得到，Gibco BRL, Gaithersburg, Md.)也可以用于培养Sf9細胞，其优选地用于繁殖Sf900+細胞。Sf9細胞具有18-M小时的群体倍増时间，且可以在单层中或在游离的悬浮培养物中繁殖。尚未报道草地贪夜蛾細胞支持任何已知的哺乳动物病毒的复制。
杆状病毒转染的单层SF細胞的空斑试验是本领域众所周知的。一旦建立表达蛋白的重组杆状病毒载体，就可以扩增和纯化病毒，用于感染SF細胞。病毒的纯化。使用已知的纯化方法，诸如蔗糖密度梯度离心，从培养基中纯化由第一代生产的病毒颗粒。例如，在感染后M-48小吋，通过离心感染的細胞的培养基，收获病毒。将得到的病毒沉淀物重新悬浮于缓冲液中，并通过缓冲的蔗糖梯度进行离心。从梯度的 40-45%蔗糖区域收获病毒帯，用缓冲液稀释，并通过在100，OOOXg离心进行沉淀。将纯化的病毒沉淀物重新悬浮于缓冲液中，在-70°C保存，或用于大规模感染細胞，进行蛋白生产。感染过程(包括病毒蛋白合成、病毒装配和部分細胞裂解)可以在感染后大约72 小时之前完成。这可以是蛋白依赖性的，因而可以更早或更晚地发生。在感染的細胞中生产的蛋白可以用mS-甲硫氨酸、3H-亮氨酸或3H-甘露糖进行放射性标记，且通过在聚丙烯酰胺凝胶上的电泳，可以分析结合細胞的多肽和脱离细胞的多肽，以测定它们的分子量。也可以在感染后的不同时间，在細胞裂解之前，检查这些产物的表达。在有些实施方案中，可以从哺乳动物細胞的病毒感染，表达本文所述的LF多肽。 病毒载体可以是，例如，腺病毒、腺伴随病毒(AAV)、逆转录病毒和慢病毒。He TC.等人 Proc. Natl. Acad. Sci. USA95 :2509-2514,1998提出了用于制备重组腺病毒的简化系统。首先将目标基因克隆进穿梭载体中，例如pAdTrack-CMV。通过用限制性内切核酸酶Riie I消化，使得到的质粒线性化，随后使用腺病毒骨架质粒(例如Mratagene的AdEasy 腺病毒载体系统的PAdEasy-I)，共转化进大肠杆菌BJ5183細胞中。关于卡那霉素抗性，选择重组腺病毒载体，并通过限制性内切核酸酶分析来证实重组。最后，将线性化的重组质粒转染进包装腺病毒的細胞系中，例如HEK 293細胞(El-转化的人胚肾細胞)或911(E1_转化的人胚视网膜细胞)(Human Gene Therapy 7:215-222,1996)。在HEK 293细胞内制备重组腺
ラ丙母。重组慢病毒具有下述优点将与靶抗原未连接的或没有共价地连接的LF多肽(例如，Un多肽)递送至分裂的和未分裂的哺乳动物细胞中并表达。与基于Moloney白血病病毒(MoMLV)的逆转录病毒系统相比，基于HIV-I的慢病毒可以有效地转导更宽范围的宿主。使用例如 pLenti4/V5-DEST 、pLenti6/V5-DEST 或 pLenti 载体以及来自 hvitrogen 的ViraPower 慢病毒表达系统，可以制备重组慢病毒。重组腺伴随病毒(XkkV)载体适用于宽范围的宿主細胞，包括许多不同的人和非人細胞系或组织。rAAV能够转导宽范围的细胞类型，且转导不依赖于活跃的宿主細胞分裂。 在上清液中容易地得到高效价(> IO8病毒颗粒/ml)，进ー步浓缩为IOll-IO12病毒颗粒/ ml。将转基因整合进宿主基因组中，使表达是长期的且稳定的。通过包装細胞系的3质粒共转染，进行AAV载体的大规模制备将携帯编码核酸的 AAV载体、含有AAV rep和cap基因的AAV RC载体和腺病毒辅助质粒pDF6共转染进亚汇合的293細胞的50x150mm平板中。在转染后3天，收获細胞，通过3个冻融循环或通过声处
理，释放病毒。根据载体的血清型，通过2种不同的方法，可以纯化AAV载体。基于它对肝素的亲和力，通过单步重力流动柱纯化方法，纯化AAV2载体(Auricchio，Α.，等人，2001，Human Gene therapy 12 ；71-6 ；Summerford, C.禾ロ R. Samulski，1998，J.Virol. 72 :1438-45 ； Summerford, C.和 R. Samulski，1999，Nat. Med. 5 :587-88)。目前通过 3 个连续 CsCl 梯度，纯化AAV2/1和AAV2/5载体。ii.蛋白纯化系统通过本领域技术人员已知的多种方法，可以表达和纯化LF多肽，例如，本文所述的Un多肽。例如，可以从任意合适的表达系统纯化重组LF或Un多肽。通过标准技木， 可以将多肽纯化至高纯度，所述标准技术包括使用诸如硫酸铵等物质的选择性沉淀、柱色谱法、免疫纯化方法和其它方法(參见，例如，ScopesJrotein Purification principles and Practice (1982)；美国专利号 4，673，641 ；Ausubel 等人，同上；和 Sambrook 等人，同上)。下一步是纯化用于本文所述的应用和組合物中的蛋白，例如评价作为疫苗或筛查剂的应用。如果本文所述的LF多肽被设计成具有分泌信号肽，编码的多肽经常释放进細胞培养基中。可以浓缩来自这些感染的細胞的培养基，并使用标准方法纯化蛋白。可以使用盐沉淀、蔗糖梯度离心和色谱法、高压液相色谱法或快速蛋白液相色谱法(HPLC或FPLC)， 因为这些方法允许快速地、定量地且大规模地纯化蛋白，且不会使表达的产物变性。目标基因产物的合成效率取决于多种因素，包括(1)表达载体系统的选择；(2) 在細胞中可用作生产mRNA的模板的基因拷贝的数目；(3)启动子強度；(4)mRNA的稳定性和结构；(5)用于起始或翻译的核糖体的有效结合；(6)蛋白产物的性质，例如，基因产物的稳定性或产物对宿主細胞的致命性；(7)系统的合成蛋白的能力，和从细胞输出蛋白从而简化以后的分析、纯化和应用的能力。当纯化重组蛋白吋，可以采用许多操作。例如，具有确定的分子粘附性质的蛋白可以可逆地与选择的蛋白融合。利用适当的配体，可以将蛋白选择性地吸附至纯化柱上，然后以相对纯的形式从柱释放。然后通过酶活性，去除融合的蛋白。最后，使用亲和柱或免疫亲和柱，可以纯化选择的蛋白。在宿主細胞中表达蛋白以后，可以裂解宿主細胞，以释放表达的蛋白进行纯化。在
“样品制备-用于蛋白研究的工具(Sample Pi^paration-jTools for Protein Research,
EMD Bioscience)” 中，和在蛋白科学的流行方法(Current Protocols in Protein Sciences(CPPS), CPPS)中，表征了裂解不同宿主細胞的方法。优选的纯化方法是亲和色谱法，诸如使用镍、钴或锌亲和树脂的金属离子亲和色谱仪(对于组氨酸标记的LF多肽)。 Clontech描述了纯化组氨酸标记的重组蛋白的方法(使用它们的TALON 钴树脂)，并被 Novagen描述在它们的pET系统手册第10版中。另ー种优选的纯化策略是免疫亲和色谱法，例如，抗-myc抗体缀合的树脂可以用于亲和纯化myc-标记的LF多肽。当存在适当的蛋白酶识别序列吋，可以从组氨酸或myc标签切割下LF多肽，从亲和树脂释放出LF多肽， 同时将组氨酸-标签和myc-标签保留结合在亲和树脂上。使用铜亲和色谱法，可以亲和纯化未标记的LF多肽。用于纯化重组的和天然存在的蛋白的标准蛋白分离技术是本领域众所周知的，例如溶解度分级分离、尺寸排阻凝胶过滤和各种柱色谱法。溶解度分级分离经常作为初始步骤，特別当蛋白混合物是复合物吋，最初的盐分级分离可以使许多不希望的宿主細胞蛋白(或源自细胞培养基的蛋白)与目标蛋白分离。 优选的盐是硫酸铵。硫酸铵通过有效地减小蛋白混合物中的水的量，使蛋白沉淀。蛋白然后基于它们的溶解度进行沉淀。蛋白越疏水，它在更低的硫酸铵浓度沉淀出来的可能性越大。ー种典型的方案包括将饱和硫酸铵加入蛋白溶液中，使得得到的硫酸铵浓度是20-30%。 该浓度会沉淀出大部分疏水蛋白。然后抛弃沉淀物(除非目标蛋白是疏水的)，将硫酸铵加入上清液中至已知会沉淀出目标蛋白的浓度。然后将沉淀物溶解在缓冲液中，如果必要的话，通过透析或渗滤，去除多余的盐。依赖于蛋白的溶解度的其它方法，诸如冷乙醇沉淀法， 是本领域技术人员众所周知的，且可以用于分级分离复杂的蛋白混合物。尺寸差别过滤选择的蛋白的分子量，可以用于使它与更大和更小尺寸的蛋白分离，其中使用穿过不同孔径的膜(例如，Amicon或Millipore膜)的超滤。作为第一歩，穿过具有比目标蛋白的分子量更低的分子量截止的孔径的膜，超滤蛋白混合物。然后使用具有大于目标蛋白分子量的分子截止的膜，超滤所述超滤的渗余物。重组蛋白会穿过膜进入滤液中。然后可以如下所述，对滤液进行色谱分离。柱色谱法基于它的尺寸、净表面电荷、疏水性和对配体的亲和力，也可以使选择的蛋白与其它蛋白分离。另外，可以将针对重组的或天然存在的蛋白产生的抗体缀合到柱基质上，并免疫纯化蛋白。所有这些方法是本领域众所周知的。技术人员会明白，可以在任意规模，使用来自许多不同生产商(例如，Pharmacia Biotech)的装置，进行色谱技木。例如，使用 PA63 七聚体亲和柱(Singh 等人，J. Biol. Chem. 269 :29039 29046 (1994))，可以纯化Un。在有些实施方案中，可以使用纯化步骤的组合，纯化本文所述的LF多肽，所述纯化步骤包括，例如α)阴离子交換色谱法，( )羟磷灰石色谱法，( )疏水相互作用色谱法，和(iv)尺寸排阻色谱法。也预见到无细胞的表达系统。无细胞的表达系统会提供胜过传统的基于细胞的表达方法的几个优点，包括容易修改反应条件以利于蛋白折叠，降低的对产物毒性的敏感性，和因为减小的反应体积和过程时间而对高处理量策略(诸如快速表达筛查或大量蛋白生产)的适应性。无细胞的表达系统可以使用质粒或线性DNA。此外，翻译效率的提高已经导致超过毫克蛋白/毫升反应混合物的产量。Spirin AS.等人，Science 242 =1162(1988) 描述了能够以高产量生产蛋白的无细胞的翻译系统的ー个实例。所述方法使用穿过反应混合物的进料缓冲液的连续流设计，所述进料缓冲液含有氨基酸、三磷酸腺苷(ATP)和三磷酸鸟苷(GTP)，并连续去除翻译的多肽产物。该系统使用大肠杆菌裂解物来提供无细胞的连续进料缓冲液。该连续流系统与原核和真核表达载体相客。Chang G.等人，Science 310 1950-3(2005)描述了完整膜蛋白EmrE多药转运蛋白的大规模无细胞生产。其它可商业得到的无细胞的表达系统包括EXPRESSWAY 无细胞的表达系统 anvitrogen)，其利用基于大肠杆菌的体外系统进行有效的、偶联的转录和翻译反应， 以试管反应形式生产多达毫克量的活性重组蛋白；快速翻译系统(RTQ (Roche Applied kience)，其也使用基于大肠杆菌的体外系统；和TNT偶联的网织红細胞裂解物系统 (Promega)，其使用基于兔网织红細胞的体外系统。C.靶抗原在本文所述的该方面和所有其它方面的一个实施方案中，靶抗原是希望递送至胞质溶胶的任意抗原。所述靶抗原未连接至LF多肽上，或非共价地连接至LF多肽上。因而， 在有些实施方案中，也包括结合的抗原，例如通过有些形式的非共价连接，诸如静电相互作用、范德华力等。
在有些实施方案中，抗原包括病毒、細菌、寄生物和肿瘤相关抗原。优选的病毒抗原包括来自希望产生細胞-介导的免疫应答的任意病毒的蛋白。特別优选的病毒包括 HIV-1、HIV_2、肝炎病毒(包括乙型和丙型肝炎)、埃波拉病毒、西尼罗病毒和疱疹病毒诸如 HSV-2。优选的細菌抗原包括来自伤寒沙门氏菌和分枝杆菌(包括结核分枝杆菌)的那些。 优选的寄生物抗原包括来自疟原虫属(包括恶性疟原虫)的那些。抗原也可以包括，例如， 致病的肽、毒素、类毒素、它们的亚基或它们的組合(例如，破伤风、白喉类毒素、霍乱亚基B
寸ノ ο在有些实施方案中，本文所述的靶抗原多肽是与病状(例如传染病或病原体)或癌症或免疫病(诸如自身免疫病)有关的任意抗原。为了提高产生对靶抗原的細胞介导的应答的可能性，可以分析靶抗原多肽的氨基酸序列，以便鉴别可以參与受体结合(诸如与 MHC受体的结合)或与受体结合有关的目标氨基酸序列部分，或抗原结合的靶受体。例如， 可以对靶抗原多肽序列进行计算机分析，以鉴别这样的位点。在有些实施方案中，靶抗原是整个病毒或减毒病毒，其中减毒病毒是不活的或无活性的病毒。在这样的实施方案中，組合物包含LF多肽(诸如Un多肽)和靶抗原(诸如整个病毒，诸如未连接LF多肽的减毒病毒)，所述LF多肽起类似于经典佐剂的功能(即所述LF多肽会增强免疫应答，诸如对整个和/或减毒的病毒靶抗原的CMI应答)。传染病抗原的ー个实例是TbH9(也称作Mtb 39A)，即ー种结核抗原。其它结核抗原包括、但不限于:DPV(也称作 Mtb8. 4)、381、Mtb41、Mtb40、Mtb32A、Mtb9. 9A、Mtb9. 8、 Mtbl6、Mtb72f、Mtb59f、Mtb88f、Mtb71f、Mtb46f 和 Mtb31f ( “f” 指示它是融合体或 2 个或更多个蛋白)。如果抗原本身不可容易地溶解，所述抗原可以悬浮存在于制剂中，或甚至作为聚集体。在有些实施方案中，可以将疏水抗原溶解在去污剂中，例如含有跨膜结构域的多肽。 此外，对于含有脂质体的制剂，可以将在去污剂溶液(例如，細胞膜提取物)中的抗原与脂质混合，然后可以通过去除去污剂(通过稀释、透析或柱色谱法)来形成脂质体。某些抗原 (例如，来自病毒(例如，甲型肝炎)的那些)不需要自身是可溶性的，但是可以以病毒体的形式直接掺入脂质体中(Morein和Simons，1985)。Plotkin和Mortimer (1994)提供了可以用于接种动物或人以诱导对特定病原体特异性的免疫应答的抗原，以及制备抗原的方法，測定抗原的合适剂量的方法，測定免疫应答的诱导的方法，和治疗病原体(例如，細菌、病毒、真菌或寄生物)感染的方法。靶细菌包括、但不限干炭疽、弯曲杆菌属、霍乱、白喉、肠毒性的大肠杆菌、贾第虫属、淋病双球菌、幽门螺杆菌(Lee和Chen，1994)、流感嗜血杆菌B、非典型流感嗜血杆菌、脑膜炎双球菌、百日咳、肺炎球菌、沙门菌属、志贺菌属、链球菌B、A群链球菌、破伤风、霍乱弧菌、耶尔森菌属、葡萄球菌属、假单胞菌种和梭状芽胞杆菌种。靶病毒包括、但不限于腺病毒、登革热血清型1-4(Delenda等人，1994 ；Fonseca 等人，1994 ；Smucny等人，1995)、埃博拉(Jahrling等人，1996)、肠道病毒、肝炎血清型 A-E (Blum, 1995 ；Katkov, 1996 ；· Lieberman 禾ロ Greenberg，1996 ；Mast, 1996 ；Shafara 等人， 1995 ；Smedila等人，1994 ；美国专利号5，314，808和5，436，126)、单纯疱疹病毒1或2、人免疫缺陷病毒(D印rez等人，1996)、流感、日本马脑炎、麻疹、诺瓦克病毒、乳头状瘤病毒、 细小病毒B19、脊髄灰质炎、狂犬病、轮状病毒、风疹、麻疹、牛痘、含有编码其它抗原(诸如疟疾抗原)的基因的牛痘构建体、水痘和黄热病。靶寄生物包括、但不限干溶组织内阿米巴Oiang等人，1995)、疟原虫属(Bathurst 等人，1993 ;Chang 等人，1989，1992，1994 ;Fries 等人，1992a，1992b ； Herrington 等人，1991 ；Khusmith 等人，1991 ；Malik 等人，1991 ；Migliorini 等人，1993 ； Pessi 等人，1991 ；Tam, 1988 ；Vreden 等人，1991 ；White 等人，1993 ；Wiesmueller 等人， 1991)、利什曼原虫属(Frankenburg等人，1996)、弓形虫病和蠕虫。抗原也可以包含在生物战中使用的那些，诸如蓖麻蛋白，通过抗体可以实现针对它们的保护。在本文所述的该方面和所有其它方面，通过重组方式可以表达用于本发明的组合物中的靶抗原，且在有些实施方案中，可以将它表达为与亲和标签或表位标签的融合体 (Summers 和 Smith, 1987 ；Goeddel, 1990 ；Ausubel 等人，1996)，或与第三种实体(用于与 LF 多肽形成非共价连接或复合物的目的)的融合体；可以使用寡肽(游离的，或与载体蛋白缀合)的化学合成，得到本发明的抗原(Bodanszky，1993 ；Wisdom，1994)。寡肽被视作ー类多月TU在一个实施方案中，所述靶抗原是细胞内病原体靶抗原多肽。病原体已经被定义为，能够造成对宿主的损害的微生物。細胞内病原体是这样的微生物其可以进入細胞内部，在宿主細胞内存活，并造成对宿主和/或宿主細胞的损害。例如，病原体可以被宿主细胞吞噬和/或内呑，随后病原体逃出吞噬体或胞内体。病原体然后寄居在細胞内，以避免其它/随后的宿主防御，诸如抗体，并繁殖。巨噬细胞的吞噬是针对病原体的主要前线宿主防御机制。当病原体没有逃出吞噬体或胞内体吋，吞噬的或吞食的病原体被来自溶酶体的酶消化。来自病原体蛋白的消化过的更小的肽与宿主細胞MHC分子形成复合物，并在細胞外展示给宿主中的其它免疫細胞，从而刺激宿主的免疫系统对特定病原体做出应答。在本文所述的MHC分子的背景下，当展示并呈递给宿主免疫細胞吋，細胞内病原体靶抗原多肽可以刺激宿主中的免疫应答，这可以涉及免疫学领域已知的许多细胞过程。这样的应答的方面包括細胞因子生产量的増加，抗体生产量的増加，和B-細胞繁殖的増加。細胞内病原体包括、但不限于病毒、某些细菌和某些原生动物。它们会造成多种人疾病和疾患结核、麻风、伤寒、杆菌性痢疾、瘟疫、布鲁杆菌病、肺炎、斑疹伤寒；洛矶山斑疹热、衣原体、沙眼、淋病、利斯特菌病、猩红热/风湿热、“脓毒性”咽喉炎、肝炎、AIDS、先天性病毒感染、单核細胞增多症、伯基特淋巴瘤和其它淋巴细胞增生性疾病、冷疱、生殖器疱疹、生殖器疣、宫颈癌、 利什曼病、疟疾和锥虫病，还有很多，这里不再一一列挙。在一个实施方案中，所述靶抗原多肽是来自原核病原体的細胞内病原体靶抗原多肽。一种原核病原体是細菌。在一个实施方案中，所述细胞内原核病原体包括但不限于结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌、单核细胞增生李斯特菌、伤寒沙门菌、痢疾志贺菌、鼠疫耶尔森菌、布鲁杆菌属、嗜肺军团病杆菌、立克次体族、衣原体、产气荚膜梭菌、肉毒梭菌、金黄色葡萄球菌、苍白密螺旋体、流感嗜血杆菌、苍白密螺旋体、肺炎克雷伯菌、铜绿假单孢菌、小隐抱子虫、肺炎链球菌、百日咳杆菌和脑膜炎奈瑟球菌。在一个实施方案中，所述靶抗原多肽是来自病毒病原体的細胞内病原体靶抗原多肽，其中所述病毒天然地感染哺乳动物宿主細胞。在一个实施方案中，所述病毒病原体包括、但不限于单纯疱疹病毒1型、单纯疱疹病毒2型、HBV、巨細胞病毒、非洲淋巴細胞瘤病毒、水痘-帯状疱疹病毒、人疱疹病毒6、人疱疹病毒7、人抱疹病毒8、天花病毒、水疱性ロ炎病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、脊髄灰质炎病毒、鼻病毒、冠状病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒.麻疹病毒、多瘤病毒、人乳头瘤病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、柯萨奇病毒、登革热病毒、腮腺炎病毒、脊髄灰质炎病毒、 狂犬病病毒、鲁斯肉瘤病毒、黄热病病毒、埃波拉病毒、马尔堡病毒、拉沙热病毒、东方马脑炎病毒、日本脑炎病毒、圣路易斯脑炎病毒、Murray山谷热病毒、西尼罗病毒、立夫特山谷热病毒、甲型轮状病毒、乙型轮状病毒、丙型轮状病毒、Sindbis病毒、狂犬病病毒、人T-細胞白血病病毒1型、汉坦病毒、风疹病毒和猿免疫缺陷病毒。在一个实施方案中，所述靶抗原多肽是寄生病原体的細胞内病原体靶抗原多肽。 在一个实施方案中，所述细胞内寄生病原体包括、但不限于结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌、 单核细胞增生李斯特菌、伤寒沙门菌、痢疾志贺菌、鼠疫耶尔森菌、布鲁杆菌属、嗜肺军团病杆菌、立克次体族、衣原体、产气荚膜梭菌、金黄色葡萄球菌、苍白密螺旋体、流感嗜血杆菌、苍白密螺旋体、肺炎克雷伯菌、铜绿假单孢菌、肺炎链球菌、百日咳杆菌、脑膜炎奈瑟球菌、杜氏利什曼原虫、疟原虫属物种、卡氏肺囊虫、锥虫属、单纯疱疹病毒1型、单纯疱疹病毒2型、HBV、巨細胞病毒、非洲淋巴細胞瘤病毒、水痘-帯状疱疹病毒、人疱疹病毒6、人疱疹病毒7、人疱疹病毒8、天花病毒、水疱性口炎病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、脊髄灰质炎病毒、鼻病毒、冠状病毒、甲型流感病毒、 乙型流感病毒.麻疹病毒、多瘤病毒、人乳头瘤病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、柯萨奇病毒、登革热病毒、腮腺炎病毒、脊髄灰质炎病毒、狂犬病病毒、鲁斯肉瘤病毒、黄热病病毒、埃波拉病毒、马尔堡病毒、拉沙热病毒、东方马脑炎病毒、日本脑炎病毒、圣路易斯脑炎病毒、 Murray山谷热病毒、西尼罗病毒、立夫特山谷热病毒、甲型轮状病毒、乙型轮状病毒、丙型轮状病毒、Sindbis病毒、狂犬病病毒、人T-細胞白血病病毒1型、汉坦病毒、风疹病毒和猿免疫缺陷病毒。在一个实施方案中，所述靶抗原多肽是结核分枝杆菌的抗原。在一个实施方案中，所述靶抗原多肽是TB-特异性的抗原，包括，但不限干包含SEQ ID N0:7或其片段的 TBI (CFP)多肽，或者，包含SEQ ID NO :8或其片段的TB2 (ESAT)多肽。在另ー个实施方案中，靶抗原多肽是至少15个氨基酸长度的細胞内病原体靶抗原多肽。例如，靶抗原可以是恶性疟原虫环孢子蛋白的91氨基酸片段(氨基酸27-117)， 所述环孢子蛋白是疟原虫子孢子对活细胞的侵入所涉及的优势表面蛋白，所述侵入导致疟疾。在替代实施方案中，通过诱导抗-钳合蛋白抗体，本发明也可以用于在疟疾中引起针对抗原(诸如病毒抗原，诸如钳合蛋白)的抗原特异性的免疫应答，以防止红细胞结合血管内皮。在替代实施方案中，本发明可以用于引起针对病毒抗原的抗原特异性的免疫应答，诸如用于诱导保护性抗体诸如抗甲型肝炎、抗乙型肝炎或抗戊型肝炎的抗体，其中在组合物中使用与LFn或其片段相組合的整个灭活的病毒或者病毒-衍生的亚基或重组产物。在替代实施方案中，本文公开的组合物和方法可以用于针对破伤风、白喉和其它毒素介导的疾病进行保护，以诱导杭-毒素抗体的生产。例如，预见到破伤风“強化”，其中本文公开的组合物包含LFn或其片段和靶抗原类毒素(诸如破伤风毒素或白喉或片段诸如破伤风C片段)。在初次免疫以后，通过用相同的或类似的抗原或用标准疫苗組合物(例如，类毒素疫苗)进行注射或经皮免疫，可以实现強化。疫苗接种也可以用作癌症和自身免疫病的治疗。例如，用肿瘤抗原(例如，前列腺特异性的抗原或PSA)进行疫苗接种，可以以抗体、CTL和淋巴細胞増殖的形式诱导免疫应答，这允许身体的免疫系统识别和杀死肿瘤細胞。已经证实，靶向树突細胞(朗格汉斯細胞是它的ー个具体子集)是癌症免疫疗法的重要策略。在本文所述的该方面和所有其它方面的一个实施方案中，靶抗原是肿瘤抗原。许多肿瘤与特定蛋白的表达和/或某些蛋白的过表达有关。例如，前列腺癌与高水平的诸如前列腺特异性的抗原(PSA)等蛋白有关。乳腺癌与诸如Her-2、MuC-l、CEA等蛋白的表达和 /或过表达有关。因而，在这样的恶性肿瘤的治疗中，已经将大量注意力放在尝试产生对这样的抗原的免疫应答(具体地，发展CMI)。可用于本文所述的该方面和所有其它方面的肿瘤抗原包括，例如PSA、Her-2、Mic-l和CEA。其它肿瘤抗原包括在引起T细胞应答中所识别的那些表位，包括但不限于下述的前列腺癌抗原(诸如PSA、PSMA等)、乳腺癌抗原(诸如 HER2/neu、mini-MUC、MUC-l、HER2 受体、乳腺珠蛋白、迷路、SCP-1、NY-ES0-1、SSX_2、N-端阻断的可溶性的細胞角蛋白、43kD人癌症抗原、PRAT、TUAN、Lb抗原、癌胚抗原、聚腺苷酸聚合酶、p53、mdm-2、p21、CA15-3、癌蛋白18/stathmin和人腺体激肽释放酶)、黑素瘤抗原等。 根据本文所述的方法和組合物可被LF多肽递送的肿瘤抗原，被描述用于黑素瘤(美国专利号5，102，663，5，141，742，和5, 262, 177，它们通过引用整体并入本文)、前列腺癌(美国专利号5，538，866)和淋巴瘤(美国专利号4，816，249,5, 068，177和5，227，159，它们都通过引用整体并入本文)。在本文所述的该方面和所有其它方面的一个实施方案中，靶抗原是T-细胞受体寡肽。例如，用T-细胞受体寡肽进行疫苗接种，可以诱导停止自身免疫病的进展的免疫应答(美国专利号 5，612，035 和 5，614，192 ；Antel 等人，1996 ；Vandenbark 等人，1996)。美国专利号5，552，300(其通过引用整体并入本文)也描述了适用于治疗自身免疫病的抗原。 在本文所述的该方面和所有其它方面的一个实施方案中，靶抗原是T-细胞受体V抗原，其在美国专利号5，552，300 (其通过引用整体并入本文)中予以讨论。在本文所述的该方面和所有其它方面的一个实施方案中，靶抗原是错误折叠的或不适当地折叠的蛋白或多肽，例如不是处于它的天然构象的蛋白。这样的蛋白的实例包括 由编码蛋白的突变体核酸序列表达的蛋白。通常，如果核酸中的突变导致蛋白中与野生型 (即非突变核酸)相比非保守的氨基酸变化，所述蛋白可以具有构象变化(即不是处于它的天然构象)或被错误折叠。在有些情况下，由非保守的氨基酸变化导致的错误折叠的多肽可以导致本领域普遍已知的“功能获得”，其中错误折叠的多肽的生物学功能不同于正确折叠的多肽和/或额外添加给正确折叠的多肽。术语“功能获得突变”表示这样的遗传突变其中突变基因产生与野生型相比具有额外能力的蛋白。这样的不同的功能或额外的能力，可以是例如蛋白聚集、异常的亚细胞定位、和在正确折叠的(即天然构象)多肽中不会存在的其它功能。实例是，例如，淀粉样蛋白以及在神经变性疾病中的突变蛋白，包括但不限于在ALS中的突变的SODl或突变的TDP-43基因，在聚谷氨酰胺障碍中生产蛋白的突变基因，诸如在亨廷顿病中的突变的亨廷顿基因，和在阿尔茨海默氏病中的突变的淀粉样蛋白。不希望受理论的约束，淀粉样蛋白是不溶性的纤维蛋白聚集体，它们具有特殊的结构特性。淀粉样蛋白在器官中的异常积累可以导致淀粉样变性，且可以在多种其它神经变性疾病中起作用。具有淀粉样蛋白的疾病包括、但不限干阿尔茨海默氏病(β淀粉样蛋白)、II型糖尿病(IAPP)、帕金森病(α-突触核蛋白)、传递性海绵状脑病aka “疯牛病”(朊病毒)、亨廷顿病(聚谷氨酰胺重复序列)、甲状腺管道样癌(降钙素)、淀粉样变性 (免疫球蛋白)、散发性包涵体肌炎(S-IBM)、嗜铬細胞瘤和骨髄炎。异常的蛋白聚集也存在于许多神经变性障碍中，包括AD、帕金森病、克雅氏病、动神经元疾病诸如ALS、聚谷氨酰胺障碍大群体(包括亨廷顿病)、以及周边组织的疾病如家族性淀粉样蛋白多神经病(FAP)。在本文所述的该方面和所有其它方面的一个实施方案中，靶抗原可以是疾病或障碍涉及的蛋白。本文使用的疾病或障碍“涉及的”基因包括这样的基因它的正常或异常的表达或功能会影响或造成疾病或障碍或所述疾病或障碍的至少ー种症状。本文使用的术语 “功能获得突变”表示这样的基因中的任意突变其中由所述基因编码的蛋白(即，突变蛋白)获得所述蛋白(即，野生型蛋白)通常不具有的功能，并造成或促进疾病或障碍。功能获得突变可以是基因中的一个或几个核苷酸的删除、添加或置換，其导致编码的蛋白的功能的变化。在一个实施方案中，所述功能获得突变会改变突变蛋白的功能，或造成与其它蛋白的相互作用。在另ー个实施方案中，所述功能获得突变会造成正常的野生型蛋白的减少或去除，例如，通过改变的突变蛋白与所述正常的野生型蛋白的相互作用。在本文所述的该方面和所有其它方面的一个实施方案中，靶抗原可以是从具有多态性的基因表达的蛋白。本文使用的术语“多态性”表示，当对比来自不同来源受试者(但是来自相同生物)的相同基因序列吋，鉴别或检测出的基因序列中的变化(例如，删除、插入或置換)。例如，当对比来自不同受试者(但是来自相同生物)的相同基因序列吋，可以鉴别出多态性。这样的多态性的鉴别是本领域常规的，其方法类似于用于检测例如乳腺癌点突变的那些。可以从例如由受试者的淋巴细胞提取的DNA进行鉴别，随后使用对所述多态区域特异性的引物扩增多态区域。或者，当对比相同基因的2个等位基因吋，可以鉴别出多态性。生物内相同基因的2个等位基因之间的序列变化在本文中称作“等位基因多态性”。多态性可以是在编码区内的核苷酸处，但是由于遗传密码的简并性，没有编码氨基酸序列中的变化。或者，多态序列可以在特定位置处编码不同的氨基酸，但是氨基酸的变化不会影响蛋白功能。多态区域也可以存在于基因的非编码区中。在本文所述的该方面和所有其它方面的一个实施方案中，靶抗原可以是具有聚谷氨酰胺结构域或延长的聚谷氨酰胺结构域的蛋白。本文使用的术语“聚谷氨酰胺结构域”表示，由通过肽键相连的连续谷氨酰胺残基組成的蛋白的区段或结构域。在一个实施方案中， 所述连续区域包括至少5个谷氨酰胺残基。本文使用的术语“延长的聚谷氨酰胺结构域” 或“延长的聚谷氨酰胺区段”表示，包括至少35个通过肽键相连的连续谷氨酰胺残基的蛋白的区段或结构域。这样的延长的区段存在于受本文所述的聚谷氨酰胺障碍影响的受试者中，无论所述受试者是否已经被证实显示出症状。本文使用的术语”三核苷酸重复”或“三核苷酸重复区”表示核酸序列区段，例如其由特定三核苷酸序列的连续重复序列組成。在一个实施方案中，所述三核苷酸重复包括至少5个连续三核苷酸序列。示例性的三核苷酸序列包括、但不限于CAG、CGG、GCC、GAA、CTG和/或CGG。在本文所述的该方面和所有其它方面的一个实施方案中，靶抗原可以是在三核苷酸重复疾病中表达的蛋白。本文使用的术语“三核苷酸重复疾病”表示，特征在于位于基因内的延长的三核苷酸重复区的任意疾病或障碍，所述延长的三核苷酸重复区是所述疾病或障碍的成因。三核苷酸重复疾病的实例包括、但不限于脊髄小脑性共济失调12型、脊髄小脑性共济失调8型、脆性X染色体综合征，脆性XE染色体精神发育迟滞和营养不良性肌强直。根据本发明进行治疗的优选的三核苷酸重复疾病是，特征在于或成因为在基因(编码造成疾病或障碍或是疾病或障碍的成因的突变蛋白的基因)的编码区的5'末端处的延长的三核苷酸重复区的那些。在本文所述的该方面和所有其它方面的一个实施方案中，靶抗原可以是在聚谷氨酰胺障碍中表达的蛋白。本文使用的术语“聚谷氨酰胺障碍”表示，特征在于在编码区的5‘ 末端处的延长的(CAG)n重复序列(因而编码在编码的蛋白中的延长的聚谷氨酰胺区域) 的任意疾病或障碍。在一个实施方案中，聚谷氨酰胺障碍的特征在干，神经细胞的渐进性变性。聚谷氨酰胺障碍的实例包括、但不限于亨廷顿病、脊髄小脑性共济失调1型、脊髄小脑性共济失调2型、脊髄小脑性共济失调3型(也称作Machado-Jos印h疾病)和脊髄小脑性共济失调6型、脊髄小脑性共济失调7型和齿状核红核苍白球丘脑下部核萎縮。在一个实施方案中，靶抗原多肽折叠成它的天然构象。在一个实施方案中，靶抗原多肽是多分子多肽复合物的一部分。在一个实施方案中，靶抗原多肽是多分子多肽靶抗原的亚基多肽。在有些实施方案中，靶抗原可以是完整的(即整个的或整体的或完全的)靶抗原， 其被本文所述的未连接的或非共价地连接的LF多肽递送至細胞的胞质溶胶。在该背景下， “完整”是指所述靶抗原是全长靶抗原，因为所述抗原多肽在自然界中存在。这与靶抗原的仅小部分或肽的递送正相反。通过向细胞递送完整靶抗原，所述LFn多肽会实现或促进整个靶抗原跨細胞膜的易位以及与MHC I分子络合的完整靶抗原的全范围表位的展示。此外， 这也会促进针对完整靶抗原的全范围表位(而不是仅单个或选择的几个肽表位)的細胞介导的免疫(CMI)应答的检测。当T細胞(淋巴細胞)结合展示抗原并触发应答(例如細胞因子的生产和释放)的其它细胞的表面时，发生CMI。应答可以涉及其它淋巴細胞和任意其它白血細胞(白細胞)。因此，与使用単独的完整靶抗原相比，或与靶抗原的一部分(即肽)相比，LFn多肽(其未连接完整抗原，或非共价地连接完整抗原)在本文所述的方法和組合物中的应用， 会产生对完整靶抗原的更强且更稳健的CMI应答，因为可以针对完整抗原的基本上任意表位产生CMI应答。在有些实施方案中，所述完整靶抗原可以分成整个靶抗原的片段或部分，例如，至少2个或至少3或至少4或至少5或更多个靶抗原片段，这取决于完整靶抗原蛋白的大小。 整个靶抗原的这些片段，可以用作例如质量对照，以滤出阳性CMI应答的假阳性。仅作为一个实例，通过评估对靶抗原集合(它们是整个靶抗原的片段)的CMI应答，可以证实对整个靶抗原的阳性CMI应答。如果1个或2个片段(而不是所有片段)产生阳性应答，则证实真实的CMI应答。如果检测到所有片段的阳性CMI应答，阳性CMI应答可能是假阳性。在有些实施方案中，可以将完整靶抗原分成许多部分(这取决于起始靶抗原的大小)，用作亚靶抗原集合。通常，在整个靶抗原是多聚体多肽的情况下，可以将整个靶蛋白分成亚基和/或结构域，它们可以各自単独地与LF多肽混合，并用于本文公开的试验方法和組合物中。或者，可以将完整靶抗原分成整个靶抗原的片段或部分，例如，至少2个、或至少3个、或至少4个、或至少5个、或至少6个、或至少7个、或至少8个、或至少约9个、或至少约10个、或至少约11个、或至少约12个、或至少约13个、或至少约15个、或至少约20个、 或至少约25个、或超过25个片段，且每个片段单独地或組合地与LF多肽混合，用于本文公开的试验方法和組合物中。全长靶抗原多肽的片段化或分隔可以是全长靶抗原多肽的均等分隔，或者，在有些实施方案中，所述片段化是不对称的或不等的。作为ー个非限制性实例，在将靶抗原分成 2个重叠片段的情况下，可以将靶抗原分成大致相同(相等)大小的片段，或者，一个片段可以是整个靶抗原的约45%，且另ー个片段可以是约65%。作为其它非限制性实例，可以将整个靶抗原分成不同大小的片段的組合，例如，在将靶抗原分成2个片段的情况下，可以将片段分成整个靶抗原的约40%和约70%、或约45%和约65%、或约35%和约75%、或约 25%和约85%。包括全长完整靶抗原的重叠片段的任意組合，用于制备靶抗原集合。仅作为ー个例证性实施例，在将靶抗原分成5部分的情况下，可以均等地(即每个重叠片段是靶抗原的整个全长的约21-25% )或不均等地(即可以将靶抗原分成下述5个重叠片段片段1是全长靶抗原大小的约25%、片段2是约5%、片段3是约35%、片段4是约10%且片段5是约25%，条件是，每个片段与至少1个其它片段重叠)分隔所述部分。作为肽(即在6个残基至20个残基之间的任意长度)的靶抗原可以由未连接的LF多肽来递送。也可以合成多肽为分支的结构，诸如在美国专利号5，229，490和 5，390，111(它们通过引用并入本文)中公开的那些。抗原多肽包括，例如，合成的或重组的B-細胞和T-細胞表位、来自ー个生物体或疾病的通用的T-細胞表位和混合的T-細胞表位以及来自另ー个的B-細胞表位。如上面所指出的，通过重组方式或肽合成，可以得到靶抗原。其它来源包括，天然来源或提取物。在任意情况下，借助于抗原的物理和化学特征，优选地通过分级分离或色谱法(Janson 禾ロ Ryden, 1989 ；Deutscher, 1990 ；Scopes，1993)，可以纯化抗原。多价靶抗原制剂可以用于同时诱导对超过ー种抗原的免疫应答。缀合物可以用于诱导对多个抗原的免疫应答，強化免疫应答，或二者兼有。另外，可以使用类毒素来強化毒素，或者可以使用毒素来强化类毒素。在有些实施方案中，可以将靶抗原溶解于水、溶剂(诸如甲醇)或缓冲液中。合适的缓冲液包括、但不限于不含有Ca2+/Mg2+的磷酸盐缓冲盐水(PBS)、生理盐水(150mM NaCl 水溶液)和Tris缓冲液。不溶于中性缓冲液中的靶抗原，可以溶解在IOmM醋酸中，然后用诸如PBS等中性缓冲液稀释至希望的体积。在仅在酸性pH时可溶的抗原的情况下，可以在溶解在稀醋酸中以后，使用处于酸性PH的乙酸盐-PBS进行稀释。甘油可以是用于本发明中的合适的非水性溶剤。D.额外的部分和佐剂在有些实施方案中，除了 LF多肽以外，可以在本文公开的包含LF多肽(诸如LFn 多肽)和靶抗原(其没有共价地连接所述Un多肽)的組合物中包括佐剂。佐剂是同时施用的增强针对抗原的免疫应答的物质的异质群体。在有些情况下， 将佐剂加入疫苗中以改善免疫应答，因而需要更少的疫苗。佐剂用于使抗原(刺激特定保护性免疫应答的物质)接触免疫系统，并影响产生的免疫的类型以及免疫应答的质量 (量级或持续时间)。佐剂也可以降低某些抗原的毒性；并提供有些疫苗组分的溶解。目前用于增强针对抗原的免疫应答的几乎所有佐剂都是颗粒，或与抗原一起形成颗粒。在书"Vaccine Design-the subunit and adjuvant approach，，(Powell&Newman 编，Plenum Press, 1995)中，关于它们的免疫活性，并关于它们的化学特征，描述了几乎所有已知的佐剂。不形成颗粒的佐剂的类型，是起免疫信号物质作用的物质群体，且在正常条件下，由免疫系统形成的物质(作为施用微粒佐剂系统以后的免疫活化的結果)組成。通常，佐剂是微粒系统，其中使抗原结合基质或与基质混合，所述基质具有可缓慢地生物降解的特征。作为基质系统的佐剂不应当降解形成有毒的代谢物。可以使用的主要基质类型主要是源自身体的物质，包括例如乳酸聚合物、聚氨基酸(蛋白)、碳水化合物、 脂质和具有低毒性的生物相容的聚合物。也可以使用源自身体的这些物质群体的組合，或源自身体的物质和生物相容的聚合物的組合。脂质是优选的物质，因为它们显示出使它们可生物降解的结构，以及它们事实上是所有生物膜的关键组分。用于疫苗的佐剂是本领域众所周知的。合适的额外佐剂包括、但不限于完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、皂苷、矿物凝胶诸如氢氧化铝、表面活性物质诸如溶血卵磷脂、 pluronic多元醇、聚阴离子、肽、油或烃乳剂、钥孔戚血蓝素、ニ硝基苯酚和潜在有用的人佐剂诸如BCG(卡介苗)和短小棒状杆菌。佐剂的选择取决于要免疫接种的动物受试者。额外的实例包括、但不限于甘油单酯和脂肪酸(例如油酸单甘油酷、油酸和大豆油的混合物)；无机盐，例如，氢氧化铝和磷酸铝或钙凝胶；基于油乳剂和表面活性剂的制剂，例如， MF59 (微流态化的去污剂稳定化的水包油乳剂)、QS21 (纯化的皂苷)、AS02 [SBAS2](水包油乳剂+MPL+QS-21) ,Montanide ISA-51和ISA-720 (稳定化的油包水乳剂)；微粒佐剂，例如，病毒体(掺入了流感凝血素的单层脂质体媒介物)、AS04([SBAS4]含有MPL的Al盐)、 ISCOMS(皂甙和脂质的结构化复合物)、聚丙交酯乙交酯(PLG)；微生物衍生物(天然的和合成的)，例如，单磷酰脂质A(MPL) ,Detox (MPL+M. Phlei細胞壁骨架)、AGP[RC_529](合成的酰化的单糖)、DC Chol (能够自己組成脂质体的类脂免疫刺激剂)、0M-174 (脂质A衍生物)、CpG基序(含有免疫刺激性的CpG基序的合成寡核苷酸)、修饰的LT和CT (遗传修饰的細菌毒素，以提供无毒的佐剂效应)；内源人免疫调节剂，例如，hGM-CSF或hIL-12 (可以作为编码的蛋白或质粒施用的細胞因子)、Immudaptin(C3d串联阵列)和惰性媒介物，诸如金颗粒。更新的佐剂描述在美国专利号6，890，M0、美国专利申请号20050M4420和PCT/ SE97/01003中，它们的内容通过引用整体并入本文。佐剂也可以选自:QS-21、Detox-PC、 MPL-SE, MoGM-CSF, TiterMax-G, CRL-1005、GERBU, TERamide、PSC97B、Adjumer, PG-026、 GSK-I、GcMAF、B-alethine、MPC-026、Adjuvax、CpG ODN、Betafectin、铝和 MF59。优选地，任意额外佐剂是药学上可接受的佐剂。例如，油或烃乳液佐剂不应当用于人疫苗接种。适用于人的佐剂的ー个实例是铝(氧化铝凝胶)。下面讨论了预见到加入本发明的組合物中的普通佐剂的细节完全弗氏佐剂(CFA)—种矿物油佐剂；使用油包水乳剤，所述乳剂主要是油。多年来，选择的佐剂是完全弗氏佐剂。该佐剂尽管在免疫原性上是有效的，也已经具有经常产生脓肿、肉芽肿和组织腐肉的重要历史。它含有石蜡油、杀死的分枝杆菌和ニ缩甘露醇ー油酸酷。所述石蜡油不会被代谢；它穿过皮肤(经由肉芽肿或脓肿)表达，或被巨噬细胞吞噬。多次暴露于CFA会造成严重的超敏反应。人意外暴露于CFA可以导致对結核菌素的致敏。
不完全弗氏佐剂(IFA):也是ー种矿物油佐剂。組成类似于CFA，但是不含有杀死的分枝杆菌，所以不会产生严重反应。在初次注射抗原-CFA以后，用于强化免疫。如果抗原是强免疫原性的，IFA可以用于初次注射。Montanide ISA (不完全kppic佐剂)一种矿物油佐剂。使用ニ縮甘露醇油酸酷作为主要表面活性剂组分。抗体应答通常类似于IFA的应答。Montanide ISA可能具有减弱的炎症应答。Ribi佐剂系统(RAS): —种水包油乳剤，其含有在2%角鲨烯中的去毒的内毒素和分枝杆菌細胞壁组分。多种制剂是可商业得到的，取决于用途。是CFA的替代物。粘度比 CFA更低。结果(效价)经常与含有CFA的那些相当。角鲨烯油是可代谢的。RAS具有更低的毒性反应发生率。TiterMax 另ー种油包水乳剂，该制品組合了合成的佐剂和微粒ニ氧化硅以及可代谢的油角鲨烯。共聚物是免疫调节组分。抗原结合到共聚物上，并以高度浓缩的形式呈递给免疫細胞。毒性比CFA更低。TiterMax经常产生与CFA相同的结果。Syntex佐剂制剂(SAF):—种预形成的水包油乳剤。使用嵌段共聚物作为表面活性剂。胞壁酰基ニ肽衍生物是免疫刺激性的组分。都在角鲨烯(ー种可代谢的油)中。SAF 在小鼠中可以偏向对IgG^i的体液应答，但是毒性比CFA更低。铝盐佐剂最经常用作疫苗抗原递送的佐剂。通常是比乳液佐剂更弱的佐剂。铝盐佐剂最佳地与强免疫原性的抗原一起使用，但是通常产生弱炎症反应。硝酸纤维素吸附的抗原硝酸纤维素基本上是惰性的，几乎不产生炎症应答。硝酸纤维素纸的缓慢降解允许长时间释放抗原。不会产生象CFA —样剧烈的抗体应答。如果仅小量抗原可以从凝胶带回收，硝酸纤维素吸附的抗原可以良好地用于例如动物免疫。包囊的或捕获的抗原允许长时间释放抗原；也可以在用于长时间释放的制品中具有免疫刺激剤。包囊的或捕获的抗原的制品是复合物。免疫刺激复合物(ISCOMs)抗原修饰的皂苷/胆固醇胶束。形成稳定的结构，其快速迁移排流淋巴结。实现細胞-介导的免疫应答和体液免疫应答。低毒性；ISCOMs可以引起显著的抗体应答。Quil A是ー个实例，QS-21是另ー个实例。GerbuR佐剂一种水相佐剂，其使用与脯氨酸锌相组合的免疫刺激剤。GerbuR不具有贮库效应，且具有微小的炎症效应。GerbuR需要经常强化来維持高效价。铝是优选的佐剂。另ー组佐剂包括免疫刺激物(诸如細胞因子IL-12、IL_4)和共刺激分子(诸如B7)。已知多种具有免疫刺激效应的分子，包括辅助分子诸如ICAM和LFA。 在一个优选的实施方案中，在初次免疫给药之前，将GM-CSF施用给患者。使用在药物制剂中的病毒载体或分离的蛋白，可以施用GM-CSF。可以使用佐剂的组合，诸如CM-CSF、I CAM 和LFA。尽管通常产生针对传染病抗原的强免疫应答，肿瘤相关抗原通常产生更弱的免疫应答。因而，诸如上述的免疫刺激物优选地与它们一起使用。E.測定CTL应答的方法在本文所述的该方面和所有其它方面的一个实施方案中，通过测量对靶抗原的 CMI应答，可以评估LF多肽向细胞递送未连接的或非共价地连接的靶抗原。CMI试验是本领域已知的，且描述在，例如，美国专利申请20050014205、W0/1987/00M00、美国专利 5674698和可商业得到的试剂盒(诸如IMMUNKNOW CYLEX免疫细胞功能测定产品号4400)中，它们通过引用整体并入本文中，用于本发明。F. LFN多肽和未连接的或非共价地连接的靶抗原的应用本发明的免疫原性組合物可以用于引起针对靶抗原的特异性免疫应答。在ー个替代实施方案中，LF多肽(诸如Un多肽或其片段)可以用于稳定不稳定的靶抗原，不需要结合靶抗原。例如，某些靶抗原难以表达和/或是不稳定的，因而不正确地折叠，形成与它的天然活性构象相比错误折叠的蛋白。对于这样的蛋白，尽管仍然能够引起CMI应答，所述应答仅可能响应于不适当地折叠的蛋白，且不会给在其中产生CMI应答的受试者赋予任何治疗性的和/或预防性的益处。尽管不希望受理论的约束，假设LF多肽(诸如与SEQ ID NO 3或SEQ ID NO :4相对应的多肽)的存在可以稳定某些这样的不稳定的靶抗原蛋白。发明人已经发现，LFn片段(它是约至少250个氨基酸或更小、或约至少150个氨基酸或更小、 或约至少103个氨基酸或更小、或约至少80个氨基酸或更小)能够稳定不稳定的靶抗原， 不需要与这样的靶抗原融合。在该模型下，在靶抗原表达过程中，或在靶抗原表达以后紧接着，未连接的LF多肽和靶抗原的共表达可能是有益的。在有些实施方案中，本文公开的组合物可以用于产生针对靶抗原的免疫应答，例如用作疫苗。一种示例性的組合物是治疗有效量的Un多肽(其对应着SEQ ID N0:3或4) 或其片段、同源物或变体和未连接的或非共价地连接的靶抗原，以诱导免疫反应。所述组合物起预防性免疫原的作用，且任选地包括在药学上可接受的且相容的载体中。本文使用的和在下面更完整地描述的术语“药学上可接受的且相容的载体”包括 (i) 一种或多种相容的固体或液体填充物稀释剂或包囊物，它们适合施用给人或其它动物， 和/或(ii) ー种系统，其能够将所述分子递送给靶細胞。在本发明中，术语“载体”因而表示天然的或合成的有机或无机成分，本发明的分子与其相组合以促进应用。术语“治疗有效量”是这样的本发明药物組合物的量其对要治疗的特定病症产生希望的结果或发挥希望的影响。例如，产生免疫反应以提供预防性保护所需的量。通常，当将所述組合物用作预防性免疫原吋，在初次施用以后，以定期的间隔施用至少一次“強化”。在制备掺入相同成分的組合物吋，可以使用不同的浓度，以提供根据下述因素的变化要治疗的患者的年齢、病症的严重性、治疗的持续时间和给药模式。在一个实施方案中，本文公开的组合物是多组分疫苗，其可以包含其它免疫原性的多肽，诸如除了 LF多肽(诸如LFn)或其片段以外的其它佐剂。多组分疫苗可以含有额外的佐剂(以引起T细胞应答)以及其它抗原和/或佐剂(以引起B细胞应答)。在有些实施方案中，通过免疫方法，将所述組合物施用给受试者，且在有些实施方案中，所述免疫方法包括多次给药方案；例如，第一次给药进行激发，其中Un可以用于递送未连接的或非共价地连接的靶抗原；然后进行第二次给药来“強化”CMI，其中使用LFn和不同的新颖的未连接的或非共价地连接的靶抗原。在有些实施方案中，也可以使用这样的組合物，其包含不同的Un和未连接的或非共价地连接的靶抗原的混合液，以用多种不同的靶抗原或用LFn(在多种靶抗原存在下) 进行激发和强化。在本文所述的该方面和所有其它方面的一个实施方案中，包含LF多肽和靶抗原的药物组合物可以用于产生许多T細胞，所述T細胞识别不同范围的抗原并与其相互作用， 例如，来自不同Hiv菌株的抗原。在有些实施方案中，编码LF多肽和靶抗原的DNA序列也可以用作基于DNA的疫苗。在产生免疫反应(诸如使用本文公开的疫苗組合物)的尝试中， 也可以使用佐剂。本发明的免疫刺激組合物可以有利地与其它治疗方案一起使用。例如，所述系统可以与癌症的传统治疗选项(包括外科手术、放射疗法、化学疗法和激素疗法)结合使用。 例如，包含LF多肽和未连接的或非共价地连接的靶抗原的乳腺癌疫苗(即组合物)可以与枸櫞酸他莫昔芬结合使用，后者会干扰雌激素的活性。所述系统也可以与下述疗法相組合 免疫疗法，例如使用HERCEPTIN (曲妥单抗)，即为了阻断HER2受体而开发的抗-HER2人源化的单克隆抗体；骨髄移植；也可以使用末梢血干细胞疗法。可以与本文所述的组合物结合使用的其它优选的治疗方案包括血管生成抑制剂和細胞毒性剂。本文使用的术语“相容的”是指，药物组合物的组分能够以基本上不损害希望的药学效能的方式彼此混合。在一个实施方案中，所述疫苗組合物包含LF多肽(诸如LFn)和未连接的或非共价地连接的靶抗原，所述靶抗原由昆虫細胞表达和纯化。在一个实施方案中，所述疫苗組合物包含许多LF多肽(诸如LFn)和许多未连接的或非共价地连接的靶抗原，所述靶抗原由昆虫細胞表达和纯化，其中所述靶抗原多肽是不同的，但是都来自单个細胞内病原体。在一个实施方案中，所述多种靶抗原多肽都来自源自单个細胞内病原体的単一多肽。在ー个实施方案中，所述疫苗組合物包含许多LF多肽和许多未连接的或非共价地连接的靶抗原。在有些实施方案中，由昆虫細胞表达和纯化LF多肽和许多未连接的靶抗原，其中每种靶抗原多肽是不同的，但是都来自几种細胞内病原体。例如，用于产生针对腮腺炎、麻疹和风疹病毒的細胞-介导的免疫(CMI)应答的疫苗组合物可以具有至少3种不同的未连接的或非共价地连接的靶抗原，各自分别对腮腺炎、麻疹和风疹病毒是特异性的。在另ー个实施方案中，所述疫苗組合物包含LF多肽(诸如LFn)和非共价地连接的靶抗原，其中所述Un多肽是N-糖基化的。相对于SEQ ID NO :3或SEQ ID N0:4的LFn， N-糖基化可以是在天冬酰胺62、212和/或286处。在有些实施方案中，本文所述的疫苗組合物另外包含药物赋形剂，包括、但不限于生物相容的油、生理盐水溶液、防腐剤、渗透压控制剂、载气、PH控制剂、有机溶剂、疏水剂、 酶抑制剂、吸水聚合物、表面活性剤、吸收促进剂和抗氧化剂。在一个实施方案中，本发明提供了一种组合物，其包含本文所述的LF多肽(诸如 LFn)和未连接的或非共价地连接的靶抗原和分离的哺乳动物細胞。分离的细胞优选地能够处理和呈递靶抗原片段，用干与MHC分子一起展示。这样的抗原呈递细胞可以仅表达MHC I类分子(所谓的“非专门的”抗原呈递細胞(APC’ S))，或表达MHC I类和II类分子(所谓的“专门”APC’ S)。因而，在一个实施方案中，所述哺乳动物细胞是抗原呈递細胞，包括专门的APC和/或非专门的APC。专门的APC’s包括，例如，巨噬细胞、树突細胞和B細胞。 在一个实施方案中，LF多肽(诸如LFn)和/或未连接的或非共价地连接的靶抗原可以由昆虫細胞表达和纯化。在一个实施方案中，所述哺乳动物细胞分离自已经暴露于病原体的受试者。这样的組合物可用于筛查向病原体的暴露，诸如在CMI应答试验中，或用于大规模疫苗接种计划。CMI试验是本领域已知的，且描述在，例如，美国专利申请20050014205、 W0/1987/005400、美国专利5674698和可商业得到的试剂盒(诸如IMMUNKNOW CYLEX免疫细胞功能测定产品号4400)中。
G.试剂盒本发明的另ー个方面涉及用于生产組合物的试剂盒，所述組合物可用于引起针对目标靶抗原的CMI，其中所述靶抗原没有共价地连接LFn多肽。这样的试剂盒可以从可容易得到的材料和试剂制备。例如，这样的试剂盒可以包含任意ー种或多种下述物质生物活性的LFru反应试管、关于测试LFn活性的说明书以及用于添加用户优选的靶抗原的试剂。根据本发明可以制备多种试剂盒和组分，这取决于试剂盒的预期用途、具体靶抗原和用户的
而O芝。在本文所述的该方面和所有其它方面的一个实施方案中，试剂盒包含本文所述的 LF多肽(诸如LFn)和用于它的包装材料。在有些实施方案中，所述试剂盒也包含未连接的或非共价地连接的靶抗原。这样的试剂盒可用于筛查向病原体的暴露，诸如在CMI应答试验中，或用于大规模疫苗接种计划。包装材料可以包括、但不限于佐剂、稀释剂、用于消毒注射部位的醇拭子、一次用弃的固定体积注射器、剂量图和免疫计划。在本文所述的该方面和所有其它方面的一个实施方案中，本文所述的试剂盒包含许多LF多肽和许多非共价地连接的靶抗原。在一个实施方案中，靶抗原的单个成员包含与相同靶抗原多肽的不同部分不同的抗原多肽。CMI试验对于评估受试者向靶抗原的暴露和受试者对致病物(诸如微生物、病毒或寄生物)的感染做出应答的能力而言是重要的，所述应答会产生自身免疫应答(诸如在糖尿病人中)，或保护免于癌症或其它肿瘤病症。結果，提及的“測量受试者中对靶抗原的 CMI应答”包括传染病和自身免疫病、免疫活性的标志物的免疫诊断，对内源性和/或外源性抗原(包括疫苗效价的测量)的T-細胞应答以及炎性疾病和癌症的标志物的检测。在器官移植患者的控制中，监测移植前和移植后的CMI是必要的。CMI试验也可以用于滴定最初的免疫抑制减小和它随后在这些患者中的増加。如上面所讨论的，可以测试多种靶抗原中的任ー种，诸如对特定生物体、病原体、 病毒、自身抗原或癌細胞特异性的那些。或者，可以使用更一般的试剂来测试引起細胞-介导的免疫应答的一般能力。后者的实例包括来自结核分枝杆菌和破伤风类毒素的皮肤试验(例如，PPD)。但是，一般而言，在本文所述的组合物中，可以以与LF多肽未连接的或非共价地连接的形式，包括任意肽、多肽或蛋白、糖蛋白、磷蛋白、磷脂蛋白。这些包括来自病原体(特別是、但不一定是细胞内病原体)的抗原。所述病原体包括，例如，本文所述的任意病毒、細菌、真菌或寄生病原体以及其它。所述抗原也可以包括肿瘤抗原和/或自身免疫抗原。H.系统在ー个方面，本文提供了用于测量受试者中对靶抗原的細胞介导的免疫应答 (CMI)的系统，所述系统包括计算机处理器和计算机可读的物理存储介质，所述存储介质在其上面具有足以采用计算机处理器来执行用于测量細胞-介导的免疫应答的过程的指令， 所述过程的指令包括a)用于接收关于生物样品中释放的至少ー种細胞因子的水平的数据的指令，所述释放是响应于所述样品中的細胞与至少ー种融合多肽的接触，所述融合多肽包含LF多肽的一部分(该部分缺少LF酶活性，但是足以促进所述融合多肽向細胞的跨膜递送)，所述部分与靶抗原多肽或其片段融合，其中所述接触允许所述靶抗原跨膜递送给所述細胞，所述細胞加工并展示所述抗原的至少1个表位到它的表面上；和b)用于对比所述生物样品中所述至少一种细胞因子的水平和所述至少一种细胞因子的參照水平的指令，c)用于向用户界面传递所述对比的结果的指令，其中来自受试者的所述生物样品中所述至少一种细胞因子的水平相对于參照水平的増加，指示受试者中对靶抗原的細胞介导的免疫应答(CMI)。在另ー个方面，本文提供了一种计算机可读的物理存储介质，所述存储介质在其上面具有足以采用计算机处理器来执行用于测量細胞-介导的免疫应答的过程的指令，所述过程的指令包括a)用于接收关于生物样品中释放的至少ー种細胞因子的水平的数据的指令，所述数据如下得到i)用至少ー种融合多肽温育来自所述受试者的生物样品，所述融合多肽包含LF 多肽的一部分(该部分缺少LF酶活性，但是足以促进所述融合多肽向細胞的跨膜递送)，所述部分与靶抗原多肽或其片段融合，其中所述生物样品包含免疫系统的細胞，所述细胞响应于抗原而释放出至少ー种細胞因子，且其中所述温育允许所述靶抗原跨膜递送给細胞， 所述细胞加工并展示所述抗原的表位到它的表面上；和ii)測量在所述生物样品中释放的至少ー种細胞因子的水平；b)用于对比所述生物样品中所述至少一种细胞因子的水平和所述至少一种细胞因子的參照水平的指令，c)用于向用户界面传递所述对比的结果的指令，其中来自受试者的所述生物样品中所述至少一种细胞因子的水平相对于參照水平的増加，指示受试者中对靶抗原的細胞介导的免疫应答(CMI)。在另ー个方面，本文提供了用于检测受试者的目标病状的系统，所述系统包括计算机处理器和计算机可读的物理存储介质，所述存储介质在其上面具有足以采用计算机处理器来执行用于测量細胞-介导的免疫应答的过程的指令，所述过程的指令包括a)用于接收关于生物样品中释放的至少ー种細胞因子的水平的数据的指令，所述数据通过包括下述步骤的方法得到用至少ー种融合多肽温育来自所述受试者的生物样品，所述融合多肽包含LF多肽的一部分(该部分缺少LF酶活性，但是足以促进所述融合多肽向細胞的跨膜递送)，所述部分与靶抗原多肽或其片段融合，其中所述靶抗原在受病状影响的组织中表达，且其中所述生物样品包含免疫系统的細胞，所述细胞响应于抗原而释放出至少ー种細胞因子；和测量在所述生物样品中释放的至少ー种細胞因子的水平；和b)用于对比所述生物样品中所述细胞因子的水平和相同細胞因子的參照水平的指令；和c)用于向用户界面传递(b)的对比结果的指令，其中来自受试者的所述生物样品中所述至少一种细胞因子的水平相对于參照水平的増加，会将受试者鉴别为具有所述病状，或具有増加的遭受所述病状的风险。在另ー个方面，本文提供了一种计算机可读的物理存储介质，所述存储介质在其上面具有足以采用计算机处理器来执行用于测量受试者中对靶抗原的細胞介导的免疫应答(CMI)的过程的指令，所述过程的指令包括
a)用于接收关于生物样品中释放的至少ー种細胞因子的水平的数据的指令，所述数据通过包括下述步骤的方法得到i)用至少ー种融合多肽温育来自所述受试者的生物样品，所述融合多肽包含LF多肽的一部分(该部分缺少LF酶活性，但是足以促进所述融合多肽向細胞的跨膜递送)，所述部分与靶抗原多肽或其片段融合，其中所述靶抗原在受病状影响的组织中表达，且其中所述生物样品包含免疫系统的細胞，所述细胞响应于抗原而释放出至少ー种細胞因子；和ii)測量在所述生物样品中释放的至少ー种細胞因子的水平； 和b)用于对比所述生物样品中所述细胞因子的水平和相同細胞因子的參照水平的指令；和c)用于向用户界面传递(b)的对比结果的指令，其中来自受试者的所述生物样品中所述至少一种细胞因子的水平相对于參照水平的増加，会将受试者鉴别为具有所述病状，或具有増加的遭受所述病状的风险。可用于不同实施方案中的计算机可读的物理存储介质包括任意计算机可读的物理存储介质，例如，磁的和光的计算机可读的存储介质以及其它。在该术语所包括的且可根据本发明使用的计算机可读的物理存储介质的范围内，未包括载波和其它基于信号的存储或传递介质。可用于不同的实施方案中的用户界面包括，例如，显示屏或打印机或用于提供计算机介导的过程的结果的读出的其它装置。用户界面也可以包括，例如，在网络中或在环球网上的地址，过程的结果被传递至所述地址，并可被一个或多个用户访问。例如，用户界面可以包括图形用户界面，其包含允许输入关于生物样品中的細胞因子释放的数据的接入组件，以及提供对比结果的图形读出的接入组件，在执行计算机可读介质上编码的指令以后， 所述对比结果被传递至处理器或可被处理器得到。I.組合物和制剂在有些实施方案中，所述免疫原性的組合物可以用于引起针对诸如流感等疾病的特异性抗原免疫应答，且通过诱导粘膜免疫或全身免疫，或通过诸如体液免疫、細胞免疫或粘膜免疫等免疫的組合，是有用的。本文所述的制剂可以施用于单个或多个位点、单肢或多肢、或皮肤的大表面积(通过完全浸没)。本发明的LF多肽和组合物非常适合药物組合物制剂。可以将药物組合物施用给可能经历本发明的組合物的有益作用的任意动物。在这样的动物中，最前面的是人，尽管本发明无意限于此。LF多肽(诸如LFn)和未连接的或非共价地结合的共价靶抗原可以直接地施用给受试者，用于治疗(包括预防性和治疗性)表达靶抗原的疾病。例如，在有些实施方案中， 本文公开的包含LFn和至少ー种未连接的或非共价地连接的靶抗原的組合物可以用于引起针对靶抗原的CMI。在有些实施方案中，本文公开的包含Un多肽和至少ー种未连接的或非共价地连接的靶抗原的組合物可以用于在体内抑制癌症、肿瘤或癌前細胞。通过通常用于使化合物最终接触要作用的组织或細胞的任意途径，进行施用。以任意合适的方式，优选地与药学上可接受的载体一起，施用化合物。施用这样的組合物的合适方法是本领域技术人员可得到的且众所周知的，尽管超过ー种途径可以用于施用特定組合物，特定途径经常可以提供比另ー种途径更速效的且更有效的反应。
药学上可接受的载体部分地取决于施用的具体組合物、以及用于施用組合物的具体方法。因此，本发明的药物组合物存在多种合适的制剂(參见，例如，Remington' s Pharmaceutical Sciences,1985 年朱 17 fe ハ制剂本文公开的包含LF多肽(诸如Un)和未连接的或非共价地连接的靶抗原的組合物可以自身(纯的)施用，或以药学上可接受的盐的形式施用。当用于药物中吋，所述盐应当是药学上可接受的，但是非药学上可接受的盐可以方便地用于制备其药学上可接受的盐，且未排除在本发明范围之外。这样的药学上可接受的盐包括、但不限于从下述酸制备的那些盐盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、马来酸、醋酸、水杨酸、对甲苯磺酸、酒石酸、柠檬酸、甲磺酸、甲酸、丙ニ酸、琥珀酸、萘-2-磺酸和苯磺酸。另外，药学上可接受的盐可以制备为碱金属或碱土金属盐，诸如羧酸基团的钠、钾或钙盐。因而，本发明也提供了用于医学用途的药物組合物，其包含本发明的核酸和/或多肽以及它们的一种或多种药学上可接受的载体和任选的任意其它治疗成分。在有些实施方案中，本文所述的包含LF多肽和靶抗原的組合物可以方便地存在于单位剂型中，且可以通过药学领域众所周知的任意方法来制备。方法通常包括下述步骤 使本发明的活性成分与构成ー种或多种助剂的载体相结合。适合肠胃外施用的优选组合物方便地包括无菌水性制剂，其优选地与受体的血液等滲。根据已知的方法，使用那些合适的分散剂或润湿剂和助悬剂，可以配制该水性制剂。 无菌注射制剂也可以是在无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌注射溶液或悬浮液，例如作为在1，3_ 丁ニ醇中的溶液。可以采用的可接受的媒介物和溶剂是水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。另外，无菌的不挥发性油常规地用作溶剂或悬浮介质。为此目的， 可以使用任意温和的不挥发性油，包括合成的甘油单酯或甘油ニ酷。另外，脂肪酸(诸如油酸)可以用于注射制剂中。施用适合肠胃外施用(例如，通过静脉内的、真皮内的和皮下的途径)的制剂包括水性的和非水性的、等渗的无菌注射溶液，它们可以含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使所述制剂与目标受体的血液等渗的溶质、以及水性的和非水性的无菌悬浮液，所述悬浮液可以包括助悬齐 、增溶齐 、增稠齐 、稳定剂和防腐齐 。在本发明的实践中，可以施用組合物，例如，通过静脉内输注、ロ服、局部地、腹膜内地、膀胱内地或鞘内地。化合物的制剂可以存在于单位剂量或多剂量密封容器(诸如安瓿和管形瓶)中。从前述种类的无菌粉末、颗粒和片剂，可以制备注射溶液和悬浮液。在有些实施方案中，通过实现它们的预期目的的任意方式，可以施用本文所述的組合物。例如，通过肠胃外的、皮下的、静脉内的、真皮内的、肌肉内的、腹膜内的、透皮的或经颊的途径，可以进行施用。替代地或并存地，施用可以是通过经ロ途径。通过快速浓注或通过随时间逐渐灌注，可以肠胃外地施用蛋白和药物组合物。或者，組合物可以包括适合口服、直肠、阴道内的、局部的、鼻、眼或肠胃外施用的那些，它们都可以用作使用本发明的物质的给药途径。其它合适的给药途径包括鞘内直接给药至脊髄液(CSF)，直接注射到动脉表面上，和脑实质内地直接注射进靶向的器官区域。适合肠胃外施用的組合物是优选的。术语“肠胃外”包括皮下注射、静脉内的、肌肉内的、胸骨内的注射或输注技木。肌肉内给药是优选的。在有些实施方案中，可以将包含LF多肽(诸如LFn)和未连接的或非共价地连接的靶抗原(単独的，或与其它合适的组分(例如，其它佐剂和/或载体)相組合)的組合物制成气雾剂制剂(即，它们可以“雾化”)，以通过吸入来施用。可以将气雾剂制剂放入加压的可接受的推进剂(诸如ニ氯ニ氟甲烷、丙烷、氮等)中，或未加压的可接受的推进剂(诸如喷雾泵或可以用于ロ服和/或气雾剂施用本文公开的组合物的类似装置(哮喘吸入器)) 中。在替代实施方案中，可以将包含LF多肽和靶抗原的組合物配制成适合口服给药， 且可以呈现为离散单元，诸如胶囊、扁囊剂、片剂或锭剂，各自含有预定量的本文讨论的LF 多肽和靶抗原。在有些实施方案中，可以将LF多肽和靶抗原配制为在水性液体或非水性液体中的脂质体或悬浮液，诸如糖浆剂、酏剂或乳剤。在有些实施方案中，所述免疫原性的組合物可以用于引起针对诸如流感等疾病的特异性抗原免疫应答，且通过诱导粘膜免疫或通过诱导全身免疫，或通过诸如体液免疫、细胞免疫或粘膜免疫等免疫的組合，是有用的。可以以片剂和胶囊形式ロ服施用的制剂，可以直肠施用的制剂(诸如栓剂)，和用于注射或ロ服给药的溶液形式的制剂，含有约0. 001至约99%、优选约0. 01至约95%的活性化合物以及赋形剂。合适的赋形剂具体地是填充剂诸如糖例如乳糖或蔗糖、甘露醇或山梨醇纤维素制品和/或磷酸钙例如磷酸三钙或磷酸氢钙，以及粘合剂诸如淀粉糊(使用例如玉米淀粉、 小麦淀粉、米淀粉、马铃薯淀粉)、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮。可以ロ服使用的其它药物制剂包括由明胶制成的推入配合胶囊，以及由明胶和塑化剂(诸如甘油或山梨醇)制成的软密封胶囊。所述推入配合胶囊可以含有颗粒形式的活性化合物，后者可以与填充剂(诸如乳糖)、粘合剂(诸如淀粉)和/或润滑剂(诸如滑石粉或硬脂酸镁)和任选的稳定剂相混合。在软胶囊中，优选地将活性化合物溶解或悬浮于合适的液体(诸如脂肪油或液体石蜡)中。另外，可以加入稳定剂。可以直肠使用的可行的药物制剂包括，例如，栓剂，其由ー种或多种活性化合物与栓剂基质的组合組成。合适的栓剂基质是，例如，天然的或合成的甘油三酯或石蜡系烃。另外，也可能使用明胶直肠胶囊，其由活性化合物与基质的组合組成。可行的基质材料包括， 例如，液体甘油三酷、聚乙ニ醇或石蜡系烃。适合肠胃外施用的制剂包括水可溶形式(例如，水可溶盐)的蛋白的水性溶液。另外，可以施用蛋白的悬浮液，作为适当的油注射悬浮液。合适的亲脂溶剂或媒介物包括脂肪油(例如，芝麻油)或合成的脂肪酸酷(例如，油酸乙酯或甘油三酷)。水性注射悬浮液可以含有增加悬浮液的粘度的物质，包括，例如，羧甲基纤维素钠、山梨醇和/或葡聚糖。任选地，所述悬浮液也可以含有稳定剂。使用用于注射施用的常规药学上可接受的肠胃外媒介物，配制蛋白。这些媒介物是无毒的且治疗性的，在Remington' s Pharmaceutical Sciences(同上)中阐述了许多制剂。赋形剂的非限制性实例是水、盐水、林格氏溶液、右旋糖溶液和汉克平衡盐溶液。根据本发明的制剂也可以含有小量添加剤，诸如维持等渗性、生理PH和稳定性的物质。
在有些实施方案中，以基本上不含有聚集体和其它蛋白物质的纯化形式，优选地在约1. 0ng/ml-100mg/ml的浓度，配制包含LF多肽(诸如LFn多肽)和未连接的或非共价地连接的靶抗原的組合物。剂量在本发明的上下文中，施用给患者的剂量应当足以在患者中随时间实现有益的治疗应答。剂量取决于采用的具体化合物的效能和患者的病症以及要治疗的患者的体重或表面积。剂量的大小也取决于特定化合物或载体在特定患者中的施用所伴随的任何不利副作用的存在、性质和程度。本文所述的药物組合物的剂量随受试者和使用的具体给药途径而异。通常，对于预防性疫苗接种，剂量范围是lng-300 μ g靶抗原/LF多肽组合。靶抗原与LF多肽的比例也可以变化。例如，从0.01靶抗原ILF多肽(即，100 1的LF与靶抗原之比)至1靶抗原0. OlLF多肽(例如，100 1的靶抗原与LF多肽之比)和其间的所有值。就LF多肽可以与靶抗原(即使当没有共价地结合它时)形成复合物而言，预见到，更高的LF多肽与靶抗原之比可能是有益的。因而，例如，100 1的LF多肽与靶抗原之比可能比更低的比例(诸如10 1、1 1或0. 1 1的LF多肽与靶抗原之比)更好。組合物的优选剂量优选地是至少2 μ g/ml。仅作为ー个实例，从例如约1纳克至约 300微克的总剂量范围可能用于人用途。基于组合物，可以以定期间隔递送该剂量。例如在至少2个分开的时间，优选地间隔约4周。其它化合物可以每天施用。根据多种其它的确定表征的方案，也可以将本发明的药物组合物施用给受试者。例如，某些目前接受的免疫方案可以包括下述的(i)给药时间是，在选择的日期进行第1次给药；在第1次给药以后1个月时进行第2次给药；和在以后的日期，例如，在第2次给药以后5个月时，进行第3次给药。 参见 Product Information，Physician’ s Desk Reference，Merck Sharp&Dohme (1990)， 1442-43。(例如，乙肝疫苗-型方案)；(ii)对于使用其它疫苗的实例，为儿童推荐的给药是，在选择的日期进行第1次给药(在6周龄或更大时)；在第1次给药以后4-8周时进行第2次给药；在第2次给药以后4-8周时进行第3次给药；在第3次给药以后6-12个月时进行第4次给药；在4-6岁时进行第5次给药；和在最后一次给药以后每10年进行额外強化。 参见 Product Information，Physician’ s Desk Reference，Merck Sharp&Dohme (1990)， 879 (例如，白喉、破伤风和百日咳-型疫苗方案)。本领域普通技术人员采用至多例行试验， 可以确定递送多次剂量的特定組合物的理想时间间隔。施用的剂量依赖于受体的年齢、性另I」、健康和体重，并行治疗的种类(如果有的话)，治疗频率，和希望的效果的性质。在疫苗接种用于治疗目的的情况下，例如用于治疗癌症和其它现有的疾病或障碍，本文所述的组合物的施用剂量范围是这样的剂量其足够大， 以产生希望的效果，由此实现例如对蛋白的免疫应答，这通过延迟型超敏反应(DTH)、T-细胞活化或抗体生产测得，并基本上抑制或治疗所述疾病。所述剂量应当不会大至造成不利副作用，诸如不希望的交叉反应、过敏反应等。在有些实施方案中，用于人类的剂量范围是约0. 001-lmg/kg体重。用于预防、抑制或治疗非传染性疾病的包含LF多肽(诸如LFn多肽)和未连接的或非共价地连接的靶抗原的組合物的有效剂量可以是在约Ing-lOOmg/kg 体重范围内。优选的剂量范围是约IOng至10mg/kg。更优选的剂量范围是约IOOng至Img/
kg ο
在有些实施方案中，通过单次剂量或分份剂量，可以实现给药，例如，对于在增强以后会诱导免疫但是具有潜在副作用的注射免疫，经皮增强可能是优选的，或者ロ服或鼻免疫可以用干“增强”针对靶抗原的免疫应答。在有些实施方案中，也可以使用注射免疫和经皮免疫的同时使用。在本说明书中引用的所有出版物和专利申请都通过引用并入本文中，如同具体地且单个地说明每篇单独的出版物或专利申请通过引用并入本文中。尽管为了清楚理解的目的，已经通过图解和实施例比较详细地描述了前述发明， 本领域普通技术人员在考虑本文的教导以后会容易地明白，可以对其做出某些变化和修改，而不脱离所附的权利要求书的精神或范围。除非另有解释，在本文中使用的所有技术和科学术语具有本公开内容所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。在分子生物学中的普通术语的定义，可以參 B =Benjamin Lewin, Genes IX， Jones&Bartlett Publishing dj IK,2007(ISBN-13 9780763740634) ；Kendrew 等 K ( lie ), The Encyclopedia of Molecular Biology, Blackwell Science Ltd.出版，1994 (ISBN 0-632-02182-9)；和 Robert A. Meyers (编)， Molecular Biology and Biotechnology :a Comprehensive Desk Reference, VCHPublishers, Inc.出版，1995 (ISBN 1-56081-569-8)。除非另有说明，本发明可以使用在下述文献中描述的标准规程来实现例如，Maniatis % 人，Molecular Cloning :A Laboratory Manual，Coid Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N. Y.，USA(1982) ；Sambrook 等人，Molecular Cloning :A Laboratory Manual (^ 2 fe ;, Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor, N. Y. , USA(1989) ；Davis ^A, Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing，Inc.，New York，USA(1986) ；Methods in Enzymology Guide to Molecular Cloning Techniques，弟 152 卷，S. L Berger 禾ロ A. R. Kimmerl 编， Academic Press Inc.，San Diego, USA(1987)) ；Current Protocols in Molecular Biology(CPMB) (Fred M. Ausubel,等人 John Wiley and Sons, Inc.) ；Current Protocols in Protein Science (CPPS) (John E. Coligan，等人，编，John Wiley and Sons， Inc.) ；Baculovirus Expression Protocols(Methods in Molecular Biology, Vol 39)， Christopher D· Richardson (编ノ ；Hardcover-450 pages Spiral edition (1998 年 3 月) Humana Pr ；ISBN :0896032728 ；BaculovirusExpression Vectors :A Laboratory Manual by David R. 0' Reilly,Lois MilleriVerne A. Luckow ；Paperback Spiral edition(1994 年 6 月)Oxford Univ Press ；ISBN :0195091310 ；The Baculovirus Expression System :A Laboratory Guide by Linda A. King，R. D. Possee ；精装片反(1992 年 5 月)Chapman&Hall ； ISBN :04ヮ371502，它们都通过引用整体并入本文。应当理解，本发明不限于本文描述的具体方法学、方案和试剂等，且它们可以变化。本文使用的术语仅用于描述具体实施方案的目的，无意限制本发明的范围，所述范围仅由权利要求书限定。可以在任意下述编号的段落中定义本发明的有些实施方案1. 一种用于促进对靶抗原的細胞介导的免疫(CMI)应答的組合物，所述组合物包含至少ー种分离的靶抗原和缺少LF酶活性的致死因子(LF)多肽的一部分，其中所述LF多肽部分没有共价地连接到靶抗原上，且其中所述组合物不包含外毒素二分蛋白的保护抗原 (PA)。2.如段落1所述的组合物，其中所述LF多肽部分包含SEQ ID NO 3的至少60个羧基端氨基酸或其促进对靶抗原的CMI应答的保守置換变体。3.如段落1所述的组合物，其中所述LF多肽部分包含SEQ ID NO 3的至少80个羧基端氨基酸或其促进对靶抗原的CMI应答的保守置換变体。4.如段落1-3中任一段所述的组合物，其中所述LF多肽部分包含SEQ ID NO 3的至少104个羧基端氨基酸或其促进对靶抗原的CMI应答的保守置換变体。5.如段落1-4中任一段所述的组合物，其中所述LF多肽部分包含与SEQ ID NO 3相对应的氨基酸序列或其促进对靶抗原的CMI应答的保守置換变体。6.如段落1-5中任一段所述的组合物，其中所述LF多肽部分不结合PA多肽。7.如段落1-6中任一段所述的组合物，其中所述LF多肽部分基本上缺少SEQ ID NO 3的氨基酸ト33。8.如段落1-3中任一段所述的组合物，其中所述LF多肽部分由SEQ ID NO :4或其促进对靶抗原的CMI应答的保守置換变体组成。9.如段落1-3中任一段所述的组合物，其中所述LF多肽部分由SEQ ID NO :5组成。10.如段落1所述的组合物，其中所述细胞是在体内或存在于生物体中。11.如段落1所述的组合物，其中所述细胞是在体外。12.如段落1所述的组合物，当所述细胞在有靶抗原存在下且在没有外毒素保护抗原(PA)存在下接触組合物吋，所述组合物诱导细胞对靶抗原的应答。13.如段落1所述的组合物，其中所述靶抗原选自病原体抗原、肿瘤抗原或内源的错误折叠的蛋白。14.如段落13所述的组合物，其中所述病原体抗原选自甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、禽流感病毒、埃波拉病毒、西尼罗病毒、流感病毒、单纯疱疹病毒1、单纯疱疹病毒 2、HIV2、HIVl 和其它 HIVl 菌株。15.如段落13或14所述的组合物，其中所述病原体抗原不是由炭疽芽孢杆菌表达的抗原。16.如段落1所述的组合物，其中所述组合物任选地包含至少ー种佐剂。17.如段落16所述的组合物，其中所述佐剂选自完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、CM-CSF, QS21、CpG、RIBI Detox、of ；IL-2、Ig_IL_2、B7、ICAM、LFS、葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、多糖、淀粉、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、聚乙ニ醇(PEG)、聚(烯烃氧化物)、单甲氧基-聚
乙ニ醇聚丙ニ醇、聚乙ニ醇的嵌段共聚物、聚丙ニ醇。18. 一种促进对细胞的細胞-介导的免疫应答的方法，所述方法包括在有缺乏LF 酶活性的炭疽芽孢杆菌LF多肽部分存在下，使所述细胞接触靶抗原，其中所述缺乏LF酶活性的炭疽芽孢杆菌LF多肽部分没有共价地连接到靶抗原上，且其中所述细胞没有接触外毒素二分蛋白的保护抗原(PA)，由此促进针对靶抗原的細胞-介导的免疫应答。19. ー种用于将靶抗原递送给細胞的組合物，所述组合物包含至少ー种靶抗原和缺乏LF酶活性的炭疽芽孢杆菌LF多肽部分，其中所述炭疽芽孢杆菌LF多肽部分没有共价地连接到靶抗原上，且其中所述组合物不包含炭疽芽孢杆菌外毒素二分蛋白的保护抗原。20.如段落19所述的组合物，其中所述炭疽芽孢杆菌LF多肽部分包含SEQ ID NO 3的至少60个羧基端氨基酸或其促进跨膜递送的保守置換变体。21.如段落19所述的组合物，其中所述炭疽芽孢杆菌LF多肽部分包含SEQ ID NO 3的至少80个羧基端氨基酸或其促进跨膜递送的保守置換变体。22.如段落19-21中任一段所述的组合物，其中所述炭疽芽孢杆菌LF多肽部分包含SEQ ID NO 3的至少104个羧基端氨基酸或其促进跨膜递送的保守置換变体。23.如段落19-22中任一段所述的组合物，其中所述炭疽芽孢杆菌LF多肽部分包含与SEQ ID NO :3相对应的氨基酸序列或其促进跨膜递送的保守置換变体。24.如段落19-23中任一段所述的组合物，其中所述炭疽芽孢杆菌LF多肽部分不结合炭疽芽孢杆菌PA多肽。25.如段落19-24中任一段所述的组合物，其中所述炭疽芽孢杆菌LF多肽部分基本上缺少SEQ ID NO 3的氨基酸1-33。26.如段落19-21中任一段所述的组合物，其中所述炭疽芽孢杆菌LF多肽部分由 SEQ ID NO :4或其促进跨膜递送的保守置換变体组成。27.如段落19-21中任一段所述的组合物，其中所述炭疽芽孢杆菌LF多肽部分由 SEQ ID NO 5 組成。28.如段落19所述的组合物，其中所述细胞是在体内或存在于生物体中。29.如段落19所述的组合物，其中所述细胞是在体外。30.如段落19所述的组合物，当所述细胞在有靶抗原存在下且在没有外毒素保护抗原(PA)存在下接触組合物吋，所述组合物诱导细胞对靶抗原的应答。31.如段落19所述的组合物，其中所述靶抗原选自病原体抗原、肿瘤抗原或内源的错误折叠的蛋白。32.如段落31所述的组合物，其中所述病原体抗原选自甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、禽流感病毒、埃波拉病毒、西尼罗病毒、流感病毒、单纯疱疹病毒1、单纯疱疹病毒 2、HIV2、HIVl 和其它 HIVl 菌株。33.如段落31或32所述的组合物，其中所述病原体抗原不是由炭疽芽孢杆菌表达的抗原。34.如段落19所述的组合物，其中所述组合物任选地包含至少ー种佐剂。35.如段落34所述的组合物，其中所述佐剂选自完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、CM-CSF, QS21、CpG、RIBI Detox、of ；IL-2、Ig_IL_2、B7、ICAM、LFS、葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、多糖、淀粉、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、聚乙ニ醇(PEG)、聚(烯烃氧化物)、单甲氧基-聚
乙ニ醇聚丙ニ醇、聚乙ニ醇的嵌段共聚物、聚丙ニ醇。36. 一种将靶抗原递送至細胞的胞质溶胶的方法，所述方法包括在有缺乏LF酶活性的炭疽芽孢杆菌LF多肽部分存在下，使所述细胞接触靶抗原，其中所述缺乏LF酶活性的炭疽芽孢杆菌LF多肽部分没有共价地连接到靶抗原上，且其中所述细胞没有接触外毒素二分蛋白的保护抗原(PA)，由此将靶抗原递送至細胞的胞质溶胶。37.如段落36所述的方法，其中所述靶抗原的递送会诱导所述细胞对所述靶抗原的細胞-介导的免疫(CMI)应答。
38.如段落36所述的方法，其中所述LF多肽部分对应SEQ ID NO 5或其功能片段。39.如段落36所述的方法，其中所述炭疽芽孢杆菌LF多肽部分包含SEQ ID NO 3的至少60个羧基端氨基酸或其促进跨膜递送的保守置換变体。40.如段落36所述的方法，其中所述炭疽芽孢杆菌LF多肽部分包含SEQ ID NO 3的至少80个羧基端氨基酸或其促进跨膜递送的保守置換变体。41.如段落36所述的方法，其中所述炭疽芽孢杆菌LF多肽部分包含SEQ ID NO 3的至少104个羧基端氨基酸或其促进跨膜递送的保守置換变体。42.如段落36所述的方法，其中所述炭疽芽孢杆菌LF多肽部分包含与SEQ ID NO 3相对应的氨基酸序列或其促进跨膜递送的保守置換变体。43.如段落36所述的方法，其中所述炭疽芽孢杆菌LF多肽部分不结合炭疽芽孢杆菌PA多肽。44.如段落36所述的方法，其中所述炭疽芽孢杆菌LF多肽部分基本上缺少SEQ ID NO 3的氨基酸ト33。45.如段落36所述的方法，其中所述炭疽芽孢杆菌LF多肽部分由SEQ ID N0:4或其促进跨膜递送的保守置換变体组成。46.如段落36所述的方法，其中所述炭疽芽孢杆菌LF多肽部分由SEQ ID N0:5组成。47.如段落36所述的方法，其中所述外毒素是炭疽芽孢杆菌。48.如段落36所述的方法，其中所述细胞是在体内或存在于生物体中。49.如段落36所述的方法，其中所述细胞是在体外。50.如段落36所述的方法，所述方法另外包括给所述細胞施用至少ー种其它佐剂，其中所述佐剂不包含SEQ ID NO 3或SEQ ID NO :4。51.如段落50所述的方法，其中所述佐剂选自完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、 CM-CSF, QS21、CpG、RIBI Detox、of ；IL-2、Ig_IL_2、B7、ICAM、LFS、葡聚糖、聚乙烯吡咯烧酮、多糖、淀粉、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、聚乙ニ醇(PEG)、聚(烯烃氧化物)、单甲氧基-聚乙
ニ醇聚丙ニ醇、聚乙ニ醇的嵌段共聚物、聚丙ニ醇。52.如段落36所述的方法，其中所述靶抗原选自病原体抗原、肿瘤抗原或内源的错误折叠的蛋白。53.如段落52所述的方法，其中所述病原体抗原选自甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、禽流感病毒、埃波拉病毒、西尼罗病毒、流感病毒、单纯疱疹病毒1、单纯疱疹病毒2、 HIV2、HIVl和其它HIVl菌株。54.如段落52所述的方法，其中所述病原体抗原不是由炭疽芽孢杆菌表达的抗原。55.如段落1所述的组合物用于诱导細胞对靶抗原的細胞介导的应答的应用，其中在有靶抗原存在下，且在没有外毒素保护抗原(PA)存在下，使所述细胞接触組合物。56.如段落1或19所述的组合物，其另外包含至少ー种额外的免疫佐剂。57.如段落56所述的组合物，其中所述免疫佐剂选自铝、完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、CM-CSF、QS21、CpG、RIBI Detox。
58.如段落56所述的组合物，其中所述免疫佐剂是选自下述的細胞因子IL_2、 Ig-IL-2。59.如段落56所述的组合物，其中所述免疫佐剂是选自下述的辅刺激分子B7、 ICAM、LFS。60.如段落56所述的组合物，其中所述免疫佐剂是选自下述的非抗原聚合物质 葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、多糖、淀粉、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、聚乙ニ醇(PEG)、聚(烯烃氧化物)、单甲氧基-聚乙ニ醇聚丙ニ醇、聚乙ニ醇的嵌段共聚物、聚丙ニ醇。61.上述段落中任一段所述的方法，其中SEQ ID NO 3或SEQ ID NO 4针对在细菌细胞中的生产进行了密码子优化。単数术语“ー个”、“ー种”和“所述”包括复数所指，除非上下文另外明确指出。类似地，词语“或”意图包括“和”，除非上下文另外明确指出。进ー步理解，为核酸或多肽给出的所有碱基大小或氨基酸大小和所有分子量或分子质量值是近似值，并提供用于描述。尽管与本文所述的那些类似或等效的方法和材料可以用于实践或测试本公开内容，下面描述了合适的方法和材料。縮写“e.g. ”源自拉丁文例如，在本文中用于指示非限制性实例。因而，縮写“e. g. ”与术语“例如”同义。指出的所有专利和其它出版物特別地通过引用并入本文，其目的是描述和公开例如在这样的出版物中描述的可以与本发明结合使用的方法。仅为了它们在本申请的申请日之前的公开内容而提供这些出版物。在这方面不应当解释为，承认发明人由于在先发明或因为任何其它原因而丧失早于这样的公开内容的权利。关于日期的所有语句或关于这些文件的内容的陈述，是基于申请人可得到的信息，并不构成关于所述日期或这些文件的内容的正确性的任何承认。在本申请中引用的所有參考文献的内容，以及其中的附图和表格，都通过引用并入本文。參考文献1. Anderson, K. S. , J. Alexander, Μ. Wei,禾ロ P. Cresswell 1993. Intracellular transport οι class I MHし molecules m antigen processing mutant cell lines Journal of Immunology. 151 :3407-19.2. Androlewicz, M. J. , K. S. Anderson,禾ロ P. Cresswell 1993. Evidence that transporters associated with antigen processing translocate a major histocompatibility complex class I-binding peptide into the endoplasmic reticulum in an ATP—dependent manner Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 :9130-4.3. Ballard, J. D. ，A. M. Doling, K. Beauregard, R. J. Collier,禾ロ Μ· N. Starnbach 1998.Anthrax toxin-mediated delivery in vivo and in vitro of a cytotoxic T-Iymphocyte epitope from ovalbumin Infection&Immunity. 66 :615-9.4. Borrow, P. ，H. Lewicki，B. H. Hahn, G. Μ. Shaw,禾ロ Μ· B. A. Oldstone 1994. Virus-specific CD8+cytotoxic T-Iymphocyte activity associated with control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 infection J. Virol. 68 6103-6110.
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权利要求
1.一种用于促进对靶抗原的细胞介导的免疫(CMI)应答的组合物，所述组合物包含至少一种分离的靶抗原和缺少LF酶活性的致死因子(LF)多肽的一部分，其中所述LF多肽部分没有共价地连接到靶抗原上，且其中所述组合物不包含外毒素二分蛋白的保护抗原 (PA)。
2.如权利要求1所述的组合物，其中所述LF多肽部分包含SEQID NO 3的至少60个羧基端氨基酸或其促进对靶抗原的CMI应答的保守置换变体。
3.如权利要求1所述的组合物，其中所述LF多肽部分包含SEQID NO 3的至少80个羧基端氨基酸或其促进对靶抗原的CMI应答的保守置换变体。
4.如权利要求1-3中任一项所述的组合物，其中所述LF多肽部分包含SEQID NO :3的至少104个羧基端氨基酸或其促进对靶抗原的CMI应答的保守置换变体。
5.如权利要求1-4中任一项所述的组合物，其中所述LF多肽部分包含与SEQID NO 3相对应的氨基酸序列或其促进对靶抗原的CMI应答的保守置换变体。
6.如权利要求1-5中任一项所述的组合物，其中所述LF多肽部分不结合PA多肽。
7.如权利要求1-6中任一项所述的组合物，其中所述LF多肽部分基本上缺少SEQID NO 3的氨基酸1-33。
8.如权利要求1-3中任一项所述的组合物，其中所述LF多肽部分由SEQID NO 4或其促进对靶抗原的CMI应答的保守置换变体组成。
9.如权利要求1-3中任一项所述的组合物，其中所述LF多肽部分由SEQID NO 5组成。
10.如权利要求1所述的组合物，其中所述细胞是在体内或存在于生物体中。
11.如权利要求1所述的组合物，其中所述细胞是在体外。
12.如权利要求1所述的组合物，当所述细胞在有靶抗原存在下且在没有外毒素保护抗原(PA)存在下接触组合物时，所述组合物诱导细胞对靶抗原的应答。
13.如权利要求1所述的组合物，其中所述靶抗原选自病原体抗原、肿瘤抗原或内源的错误折叠的蛋白。
14.如权利要求13所述的组合物，其中所述病原体抗原选自甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、禽流感病毒、埃波拉病毒、西尼罗病毒、流感病毒、单纯疱疹病毒1、单纯疱疹病毒 2、HIV2、HIVl 和其它 HIVl 菌株。
15.如权利要求13或14所述的组合物，其中所述病原体抗原不是由炭疽芽孢杆菌表达的抗原。
16.如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物任选地包含至少一种佐剂。
17.如权利要求16所述的组合物，其中所述佐剂选自完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、GM-CSF ；QS21 ；CpG ；RIBI Detox ；IL-2 ；lg-IL-2 ；B7 ；ICAM ；LFS ；葡聚糖；聚乙烯吡咯烷酮；多糖；淀粉；聚乙烯醇；聚丙烯酰胺；聚乙二醇(PEG)；聚(烯烃氧化物)；单甲氧基-聚乙二醇聚丙二醇；聚乙二醇的嵌段共聚物；聚丙二醇。
18.一种促进对细胞的细胞-介导的免疫应答的方法，所述方法包括在有缺乏LF酶活性的炭疽芽孢杆菌LF多肽部分存在下，使所述细胞接触靶抗原，其中所述缺乏LF酶活性的炭疽芽孢杆菌LF多肽部分没有共价地连接到靶抗原上，且其中所述细胞没有接触外毒素二分蛋白的保护抗原(PA)，由此促进针对靶抗原的细胞-介导的免疫应答。
19.一种用于将靶抗原递送给细胞的组合物，所述组合物包含至少一种靶抗原和缺乏 LF酶活性的炭疽芽孢杆菌LF多肽部分，其中所述炭疽芽孢杆菌LF多肽部分没有共价地连接到靶抗原上，且其中所述组合物不包含炭疽芽孢杆菌外毒素二分蛋白的保护抗原。
20.如权利要求19所述的组合物，其中所述炭疽芽孢杆菌LF多肽部分包含SEQID NO 3的至少60个羧基端氨基酸或其促进跨膜递送的保守置换变体。
21.如权利要求19所述的组合物，其中所述炭疽芽孢杆菌LF多肽部分包含SEQID NO 3的至少80个羧基端氨基酸或其促进跨膜递送的保守置换变体。
22.如权利要求19-21中任一项所述的组合物，其中所述炭疽芽孢杆菌LF多肽部分包含SEQ ID NO 3的至少104个羧基端氨基酸或其促进跨膜递送的保守置换变体。
23.如权利要求19-22中任一项所述的组合物，其中所述炭疽芽孢杆菌LF多肽部分包含与SEQ ID NO :3相对应的氨基酸序列或其促进跨膜递送的保守置换变体。
24.如权利要求19-23中任一项所述的组合物，其中所述炭疽芽孢杆菌LF多肽部分不结合炭疽芽孢杆菌PA多肽。
25.如权利要求19-24中任一项所述的组合物，其中所述炭疽芽孢杆菌LF多肽部分基本上缺少SEQ ID NO 3的氨基酸1-33。
26.如权利要求19-21中任一项所述的组合物，其中所述炭疽芽孢杆菌LF多肽部分由 SEQ ID NO :4或其促进跨膜递送的保守置换变体组成。
27.如权利要求19-21中任一项所述的组合物，其中所述炭疽芽孢杆菌LF多肽部分由 SEQ ID NO 5 组成。
28.如权利要求19所述的组合物，其中所述细胞是在体内或存在于生物体中。
29.如权利要求19所述的组合物，其中所述细胞是在体外。
30.如权利要求19所述的组合物，当所述细胞在有靶抗原存在下且在没有外毒素保护抗原(PA)存在下接触组合物时，所述组合物诱导细胞对靶抗原的应答。
31.如权利要求19所述的组合物，其中所述靶抗原选自病原体抗原、肿瘤抗原或内源的错误折叠的蛋白。
32.如权利要求31所述的组合物，其中所述病原体抗原选自甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、禽流感病毒、埃波拉病毒、西尼罗病毒、流感病毒、单纯疱疹病毒1、单纯疱疹病毒 2、HIV2、HIVl 和其它 HIVl 菌株。
33.如权利要求31或32所述的组合物，其中所述病原体抗原不是由炭疽芽孢杆菌表达的抗原。
34.如权利要求19所述的组合物，其中所述组合物任选地包含至少一种佐剂。
35.如权利要求34所述的组合物，其中所述佐剂选自完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、GM-CSF ；QS21 ；CpG ；RIBI Detox ；IL-2 ；Ig-IL-2 ；B7 ；ICAM ；LFS ；葡聚糖；聚乙烯吡咯烷酮；多糖；淀粉；聚乙烯醇；聚丙烯酰胺；聚乙二醇(PEG)；聚(烯烃氧化物)；单甲氧基-聚乙二醇聚丙二醇；聚乙二醇的嵌段共聚物；聚丙二醇。
36.一种将靶抗原递送至细胞的胞质溶胶的方法，所述方法包括在有缺乏LF酶活性的炭疽芽孢杆菌LF多肽部分存在下，使所述细胞接触靶抗原，其中所述缺乏LF酶活性的炭疽芽孢杆菌LF多肽部分没有共价地连接到靶抗原上，且其中所述细胞没有接触外毒素二分蛋白的保护抗原(PA)，由此将靶抗原递送至细胞的胞质溶胶。
37.如权利要求36所述的方法，其中所述靶抗原的递送会诱导所述细胞对所述靶抗原的细胞-介导的免疫(CMI)应答。
38.如权利要求36所述的方法，其中所述LF多肽部分对应SEQID NO :5或其功能片段。
39.如权利要求36所述的方法，其中所述炭疽芽孢杆菌LF多肽部分包含SEQID NO 3的至少60个羧基端氨基酸或其促进跨膜递送的保守置换变体。
40.如权利要求36所述的方法，其中所述炭疽芽孢杆菌LF多肽部分包含SEQID NO 3的至少80个羧基端氨基酸或其促进跨膜递送的保守置换变体。
41.如权利要求36所述的方法，其中所述炭疽芽孢杆菌LF多肽部分包含SEQID NO 3的至少104个羧基端氨基酸或其促进跨膜递送的保守置换变体。
42.如权利要求36所述的方法，其中所述炭疽芽孢杆菌LF多肽部分包含与SEQID NO 3相对应的氨基酸序列或其促进跨膜递送的保守置换变体。
43.如权利要求36所述的方法，其中所述炭疽芽孢杆菌LF多肽部分不结合炭疽芽孢杆菌PA多肽。
44.如权利要求36所述的方法，其中所述炭疽芽孢杆菌LF多肽部分基本上缺少SEQID NO 3的氨基酸1-33。
45.如权利要求36所述的方法，其中所述炭疽芽孢杆菌LF多肽部分由SEQID N0:4或其促进跨膜递送的保守置换变体组成。
46.如权利要求36所述的方法，其中所述炭疽芽孢杆菌LF多肽部分由SEQID N0:5组成。
47.如权利要求36所述的方法，其中所述外毒素是炭疽芽孢杆菌外毒素。
48.如权利要求36所述的方法，其中所述细胞是在体内或存在于哺乳动物中。
49.如权利要求36所述的方法，其中所述细胞是在体外。
50.如权利要求36所述的方法，所述方法另外包括给所述细胞施用至少一种其它佐剂，其中所述佐剂不包含SEQ ID NO 3或SEQ ID NO :4。
51.如权利要求50所述的方法，其中所述佐剂选自完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、 GM-CSF ；QS21 ；CpG ；RIBI Detox ；IL-2 ；Ig-IL-2 ；B7 ；ICAM ；LFS ；葡聚糖；聚乙烯吡咯烷酮； 多糖；淀粉；聚乙烯醇；聚丙烯酰胺；聚乙二醇(PEG)；聚(烯烃氧化物)；单甲氧基-聚乙二醇聚丙二醇；聚乙二醇的嵌段共聚物；聚丙二醇。
52.如权利要求36所述的方法，其中所述靶抗原选自病原体抗原、肿瘤抗原或内源的错误折叠的蛋白。
53.如权利要求52所述的方法，其中所述病原体抗原选自甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、禽流感病毒、埃波拉病毒、西尼罗病毒、流感病毒、单纯疱疹病毒1、单纯疱疹病毒2、 HIV2、HIVl和其它HIVl菌株。
54.如权利要求52所述的方法，其中所述病原体抗原不是由炭疽芽孢杆菌表达的抗原。
55.如权利要求1所述的组合物用于诱导细胞对靶抗原的细胞介导的应答的应用，其中在有靶抗原存在下，且在没有外毒素保护抗原(PA)存在下，使所述细胞接触组合物。
56.如权利要求1或19所述的组合物，其另外包含至少一种额外的免疫佐剂。
57.如权利要求56所述的组合物，其中所述免疫佐剂选自铝；完全弗氏佐剂；不完全弗氏佐剂；GM-CSF ；QS21 ；CpG 和 RIBI Detox。
58.如权利要求56所述的组合物，其中所述免疫佐剂是选自下述的细胞因子IL-2和 Ig-IL-2。
59.如权利要求56所述的组合物，其中所述免疫佐剂是选自下述的辅刺激分子B7、 ICAM 禾口 LFS0
60.如权利要求56所述的组合物，其中所述免疫佐剂是选自下述的非抗原聚合物质 葡聚糖；聚乙烯吡咯烷酮；多糖；淀粉；聚乙烯醇；聚丙烯酰胺；聚乙二醇(PEG)；聚(烯烃氧化物)；单甲氧基-聚乙二醇聚丙二醇；聚乙二醇的嵌段共聚物和聚丙二醇。
61.上述权利要求中任一项所述的方法，其中SEQID NO :3或SEQ ID NO :4针对在细菌细胞中的生产进行了密码子优化。
62.如权利要求52所述的方法，其中所述病原体抗原是结核抗原。
63.如权利要求52所述的方法，其中所述结核抗原选自下述的至少一种Mtb8.4、381、 Mtb41、Mtb40、Mtb32A、Mtb9. 9A、Mtb9. 8、Mtbl6、Mtb72f、Mtb59f、Mtb88f、Mtb71f、Mtb46f 和 Mtb3If ;TbH9(Mtb 39A) ；TBI (CFP) -M TB2 (ESAT)或其片段。
全文摘要
本发明涉及用于促进或刺激对抗原的细胞-介导的免疫应答的方法，其中与含有二分蛋白外毒素的片段的转运因子一起施用靶抗原(诸如蛋白)，但是不施用对应的保护抗原。优选的转运因子包括来自炭疽芽孢杆菌的致死因子(LFn)的保护抗原结合域，其由以下组成氨基酸1-255、优选显示出与LFn的至少80％同源性的至少80个氨基酸的片段、以及不结合PA的来自羧基部分的约105个氨基酸的片段。所述靶抗原可以包括希望引起针对它的CMI应答的任意分子，包括病毒抗原和肿瘤抗原。
文档编号A61K38/00GK102573883SQ201080038561
公开日2012年7月11日 申请日期2010年6月11日 优先权日2009年6月12日
发明者A·斯特隆, N·库什纳, 吕亦晨, 徐争晖 申请人:疫苗技术公司