专利名称：红豆杉多糖免疫佐剂及含有该佐剂的流感疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种红豆杉多糖免疫佐剂，还涉及含有红豆杉多糖免疫佐剂的流感疫苗，属于生物技术领域。
背景技术：
曼迪亚红豆杉(Taxus madia)属于红豆杉中的一个天然杂交品种，其母本为东北红豆杉(T. cuspidata)，父本为欧洲红豆杉(T. bauata)，在美国、加拿大生长已有近100年的历史。我国20世纪90年代中期从加拿大引种，并通过人工繁殖后，在四川、广西、山东和云南等地栽培。人工栽培的曼迪亚红豆杉为常绿灌木，生物量十分巨大，且生长时间短，生长速度快，主根不太明显，但侧根却很发达，且枝叶茂盛，萌发力强，能耐-25°C的低温。曼迪亚红豆杉通过人工栽培、选育，目前已有10多个品系，曼迪亚红豆杉的年生长40 50cm， 最高可达60 70cm，5年生树枝叶剪下后可产“紫杉醇”原料1. 5kg以上，剪过的树木次年又可萌生新枝叶，且新枝叶的生物量还大于头年老枝叶的生物量。故曼迪亚红豆杉是经美国FDA批准可用作提取“紫杉醇”的红豆杉品种之一，目前主要作为提取“紫杉醇”的原料使用。专利申请号为200610053803，发明名称为“红豆杉多糖在制药中的应用”的中国专利申请，涉及红豆杉多糖在制备治疗肺癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌等癌症的药物中的应用，同时涉及红豆杉多糖在制备抗肿瘤复方药物中的应用，涉及红豆杉多糖在制备增强机体的耐受力的药物中的应用。红豆杉多糖具有优异的提高机体免疫功能的活性和抑制肿瘤生长和肿瘤转移的作用，并能增强机体的耐受力。以红豆杉多糖为活性成份的药物，在临床试验中具有缓解和稳定晚期肺、胃、大肠、乳腺、前列腺癌的疗效，具有保护人体的T细胞功能，使癌症患者免疫功能保持在较正常的状态。但没有涉及红豆杉多糖在佐剂领域的应用。研究表明红豆杉多糖具有免疫调节作用，从红豆杉中分离纯化出的红豆杉多糖。 腹腔内注射能显著增加小鼠脾重，促进小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能及小鼠血清溶血素的形成，对环磷酰胺所致小鼠免疫器官的萎缩，白细胞的减少，腹腔巨噬细胞吞噬功能的降低，以及小鼠血清溶血素的形成减少等，具有明显对抗作用。同时具有明显的提高荷瘤小鼠脾指数和胸腺指数的作用，以MTT法检测的荷瘤小鼠脾淋巴细胞转化和对NK细胞活性的影响，也显示出具有提高淋巴细胞转化率和促进NK细胞杀伤靶细胞的作用。另外，红豆杉多糖还具有促进细胞生长、抗肿瘤、抗辐射、抗氧化、抗衰老等作用，对核酸内切酶活性和DNA 修复合成也有增强作用，是一重要的天然生物活性物质。佐剂应用于疫苗中，能够增强抗原的免疫原性，提高疫苗的效果，使疫苗在价格上具有明显优势。尤其在流感疫苗中使用佐剂，不仅可增强免疫原性，还可以降低抗原用量， 特别在应对流感大流行时，佐剂的使用可有效降低抗原用量，扩大接种人群数量，降低疫苗生产企业因产量不足而带来的巨大压力。目前应用较为广泛的佐剂主要有铝佐剂(氧化铝、氢氧化铝、磷酸铝)、MF59 (是一种包含1%的鲨烯，0. 5%的Tween80和0. 5%的三油酸聚山梨脂的水包油乳液)、LTK63和新型佐剂。目前上市流感疫苗使用的佐剂主要是铝佐剂和MF59。但事实上铝佐剂对蛋白亚单位疫苗诱导抗体产生的能力较弱，不能有效地诱导免疫应答，在某些情况下还会产生与过敏反应有关的IgE，其副作用难以避免；MF59作为佐剂使用时，在增加免疫原性的同时也增强了反应原性，如接种部位红、肿、热、痛等症状增加。此外，由于存在安全性及副作用等问题，LTK63和其它新型佐剂如壳聚糖、ISCOMs等，要作为流感疫苗的佐剂，目前还只限于研究阶段。因此，随着各种新发流感在全世界的爆发和对人感染性的增强，，加快了新型流感疫苗的研究，寻求更高安全性和免疫原性的佐剂仍然是流感疫苗发展的一个需要。佐剂发挥作用是由于能增强抗原的免疫原性，提高疫苗效果。因此佐剂一般可在多种疫苗中使用，如目前的铝佐剂。因而佐剂的研究不仅对流感，而且对其它感染性疾病的防治也有很高的价值。流行性感冒(简称流感)是指由流感病毒引起，具有高度传染性的急性呼吸道传染病。流感发病快，传染性强，发病率高，主要通过空气飞沫传播。流感的流行没有明显的季节性，只是冬末春初发病率稍高一点，而且几乎每年都会发生，要么在局部爆发，要么大规模流行，甚至造成世界规模的大流行，严重危害了人类的健康和生命，给社会造成沉重的负担。到目前为止，接种流感疫苗被认为是预防流感发生与传播的最佳途径。由于流感病毒变异很快，通常每年的流行类型都有所不同，生产企业一般都在世界卫生组织(WHO)指导下选择流感病毒毒株进行疫苗生产，每年接种最新的流感疫苗才能达到预防的效果。一旦流感病毒变异造成大规模流行或者是世界性流行，疫苗需求量必将猛增，但目前由于受流感疫苗生产工艺的限制，短时间内是难于提供大规模流行所需的足量疫苗的，因此，应用免疫佐剂，减少疫苗用量并提高免疫效果，是应对大规模流行期间疫苗量不足的途径之一。经系统查阅文献和专利，目前未发现关于红豆杉多糖具有免疫佐剂作用的报道。
发明内容
为解决目前免疫佐剂单一，副作用难以避免，疫苗生产供应量有限，难以满足感染性疾病暴发时急需提供大量疫苗的要求，以及疫苗起效时间慢等诸多问题，本发明提供一种能有效提高疫苗免疫效果，降低疫苗用量的红豆杉多糖免疫佐剂。本发明的另一个目的在于提供一种含有红豆杉多糖免疫佐剂的流感疫苗。本发明提供的红豆杉多糖免疫佐剂由下列质量比的组分组成 红豆杉多糖0. 001 100%
载体0 99. 999%O所述载体由下列质量比的组分组成 乳化剂20 70% 助乳化剂 20 70% 油相 1 50% 水相 1 30%。所述乳化剂为常规的TweenSO或聚氧乙烯蓖麻油中的一种，或者为质量混合比为3 2 2 3的常规TweenSO与SpanSO的混合物，或者为质量混合比为1 1的常规聚氧乙烯蓖麻油与SpanSO的混合物。所述助乳化剂为常规的1，2_丙二醇或聚乙二醇400中的一种。所述油相为常规的肉豆蔻酸异丙酯或油酸乙酯或注射用大豆油中的一种。所述水相为注射用水或者含有药物或疫苗成分的注射用水溶液。本发明提供的红豆杉多糖免疫佐剂，优选下列质量比 红豆杉多糖0. 1 100%
载体0 99. 9%O本发明提供的一种含有红豆杉多糖免疫佐剂的流感疫苗的组成是红豆杉多糖免疫佐剂与流感疫苗血凝素的质量比为5(Γ183500，其中，所述红豆杉多糖免疫佐剂由下列质量比的组分组成
红豆杉多糖0. 001 100%
载体0 99. 999%O所述红豆杉多糖免疫佐剂与流感疫苗血凝素的质量比优选76 183500。所述红豆杉多糖为市购产品，或者为常规方法提取的产品。本发明提供的红豆杉多糖免疫佐剂与传统氢氧化铝佐剂相比，具有以下优点
1)红豆杉多糖是从红豆杉枝条中提取的一种天然物质，红豆杉多糖作为免疫佐剂使用，取得了应用性的实验结果，其安全性高、副作用小。将含有红豆杉多糖佐剂的流感疫苗肌肉注射小鼠，4小时内观察小鼠活动性无明显减弱，未见全身不良反应；而用含氢氧化铝佐剂的流感疫苗肌肉注射小鼠，可观察到小鼠活动性明显减弱，注射局部肿胀明显。2)用红豆杉多糖为佐剂的流感疫苗，不仅制备方法简便，而且疫苗质量容易控制； 而以氢氧化铝为佐剂制备流感疫苗，制备和存储过程中，影响因素较多，对于疫苗的质量较难控制。3)用红豆杉多糖作为流感疫苗佐剂，可更好的提高疫苗免疫原性，大大降低疫苗抗原用量。例如通过以红豆杉多糖为佐剂的流感疫苗和以氢氧化铝为佐剂的流感疫苗免疫小鼠发现，以红豆杉多糖为佐剂使用的疫苗抗原用量只是以氢氧化铝为佐剂的疫苗抗原用量的一半或者更少，但免疫保护效果却是一样的。
图1为不同接种组在56天内的血凝抑制抗体效价变化； 图2为不同接种组在加免后2周的血凝抑制抗体效价；
图3为不同接种组在接种后7天内的体重增长情况； 图4为不同接种组在加免后2周的血凝抑制抗体效价。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明做进一步说明，但并不以此来限定本发明。本发明实施例中未特别指明的组分均为市购产品，所用设备或仪器均是常规的。 实施例1
红豆杉多糖的乙醇提取取干燥曼迪亚红豆杉枝叶500g，粉碎成粉，置于容器内，用4倍体积即2000 ml且浓度为95%的乙醇，按常规进行加热回流提取，其中，每次加热温度为50°C，回流时间为60分钟，提取次数为2次，过滤后，对滤液进行减压回收乙醇后，余下滤液经浓缩干燥后，得乙醇浸膏50克，该浸膏的紫杉醇含量为0. 2%，多糖含量达60%以上，用200目的硅胶G拌料，装入内径15厘米，高150厘米的玻璃层析柱，以甲醇和氯仿(两者的体积比为1:1)为流动相进行常规洗脱，红豆杉多糖在玻璃柱层析分离过程中可显见棕红色，视其颜色的变化准确获取分离段溶液，浓缩回收该溶剂，获得35克多糖含量高于90%的曼迪亚红豆杉多糖。实施例2 红豆杉多糖的水提取
取干燥曼迪亚红豆杉枝叶500g，粉碎成粉，置于容器内，用8倍体积即4000 ml的蒸馏水按常规进行加热煎煮提取，其中，每次煎煮时间为4小时，提取次数为3次，过滤，合并滤液后，对滤液进行浓缩干燥，得水提浸膏30克，用实施例3的层析柱，并按照相同方法和相同分离条件进行洗脱，红豆杉多糖在玻璃柱层析分离过程中可显见棕红色，视其颜色的变化准确获取分离段溶液，浓缩回收该溶剂，得到25克多糖含量高于90%的曼迪亚红豆杉多糖。实施例3
曼迪亚红豆杉多糖的检测分别取实施例1和实施例2获得的曼迪亚红豆杉多糖， 按照《中华人民共和国药典》(2010年版二部)中国医药科技出版社1008页的方法，采用高效液相色谱仪进行检测，其指标符合多糖要求。实施例4 纳米乳剂载体的制备
1)按下列质量比备料0.475g注射用水，Ig肉豆蔻酸异丙酯(IPM)，1g 1，2_丙二醇，Ig Tween80 ；
2)向混合搅拌瓶内加入1gTween80,lg 1，2-丙二醇，在转速为200转/分钟，室温条件下，持续搅拌8分钟，混勻后加入Ig肉豆蔻酸异丙酯，混合均勻得混合物；
3)在上述2)的混合物中滴入0.475g注射用水，同时在转速为200转/分钟，室温下， 搅拌混合物至液体为透明，得到纳米乳剂；
4)对3)制得的纳米乳剂进行如下检测1.经马尔文粒径检测仪检测，粒径范围为 19. 205 24. 896nm,合格；2.经3000rpm, 15min离心分离，纳米乳剂体系不分层，合格； 3.经4°C放置50天，纳米乳剂体系无变化，合格。实施例5
含有红豆杉多糖免疫佐剂的流感疫苗的制备及动物免疫
1)称取实施例1的曼迪亚红豆杉多糖3.5mg，溶于 οομ 无水乙醇中，制成曼迪亚红豆杉多糖溶液，备用；
2)将上述1)制备的溶液与375μ1的Η3Ν2流感病毒裂解疫苗(血凝素含量为43.67μδ/ ml)混合，得475μ1含曼迪亚红豆杉多糖的流感疫苗；
3)取实施例4的全部纳米乳剂，在搅拌状态下缓慢滴入2)的含曼迪亚红豆杉多糖的流感疫苗475μ1，同时维持转速在100转/分钟，搅拌至溶液为微黄色透明，得到以曼迪亚红豆杉多糖、纳米乳剂为佐剂的流感病毒疫苗，其中曼迪亚红豆杉多糖的质量比为0. 117%，载体质量比为99. 883% ；曼迪亚红豆杉多糖纳米乳剂免疫佐剂与流感疫苗血凝素的质量比为:183409ο用实施例5制备的曼迪亚红豆杉多糖纳米乳剂流感病毒疫苗肌肉注射标准体重昆明种雌性小鼠，每只小鼠注射200μ1，其中200μ1注射疫苗中流感疫苗血凝素含量为 0. 94Pg，红豆杉多糖0. ang，第1天接种一针，第21天补种一针；于首次免疫后第一周开始， 每隔7天采尾血，分离血清，测定血凝抑制效价，同时设立注射等量的生理盐水空白对照组、等血凝素含量的Al (OH) 3佐剂流感疫苗的佐剂对照组、等血凝素含量的单独流感疫苗对照组。56天内得到的血凝抑制抗体效价检测结果见图1。实施例6
含有红豆杉多糖免疫佐剂的流感疫苗的制备
1)称取实施例2的曼迪亚红豆杉多糖7.6mg，溶于200μ1无水乙醇中，得曼迪亚红豆杉多糖溶液，备用；
2)将1)溶液与3.2ml市购的H3N2流感病毒裂解疫苗(血凝素含量43. 67Pg/ml)，得 3. 4ml含曼迪亚红豆杉多糖的流感疫苗；
3)取1.Ig聚氧乙烯蓖麻油、1.6g Span80,6g 1，2-丙二醇，3g肉豆蔻酸异丙酯放于搅拌瓶中，转速维持在200转/分钟，室温搅拌10分钟，至充分混勻，得纳米乳剂；
4)在上述3)的纳米乳剂中缓慢滴入2)的含曼迪亚红豆杉多糖的流感疫苗3.4ml,同时维持转速在200转/分钟，搅拌至溶液为淡黄棕色半透明，得到以曼迪亚红豆杉多糖、纳米乳剂载体为佐剂的流感病毒疫苗，其中曼迪亚红豆杉多糖的质量比为0. 065%，载体质量比为99. 935% ；曼迪亚红豆杉多糖与流感疫苗血凝素的质量比为83779。实施例7
动物实验用样品的制备及免疫
1)制备下列不同的佐剂或溶液
a)取实施例1的曼迪亚红豆杉多糖0. 2 mg，溶于20μ1无水乙醇，然后与120μ1生理盐水混合，得140ul曼迪亚红豆杉多糖溶液，备用；
b)取浓度为15. 98 mg/ml的氢氧化铝12. 5 μ ，其中含AL(OH)3 0. 2mg，加入生理盐水至体积为140 μ ，备用；
c)140 μ 生理盐水，备用；
d)200 μ 生理盐水，备用；
2)制备下列不同的疫苗
取血凝素含量为43. 67 μδ/πι1的市购Η3Ν2流感病毒裂解疫苗60μ1，分别与上述a、b、 c不同溶液混合，分别得到含有曼迪亚红豆杉多糖免疫佐剂的流感疫苗样品Α、含有AL(OH)3 佐剂的流感疫苗样品B、单独的流感疫苗样品C。d组不加疫苗，为生理盐水空白对照样品 D。所配置的上述A、B、C、D四个样品均制备五份，体积均为200 μ ，备用；其中含有曼迪亚红豆杉多糖的流感疫苗样品A中曼迪亚红豆杉多糖的质量比为100%，载体质量比为0 % ； 曼迪亚红豆杉多糖免疫佐剂与流感疫苗血凝素的质量比为76。3)免疫接种及检测
用上述2)所配的Α、B、C、D四个不同的样品分别免疫标准体重雌性昆明小鼠，每组5 只，每只肌肉注射200ul，第1天接种一针，第21天补种一针。于首次免疫后7天、14天、21天、观天、35天、42天、56天取尾血，分离血清测定血凝抑制效价，结果见附图2。于第一天接种前和接种后第8天对各组小鼠进行体重测量，对7天内各组平均增长的体重进行计算，所测结果显示红豆杉多糖佐剂组较之铝佐剂组及单独疫苗组小鼠体重增长受影响最低，并与空白对照组相比，小鼠体重增长幅度反而较大，可能是由于螺旋红豆杉多糖本身具有一定的补益作用，具体结果见附图3。实施例8
动物实验用样品的制备及免疫
A、取实施例2的曼迪亚红豆杉多糖0. 3 mg，溶于40μ1无水乙醇，再与130μ1生理盐水混合，然后加入市购的Η3Ν2流感裂解疫苗30μ1至终体积为200 μ ，Η3Ν2流感裂解疫苗的血凝素含量为1.3lPg，得含有曼迪亚红豆杉多糖的流感病毒疫苗，备用；其中曼迪亚红豆杉多糖的质量比为100%，载体质量比为0 %;曼迪亚红豆杉多糖佐剂与流感疫苗血凝素的质量比为:2290B、取Η3Ν2流感裂解疫苗60 μ ，其中含血凝素2. 62μδ,与140 μ 生理盐水混合至终体积为200 μ ，作为单独疫苗对照组，备用；
C、取浓度为15.98 mg/ml的氢氧化铝佐剂12. 5 μ ，其中含OJmg AL(OH)3，与含血凝素2. 62μδ的流感疫苗60 μ 混合，然后加入生理盐水至终体积200 μ ，作为AL (OH) 3佐剂疫苗对照组，备用
D、生理盐水200μ ，为空白对照组，备用； F、免疫接种及抗体检测
将上述配好的A、B、C、D四个样品分别免疫标准体重昆明雌性小鼠，肌肉注射，每只200 μ ，每组5只，第1天接种一针，第21天补种一针，于第2次免疫后2周进行尾部采血，分离血清，检测血凝抑制抗体效价，结果见附图4。
权利要求
1.一种红豆杉多糖免疫佐剂，其特征在于由下列质量比的组分组成红豆杉多糖0. 001 100%载体0 99. 999%O
2.如权利要求1所述的红豆杉多糖免疫佐剂，其特征在于所述载体由下列质量比的组分组成乳化剂20 70%助乳化剂20 70%油相1 50%水相1 30%。
3.如权利要求2所述的红豆杉多糖免疫佐剂，其特征在于所述乳化剂为常规的 TweenSO或聚氧乙烯蓖麻油中的一种，或者为质量混合比为3 2 2 3的常规TweenSO 与SpanSO的混合物，或者为质量混合比为1 1的常规聚氧乙烯蓖麻油与SpanSO的混合物。
4.如权利要求2所述的红豆杉多糖免疫佐剂，其特征在于所述助乳化剂为常规的1， 2-丙二醇或聚乙二醇400中的一种。
5.如权利要求2所述的红豆杉多糖免疫佐剂，其特征在于所述油相为常规的肉豆蔻酸异丙酯或油酸乙酯或注射用大豆油中的一种。
6.如权利要求2所述的红豆杉多糖免疫佐剂，其特征在于所述水相为注射用水或者含有药物或疫苗成分的注射用水溶液。
7.一种含有如权利要求1所述红豆杉多糖免疫佐剂的流感疫苗，其特征在于红豆杉多糖免疫佐剂与流感疫苗血凝素的质量比为5(Γ183500，其中，所述红豆杉多糖免疫佐剂由下列质量比的组分组成红豆杉多糖0. 001 100%载体0 99. 999%O
全文摘要
本发明提供一种红豆杉多糖免疫佐剂及含有该佐剂的流感疫苗，其中红豆杉多糖免疫佐剂由下列质量比的组分组成红豆杉多糖0.001～100%，载体0～99.999%。红豆杉多糖免疫佐剂与流感疫苗血凝素的质量比为50~183500。红豆杉多糖是从红豆杉枝条中提取的一种天然物质，红豆杉多糖作为免疫佐剂使用，取得了应用性的实验结果，其安全性高、副作用小。含有红豆杉多糖佐剂的流感疫苗，不仅制备方法简便，而且疫苗质量容易控制，能更好的提高疫苗免疫原性，大大降低疫苗抗原用量，实验证明，以红豆杉多糖为佐剂使用的疫苗抗原用量只是以氢氧化铝为佐剂的疫苗抗原用量的一半或者更少，但免疫保护效果却是一样的。
文档编号A61K39/39GK102160893SQ20111004618
公开日2011年8月24日 申请日期2011年2月25日 优先权日2011年2月25日
发明者刘洪卿, 孙笠雯, 李慧, 李映波, 高天荣 申请人:中国医学科学院医学生物学研究所