专利名称：重组人源脑红蛋白的生物活性检测方法及其用途的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医药领域，具体涉及重组人源脑红蛋白的生物活性检测方法及其用途，特别是重组人源脑红蛋白的清除自由基活性的检测方法及其在制备具有清除自由基功能药物中的用途。
背景技术：
脑红蛋白(neuroglobin，Ngb)是2000年新发现的主要表达于神经系统的第三类携氧珠蛋白，功能和性质方面与肌红蛋白类似，与氧有很高的亲和力(P5tl 2torr)。对于 Ngb蛋白检测，现多集中在蛋白的免疫活性(蛋白印迹检测)和蛋白含量的检测方面，针对 Ngb蛋白的生物活性，尤其是清除自由基活性，目前尚无合适的检测方法报道。申请人:在发明专利ZL200510059313. 5中公开了重组全长人源脑红蛋白(rhNgb) 的制备方法，获得了原核表达的rhNgb蛋白，为rhNgb蛋白在产业上大量生产奠定了基础。然而，产业生产需要有相应的质量标准和质检体系支持，由此，申请人在蛋白水平上对 rhNgb的生物活性进行系列深入研究，并有望将研究成果转化为rhNgb蛋白生产的质量标准和质检方法。目前，国内外有很多关于Ngb抗自由基损伤的研究报道，已经通过真核表达载体技术和转基因等手段(而不是使用Ngb蛋白)，间接证明Ngb具有保护细胞抵抗自由基损伤的功會邑。如 Fordel 等(Neurosci Lett,Neuroglobin and cytoglobin overexpression protects human SH—SY5Y neuroblastoma cells against oxidative stress-induced cell death, 2006,410 (2) : 146-51)研究指出，过表达的Ngb能够保护SH-SY5Y细胞抵抗氧化应激诱导的细胞死亡；而Wang等(Stroke，Effects of neuroglobin overexpression on acute brain injury and long-term outcomes after focal cerebral ischemia，2008， 39(6) :1869-74)用过表达Ngb的转基因小鼠进行实验，发现Ngb过表达能够减少机体内氧化应激的产生；Nayak 等(J Neurochem, Role of neuroglobin in regulating reactive oxygen species in the brain of the anoxia-tolerant turtle Trachemys scripta, 2009,110(2) :603-12)研究发现，在体外培养的神经细胞中Ngb能够降低自由基的产生；Li 等(Brain Res, Neuroglobin protects PC 12 cells against oxidative stress,2008, 1190 :159-66)发现，过表达的Ngb能够保护PC12细胞抵抗氧化应激损伤。但是，以上研究只能说明Ngb对自由基引起的细胞损伤具有保护作用，并不能说明Ngb本身对自由基具有清除作用，也无法证明其抗氧化能力，因此文献中所报道的内容并不适合rhNgb生物活性的检测；同时，目前仅有的直接从Ngb蛋白进行的清除自由基研究(Neuro-and cytoglobin are found to show no appreciable superoxide dismutase, catalase, and peroxidase activities. (Gene, Neuroglobin and cytoglobin as potential enzyme or substrate, 2007,398(1-2) :103-1 )，却并未发现Ngb具有超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT) 和过氧化物酶(POD)活性，尚未证明其具有能够清除自由基的能力，导致对于Ngb生物活性的判定出现相互矛盾之处。这可能是由于检测技术灵敏度不足所导致的。因此目前还没有从蛋白水平直接检测Ngb蛋白清除自由基活性的报道。自由基是机体正常代谢的中间产物(包括但不限于超氧阴离子、过氧化氢、羟自由基等)。自由基在机体内具有很强的氧化反应能力，同时过量的自由基却又易于在机体内与各种生物大分子发生反应而导致细胞和组织氧化损伤。机体内过多的自由基是许多疾病产生的重要原因，因此清除过量自由基已成为防治多种疾病的重要方式。生理状态下人体内自由基处于产生与清除的动态平衡中，而此平衡主要依靠机体内的抗氧化系统进行维持。机体内过多的自由基是产生氧化应激的重要因素，也是致病的重要原因，如神经系统退行性疾病、脑中风、肿瘤等，因此清除体内过多的自由基或防止过多自由基的产生已成为预防神经系统疾病的重要途径。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种灵敏度较高的从蛋白水平直接检测重组人源脑红蛋白生物活性的方法。本发明所提供的重组人源脑红蛋白的生物活性检测方法，是通过重组人源脑红蛋白清除自由基能力体现，以rhNgb清除超氧阴离子、过氧化氢和羟自由基的活性作为检测指标。具体来讲，一种所述重组人源脑红蛋白的系列生物活性检测方法，针对rhNgb清除超氧阴离子活性进行检测，用NBT光还原法，可包括以下步骤(1)测定样品吸收度向样品组中加入样品、反应混合液、PBS和VB2,向空白对照组中加入双蒸水，然后立即将待测样品放于光照箱，室温下光照15min，立即遮光终止反应，测定560nm处吸光度； 所述反应混合液为L-Met NBT EDTA-Na2按体积比2 2 1比例混合的混合液；(2)计算清除超氧阴离子的活性按下式计算清除超氧阴离子活性SAA(%) = [1-A/AJX100，其中A为空白对照组吸光度，A0为样品组吸光度。在上述NBT光还原法测定rhNgb清除超氧阴离子活性的方法中，所述各试剂浓度为L-Met 39mM、NBT 0. 225mM 和 EDTA-Na2 3mM、VB2 0. 12mM、PBS (pH 7.2)。具体来讲，另一种所述重组人源脑红蛋白的系列生物活性检测方法，针对rhNgb 清除过氧化氢活性进行检测，用过氧化氢灭活酶法进行检测，可包括以下步骤1)检测(1)标准曲线测定①取过氧化氢溶液至离心管中，加入过氧化氢酶检测缓冲液，混勻；然后加入显色工作液，25°C孵育后测定A520 ；②计算出标准曲线；(2)样品测定①将样品中加入到新的离心管中，然后加入过氧化氢酶检测缓冲液，混勻，再加入过氧化氢溶液，迅速混勻，25°C反应；②向上述反应体系中加入过氧化氢酶反应终止液，混勻以终止反应，并在终止反应后15分钟内完成下一步；
③向新的塑料离心管内加入过氧化氢酶检测缓冲液，然后加入已终止并混勻的上述反应体系，混勻；再加入200 μ 1显色工作液；25°C孵育后测定A520 ；2)清除过氧化氢活性的计算根据标准曲线计算出的k和b值计算实验中消耗的过氧化氢微摩尔数；在上述过氧化氢酶检测rhNgb清除过氧化氢活性的方法中，所述过氧化氢酶检测缓冲液、过氧化氢酶反应终止液、显色工作液均为过氧化氢酶检测试剂盒自带试剂(江苏碧云天生物技术研究所)。具体来讲，再一种所述重组人源脑红蛋白的系列生物活性检测方法，针对羟自由基的活性进行检测，用邻二氮菲-Fe (II)比色法；所述邻二氮菲-Fe (II)比色法可包括以下步骤1)待测样品溶液准备将待测rhNgb样品配成0. 1，0. 5，lmg/ml的样品溶液；2)四个离心管分别标号f、0、χ、s，分别依次加入邻二氮菲溶液，PBS, FeSO4溶液， f、0、s中加入双蒸水，χ中加入等量的样品溶液；再等量分别在f、x中加入H2O2，在0中加入双蒸水，在s中加入样品溶液；水浴后于536nm处测其吸光度，其值分别为Af、A0, Ax和As ；3)计算清除羟自由基活性按算式计算羟自由基清除率HRSA HRSA (% ) = [1-(As-Ax) / (A0-Af) ] X 100。以上三种检测方法中，将10 μ g/ml的rhNgb清除超氧阴离子的比率>50%作为产品具有此清除活性的指标；10 μ g的rhNgb清除过氧化氢的摩尔数> 5 μ mol为产品具有清除过氧化氢活性的指标；100 μ g/ml的rhNgb清除羟自由基的比率> 10%作为产品具有该清除活性的指标。对于被检测的rhNgb产品，可以选用其中的任意一项作为检测指标，只要有一项检测指标达标的产品即可认为其具有清除自由基活性，作为合格产品，并可进一步用于制备具有清除自由基功能的药物的活性成分。上述重组人源脑红蛋白的生物活性检测方法在对rhNgb生物活性的跟踪，rhNgb 生产制备、储存、运输过程中rhNgb的活性确认，含有rhNgb的生物制品的活性检测，以及在建立rhNgb质量标准和质检体系中的应用也属于本发明的保护范围。经本发明的发明人证实，脑红蛋白Ngb具有清除自由基功能，因而可以其为活性成份制备具有清除自由基功能的药物。所述Ngb优选为重组人源脑红蛋白(rhNgb)。所述具有清除自由基功能的药物包括治疗氧化应激诱导的多种神经系统疾病的候选药物，治疗氧化应激诱导的神经系统疾病中的药物，治疗氧化应激诱导的多种神经系统疾病和脑缺血/缺氧等引起机体自由基增加的相关疾病的药物，还包括它们的医药产
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ΡΠ O本发明用NBT光还原法、过氧化氢灭活酶法和邻二氮菲-Fe(II)比色法等检测技术证明rhNgb能够清除自由基(包括但不限于超氧阴离子、过氧化氢、羟自由基等)，因而可以其为活性成份制备具有清除自由基功能的药物，并以此建立了 rhNgb的生物活性的检测方法。本发明提供的活性检测方法包括但不限于以rhNgb清除超氧阴离子、清除过氧化氢等能力作为检测指标。本发明的检测方法稳定，具有测定结果可靠、检测数据重复性较高等优点，测定的结果能较好地反映rhNgb蛋白的生物活性，并且在对rhNgb本身以及含有 rhNgb的生物制品的活性跟踪方面具有广泛用途，还可用于rhNgb生产过程中的质量跟踪， 对建立rhNgb质量标准和质检体系提供了保证，适合推广和应用。
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
图1为rhNgb清除超氧阴离子活性检测结果图2为rhNgb清除过氧化氢活性检测结果图3为rhNgb清除羟自由基活性检测结果
具体实施例方式下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。本发明用下列实施例来进一步从清除自由基能力角度对rhNgb生物活性进行检测来说明本发明，但本发明的保护范围并不限于实施例。实施例1 :rhNgb清除超氧阴离子活性检测采用氯化硝基四氮唑蓝(NBT)-光还原法测定，该反应中VBJP EDTA在光照下发生反应，产生超氧阴离子，超氧阴离子与NBT发生反应，在560nm处有最大吸收峰。在反应中， VB2和EDTA在光照下发生反应，产生超氧阴离子，超氧阴离子与NBT发生反应，加入rhNgb 后，rhNgb与超氧阴离子反应，进一步阻止了超氧阴离子与NBT的反应，在560nm处吸收峰的值会发生变化。根据rhNgb与超氧阴离子反应的程度可计算rhNgb清除超氧阴离子活性能力。实施例中清除超氧阴离子活性的测定方法分为试剂配制，样品/对照品配制，测定样品和对照品吸收度，计算清除超氧阴离子的活性四个步骤(1)试剂配制①39mM L-蛋氨酸(L-Met)、0. 225mM氯化硝基四氮唑兰(NBT)、3mM乙二氨四乙酸二钠(EDTA-Na2)的配制分别称取L_Met、NBT、EDTA-Na2 lOOmg，用双蒸水溶解为39mM、 0. 225mM、3mM，避光保存，备用。②核黄素(VB2)的配制称取VB2 IOmg,用双蒸水溶解为0. 12mM,避光保存，备用。③反应混合液配制L-Met NBT EDTA-Na2按体积比2 2 1比例混合(避光操作)，反应液现配现用。④0. 05M 磷酸缓冲液(PBS)配制称取 NaCl 8g，KCl 0. 2g，Na2HPO4 1. 44g，KH2PO4 0. 24g，调pH值至7. 4，用双蒸水定容至IOOOml，备用。(2)样品和对照品的配制①rhNgb样品溶液制备在已制备的rhNgb样品基础上，用双蒸水将rhNgb配制成 0. 025,0. 05，0. 075,0. 1,0. 125mg/ml 不同浓度，4°C冰箱保存备用。②对照品维生素C(Vc)、还原型谷胱甘肽(GSH)、N_乙酰半胱氨酸(NAC)和血红蛋白(Hb)溶液的制备同rhNgb制备，称取对照品10mg，用双蒸水将其配制成lmg/ml，然后再将其分别稀释为0. 025,0. 05，0. 075,0. 1,0. 125mg/ml，4°C冰箱保存备用。(3)测定样品和对照品吸收度向微量离心管(Eppendorf管)中依次加入反应混合液0. 35ml和0. 12mM核黄素 (VB2)0. 1ml，然后向空白对照组中加入0. Iml双蒸水，向样品组中加入0. Iml的样品溶液， 各组中加入0.45ml 0. 05 M PBS，最后各组中加入0. Iml VB2，立即将各组放于光照箱(日光灯，30W)，室温下照光15min，立即遮光终止反应，用美国Varian公司的Cary 50 UV-VIS 测定560nm处吸光度。以常见的抗氧化剂Vc、GSH、NAC和血红蛋白(Hb)同浓度溶液作为对照。(4)计算清除超氧阴离子的活性清除超氧阴离子活性(superoxide anion scavenging activity, SAA)按下式计算SAA(% ) = [1-A/AJ X100。其中A为空白对照组吸光度，A0为样品组或对照组吸光度。实验结果参见图1。结果表明，rhNgb在测定浓度范围内对超氧阴离子有较强的清除能力，并且随rhNgb浓度的增加，清除能力也明显增加。分析发现，与Vc相比，rhNgb的清除能力相差不大，但比GSH和NAC强得多，比Hb强一些(图1)。实施例2 :rhNgb清除过氧化氢活性检测在过氧化氢相对充足的情况下，过氧化氢酶可催化过氧化氢产生水和氧气。残余的过氧化氢在过氧化物酶催化下可产生红色的产物N-(4-安替比林基)-3_氯-5-磺酸基-对苯酉昆亚月安(N- (4-antipyryl) -3-chloro-5-sulfonate-p-benzoquinonemonoimine)， 其最大吸收波长为520nm。rhNgb清除过氧化氢活性检测使用碧云天生物技术研究所过氧化氢酶检测试剂盒进行测定。1、试剂配制(l)rhNgb样品溶液制备在已制备的rhNgb样品基础上，用双蒸水将rhNgb配制成lmg/ml样品溶液。(2)对照品维生素C(Vc)、还原型谷胱甘肽(GSH)、N-乙酰半胱氨酸(NAC)和血红蛋白(Hb)溶液的制备同rhNgb制备，称取对照品10mg，用双蒸水将其配制成lmg/ml的对照品溶液。2、试剂盒检测(1)标准曲线测定①取0、12· 5、25、50或75 μ 1配制好的5mM过氧化氢溶液至1. 5ml或0. 5ml塑料离心管中，分别加入过氧化氢酶检测缓冲液至最后体积为100μ 1，混勻。②各取4μ 1，加入到塑料离心管内，加入200μ 1显色工作液。25°C至少孵育15分钟(孵育时间不宜超过45分钟)后测定A52tl(注本步骤可以和样品测定步骤中的最后一步同时进行)。③绘制过氧化氢浓度与A52tl的标准曲线。由标准曲线算式A52tl = k[过氧化氢微摩尔数]+b计算出系数k和b的值(A52tl值与H2O2微摩尔数为对应关系，0、12. 5、25、50μ 1的H202 (5mM)分别对应固定的A52tl值)。(2)样品测定①取10 μ 1样品溶液加入到新的微量离心管(Eppendorf管)中，然后加入过氧化氢酶检测缓冲液至体积为20 μ 1，混勻；再加入10 μ 1 250mM过氧化氢溶液，用移液器迅速混勻，25 °C反应1-5分钟。②加入450 μ 1过氧化氢酶反应终止液，颠倒混勻或涡旋(Vortex)混勻以终止反应。需在终止反应后15分钟内完成下面的步骤③和步骤④。③在一洁净的塑料离心管内加入40 μ 1过氧化氢酶检测缓冲液，再加入10 μ 1已终止并混勻的上述反应体系，混勻。④从上一步骤的50 μ 1体系中取10 μ 1加入到塑料离心管中，加入200 μ 1显色工作液。⑤25°C至少孵育15分钟(孵育时间不宜超过45分钟)后，用美国Varian公司的 Cary50 UV-VIS 测定 A520。(3)、清除过氧化氢活性的计算在样品测定中，可根据测定的A520数值代入标准曲线计算，得出反应体系中剩余的H2A量即样品的[过氧化氢微摩尔数]，进而得到实验体系中参加反应的H2O2。①通过标准曲线计算出样品中残余的H2A摩尔数。残余H2A 微摩尔数=(A520-b) /k ；②清除H2O2摩尔数=空白对照残余过氧化氢微摩尔数-样品残余过氧化氢微摩尔数。 按同样方法进行对照品的检测与计算。实验结果参见图2。显示，rhNgb清除过氧化氢的活性较强，10 μ g/ml的样品溶液清除过氧化氢> 7 μ M，与Vc等常规抗氧化剂比较，其清除能力更强(图2)。实施例3 :rhNgb清除羟自由基活性的检测采用邻二氮菲-Fe2+比色法对rhNgb清除羟自由基的活性进行测定。羟自由基通过芬顿(Fenton)反应产生!^e2+和H2O2。1)用双蒸水将rhNgb配制成0. 1,0. 5，lmg/ml不同浓度的样品溶液，而血红蛋白 (Hb)、Vc、还原型谷胱甘肽(GSH)、N-乙酰半胱氨酸(NAC)溶液的配制同rhNgb，4°C冰箱保存备用；2)向微量管(离心Eppendorf管)中依次加入0. 75mM的邻二氮菲溶液100 μ 1， PBS (ρΗ7· 2) 200 μ 1,加入 0. 75mM 的 FeSO4 100 μ 1 和双蒸水 50 μ 1，充分摇勻；3)加入0.01%的H2A 50μ 1，起始反应，并置于37°C下水浴60min ；4)将混合液从水浴中取出后，于536nm处测其吸光度，其值称Af ；5)同1) -3)，用50 μ 1的双蒸水代替50 μ 1的H2O2，测得的吸光度称A0 ；6)同1) -3)，用50 μ 1的rhNgb样品溶液代替50 μ 1的双蒸水，测得的吸光度称 Ax ； 7)同1) -3)，将50 μ 1的rhNgb样品溶液代替50 μ 1的H2O2，测得的吸光度称As ；8)清除羟自由基活性(hydroxyl radical scavenging activity, HRSA)计算方法为HRSA (% ) = [1-(As-Ax) / (A0-Af) ] X 100 ；按同样方法进行对照品的检测与计算。结果如图3所示，显示在lmg/ml浓度下，rhNgb清除羟自由基的活性较强，高于 GSH和Hb，但与Vc和NAC相比较，其清除能力稍弱。实施例4 不同rhNgb产品的生物活性检测1)样品准备
针对不同批次的rhNgb蛋白产品，用双蒸水将rhNgb产品配制成lmg/ml的浓度， 后续根据需求进行不同浓度的稀释；2)所需试剂及仪器试剂所用试剂参照实施例1-3所述进行配制；仪器具有检测使用波段的紫外分光光度计，如Cary 50UV-VIS ；3)检测操作过程参照实施例1-3的具体操作步骤进行测定。4)结果及评价标准
权利要求
1.重组人源脑红蛋白的生物活性检测方法，包括以下步骤1)将待检重组人源脑红蛋白配制成设定浓度的样品溶液；2)检测样品溶液清除自由基的能力；3)计算出检测数据并与重组人源脑红蛋白的生物活性标准数据比较，得出检测结果；其中所述清除自由基的能力包括但不限于以rhNgb对超氧阴离子清除率、rhNgb清除过氧化氢的量、和/或rhNgb对羟自由基的清除率作为检测指标。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于针对rhNgb清除超氧阴离子活性进行检测，用NBT光还原法；所述NBT光还原法可包括以下步骤1)待测样品溶液准备将待测rhNgb样品配成0.025 0. 125mg/ml的样品溶液；2)显色反应向样品溶液中加入反应混合液、PBS和VB2,同时设空白对照组，其中加入与样品溶液等量的双蒸水；然后将待测样品溶液和空白组溶液室温下照光15min，立即遮光终止反应；所述反应混合液为L-Met NBT EDTA-Nei2按体积比2 2 1比例混合的混合液；3)测定吸收度分别对待测样品溶液和空白组溶液测定560nm处吸光度，得到待测样品溶液吸光度值Atl，空白组溶液吸光度值A ；4)计算清除超氧阴离子的活性按下式计算超氧阴离子清除率SAA(% ) = [1-A/AJ X100，计算得到的百分数即为待测样品清除超氧阴离子活性数值。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于所述rhNgb清除超氧阴离子比率> 50%为重组人源脑红蛋白具有清除超氧阴离子活性的标准。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于针对rhNgb清除过氧化氢活性进行检测，用过氧化氢灭活酶检测法；所述过氧化氢灭活酶检测法可包括以下步骤1)制作标准曲线按照过氧化氢酶检测试剂盒方法制作过氧化氢浓度与吸光度A5^1的标准曲线；由标准曲线算式A52tl = k[过氧化氢微摩尔数]+b计算出系数k和b的值；2)将待测rhNgb样品配成lmg/ml的样品溶液；3)按照过氧化氢酶检测试剂盒方法，测定样品溶液的吸光度A52tl的数值，并代回标准曲线算式计算样品溶液中的残余过氧化氢微摩尔数残余H2A微摩尔数=(A520-b) /k ；4)利用以下算式计算得出待测rhNgb样品清除H2A的摩尔数清除H2O2摩尔数=空白对照残余过氧化氢微摩尔数-样品残余过氧化氢微摩尔数。
5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于所述rhNgb清除过氧化氢的量> 5 μ mol为重组人源脑红蛋白具有清除过氧化氢活性的标准。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于针对羟自由基的活性进行检测，用邻二氮菲-Fe(II)比色法；所述邻二氮菲-Fe (II)比色法可包括以下步骤1)待测样品溶液准备将待测rhNgb样品配成0.1,0. 5，lmg/ml的样品溶液；2)四个试管分别标号f、0、χ、s，分别依次加入邻二氮菲溶液，PBS,FeSO4溶液，f、0、s 中加入双蒸水，χ中加入等量的样品溶液；再等量分别在f、χ中加入H2O2，在0中加入双蒸水，在s中加入样品溶液；水浴后于536nm处测其吸光度，其值分别为Af、A0, Ax和As ；3)计算清除羟自由基活性按算式计算羟自由基清除率HRSA HRSA (% ) = [1-(As-Ax) / (A0-Af) ] XlOO0
7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于所述rhNgb羟自由基清除率>10% 为重组人源脑红蛋白具有清除羟自由基活性的标准。
8.权利要求1-7任一项所述方法在对rhNgb生物活性的跟踪，rhNgb生产制备、储存、 运输过程中rhNgb的活性确认，含有rhNgb的生物制品的活性检测中的应用。
9.脑红蛋白Ngb在制备具有清除自由基功能药物中的应用；所述Ngb为重组人源脑红蛋白rhNgb。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于所述具有清除自由基功能的药物包括治疗氧化应激诱导的多种神经系统疾病的候选药物，治疗氧化应激诱导的神经系统疾病中的药物，治疗氧化应激诱导的多种神经系统疾病和脑缺血/缺氧等引起机体自由基增加的相关疾病的药物，还包括它们的医药产品。
全文摘要
本发明公开了一种重组人源脑红蛋白的生物活性检测方法及其用途，该检测方法包括1)将待检重组人源脑红蛋白配制成设定浓度的样品溶液；2)检测样品溶液清除自由基的能力，以rhNgb对超氧阴离子清除率、rhNgb清除过氧化氢的量、和/或rhNgb对羟自由基的清除率作为检测指标；3)计算出检测数据并与重组人源脑红蛋白的生物活性标准数据比较，得出检测结果。本发明还提出脑红蛋白Ngb在制备具有清除自由基功能药物中的应用，为新药研发提供了思路。本发明的检测方法稳定，具有测定结果可靠、检测数据重复性较高等优点，测定的结果能较好地反映rhNgb蛋白的生物活性，并且在对rhNgb本身以及含有rhNgb的生物制品的活性跟踪方面具有广泛用途。
文档编号A61P25/00GK102175682SQ20111005396
公开日2011年9月7日 申请日期2011年3月7日 优先权日2010年3月8日
发明者吴永红, 张成岗, 李伟光, 高艳 申请人:中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所