专利名称：一种组织工程化神经组织及其构建方法
技术领域：
本发明属于组织工程与再生医学技术领域，具体涉及一种组织工程化神经组织及其构建方法。
背景技术：
组织工程是20世纪80年代末发展起来的一门新兴交叉学科，近年来，随着生命科学和材料科学的发展，科研人员相继在骨骼、软骨、皮肤等多种组织和器官体外再造研究方面取得突破性进展，其中，一些组织工程产品如软骨、皮肤已实现商品化。尽管由于神经系统本身的复杂性，再加上组织工程化神经组织的研究起步较晚，目前在体外构建的神经组织还远不能实现商品化；但是，随着干细胞、神经营养因子与生物材料研究领域的快速发展，体外构建组织工程化神经组织后的体内移植已经成为治疗脊髓与周围神经损伤研究的重要手段，也可以作为体外模型进行神经干细胞发育机理、神经电生理、脑损伤等研究。James等人的研究发现，将混有雪旺氏细胞及成纤维细胞的胶原注入硅管中，移植修复坐骨神经损伤，能够促进其神经再生[1]。Heather等人研究发现，复合神经干细胞或者雪旺氏细胞的PLGA移植治疗大鼠脊髓横断损伤能有效的促进轴突再生β]。Hillary等用 Matrigel为基质，神经元和星形胶质细胞混合体外再造神经组织，作为神经生理学研究平台D]。Michelle等将神经元、星形胶质细胞以及Matrigel混合再造的三维神经组织作为脑外伤研究模型，研究高速剪切力对其损伤的细胞机制M。生物材料是细胞附着的基本框架和代谢场所，其形态和功能直接影响所构成组织的形态和功能。对于神经组织体外三维再造而言，再造的三维微环境必须能够支持神经细胞的黏附、突起生长与功能性突触的形成，并且能够允许营养物的扩散，从而能够长时间的培养与研究。目前，在神经组织的体外三维再造研究中，所应用的支架材料包括胶原、 Matrigel、琼脂糖、三维文石生物基质等。其中，利用三维文石生物基质作为支架材料构建的神经组织中的神经元与星形胶质细胞的能够高效存活[5]；将神经干细胞接种于胶原基质并在旋转壁式生物反应器提供的微环境下进行长期培养，能够形成在结构和功能上一定程度类似于胚胎脑皮层的双层结构[6]；利用气/液界面系统进行胚胎干细胞来源的神经祖细胞的体外扩增和分化可以形成有机的三维神经组织，该方法形成的组织在表型和结构上与早期发育的胎儿脑具有相似性[7]。但是，根据以往研究报道，利用单纯I型胶原体外再造的神经组织由于缺少氧气和营养致使神经细胞难以长期生存，而单纯Matrigel构建的组织韧性差、易碎。将一定比例的Matrigel掺入I型胶原获得的胶原/Matrigel支架除了具有胶原低免疫原性，良好的生物相容性等优点之外，还可以改善胶原的物理特性，使其疏松多孔，能够更好的作为组织工程支架材料，为细胞提供附着点，且便于细胞在三维孔径中的生长延展，利于氧气、营养物质和代谢废物等的运输，且Matrigel中的一些组分如层连接蛋白、IV型胶原、巢蛋白等能够为细胞生长提供营养作用。将液态I型胶原/Matrigel应用于神经组织工程，作为神经干细胞的支架材料尚未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种组织工程化神经组织的构建方法。本发明的目的还在于提供一种利用上述方法获得的组织工程化神经组织。一种组织工程化神经组织的构建方法，按照如下操作步骤进行(1)制备神经干细胞悬液从已死亡的Wistar小鼠大脑皮层组织中分离得到神经干细胞，传代纯化培养，然后用DMEM培养液重悬细胞制备细胞密度为1 X IO6 1 X IO8的神经干细胞悬液；(2)胶原/Matrigel支架材料的制备将胶原与10 X DMEM混勻，并用NaOH调节其pH值至7. 2-7. 4，然后加入Matrigel， 充分混勻，此操作过程在冰上进行；(3)细胞与支架材料的复合及细胞-支架材料复合物的培养将步骤(1)制得的细胞悬液与步骤( 制得的胶原/Matrigel支架材料混合，其中胶原的终浓度为0. 4-lmg/mL，支架材料中Matrigel所占的体积分数为10% -80% ；然后将获得的细胞-支架材料复合物加至培养板中，置于5% C02、37°C的培养箱中培养30min， 待细胞-支架材料凝胶化后再加入含生长因子的DMEM-F12培养基，培养14天，即得到组织工程化神经组织。所述胶原为液态I型鼠尾胶原。DMEM-F12培养基中的生长因子为5 50ng/mL碱性成纤维生长因子和5 50ng/ mL表皮生长因子。一种利用上述的组织工程化神经组织构建方法获得的组织工程化神经组织。本发明的有益效果本发明用鼠尾液态I型胶原，结合Matrigel基质胶作为组织工程化神经组织的支架，同现有的用于神经组织的支架材料相比，该支架材料能够有效的促进细胞在材料中的存活，其中，Matrigel基质胶掺入I型胶原后，有效的增加了胶原表明的孔径，更有利于气体以及营养物质的交换，且Matrigel基质胶中的IV型胶原、层连接蛋白等对细胞的生长有营养支持的作用。本方法操作简单、可实施性强，能够较好的维持神经干细胞的存活与增殖，促进神经干细胞的分化，对推进组织工程化神经组织发展具有重要意义。
图1为神经干细胞在相差显微镜下观察结果；图中，bar :Α = ΙΟΟμπι，B = 200μπι。
具体实施例方式通过以下实施例对本发明做详细描述，但是以下实施例仅作为例证，并不对本发明构成任何限制。实施例1组织工程化神经组织的体外构建本实施例中使用的细胞分离、培养及组织鉴定所需试剂(1)解剖液3g D-葡萄糖，7.5g 蔗糖，2.34g HEPES，8g NaCl，0.4g KC1,0. 24gNa2HPO4,4. 12g H20,0. 03g KH2PO4 加至 IL 超纯水中，调 pH 值为 7. 2-7.4,0. 22 μ m 滤膜过滤
除菌，4°C保存。(2) DMEM-F12培养基DMEM_F12干粉培养基一包溶解于IOOOmL超纯水中，添加 1. 2g NaHCO3,调节pH值为7. 2-7. 4，经0. 22 μ m滤膜过滤除菌，分装并4°C保存。(3)浓缩培养基(10XH-DMEM) :DMEM_F12干粉培养基一包溶解于IOOmL超纯水中，添加1.2g NaHCO3，调节pH值为7. 2-7. 4，经0. 22 μ m滤膜过滤除菌，分装并4°C保存。(4)胰酶抑制剂lmg/mL胰酶抑制剂溶解于DMEM-F12溶中，0. 22 μ m滤膜过滤除菌，4°C保存，现用现配。(5)赂(完全培养基以01^]\0712作为基础培养基，添加N2、2% B27、20ng/mL EGF 禾口 20ng/mL bFGF，现用现配。(6)NSC分化培养基以DMEM/F12作为基础培养基，添加1 % N2,2% B27和5% FBS，现用现配。1、大鼠神经干细胞的分离、纯化与鉴定大鼠神经干细胞来源于已死亡的Wistar大鼠。取Wistar大鼠大脑皮层，并剥去脑膜，随后将之转移到60mm培养皿中，用眼科剪剪成Imm3左右的组织块，整个操作过程在冰盒上进行。然后将组织块转移到35mm培养皿中，加入适量0. 25%胰酶溶液消化约20min， 胰酶抑制剂终止消化，移入离心管中IOOOrpm离心5min，弃上清，将沉淀移入到完全培养基中，并用吸管轻轻吹打成细胞悬液，并通过200目的筛网过滤。收集到的细胞悬液通过血球计数板计数，以1-2X IO5个/mL的细胞密度接种于培养瓶中。5% CO2, 37°C孵箱恒温培养 5-7d，待神经干细胞分裂、增殖形成较大的细胞球后传代。待原代培养5-7d，神经干细胞克隆形成后，用吸管在培养瓶中轻轻吹打，使沉在瓶底没有贴壁的神经球浮起，然后将神经球和培养液一并移入到50mL的无菌离心管中， 800rpm离心％iin，弃上清，加入适量0. 25%胰酶37°C消化约3min，胰酶抑制剂终止消化，然后用巴斯德吸管机械吹打成单个细胞悬液，经200目筛网过滤，将收集到的液体血球计数板计数，IOOOrpm离心5min，弃上清，加入神经干细胞完全培养基调整细胞浓度为1-2X105 个/mL，并接种于培养瓶中。于5% CO2, 37°C孵箱恒温培养。以后每隔3_4d传代一次，方法同前。相差显微镜下的观察结果表明，神经干细胞存活良好，形成大小均一的细胞克隆(图 1)；免疫荧光染色结果表明，分离培养的细胞内表达神经干细胞特异性的Nestin蛋白，具有良好的增殖能力和多向分化的潜能。2、细胞与支架材料的复合及复合物培养将神经干细胞，加入液态I型鼠尾胶原、MatrigelUOXDMEM混勻，并用NaOH调节PH值，调整胶原浓度为0. 5mg/mL、Matrigel所占体积分数为60 %、神经干细胞密度为 1 X IOVmL ；将细胞-支架材料的混合物加入48孔板，每孔注入复合物200 μ L。30min后， 待细胞-胶原复合物凝固，加入无血清培养基培养。24h后更换培养液，此后每天更换培养液。实施例2体外构建的组织工程化神经组织的Live/Dead和免疫荧光检测Live/Dead检测实施例1中体外构建的组织工程化神经组织，在培养的第ld、3d、 7d，用Live/Dead试剂盒检测组织工程化神经组织内细胞存活的影响。方法如下首先将 20 μ 1的2mM EthD-I禾口 5 μ 1的4mM Calcein AM力口入至Ij IOml PBS中制备染料溶液；弃培养基，PBS漂洗3次；加入ImL染料溶液，37°C染色60min ；弃染液，新鲜PBS再次清洗30min ； 随机选取3-5个视野运用激光共聚焦检测细胞存活情况。结果显示，神经干细胞以及分化细胞在胶原/Matrigel复合物中存活良好，在体外培养7天时，存活率仍然高达87%以上。免疫荧光检测实施例1中体外构建的组织工程化神经组织，在体外培养14d后， 去除培养基，将细胞-材料复合体在预冷冷4%多聚甲醛中固定30min ；PBS漂洗5minX3 次；加入MAP2、GFAP或01igo2抗体37°C孵育浊；PBS漂洗5minX3次；加入二抗37°C孵育 30min ；PBS漂洗5minX3次；共聚焦荧光显微镜观察结果。结果显示，神经干细胞在胶原/Matrigel复合物中分化为GFAP阳性的星形胶质细胞，MAP2阳性的神经元以及01igo2阳性的少突胶质细胞。参考文献1. Olson HE, Rooney GE, Gross L, Nesbitt JJ, Galvin KE, Knight A, Chen B, Yaszemski MJ, Windebank AJ. Neural stem cell—and Schwann cell-loaded biodegradable polymer scaffolds support axonal regeneration in the transected spinal cord. Tissue Eng Part A. 2009Jul ； 15 (7) :1797-805.2.Phillips JB, Bunting SC, Hall SM, Brown RA. Neural tissue engineering a self-organizing collagen guidance conduit. Tissue Eng. 2005Sep-0ct；11(9-10) 1611-7.3. Irons HR, Cullen DK, Shapiro NP, Lambert NA, Lee RH, Laplaca MC. Three-dimensional neural constructs -.a novel platform for neurophysiological investigation. J Neural Eng. 2008S印；5 (3) :333-41. Epub 2008Aug 28.4. LaPlaca MC, Cullen DK, McLoughlin JJ, Cargill RS 2nd. High rate shear strain of three-dimensional neural cell cultures -.a new in vitro traumatic brain injury model. J Biomech. 2005May ；38 (5) :1093-105.5. Peretz H, Talpalar AE, Vago R, Baranes D. Superior survival and durability of neurons and astrocytes on 3-dimensional aragonite biomatrices. Tissue Eng. 2007Mar ； 13(3) :461-72.6. Ma W, Tavakoli Τ, Chen S, Marie D， Liu JL, 0' Shaughnessy TJ, Barker JL. Reconstruction of functional cortical-like tissues from neural stem and progenitor cells.Tissue Eng Part A.2008 Oct ；14(10) :1673-86.7.Preynat-Seauve 0, Suter DM, Tirefort D, Turchi L, Virolle T, Chneiweiss H,Foti M,Lobrinus JA,Stoppini L,Feki A,Dubois-Dauphin M,Krause KH. Development of human nervous tissue upon differentiation of embryonic stem cells in three-dimensional culture. Stem Cells. 2009Mar ；27 (3) :509-20. 7.
权利要求
1.一种组织工程化神经组织的构建方法，其特征在于，按照如下操作步骤进行(1)制备神经干细胞悬液从已死亡的WiStar小鼠大脑皮层组织中分离得到神经干细胞，传代纯化培养，然后用 DMEM培养液重悬细胞制备细胞密度为1 X IO6 1 X IO8的神经干细胞悬液；(2)胶原/Matrigel支架材料的制备将胶原与10 X DMEM混勻，并用NaOH调节其pH值至7. 2-7. 4，然后加入Matrigel，充分混勻，此操作过程在冰上进行；(3)细胞与支架材料的复合及细胞-支架材料复合物的培养将步骤(1)制得的细胞悬液与步骤( 制得的胶原/Matrigel支架材料混合，其中胶原的终浓度为0. 4-lmg/mL，支架材料中Matrigel所占的体积分数为10% -80% ；然后将获得的细胞-支架材料复合物加至培养板中，置于5% C02、37°C的培养箱中培养30min，待细胞-支架材料凝胶化后再加入含生长因子的DMEM-F12培养基，培养14天，即得到组织工程化神经组织。
2.根据权利要求1所述一种组织工程化神经组织的构建方法，其特征在于，所述胶原为液态I型鼠尾胶原。
3.根据权利要求1所述一种组织工程化神经组织的构建方法，其特征在于，DMEM-F12 培养基中的生长因子为5 50ng/mL碱性成纤维生长因子和5 50ng/mL表皮生长因子。
4.一种利用权利要求1-3任一所述的组织工程化神经组织构建方法获得的组织工程化神经组织。
全文摘要
本发明公开了属于组织工程与再生医学技术领域的一种组织工程化神经组织及其构建方法。该组织工程化神经组织以传代、纯化培养的神经干细胞作为种子细胞，以液态I型胶原和Matrigel基质作为支架材料，种子细胞与支架材料体外复合后进行培养。本发明采用的支架体系能够有效地维持神经干细胞的存活与增殖，促进神经干细胞的分化，形成由分化成熟神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞构成的工程化神经组织。本发明对于未来临床利用组织工程化神经组织移植治疗神经系统损伤具有重要意义，同时也可以作为神经发育、脑外伤以及神经电生理研究的体外模型。
文档编号A61L27/38GK102228718SQ20111017255
公开日2011年11月2日 申请日期2011年6月24日 优先权日2011年6月24日
发明者张志立, 李蓝兰, 林秋霞, 王妍, 王常勇, 陈威震, 韩尧 申请人:中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所