专利名称：一株饲用凝结芽孢杆菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物菌株，特别是涉及一株饲用凝结芽孢杆菌菌株及其应用。
背景技术：
饲用抗生素滥用所引发的病原菌耐药、抗生素残留等问题，已经引起了全世界的普遍关注。欧美许多国家对饲料中抗生素的使用都有严格的控制，一些发达国家甚至禁止在动物饲料中使用任何抗生素。用微生态制剂替代饲用抗生素逐渐受到饲料行业人士的认可。目前，常用的饲用微生态制剂主要是由乳酸菌、芽孢杆菌、酵母菌等菌株中的一种或几种制成。一般的乳酸菌，如干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌等抗逆性较差，对高温、胆盐、强碱等比较敏感，在应用和贮藏方面也存在一些困难；芽孢杆菌可形成芽孢，其芽孢抗逆性强， 耐高温高压、耐强酸、强碱和胆盐，易于加工和贮藏。凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans) 又称乳酸芽孢杆菌，既能产生乳酸、又能形成芽孢，是一种具有很大应用潜力的菌株。目前，凝结芽孢杆菌产品在动物饲料中的研究和应用还处于初级阶段，专利 CN1831113A公开了一株用于水质净化的凝结芽孢杆菌，但未研究该菌对病原菌是否有抑制作用；专利CN101390571A中公开了一种凝结芽孢杆菌饲料添加剂及其制备方法，其菌株保藏号为ASl. 2407，与本发明的菌株为不同亚种的凝结芽孢杆菌。
发明内容
本发明的目的是提供一株对致病菌具有抑制作用的饲用凝结芽孢杆菌。本发明所提供的凝结芽孢杆菌菌株(Bacillus coagulans)的名称为F5，该菌株已于2011年05月16日保藏于地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 4846。凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)F5 CGMCC No. 4846是革兰氏阳性杆菌，端生芽孢；在YPD培养基上生长良好，4 形成直径2 3mm大小的圆形菌落，菌落呈白色有光泽，表面湿润、平坦，边缘整齐；兼性厌氧或需氧生长，生长温度范围20°C 90°C，最适生长温度37°C 55°C ；生长酸碱度范围pH 2 9，最适pH值为7. 0 ；部分生化特性如表1 所示表1凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)F5 CGMCC No. 4846的部分生化特性试验项目_结果
V-P测定十
淀粉水解+
吲哚产生一
明胶液化一葡萄糖氧化发酵发酵
甲基红十 运动性十 厌氧生长十 氧化酶 + 过氧化氢酶_+_注“ + ”表示反应阳性；“-”表示反应阴性。体外拮抗试验结果表明凝结芽孢杆菌(Baci 1 Ius coagulans) F5 CGMCC No. 4846 对大肠杆菌(Escherichia coli 0139、Ε. coli K88、Ε. coli K99)、伤寒沙门氏菌 (Salmonella typhimurium 04Hi, ST 04Hi)禾口金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) 等均有很强的抑制作用。凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)F5 CGMCC No. 4846 可耐受 pH 1.5 2. 5 合成胃液ISOmin ；最高耐受胆盐浓度为3. 0% (质量百分比浓度)。磺胺类和杆菌肽类抗生素对凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)F5 CGMCC No. 4846的抑制作用较弱，青霉素类、先锋霉素类、氨基糖苷类和四环素类抗生素对凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)F5 CGMCC No. 4846 的抑制作用明显。急性毒性试验结果表明小鼠对凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)F5 CGMCC No. 4846的最大耐受剂量MTD > 15000mg/kg，根据分级标准，该菌株为无毒物质。本发明的第二个目的是提供一种凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)F5 CGMCC No. 4846 菌剂。本发明所提供的菌剂，其活性成分为凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)F5 CGMCC No. 4846。所述凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)F5 CGMCC No. 4846菌剂的制备方法，可包括以下步骤1)配制液体培养基(DS培养基)葡萄糖20g/L，氯化钠5g/L，酵母粉5g/L，大豆蛋白胨10g/L，胰蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L，磷酸二氢钾5g/L，硫酸镁lg/L，硫酸锰lg/L， 碳酸钙lg/L，碳酸钠lg/L，调节初始pH 7. 0 ；2)将凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)F5 CGMCC No. 4846 按 1% -5%的比例接种于步骤1)的液体培养基中，摇瓶转速100-300r/min，培养12-3 ，得到凝结芽孢杆菌 (Bacillus coagulans)F5 CGMCC No. 4846 菌剂。本发明提供了一株凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)F5 CGMCC No. 4846。由该菌株制成的菌剂无毒无害，耐胃液，耐胆盐，对多种有害菌有很强的抑制作用，可广泛应用到禽、畜养殖业，增强动物抗病能力，有望成为饲用抗生素的替代物。生物材料说明本发明凝结芽孢杆菌菌株(Bacillus coagulans)的名称为F5，该菌株已于2011 年05月16日保藏于地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏编号为CGMCC No. 4846。
图1为凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)F5 CGMCC No. 4846的体外拮抗试验结果
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。实施例1、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)F5 CGMCC No. 4846的分离、鉴定及保藏一、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)F5 CGMCC No. 4846 的分离富集培养基(MRS培养基)胰蛋白胨10g、牛肉膏10g、柠檬酸二铵2g、乙酸钠5g、 酵母粉5g、葡萄糖5g、磷酸二氢钾2g、土温80 1. OmL、碳酸钙20g、硫酸镁0. 58g、硫酸锰 0. 25g、α -甲基葡萄糖苷 10g、山梨酸钾 lg,7jC lOOOmL，调 pH 6. 2-6. 5，115°C灭菌 20min。乳酸菌增殖固体培养基(YPD固体培养基)葡萄糖20g、胰蛋白胨20g、酵母粉 10g、琼脂粉 18g，水 IOOOmLJpH 7. 0，115°C灭菌 20min。从各地养猪场附近水稻田里植物的根部土壤采集样品，取采集样品1 Og，放入装有 90mL无菌水并有小玻璃珠的250mL三角瓶中，振荡20min，静置20s 30s。吸取IOmL上清液转接到富集培养基中，37°C静置培养7d。每个样品取2mL，80°C水浴5min，后取0. ImL转接乳酸菌增殖固体培养基平板，37°C培养。待菌落长出，随机挑取菌落，纯化，编号并保存。将活化好的菌液1 μ 1接种到YPD平板中间，37°C培养，待其长出菌落后，倒入分别混有100 μ 1 肠道致病菌大肠杆菌(Escherichia coli 0139、Ε· coli K88、Ε. coli K99)、伤寒沙门氏菌 (Salmonella typhimurium 04Hi, ST 04Hi)禾口金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) (肠道致病菌由华中农业大学农业微生物学国家重点实验室提供，菌数为108CFU/mL)的软琼脂上，37°C培养，观察生长情况。挑选出抑菌能力最强的菌株，命名为F5。二、F5菌株的生理生化鉴定对F5菌株进行生理生化鉴定，结果革兰氏阳性杆菌，端生芽孢；在YPD培养基上生长良好，4 形成直径2 3mm大小的圆形菌落，菌落呈白色有光泽，表面湿润、平坦，边缘整齐；该菌在兼性厌氧或需氧条件下生长，生长温度范围20°C 90°C，最适生长温度 37°C 55°C ；生长酸碱度范围pH 2 9，最适pH值为7. 0 ；部分生化特性如表2所示表2 F5菌株的部分生化特性
权利要求
1.一株凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)F5 CGMCC No. 4846。
2.根据权利要求1所述的凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)F5 CGMCC No. 4846，其特征在于所述凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)F5 CGMCC No. 4846是革兰氏阳性杆菌，端生芽孢；在YPD培养基上生长良好，48h形成直径2 3mm大小的圆形菌落，菌落呈白色有光泽，表面湿润、平坦，边缘整齐；兼性厌氧或需氧生长，生长温度范围20°C 90°C， 最适生长温度37°C 55°C ；生长酸碱度范围pH 2 9，最适pH值为7.0。
3.根据权利要求1所述的凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)F5 CGMCC No. 4846， 其特征在于所述凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)F5 CGMCC No. 4846对大肠杆菌(Escherichia coli0139、Ε. coliK88、Ε. coliK99)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium 04Hi，ST 04Hi)和金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus)有很强的抑制作用。
4.根据权利要求1所述的凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)F5 CGMCC No. 4846，其特征在于所述凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)F5 CGMCC No. 4846可耐受pH 1. 5 2. 5合成胃液ISOmin ；最高耐受胆盐浓度为3. 0% (质量百分比浓度)。
5.根据权利要求1所述的凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)F5 CGMCC No. 4846， 其特征在于磺胺类和杆菌肽类抗生素对凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)F5 CGMCC No. 4846的抑制作用较弱，青霉素类、先锋霉素类、氨基糖苷类和四环素类抗生素对凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)F5 CGMCC No. 4846 的抑制作用明显。
6.根据权利要求1所述的凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)F5 CGMCC No. 4846，其特征在于小鼠对凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)F5 CGMCC No. 4846的最大耐受剂量 MTD > 15000mg/kg，根据分级标准，该菌株为无毒物质。
7.一种凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)F5 CGMCC No. 4846菌剂，其活性成分为凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)F5 CGMCC No. 4846。
8.一种制备权利要求7所述凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)F5 CGMCC No. 4846 菌剂的制备方法，包括以下步骤1)配制液体培养基(DS培养基)葡萄糖20g/L，氯化钠5g/L，酵母粉5g/L，大豆蛋白胨10g/L，胰蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L，磷酸二氢钾5g/L，硫酸镁lg/L，硫酸锰lg/L，碳酸钙lg/L，碳酸钠lg/L，调节初始pH 7. 0 ；2)将凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans) F5 CGMCC No. 4846 按 1 %-5 % 的比例接种于步骤1)的液体培养基中，摇瓶转速100-300r/min，培养12_36h，得到凝结芽孢杆菌 (Bacillus coagulans)F5 CGMCC No. 4846 菌剂。
9.权利要求7所述的凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)F5 CGMCC No. 4846菌剂在禽、畜养殖中的应用，可取代抗生素。
全文摘要
本发明公开了一株凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)F5 CGMCC No.4846，是革兰氏阳性杆菌，端生芽孢；在YPD培养基上生长良好，48h形成直径2～3mm大小的圆形菌落，菌落呈白色有光泽，表面湿润、平坦，边缘整齐；兼性厌氧或需氧生长，生长温度范围20℃～90℃，最适生长温度37℃～55℃；生长酸碱度范围pH 2～9，最适pH值为7.0。由该菌株制成的菌剂无毒无害，耐胃液，耐胆盐，对多种有害菌有很强的抑制作用，可广泛应用到禽、畜养殖业，增强动物抗病能力，有望成为饲用抗生素的替代物。
文档编号A61P31/04GK102250817SQ20111020570
公开日2011年11月23日 申请日期2011年7月21日 优先权日2011年7月21日
发明者付生慧, 唐泽华, 张东晓, 戴青, 方莉玉, 梁运祥, 游伟, 赵述淼, 雷红升 申请人:北京金泰得生物科技股份有限公司