专利名称：重组灵芝免疫调节蛋白在制备治疗化疗药所致白细胞减少症药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医药工程领域，涉及使用巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达的重组灵芝免疫调节蛋白的抗肿瘤用途及其抗肿瘤药物制剂。
背景技术：
灵芝免疫调节蛋白(Immunoregulatory Protein of Ganoderma lucidium),由日本Kino等人1989年从赤灵芝菌丝体提取物中分离和纯化的小分子蛋白质(Kohsuke Kino et al.，J. Boil. Chem. 1989，1 :472_478)，命名为LZ-8，并测定其氨基酸顺序和免疫生理活性。蛋白质测序表明LZ-8由110个氨基酸残基组成，氨基端乙酰化，分子量为12.4KD，等电点为4. 4。灵芝免疫调节蛋白的主要功能在于它可以促进末梢淋巴细胞和脾脏细胞的增生，诱导动物和人体的巨噬细胞分泌多种细胞因子(如白细胞介素，肿瘤坏死因子和干扰素等)，进而防御及消除病原体的侵害，维护机体的健康，实现免疫调节功能。很多研究表明，LZ-8发挥抗肿瘤作用主要是通过免疫调节途径实现。但本发明的积极效果在于首次公开了重组灵芝免疫调节蛋白(Recombinant Immunoregulatory Protein of Ganoderma Lucidium, rLZ-8)通过与肿瘤细胞膜特异结合诱导其凋亡来直接杀伤或杀死肿瘤细胞而发挥抗肿瘤的用途。在发挥作用的同时，不同于化疗药物会降低白细胞，rLZ-8会维持和升高白细胞，且不影响正常细胞的作用。恶性肿瘤是严重威胁人类健康的常见病和多发病，目前尚无特别有效的防治策略。近年来，随着分子肿瘤学、分子药理学的不断发展，以及对肿瘤本质的阐明，大规模、快速筛选组合化学、基因工程等先进技术的发明和应用加速了药物开发进程。用不同方法启动或激活肿瘤细胞凋亡机制，影响细胞不同基因表达，诱导肿瘤细胞凋亡，减少对正常细胞的影响和放化疗带来的副作用，已成为目前肿瘤治疗的重要策略。本发明的重组灵芝免疫调节蛋白不仅在体外能快速高效诱导多种肿瘤细胞凋亡， 而且在小鼠肿瘤模型体内也能有效杀死肿瘤细胞，且无明显毒副作用，并能保持或升高白细胞的水平，对应用重组灵芝免疫调节蛋白研制抗肿瘤药物有一定的积极作用。
发明内容
1.公开了 rLZ-8抗肿瘤作用及升高白细胞作用。2.杀伤白血病细胞的药效学和细胞凋亡实验，药效学实验表明rLZ-8对白血病细胞NB4、K562和HL-60具有很强杀伤作用，流式细胞仪进行的细胞凋亡检测进一步证明了 rLZ-8诱导人白血病细胞发生凋亡。
3.溶血实验、大鼠骨髓像实验和促红细胞凝聚实验证实其对正常细胞没有影响。4.荷瘤小鼠实验表明，rLZ-8可以抑制小鼠艾氏腹水瘤S180和移植性肝癌细胞 H22在体内生长。5.蛋白荧光标记实验表明，rLZ-8可以通过与肿瘤细胞膜特异结合诱导其凋亡而杀伤或杀死肿瘤细胞。6. rLZ-8药物制剂的核心成分含有重组灵芝免疫调节蛋白和任选的药学可接受的辅剂。7. rLZ-8药物制剂可以通过口服和非肠道给药。说明书
图lrLZ-8对NB4肿瘤细胞体外杀伤结果 图2rLZ_8对K562肿瘤细胞体外杀伤结果图3rLZ-8诱导K562和NB4细胞凋亡PI单染检测结果图4rLZ-8诱导K562和HL-60细胞凋亡Annexin V/PI双染检测结果图5用流式细胞仪检测NB4细胞发生凋亡时线粒体膜电位的变化图6接种S180艾氏腹水瘤细胞小鼠体重变化(横轴为时间(d)；纵轴为平均体重 (g)；曲线符号_ _代表S180组；_ ■-代表S180+rLZ-8组；-▲-代表CK组)图7接种H22移植性肿瘤细胞小鼠体重变化((横轴为时间(d)；纵轴为平均体重 (g)；曲线符号_ _代表H22组；_ ■-代表H22+rLZ-8组；-▲-代表CK组))图8FITC-rLZ-8 (lOOng. ml_l)对大鼠心肌组织的标记(暗、明场)图9FITC-rLZ-8 (lOOng. ml_l)对兔软骨细胞的标记(暗、明场)图 10FITC-rLZ-8 (lOOng. ml_l)对 HL-60 细胞的标记(暗、明场)注以上图1-图5，Cl代表NB4正常对照组；P代表As2O3阳性药对照组；C2代表K562正常对照组；C3代表HL-60正常对照组；R1-R6代表rLZ_8药物组(浓度由0. 78 μ g · 1111^-25 μ g · ml—1) ；H1-H6代表rLZ_8药物组(浓度为 3. 125 μ g · Iiir1-IOO μ g · πιΓ1) ；11-13 代表 rLZ_8 药物组(浓度分另Ij 为 5 μ g · πιΓ1、 10 μ g · mr1 禾口 20 μ g · mr1)
具体实施例方式实施例1 重组灵芝免疫调节蛋白的获得1. rLZ-8基因人工合成、工程菌构建和筛选根据毕赤酵母遗传密码偏爱性，在原有的灵芝免疫调节蛋白基因序列的基础上， 重新设计编码了 rLZ-8基因进行全基因合成，并与酵母α -因子前导肽编码序列相连成为融合基因，克隆入PMD18-T载体中。将测序正确的载体线性化，转入酵母基因组中，在MM和 MD平板上筛选甲醇利用高效型Mut+菌株。2. rLZ-8工程菌的表达对规模发酵表达的温度、转速、pH值、装液体积、甲醇添加量等条件进行检测，确立了酵母工程菌在80L发酵罐规模下表达rLZ-8的工艺条件优化方法。根据rLZ_8的理化特性，设计了发酵培养基的配方。目的蛋白产量约为SOOmg · L—1。3. rLZ-8 纯化工艺
发酵液分离机离心一将上清用管式分离机一超滤一阳离子交换纯化柱一AKTA蛋白质纯化工作站制备目的蛋白一强阴离子交换作用层析一疏水作用纯化柱一凝胶过滤层析。4. rLZ-8纯度鉴定及分子量测定利用反相液相色谱对分离纯化的产物进行纯度分析，rLZ-8纯度为> 99%。激光飞行质谱鉴定重组表达的rLZ-8分子量为12722。5. rLZ-8高级空间结构的确定利用悬滴气相扩散法获得了 0. 2cm X 0. 2cm X 0. 2cm的单晶。硒代晶体在 MacChessF2beamline上收集了 1. 8埃分辨率的晶体衍射数据。非硒代母体晶体在 MarResearch 345dtd像板衍射数据收集系统收集了一套1. 8埃分辨率的晶体衍射数据。重组灵芝免疫调节蛋白rLZ-8亚基的二级结构由2个α -螺旋，7个β -折叠和一个无规则卷曲组成。实施例2 rLZ-8对人早幼粒白血病细胞NB4的杀伤作用1.试齐[JrLZ-8除菌后用IMDM培养液配制成8个浓度，分别为0. 78 μ g · πιΓ1, 1· 56μ g · ι Γ1^. 125μ g · ι Γ',Θ. 25 μ g · ι Γ1, 12. 5μ g · πιΓ'^δμ g · ι Γ1。2.实验方法96孔培养板中，试验孔加ΝΒ4肿瘤细胞0. Iml和rLZ_80. lml, rLZ-8浓度由低到高；阴性对照组加NB4肿瘤细胞和培养液各0. Iml ；阳性药物对照组为三氧化二砷As2O3 ；每组作6个复孔。置37°C、5% CO2培养箱中48h，在细胞培养终止前4h加入ΜΤΤ15μ l(5mg πιΓ1)，细胞培养终止后加入100 μ 1 0. Imol Γ1盐酸异丙醇，在酶联免疫检测仪上570nm测 OD值。3.实验结果表1和图1显示，rLZ-8药物组在OD57tlnm的光吸收值与NB4正常对照组比较，有明显差异，说明rLZ-8在体外对NB4肿瘤细胞有较强杀伤作用。表lrLZ-8对NB4细胞体外杀伤作用(社s, =6)
权利要求
1.重组灵芝免疫调节蛋白rLZ-8在制备治疗化疗药所致白细胞减少症的药物中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征为在于所述的化疗药是环磷酰胺。
3.如权利要求1或2所述的应用，其特征为在于所述的药物是由活性成分重组灵芝免疫调节蛋白rLZ-8和任选的药学可接受的辅剂组成。
4.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于所述的药物可以通过口服和非肠道给药， 口服药包括口服液、片剂、丸剂和胶囊；非肠道包括外用药和注射剂。
全文摘要
本发明涉及重组灵芝免疫调节蛋白rLZ-8在制备治疗化疗药所致白细胞减少症的药物中的应用。本发明建立了环磷酰胺所致的大鼠白细胞减少症疾病模型，并使用重组灵芝免疫调节蛋白对其进行治疗实验，实验结果证明重组灵芝免疫调节蛋白对升高白细胞具有极为显著作用。
文档编号A61P7/00GK102274487SQ20111022201
公开日2011年12月14日 申请日期2008年1月3日 优先权日2008年1月3日
发明者刘立侠, 孙非, 梁重阳, 许守民 申请人:张喜田