专利名称：一种布鲁氏菌活疫苗及其生产方法
技术领域：
本发明涉及一种布鲁氏菌活疫苗及其生产方法，属兽用生物制品领域。
背景技术：
布鲁氏菌病(布病)是由布鲁氏菌或称布鲁氏菌(Brucella)引起的以流产和发热为特征的人兽共患病，严重地威胁着人和多种动物的生命健康。本病不但对动物的繁殖和生产性能具有严重危害，更重要的是，人感染布鲁氏菌后，往往难以治愈，从而造成严重的公共卫生问题。因此在布鲁氏菌流行的国家，消除布病一直是公共卫生计划中最重要的目标之一。目前全世界范围内消除该病的主要方法是扑杀与免疫相结合，对布病发生相对比较严重的中国，由于扑杀的成本高，疫苗预防成为本病主要控制手段。布鲁氏菌疫苗免疫带来的主要问题是无法区分疫苗免疫和自然感染的动物，这在很大程度上限制了布鲁氏菌疫苗的使用和推广，也给布病的有效防治和清除带来了一定的难度。布鲁氏菌存在光滑型( 和粗糙型(R)两类不同表型的菌株，在凝集类抗体水平上无交叉反应，因此用粗糙型布鲁氏菌疫苗免疫的动物，其血清只与粗糙型抗原发生凝集反应，而与光滑型血清不反应，以此可以区分疫苗株和野毒株。最早使用过的粗糙型布鲁氏菌疫苗是用45/20菌株制备的，但该菌株极不稳定，经常会出现从R型到S型的变异，造成毒力返强，因而该疫苗已基本不再使用。90年代美国科学家通过人工诱变的方法获得了粗糙型布鲁氏菌RB51菌株，该菌株具有良好的免疫力，已在美国和拉美的多个国家广泛使用。但目前该菌株在基因水平与原始菌株之间的的区别尚为完全弄清楚。已有的研究证实布鲁氏菌细胞壁脂多糖(LPS)中的0链组成决定了其光滑型或粗糙型的表型，0链的某些成分缺失，会导致菌株由光滑型变成粗糙型。现已发现多个与布鲁氏菌光滑型表型相关的基因，包括gmd、per、pgm、wbkA、lpx、wa、wbkC、wz和wbkC。本实验室曾构建了 wbkC和wboA基因缺失的重组布鲁氏菌疫苗株，并比较了它们之间的免疫效果。 其后，又进一步构建了 wboA基因不完全缺失株，系统地研究了 wboA基因的不同缺失对重组菌的存活率、免疫保护性以及粗糙型表型等方面的特性，并最终确定了 wboA基因1-897之间的片段为缺失的靶片段。虽然有报告通过插入抗性基因获得重组粗糙型布鲁氏菌，但由于抗性基因导致的潜在生物安全隐患限制了其作为疫苗开发的可能。
发明内容
本发明的目的是通过基因同源重组和蔗糖敏感基因的负筛选技术，构建获得了具有生物安全意义的粗糙型布鲁氏菌，以该重组菌制备的布鲁氏菌活疫苗比现在使用的布鲁氏菌S2株生产的布鲁氏菌活疫苗具有更好的安全性，且该疫苗免疫动物后不干扰布病的临床检测。本发明是采用蔗糖敏感基因的负筛选技术，缺失猪布鲁氏菌(Brucella suis)S2菌株(本发明又简称为布鲁氏菌S2株)wboA基因1 897bp之间的序列，构建重组布鲁氏菌rS2- AffboA株，使原始菌株由光滑型转变为了粗糙型，且具有良好的体内外存活能力； 用一对特异性引物，通过PCR方法可以与非重组的原始菌相区分；用该菌株制备的布鲁氏菌活疫苗免疫动物后的血清可用常规的凝集试验与自然感染相区分。本发明是通过以下步骤实现的1.蔗糖敏感基因转移质粒构建将含有启动子序列的蔗糖敏感基因(SucBk)通过Nde I酶克隆近pUC18载体中， 构建重组质粒pUC-McB。将恥(^基因(1 897位)的上、下游同源臂(L和R)的PCR产物分别克隆进PUC18载体中，构建重组质粒pUC-L-R。通过一对引物，以pUC-L-R为模板，将包含L和R的片段扩增后通过Ml I和Sma I克隆进pUC-McB质粒中，获得重组穿梭质粒 pL-R-^cB。将重组穿梭质粒按常规方法电转化进布鲁氏菌疫苗S2株的感受态细胞中。2.重组菌的筛选与鉴定利用pUC18载体中的氨苄抗性(AmpK)以及克隆进的蔗糖抗性(SucBk)基因进行筛选。首先用50yg/ml Amp筛选出重组菌(第一次同源重组)，重组菌在不含氨苄的TSB培养后，再通过5%蔗糖TSA平板筛选出丢失氨苄抗性基因和蔗糖敏感基因全的重组菌(第二次同源重组)。通过一对PCR引物，鉴定wboA基因缺失的重组菌。对获得的重组布鲁氏菌进行形态学、血清学及基因水平检测，并对重组菌安全性、免疫保护性进行鉴定。3疫苗制备用构建的重组菌作为疫苗生产菌株，按布鲁氏菌活疫苗(S2株)的生产方法，接种于适宜培养基，收获培养物，加适宜稳定剂，经冷冻真空干燥制成活疫苗。用于预防布鲁氏菌病。
具体实施例方式本发明所涉及基因为与光滑型表型相关的布鲁氏菌WboA基因。本发明所涉及基因重组技术包括利用含蔗糖敏感基因的穿梭质粒介导，筛选 wboA基因缺失的重组布鲁氏菌。本发明通过2次同源重组，无痕缺失了光滑型猪布鲁氏菌S2株的wboA基因第 l-897bp之间的序列，最终筛选获得了粗糙型重组猪布鲁氏菌(Brucella suis)rS2株(本菌株已于2011年9月2日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所内中国微生物保藏委员会普通微生物保藏中心保藏，保藏号为CGMCC No. 5212)。1.重组猪布鲁氏菌的构建及筛选本发明利用同源重组及蔗糖敏感基因的负筛选技术，成功构建了 WboA基因第 l-897bp之间的序列缺失的重组布鲁氏菌rS2-AffboA株，该重组菌株由光滑型转变为了粗糙型。重组菌在培养基上传20代后，遗传性状仍很稳定。动物试验表明重组菌比原始毒株 S2安全性提高10 100倍，对布鲁氏菌病免疫保护性与S2相似，免疫动物后产生的抗体不干扰布病的临床诊断。具体操作方法如下(I)PCR扩增wboA基因上、下游同源臂引物设计
上游同源臂引物(序列1和序列2)FffboaL 5，-CGCAGAGCTCGCATCCAGATACATTGAAC-3，(含 SacI 位点)；Rffboal 5，-CCGTTCTAGAACTGATTTCCCGTGTCAAC-3，(含 XbaI 位点)。下游同源臂引物(序列3和序列4)Fwboali 5，-ATGCTCTAGAGACAAGGAGTATGCGCAGC-3，(含 XbaI 位点)； Rwboali 5’ -CACGGCATGCTGACCTGATAACACGACTA-3，(含 Sph I 位点)。 用!Iomega公司的细菌基因组提取试剂盒(Lot :187282)，参照说明书提取布鲁氏
菌S2基因组DNA，并以提取的基因组DNA为模板扩增wboA上、下游的基因片段。PCR反应程序为95°C变性 5min ；95°C 50s-54°C 50s_72°C lmin，进行 30 个循环，72°C延伸 lOmin。获得的上游同源臂标注为L，下游同源臂标注为R。(2)构建用于同源重组的穿梭质粒。1) pUC-L-R质粒的构建将以上(1)项中PCR获得的左侧同源臂L，用McI和)(baI酶双酶切后，克隆进同酶处理的PUC18质粒中，按常规方法筛选重组质粒pUC-L;将其与(1)项中PCR获得右侧同源臂R均用)(bal和SphI双酶切后，连接、转化，筛选重组质粒pUC-L-R。2)穿梭质粒pLR-McB的构建设计引物F 5，-CGCAGTCGACGCATCCAGATACATTCAAC-3，(含 Sal I 位点)；R 5，-CA AACCCGGGTGACCTGATAACACGTCTA-3，(含 SmaI 位点)，以 pUC-L-R质粒为模板，扩增出包含上、 下游同源臂(LR)的大小为ISOObp的序列。将该PCR产物用Ml I和Sma I酶切后，克隆进同酶处理的pUC-McB质粒(本发明人实验室构建保存)中，获得重组质粒pLR-McB。(3)制备布鲁氏菌S2株菌的电转化感受态细菌将单个CFU的S2菌接种于100ml TSB培养基中培养至对数期的中期，放冰水中冷却。12000r/min离心lOmin，弃去培养基，再分别用100ml、50ml、10m、5m、2ml灭菌水各离心洗涤一次。最后将获得的菌体重悬于Iml 10%的甘油水溶液中，此即为待用的感受态细菌。(4)电转化和筛选1)电转化将3 μ g pLR-SacB质粒加入到50 μ 1 S2感受态细菌中。混勻后转移到电极杯中。电击电压2. 5KV ；电击时间5毫秒。电击完成后，加入Iml SOC培养基(配方 1000ml培养基中含胰蛋白胨20g，酵母浸粉5. 0，氯化钠0. 5，氯化钾0. 186，氯化镁0. 95， 硫酸镁1. 2，葡萄糖3. 6，pH值7. 0士0. 2，25°C )，置37°C摇振培养4h后，将全部菌落涂布到含50 μ g/ml氨苄青霉素的TSA平板上，37°C培养72h。2)用于鉴定第二次同源重组成功的PCR引物
设计如下引物(序列8和序列9)405F405 :5，-aatgagctattcccgc-3，(位于 WboA 阅读框上游-44 到-28 位。)405R405 :5，-tagccgataaacacgc-3，(位于 WboA 阅读框下游 1243 到 1258 反向互补位。)阳性重组菌的PCR产物预期大小为40M05bp，非重组菌的PCR产物大小为 1302bpo3)筛选挑取平板上单个菌落(第一次重组菌)，接种到不含氨苄的TSB培养液中， 37°C摇振培养6-他，将菌液用生理盐水进行1 10、1 100和1 1000稀释，每稀释度各取菌液100 μ 1涂布含5%蔗糖的TSA平板，37°C培养72h。挑取蔗糖平板上生长的菌落，用鉴定引物进行菌落PCR，筛选阳性重组菌。对PCR筛选获得的阳性菌，进一步用凝集试验验证其粗糙型特性。提取重组菌的基因组DNA，以F405和R405为引物进行PCR，并将PCR产物进行克隆和序列测定，结果证实WdoA基因l-897bp之间的序列已经缺失，获得的重组菌命名为 rS2-AWboA。2布鲁氏菌rS2菌株的特性检查(1)形态和生化特性检查革兰氏染色为阴性；柯氏染色成红色。菌体为球杆菌，单个散在，无鞭毛，不形成芽孢和荚膜，大小约0. 6 2. 5 μ m。生化试验为硫化氢试验阳性。(2)培养特性检查重组布鲁氏菌rS2_ Δ WboA株，在ρΗ 6. 4 6. 8的胰大豆琼脂 (TAB)或其他适宜培养基(如马丁汤、胰目示肉汤、肝汤等)上生长良好；静止培养易出现沉淀，振摇后液体浑浊、不透明。(3)粗糙型特性检查热凝集试验、吖啶黄凝集试验、菌落结晶紫染色试验结果符合粗糙型布鲁氏菌的特点，即热凝集试验阳性，吖啶黄凝集试验阳性，能被结晶紫染色。(4)血清学特性检查将布鲁氏菌S2株和重组布鲁氏菌rS2_ Δ WboA株菌培养物制成抗原注射小鼠2次，间隔1个月，第二次接种1个月后采血分离血清。布鲁氏菌S2株的抗血清与布鲁氏菌Μ5株、IC8株、Α387株和Α19株等光滑型布鲁氏菌凝集反应为阳性；与布鲁氏菌rS2- Δ WboA株和Ml 11株等粗糙型布鲁氏菌凝集反应为阴性；而布鲁氏菌rS2_ Δ WboA 株抗血清与S2株、Μ5株、IC8株、A387株和A19株等光滑型布鲁氏菌凝集反应为阴性，与粗糙型布鲁氏菌Ml 11株凝集反应为阳性。表明rS2- Δ WboA菌株免疫小鼠后，其血清不含有对光滑型布鲁氏菌的凝集类抗体。以上试验说明重组布鲁氏菌rS2_AffboA株菌免疫动物后，所产生的血清抗体通过凝集试验能够与光滑型布鲁氏菌感染或免疫后所产生的血清抗体相区别，即重组布鲁氏菌rS2-AffboA株菌免疫动物后不会对布鲁氏菌病血清学检疫产生干扰。(5)基因特性检查设计用于同时检测WboA 基因的引物(F405 :5，-aatgagctattcccgc-3，；R405 5’ -tagccgataaacacgc-3’)，以重组菌基因组DNA为模板，扩增结果为阳性，PCR产物大小为405bp ；原始菌S2对照为1302bp。(6)毒力检查用生理盐水将固体培养基上培养48h的培养物洗下，稀释成每毫升含10亿CFU菌的悬液，皮下注射体重350 400g的豚鼠5只，每只1ml。经14 15日后剖杀，取脾脏，混合称重，制成乳剂，接种胰际琼脂或其他适宜的培养基平板，根据其生长的菌落数计算豚鼠脾脏的含菌量，结果每个脾脏含菌不超过20万CFU。(7)安全检验将重组布鲁氏菌rS2-AWx)A株活菌用生理盐水稀释成Iml含活菌 100亿，皮下注射体重18 20g的小白鼠5只，每只0. Iml, 6日应全部健活。(8)免疫原性用生理盐水将重组布鲁氏菌rS2-AWx)A株菌稀释成每毫升含50亿CFU菌的悬液，皮下注射体重350 400g的豚鼠10只，每只0. Iml0 30日后，用3个最小感染量的强毒布鲁氏菌S1330菌株(约60个CFU)接种攻毒，攻毒后30天剖杀，取脾脏捣碎作布鲁氏菌分离培养，80%以上的豚鼠应无强毒出现。(9)遗传稳定性重组布鲁氏菌rS2_ Δ ^fboA株在TSA培养基上传30代，其形态和生化特性、培养特性、血清学特性、粗糙型特性、基因特性、毒力、免疫原性没有改变。3疫苗制备与质量标准(1)疫苗制备用重组布鲁氏菌rS2_ Δ WboA株作为粗糙型布鲁氏菌疫苗生产菌株， 按布鲁氏菌S2株作为生产菌株生产布鲁氏菌活疫苗的常规方法，接种于适宜培养基，收获培养物，加适宜稳定剂，经冷冻真空干燥制成活疫苗(中华人民共和国农业部.中华人民共和国兽用生物制品规程二〇〇〇年版.化学工业出版社，2001，本发明简称《规程》)。用于预防布鲁氏菌病。用胰大豆肉汤(TSB，美国BD公司)或用于布鲁氏菌活疫苗(S2株)生产用培养基(如马丁汤、胰肉汤、肝汤等)均可作为本发明的疫苗生产用培养基。培养基灭菌后按培养基量的 2%接入重组布鲁氏菌rS2株种子菌液，37°C培养48 72h，加入兽用生物制品常用的蔗糖明胶稳定剂，充分混勻、分装于疫苗瓶中后立即进行冷冻真空干燥， 即成为rS2活疫苗，命名为布鲁氏菌活疫苗(rS2株)。冷冻真空干燥后的疫苗应按质量标准立即进行成品检验。(2)质量标准本标准涉及到的相关检验方法按中华人民共和国兽药典(中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典二〇一〇年版(三部).中国农业出版社，2011，本发明称《中国兽药典》)的方法进行。1)疫苗应为疏松团快，加入稀释液后能迅速(Imin内)溶解；2)疫苗应纯粹无其他细菌；3)用含5亿CFU活菌的疫苗接种18 20g的昆明系小白鼠，6天内应全部健活；4)对疫苗进行活菌计数，每头份活菌数应不少于800亿 1000亿CFU。本发明的积极意义本发明涉及一布鲁氏菌及其疫苗的生产方法。疫苗是由重组布鲁氏菌rS2_ AffboA 株作为生产菌株。该重组菌株通过非抗性基因筛选技术，缺失布鲁氏菌S2株菌WboA基因 l-897bp之间的碱基序列，使其失去了光滑型布鲁氏菌细胞壁LPS结构中0链形成的条件， 从而由光滑型转变为粗糙型。粗糙型重组菌株的安全性显著提高，但仍保留了对布鲁氏菌病良好的免疫效果。以此菌株生产疫苗将改变布鲁氏菌疫苗免疫动物与野毒株感染动物难以区分的现状，并有效提高现有疫苗的安全性。
图1重组菌rS2_ Δ WboA不同代次PCR鉴定结果1 :Mareker 2000 ；2 非重组的S2 菌PCR结果；3-6. rS2-AffboA在豚鼠体内传代不同传代的PCR结果。
实施例实施例1胰大豆肉汤(TSB，美国BD公司)或其它适宜培养基作为重组菌的培养基，按培养基量加入适量的常用消泡剂，灭菌后按培养基量的 2%接入重组布鲁氏菌rS2株种子菌液，在36 37°C逐渐加大通气量，按常规方法发酵培养36h，，培养过程中可根据需要加入50%的葡萄糖溶液，每次加入量为培养基总量的1 % 2%。培养完成，取样用胰大豆琼脂按《中国兽药典》规定的方法作纯粹检验，为纯粹。同时取样用TSA进行活菌计数，供浓缩时参考。
将纯粹检验合格的菌液，按总量0.2% 0.4%加入羧甲基纤维素钠，使菌体沉淀，吸去上清液，置2 8°C保存备用。取浓缩的菌液按《中国兽药典》规定的方法进行纯粹检验，为纯粹。取浓缩的菌液按《中国兽药典》规定的方法用TSA进行活菌计数，作为配苗时的参考。经检验合格的菌液，按其菌数加入兽用生物制品常用的pH 7. 0蔗糖明胶稳定剂 (《规程》)，使其最终含量为5% 10%蔗糖和 1.5%明胶；加入最终含量为 3%的硫脲。充分混勻后、按800亿 1000亿/ml的剂量定量分装。分装后疫苗瓶迅速冷冻真空干燥后即成为粗糙型布鲁氏菌病活疫苗(rS2- Δ WboA株)。实施例2成品检验本发明涉及到的相关检验方法按《中国兽药典》的方法进行(1)物理性状疫苗应为疏松团快，加入稀释液后能迅速(Imin内)溶解；( 纯粹检验疫苗应纯粹无其他细菌；(3)用含5亿CFU活菌的疫苗接种18 20g的昆明系小白鼠，6天内应全部健活；(4)活菌计数用TSA进行活菌计数对疫苗进行活菌计数，每头份活菌数为于800 亿 1000亿CFUo(5)安全检验将布鲁氏菌活疫苗(rS2株)用生理盐水稀释成Iml含活菌100亿 CFU，皮下注射体重18 20g的小白鼠5只，每只0. Iml, 6日应全部健活。(6)免疫原性用生理盐水将布鲁氏菌活疫苗(rS2株)活疫苗稀释成每毫升含50亿CFU菌的悬液，皮下注射体重350 400g的豚鼠10只，每只0. Iml0 30日后，用3个最小感染量的强毒布鲁氏菌S1330菌株(约60个CFU，中国兽医药品监察所保存和供应)接种攻毒，攻毒后 30天剖杀，取脾脏捣碎作布鲁氏菌分离培养，80%以上的豚鼠应无强毒出现。实施例3重组布鲁氏菌rS2_ Δ WboA (rS2株)的PCR鉴定设计如下引物F405 :5，-aatgagctattcccgc-3，(位于 WboA 阅读框上游-44 到-28 位)R405 5' -tagccgataaacacgc-3，(位于 WboA 阅读框下游 1 3 到 1 8 反向互补位)。按如下PCR反应程序进行95 "C 5min——95 °C 45sec，56 °C 45sec，
72°C lmin(30cycles)-72 °C IOmin-4 °C IOmin0 反应结束后，取 5yL PCR 产物进行
电泳。重组菌的预期大小为398bp，非重组菌能扩出大小为1302bp的条带(见图1)。
权利要求
1.一种布鲁氏菌活疫苗，其特征在于该菌苗是用一株重组猪布鲁氏菌rS2株作为生产菌株制备的，用该菌疫苗免疫动物后，其血清可用常规的凝集试验与自然感染相区分进行鉴别诊断。
2.如权利要求1所述一种布鲁氏菌活疫苗，其特征在于该疫苗的生产菌株重组猪布鲁氏菌rS2-株菌是采用非抗性筛选技术，缺失猪布鲁氏菌S2菌株wboA基因1 897bp之间的序列，使原始菌株由光滑型转变为了粗糙型，且具有良好的体内外存活能力；用一对特异性引物，通过PCR方法可以与非重组的原始菌相区分，猪布鲁氏菌rS2-株菌已于2011年9 月2日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所内中国微生物保藏委员会普通微生物保藏中心保藏，保藏号为CGMCC No. 5212。
3.—种如权利要求1和2所述的布鲁氏菌活疫苗的生产方法，其特征在于用胰大豆肉汤作为重组猪布鲁氏菌rS2-株菌疫苗制造用培养基，培养基灭菌后按培养基量的按 2%接入猪布鲁氏菌rS2-株种子菌液，370C，按常规方法发酵培养观 38h，加入兽用生物制品常用的蔗糖明胶稳定剂，充分混勻、分装疫苗瓶中后经冷冻真空干燥，即成为布鲁氏菌活疫苗(rS2株)。
全文摘要
本发明涉及一布鲁氏菌及其疫苗的生产方法。疫苗是由重组布鲁氏菌rS2-ΔWboA株作为生产菌株。该重组菌株通过非抗性基因筛选技术，缺失布鲁氏菌S2株菌WboA基因1-897bp之间的碱基序列，使其失去了光滑型布鲁氏菌细胞壁LPS结构中O链形成的条件，从而由光滑型转变为粗糙型。粗糙型重组菌株的安全性显著提高，但仍保留了对布鲁氏菌病良好的免疫效果。以此菌株生产疫苗将改变布鲁氏菌疫苗免疫动物与野毒株感染动物难以区分的现状，并有效提高现有疫苗的安全性。
文档编号A61P31/04GK102327606SQ20111026167
公开日2012年1月25日 申请日期2011年9月6日 优先权日2011年9月6日
发明者丁家波, 冯忠武, 周桂兰, 毛开荣, 王楠, 程君生, 蒋玉文, 陈光华 申请人:中国兽医药品监察所