专利名称：一种新型免疫调节蛋白及其制备和应用的制作方法
一种新型免疫调节蛋白及其制备和应用技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种基因重组及表达的促Treg活化蛋白及其制备方法和应用。
背景技术：
CD4+CD25+调节性 T 细胞(CD4+CD25+regulatory T cells, Tregs)是在研究自身免疫性疾病时发现的一类特殊的⑶4+T淋巴细胞亚群，表达⑶25、CTLA-4、GITR、⑶86和特征性的转录因子FoxP3，对维持和调节人体免疫平衡有重要作用。Tregs具有持久的免疫抑制活性。Tregs可识别自身抗原和外来抗原，非特异性抑制其它免疫相关细胞活性， 抑制不适当或过度的免疫反应，调节和维持免疫稳态，诱导免疫耐受。Tregs的特殊生物学功能，为临床治疗自身免疫性疾病和移植免疫相关疾病提供了新的思路。根据细胞发育过程、抗原特异性、活化机制和信号通路，Tregs分为天然型Treg细胞(nTregs)和诱生型 Treg细胞(iTregs)。天然Tregs占全部⑶4+细胞的5%-10%，在外周血不到2%，且只有 CD4+CD25bHgh+high orCD4+CD25+Fox3+T细胞才为具有免疫抑制的Tregs。因此，如何获得足够数量的有功能的Tregs成为其临床应用的瓶颈。尝试诱发或扩大Tregs的调节功能主要有两种途径分离有适应症患者Tregs在体外扩增后回输和利用相关媒介在体内增强Tregs 功能。后一方法需要一种生物制剂。
寻求能在体内活化Tregs增强其抑制功能且无毒副作用的生物制剂成为研究的热点。Jiaxiang(an additional [J] · Int Tmmunol , 2009, 21 (3) :283-294)等分离健康人外周血⑶4+⑶25+T细胞使其感染人类免疫缺陷病毒I (HIV-1)并检测Treg相关功能标记物， 研究发现，静止的⑶4+CD25+T细胞感染有活性或灭活的HIV-1后，Treg特征性标记Fox3表达量增多，⑶4+CD25+T细胞的抑制功能增强了 2 5倍，且上调抗凋亡分子Bcl_2延长细胞生存，表达归巢受体⑶62L和α 4β 7，诱导⑶4+⑶25+T在外周淋巴结和粘膜相关淋巴组织聚集。HIV引起的静止⑶4+⑶25+Τ的生物学行为改变引起了人们的关注。HIV主要通过其包膜蛋白gpl20与Q34+T细胞表面0)4分子结合入侵人体。Christian Becker (Blood, 2009, 114(6 ) :1263-1269)等发现真核表达获得的可溶性重组gpl20分子能够与⑶4分子结合上调⑶4+⑶25+T细胞内cAMP，增强其抑制功能，单剂量输注5 μ g gpl20输入小鼠体内，足以能够保护小鼠免死于致死性的移植物抗宿主病，说明游离的gpl20分子在体内外均与CD4分子结合，增强⑶4+⑶25+T细胞的抑制功能，可能为一种潜在的生物制剂。
外膜蛋白gpl20由恒定区和高变区组成V1 V5区段为高变区，位于gpl20表面， Cl C5区为稳定区，主要位于gpl20核心区域。gpl20的第4恒定区(C4)与⑶4的MHC II分子结合部位结合，引起gpl20的构象改变，在其第3高变区(V3)发生蛋白水解，并通过细胞表面融合受体(fusion receptor)与跨膜蛋白gp41融合,使gp41暴露,从而使疏水性较强的gp41 —端插入靶细胞胞膜中，便于病毒胞膜与靶细胞膜融合，完成HIV侵入CD4+ 靶细胞。C4区是gpl20与⑶4结合的主要区域，V3区对HIV侵入有重要的辅助作用，此外， gpl20的第2恒定区(C2)、第3恒定区(C3)和第4高变区(V4)也有一定的辅助作用。OgertRA等研究发现HIV gpl20全长在大肠杆菌中很难得到表达，通过同源基因重组技术克隆对 AIDS治疗药物vicriviroc有抗性HIV gpl20的C2-V5区，证实C2-V5区与gpl20全长有同样的生物学活性，对vicriviroc有100%的抗性。可见C2-V5区是gpl20活性中心。发明内容
本发明的目的是提供人类免疫缺陷病毒的被膜蛋白gpl20 C2-C4蛋白分子，简称 PC2-C4，其氨基酸序列优选如SEQ ID N0:1所示。
本发明提供编码pC2-C4蛋白的核酸序列，优选如SEQ ID NO 2所示。
本发明还提供包含pC2-C4蛋白分子核酸序列的载体和宿主菌。
本发明进一步提供制备pC2-C4蛋白分子的方法，包括克隆构建了 gpl20的 C2-V3-C3-V4-C4(为方便描述，以下核苷酸序列简称gC2_C4，翻译的蛋白命名为pC2_C4)区 cDNA原核表达载体，在原核表达系统中获得了以包涵体形式的高表达，纯化获得纯度大于 90%的蛋白pC2-C4。原核表达的蛋白无活性，需在体外环境下复性，重新折叠形成正确的空间构象，恢复生物学活性。
本发明的蛋白经体外复性后，恢复生物学活性，能够与人T淋巴细胞白血病细胞 Hut78 和 jurkat clone E6-1 表面 CD4 分子结合。
本发明获得的蛋白可用于
I)与HIV竞争性结合CD4，预防HIV感染；
2)增加体内活化Treg细胞数量，增强Treg功能，用于治疗自身免疫性疾病、移植物抗宿主病等免疫介导的相关疾病；
3)抑制肿瘤细胞增殖并可诱导凋亡，用于防治肿瘤。
相对于现有技术，本发明表现有以下特点
1、重组分子截取了 gpl20的C2-C4区,减小了分子量,避免因gpl20分子量大表达困难的问题；
2、保留了 gpl20与⑶4结合主要结构域和辅助结构域，gpl20 C2-C4区特异性结合⑶4分子，具有靶向特异性，提高重组分子的转化效率，gpl20 C2-C4与⑶4结合后，可活化体内静止的⑶4+⑶25-T细胞，增强其抑制功能；
3、蛋白pC2-C4分子量小，降低了蛋白的免疫原性；
4、构建重组分子的原核表达系统，并融合6个HIS标签，蛋白以包涵体形式表达， 具有蛋白表达量高、纯度高、易于纯化回收等优点。
图1. gpl20结构简式图
图2. C2-C4区基因片段PCR和载体构建双酶切鉴定
M IOObp DNA marker ;lane1:C2_C4 per 结果电泳图，与理论值大小相符；lane 2 :质粒pET28a-c2-c4 ；Lane 3 =BamHI和Sal双酶切鉴定质粒pET28a_C2_C4，结果与理论值相符。
图3. SDS-PAGE凝胶电泳和western-blot鉴定蛋白表达
A M :蛋白marker ；lane1:诱导前对照；lane 2 :诱导后全菌；lane 3 :诱导后上清；lane4 :包涵体溶解液；5 :纯化后；B1 :western_blot检测蛋白表达。
图4.免疫共沉淀法验证蛋白与⑶4相互作用图
1:空白对照；2 Tca8113 阴性对照组；3 :Hut78 细胞组；4 Jurkat clone E6-1 cells细胞组。
图5.1. 5 μ mo I/L的重组蛋白pC2_C4对混合淋巴细胞反应的抑制作用(100X)
A PBS 组:20h :32h :44h :56h :68h :80h ；
B pC2-C4 组:20h !②32h :44h :56h :68h :80h ；
图6.1. 5 μ mol/L的重组蛋白pC2_C4对混合淋巴细胞反应的抑制作用
*表示与PBS组比较P < O. 05
图7.不同浓度的pC2-C4对混合淋巴细胞反应的抑制作用
*表示与PBS组比较P < O. 05图8. pC2-C4作用后Foxp3的表达水平
A Foxp3mRNA的表达*表示同PBS组比较P < O. 05
B Foxp3蛋白的表达1:空白对照；2 =PBS组；3 :pC2_C4组具体实施方式
现结合以下实施例更加详细的描述本发明的gpl20蛋白及其制备方法和应用。提供这些实施例的目的仅在于示例性地说明本发明，不能将其理解为是对本发明的范围和实质的限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Samtoook等人所著《分子克隆实验室手册》(New York Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) 中的条件进行操作，或按照制造厂商所建议的条件进行。
实施例一 RT-PCR扩增C2-C4区基因片段
分离中国流行株HIV-1感染患者外周血单个核细胞，Trizol (购自invitrogen) 法提取总RNA,用逆转录酶superscript III (购自invitrogen)逆转录获得cDNA, 以cDNA模板，特异性引物指导下PCR扩增C2-C4区DNA片段。特异性引物上游引物5，-CGCAGGATCCTCTGTCAATTTCACGG-3,引入内切酶 BamHI 位点；下游引物 5，-ACGCGTCGACATACATTGCTTTTCCT-3，引入内切酶 SalI 位点。反应条件98°C预变性 3min， 98°C 30s, 50°C 30s, 72°C 60s，共 30 个循环，最后 72°C延伸 IOmin。
PCR结果电泳图见图2，Iane I。
实施例二 C2-C4原核表达载体的构建
凝胶回收试剂盒(上海捷瑞生物技术公司)纯化回收目的基因C2-C4，BamHI和 SalI双酶切后亚克隆至原核表达载体pET28a，命名pET28a_C2_C4，所表达的蛋白命名为 pC2-C4，BamHI和SalI双酶切鉴定，理论大小498bp，鉴定正确者寄出测序。BamHI和SalI 双酶切电泳图见图2，lane2-3。测序结果与序列完全相符。
C2-C4 序列如 SEQ ID NO 2 所示。
实施例三蛋白pC2-C4的诱导表达
将质粒pET28a-C2_C4转化到表达菌株大肠杆菌BL21中。挑取单克隆菌落，接种于LB (含25%卡那霉素)培养基，37°C、150rpm振荡培养过夜。次日按1: 100转接LB (含 25%卡那霉素)培养基，37°C、300rpm剧烈振荡培养，检测OD值至0D550约为0. 6时，加诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度O. lmmol/L，37°C诱导振荡培养5小时。
诱导前后分别取菌液，冷却至4°C，12，OOOrpm离心3min，弃上清液，收获菌体。按每I克细菌加入20ml 50mM Tris-HCl (pH 8. O)重悬菌体，以功率300W、工作5秒、间隙3 秒、总时间8min为一循环,共5次进行超声破碎。14，000g, 20min离心,收集上清和沉淀包涵体，SDS-PAGE凝胶电泳(见图3A :1_4)和western-blot鉴定蛋白表达(见图3 BI)，蛋白以包涵体形式获得大量表达。
实施例四蛋白pC2-C4的纯化
挑保存菌种接种于LB (含25%卡那霉素)培养基，37°C、150rpm振荡培养过夜。 次日按1: 100转接2000ml LB (含25 %卡那霉素)培养基，37°C、300rpm剧烈振荡培养， 检测OD值至0D550约为O. 6时，加诱导剂异丙基-β -D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度 O. lmmol/L，37°C诱导振荡培养5小时。
包涵体洗漆液(2mol/Lurea, 2% Triton X 100, lmmol/L EDTA, 300mmol/NaCl, 50mMTri s-HCl pH 8. 0)重复洗涤包涵体2次。
每克包涵体加入15ml包涵体溶解液(8M尿素，IOOnM PMSF, 50mM Tris-HCl pH 8. 0，300mmol/L NaCl)，室温放置3_4h，4000r/min室温离心lOmin，收集上清液，准备蛋白质纯化。
以Qiagen的N1-NTA凝胶、亲和层析方法纯化蛋白pC2_C4
a)平衡液 1(8M 尿素，300mmol NaCl 50mM Tris_Hcl，pH8. O) 10 个柱床体积平衡镍柱
b)包涵体溶解液等柱床体积过柱，夹闭流出口，室温静置30min，分次纯化全部包涵体溶解液。
c)洗涤液 2(20mmol 咪唑，8M 尿素，300mmol NaCl 50mM Tris-Hcl，ρΗ8· O) 2 个柱体积洗涤非特异结合蛋白。
d)洗脱液 3(500mmol 咪唑，8M 尿素，300mmol NaCl 50mM Tris_Hcl，pH8· O) 5 个柱体积洗脱目标蛋白。
e) 10个柱床三蒸水洗柱后灌注20%乙醇保存于4度冰箱。
SDS-PAGE凝胶电泳分析蛋白纯化。结果见图3 A5，可见纯度很高的目的条带。
实施例五蛋白PC2-C4的复性
纯化后蛋白溶解液用洗脱液3 (500mmol咪唑，8M尿素，300mmol NaCl，50mM Tris-Hcl, pH8. O) 3倍稀后装入透析袋(pierce公司)，配制复性液(2M尿素，Immol还原型谷胱甘肽，O.1mmol氧化型谷胱甘肽，IOOmmol苯甲基磺酰氟，10 %丙三醇,300mmol NaCl, 50mM Tris-Hcl，pH8.0)置4°C冰柜中预冷，将按稀释后蛋白溶解液复性液=I 15配制复性液，透析袋水平放置且全部没入复性液中，置于4°C摇床缓慢摇动，复性过程中，前 12h，每4h换一次预冷的复性液，在12-24h过程中，每6h换一次复性液，在24h_72h中，每 12h换一次复性液，共复性72h，结束后，按与稀释后蛋白溶解液体积比=I 1，用预冷磷酸盐缓冲液逐步透析去除尿素，每2h换缓冲液一次，至少换6次，及时离心去除析出蛋白。从复性液取出透析袋，水平置于干净玻璃器皿，用聚乙二醇20000 (购自国药集团)于4°C透析浓缩，定时观察，防止析干，透析袋内存留液浓缩至原蛋白溶液体积1/10左右停止浓缩， Iowary法测蛋白浓度。O. 22 μ m —次性滤器过滤除菌,4°C保存备用。
实施例六复性后蛋白pC2-C4与细胞表面CD4分子结合的功能鉴定
各接种IO8个Jurkat clone E6-1细胞和Hut78细胞于6cm培养皿，实验分以下四组
权利要求
1.一种重组的新型免疫调节蛋白，其特征为该重组蛋白药物氨基酸片段优选人类免疫缺陷病毒的被膜蛋白gpl20，其机理为促Treg (⑶4+⑶25+调控T细胞)活化。
2.如权利要求1所述的促Treg活化药物，其靶向片段优选gpl20的C2-C4区。
3.如权利要求1所述的促Treg活化药物，其氨基酸序列与SEQID NO :1所示的氨基酸序列具有至少90%的序列同源性。
4.如权利要求1所述的促Treg活化药物，其氨基酸序列与SEQID NO :1所示的氨基酸序列具有至少95%的序列同源性。
5.如权利要求1所述的促Treg活化药物，其氨基酸序列为SEQID NO :1所示。
6.—种编码如权利要求书I所述的蛋白质的核酸序列，其核苷酸序列SEQ ID N0:2具有至少90%的序列同源性。
7.一种编码如权利要求书I所述的蛋白质的核酸序列,其核苷酸序列如SEQ ID NO 2 所示。
8.—种载体质粒,携带有编码如权利要求1所述的促treg活化药物的核苷酸序列。
9.一种重组宿主系统，经权利要求8所述的重组载体质粒转化、转染或转导得到，并用于表达如权利要求1所述的促Treg活化药物。
10.如权利要求9所述的重组宿主系统可以是脊椎动物、昆虫、植物的细胞、酵母菌、细菌或病毒。
11.如权利要求10所述的重组宿主细胞，其中酵母菌可以是酿酒酵母、毕赤酵母、念珠菌酵母、汉逊酵母、克鲁维亚酵母或裂殖酵母。
12.如权利要求11所述的宿主细胞，其中细菌可以是大肠杆菌。
13.生产如权利要求1所述的促Treg活化蛋白的方法该方法包括下列步骤包括克隆构建gp 120的C2-V3-C3-V4-C4区cDNA原核表达载体，在表达系统中获得了以包涵体形式的高表达，并纯化获得纯度大于90%的蛋白 PC2-C4。
14.一种药物组合物，其含有如权利要求1所述的促Treg活化药物。
15.如权利要求1-14所述的促Treg活化药物，可以加工成冻干粉针或注射液以及其它可以接受的溶液剂型的制剂，可用于全身给药，如肌注、静脉点滴、静脉推注，或者局部给药，如皮下或病变部位注射；该蛋白也可用于体外细胞诱导。
16.如权利要求1-15所述的促Treg活化药物，用于制备预防HIV感染、治疗自身免疫性疾病、移植物抗宿主病等免疫介导的相关疾病、防治肿瘤的药物。
17.如权利要求16所述的自身免疫性疾病包括慢性淋巴性甲状腺炎、甲状腺功能亢进、胰岛素依赖型糖尿病、重症肌无力、炎性肠病、寻常天皰疮、类天皰疮、原发性胆汁性肝硬变、多发性硬化、急性特发性多神经炎等，系统性红斑狼疮、肾小球肾炎、银屑病、干燥综合征、类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、硬皮病、结节性多动脉炎、Wegener肉芽肿病等。
18.如权利要求16所述的肿瘤包括CD4+的良性和恶性肿瘤，包括淋巴瘤、成人T细胞白血病、NK母细胞白血病等。
全文摘要
本发明提供一种新型免疫调节蛋白及其制备方法和应用，属于生物技术领域。该蛋白为人类免疫缺陷病毒膜分子gp120功能域C2-C4部分的重组分子，本发明的pC2-C4能同细胞表面分子CD4分子相结合，激活和增强外周血静止CD4+CD25+调节性T细胞的功能，为临床治疗自身免疫性疾病、移植相关疾病及相关肿瘤提供新的策略。
文档编号A61P31/18GK102993277SQ201110266969
公开日2013年3月27日 申请日期2011年9月9日 优先权日2011年9月9日
发明者曾令宇, 徐开林, 曹江, 陈翀, 齐共健, 王东洋, 张倩, 张建军, 李振宇, 程海, 闫志凌, 桑威, 李德鹏 申请人:徐州医学院附属医院