用于检测和治疗老年性痴呆的单克隆抗体的制作方法

专利名称：用于检测和治疗老年性痴呆的单克隆抗体的制作方法
技术领域：
本发明属于生物制药领域。本发明涉及用于早期检测和治疗老年性痴呆 (Alzheimer' sDisease.AD)的单克隆抗体。具体而言，本发明涉及抗老年痴呆症主要靶蛋白A β 42肽的单克隆抗体及其应用。
背景技术：
老年性痴呆(Alzheimer’ s Disease. AD)是一种渐进性神经退化性疾病，其主要表现为记忆功能衰减及识别能力障碍，同时伴有各种神经症状和行为障碍，具有非常高的发病率。自1907年德国医生Alois Alzheimer首次报道AD的症状和病理至今已近一个世纪，AD的确切致病机理仍无定论。研究发现，AD的主要病理表现有脑内细胞外的老年斑(senile plaques)沉积、 细胞内的神经原纤维缠结(neurofibrillary tangles, NFT)以及胆碱功能缺损等，最终造成神经元损伤和坏死并最终导致海绵脑病。1984年，Glenner和Wong(Biochem Biophys Res Commun, 1984,120 (3) =885-890)发现老年斑的主要成分是一种由39至43个氨基酸残基组成的具有折叠构型的多肽，相对分子质量约4200，称为β-淀粉样蛋白(β-amyloid， Αβ ) ο 1992 年，Hardy 和 Higgins Science，1992,256(5054) 184-185)提出了 “Αβ 级联假说(amyloid cascade hypothesis) ”，认为A β的聚集和沉积能加剧神经原纤维的缠结， 并导致细胞死亡，是AD形成的最主要原因。Αβ沉积发生在AD早期，且与正常大脑相比， AD患者大脑中的Αβ沉积更为严重和广泛，而Αβ本身能引起氧化应激、细胞凋亡以及轴突生长异常等神经病理学变化，提示Aβ在AD的产生与发展中具有重要作用。Αβ沉积主要集中在小胶质细胞周围，并刺激小胶质细胞释放炎症因子，发生炎症反应，这种慢性炎症反应能够引起细胞的裂解并释放具有反应活性的氧化性物质，从而削弱了吞噬细胞的吞噬作用，这样更加剧了 Aβ的沉积。A β蛋白在大脑内积聚形成纤维和斑块(俗称老年斑)，造成神经元损伤和坏死并最终导致海绵脑病。A β是淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein,APP)正常代谢的产物之一。APP基因位于人类第21号染色体长臂，由至少18个外显子编码，Aβ的编码序列位于第16、17个外显子。APP主要有两条代谢途径一是α -分泌酶在687与688氨基酸之间切割，将APP氨基末端671个氨基酸的可溶性多肽sAPP α释放到胞外，由于切割位点在A β序列内，因此不产生完整的A β片段；另一条途径是经β-分泌酶在671与672 氨基酸之间切割，然后由g_分泌酶在APP的跨膜区切割，释放出A β 40、Α β 42、Α β 43，正常情况下多数为A β 40(90% )，只有少量A β 42和A β43产生。Wiltfang等Q007，Journal ofNeurochemistry, 101 (4) :1053-1059)发现，A β 40 肽和 A β 42 肽的比例失调，是造成老年痴呆的重要原因之一。APP的代谢和Αβ的产生受到多种因素的调节。对早期发病AD的遗传学研究发现，大部分AD与第21号染色体上的APP基因突变相关，为揭示A β和APP在AD病理发展中的作用提供了强有力的证据。AD突变位于APP的第670和671密码子，能增强β -分泌酶的活性。突变位于APP的第612个密码子，能抑制α-分泌酶的剪切活性。这两种突变的结果使更多的APP由β -分泌酶途径代谢，产生大量的A β。经细胞产生并释放至胞外的A β将在适当的条件下聚集。Αβ的聚集主要有两个步骤，即核心形成和聚集体扩大。核心形成是Αβ聚集过程中的限速步骤。Αβ 42具有较强的自我聚集能力，是核心的主要成分。因此，Αβ 42肽是治疗老年痴呆症的主要靶点。Αβ的毒性主要表现在(1)Αβ能与细胞表面的许多受体结合，如神经NGF的低亲和力受体ρ75、 高级糖基化终产物的受体，从而激活胞内的caspase信号通路，诱导神经元凋亡。Αβ还能改变线粒体膜的通透性，导致细胞色素c由线粒体释放到胞浆并与凋亡蛋白酶激活因子结合，参与激活caspase通路，引起细胞凋亡。的毒性一部分是通过小胶质细胞之类的非神经元细胞来介导，在神经斑周围通常能够发现被激活的小胶质细胞。胶质细胞的活化导致白介素-I(IL-I)的过度表达和释放，继而诱发IL-6、肿瘤坏死因子-a (TNF-α )、 Y-干扰素(INF-Y)等细胞因子的表达，还能诱导补体、黏附分子、急性期蛋白、氧自由基、 前列腺素、一氧化氮等生成增加，这些分子通过作用于胶质细胞或神经元，促使其他炎症分子的产生，这种交互作用促成了慢性炎症产物分别在AD病理损伤的不同阶段起作用，并贯穿其病理发展的全过程。(3)Αβ能降低Na+和Κ+-ΑΤΡ酶的活性，从而改变膜的极性和流动性，并通过干扰L-型电压依赖性的Ca2+通道来破坏细胞内钙的动态平衡。另外，Αβ能引起蛋白质过氧化和脂质过氧化，破坏超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)，从而降低细胞抵御氧化应激的能力。(4) AD患者脑中的能量代谢变化早于老年斑等主要病理表现的产生。试验发现Αβ不仅能破坏线粒体膜，还能直接作用于线粒体内的三羧酸循环和电子传递链，减少ATP的产生。能量代谢的损伤将进一步诱导氧自由基和钙超载，三者之间相互影响而形成恶性循环，最终导致包括AD在内的神经退行性疾病。(5)Αβ可以作用于兴奋性氨基酸受体-NMDA (N-methyl-D-aspartiate)受体，增加该受体对兴奋性氨基酸，如谷氨酸的敏感性，导致带有该受体的神经元被内源性谷氨酸损害。由于机体自身存在有效的清除机制，A β的产生和清除在生理条件下能保持动态平衡；而在AD病理过程中，Αβ的产生和清除之间失去平衡。近年来人们开始认识到迟发性 AD与脑内Αβ的清除减少密切相关。脑内Αβ的清除主要包括细胞外降解、细胞内吞和转运清除。(1)细胞外降解。Αβ的降解有多种酶的参与，它们在Αβ的不同位点发挥作用， 不同脑区(皮质和海马)和不同状态(可溶性或不溶性、单体或寡聚体)的Αβ由不同的酶降解，任何一种降解酶的功能障碍都有可能成为引发AD的危险因素。(2)细胞内吞。Αβ 的细胞内吞由低密度脂蛋白受体相关蛋白(low-density lipoprotein receptor related protein,LRP)和清道夫受体(scavenger receptor, SR)介导。LRP介导可溶性Αβ复合物的内吞，SR介导小胶质细胞对纤维化A β的内吞。随年龄增长，LRP的表达呈现进行性下降，在AD患者尤其明显。(3)转运清除。脑内Αβ的转运清除包括血脑屏障转运和经非特异性脑间质液泵流到脑脊液后进入血流而清除。脑内绝大多数的Αβ是经血脑屏障转运出脑，10% -15%的Αβ由脑间质液泵流清除。这两种方式都与LRP有关，LRP基因缺失后动物脑内Aβ成倍增加。由于认识到Αβ在AD发病过程中作用的基础上，研究者不断设计出各类干扰Αβ 病变的方法，延缓或阻止AD的进程。Αβ的毒性受其数量、聚集程度和清除速度的影响，因此可以通过减少Αβ生成、防止Αβ聚集和沉积、干预Αβ的毒性。单克隆抗体技术是抗体制备的经典方法，该技术比较成熟，应用广泛。
本发明人旨在利用单克隆抗体与A β特异性结合，达到防止和排除Αβ聚集和沉积，促进小胶质细胞对A β的吞噬作用，从而实现对老年性痴呆的早期诊断和治疗。

发明内容
本发明的目的在于提供能用于早期检测和治疗老年性痴呆的抗体。本发明的发明原理和发明思路为利用生物合成的方法，制备全长A β42肽及其片段(包括N端片段、中间片段和C端片段)免疫小鼠，用免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合，制备杂交瘤细胞株，得到特异性抗A β 42肽的单克隆抗体。本发明提供了能够用于早期检测和治疗老年性痴呆的单克隆抗体和含有所述单克隆抗体的药物组合物及诊断试剂。一种用于治疗老年性痴呆的药物组合物，其包括作为活性成分的单克隆抗体和药用载体，所述单克隆抗体(a)重链可变区包括SEQ ID NO 3所示氨基酸序列；(b)轻链可变区包括SEQ ID NO 4所示氨基酸序列；(c)重链可变区包括SEQ ID NO 3所示氨基酸序列，且轻链可变区包括SEQ ID NO 4所示氨基酸序列；(d)重链可变区与SEQ ID NO 3所示氨基酸序列具有至少90%同一性；或(e)轻链可变区与SEQ ID NO 4所示氨基酸序列具有至少90%同一性。在一个优选实施方案中，所述单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO :3，轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO :4。在一个优选实施方案中，编码所述重链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列为SEQ ID NO :1，编码所述轻链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列为SEQ ID NO :2。另一方面，本发明提供了具有选自下列可变区的单克隆抗体(a)重链可变区的编码基因包括SEQ ID NO 1所示核苷酸序列；(b)轻链可变区的编码基因包括SEQ ID NO 2所示核苷酸序列；(c)重链可变区的编码基因包括SEQ ID NO 1所示核苷酸序列，且轻链可变区的编码基因包括SEQ ID NO 2所示核苷酸序列；(d)重链可变区的编码基因能与SEQ ID NO :1所示核苷酸序列在严谨条件下杂交；或(e)轻链可变区的编码基因能与SEQ ID NO :2所示核苷酸序列在严谨条件下杂 、-父。一个优选的实施方案中，所述单克隆抗体的重链可变区的编码基因的核苷酸序列为SEQID NO :1，轻链可变区的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO :2。另一方面，本发明提供了重组表达载体，其中含有编码本发明所述单克隆抗体可变区的核酸序列。另一方面，本发明提供了宿主细胞，所述宿主细胞被本发明所述的重组表达载体所转化。另一方面，本发明提供了杂交瘤细胞系，其分泌产生本发明所述的单克隆抗体。本发明实验证明，本发明提供的单克隆抗体具有高亲和力，能与老年性痴呆脑组织特异性结合，而不结合正常脑组织。因此，本发明所述单克隆抗体可用于诊断老年性痴呆，特别是老年性痴呆的早期诊断。在老年性痴呆患者脑内，小胶质细胞除了清除凋亡坏死的细胞碎片外，还具有吞噬和清除A β沉积的功能。小胶质细胞能够有效地吞噬淀粉样A β纤维和斑块(DeWitt 等，1998，ExpNeurol，149 =329-340)。进一步研究表明在患有AD的小鼠模型中，主动产生 (Schenk 等，1999,Nature，400 :173-177)或被动免疫(Bard 等，2000，Nat Med, 6 :916-919 ； Wilcock等，2003，J Neurosci，23 :3745-3751.)的抗A β抗体，都可以直接进入大脑，并且通过增强吞噬作用消除Aβ沉积。本发明对制备的抗体进行了 Ν9小胶质细胞吞噬实验，同时把与人抗体无同源性的小鼠抗幽门螺旋杆菌的抗体和小鼠抗结核杆菌的抗体设定为同型对照抗体。本发明实验证明本发明所述抗体能显著增强小胶质细胞对A β 42肽的吞噬作用。现在开发的抗Αβ42肽线性化表位的抗体有三种类型(WekSler，2004，Immun. Ageing，l :2.)，即针对Αβ42Ν端片段，C端片段以及中间片段的抗体。研究人员发现，结合 N端表位(l-7aa)的抗体既可以在体外聚合A β，也能结合患者体内的大脑部位、血管沉积处以及未被剪切加工的前体蛋白ΑΡΡ。研究人员报导，这些抗体可以直接进入大脑，结合大脑的淀粉样沉积，溶解斑块并且可以完成Fc依赖的细胞吞噬，进而被小胶质细胞吞噬并降解。同样证明，只有针对Αβ (或3_7aa)的抗体才能在体内有效的结合A β沉积，针对其他表位的抗体虽然在体外可以有效地结合Αβ，但是在体内无法有效的行使功能。(Bard 等，2000，Nat. Med, 6 :916-919 ；Bard 等，2003，Proc. Natl Acad. Sci. USA, 100 :2023-2028.)本发明通过抗原表位鉴定实验证实本发明的抗体特异性结合N端Αβ 42(l-9aa) 线性表位，从而进一步佐证了本发明所述抗体能增强小胶质细胞介导的吞噬作用，溶解和清除A β沉积。因此，另一方面，本发明提供了一种用于治疗老年性痴呆的药物组合物，包括作为活性成分的本发明所述的单克隆抗体和药用载体。另一方面，本发明提供了一种针对老年性痴呆的早期诊断试剂，包括本发明所述的单克隆抗体、能够产生可检测信号的标记物以及使用说明书。另一方面，本发明提供了本发明所述单克隆抗体在制备用于治疗老年性痴呆的药物中的用途。另一方面，本发明提供了本发明所述单克隆抗体在制备老年性痴呆诊断试剂中的用途。


图1图示的是Ν9细胞对A β 42肽的吞噬作用。图2图示的是同型对照抗体(亚型IgG2b)对N9细胞吞噬作用的影响图3图示的是抗体3F5 (亚型IgG2b)对N9细胞吞噬作用的影响。图4图示的是不同浓度的42肽与0. 05ug/ml的抗体竞争抑制ELISA结果。除另有说明外，本申请中的所有科技术语的都具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解相同的含义。尽管与本申请中描述类似或等同的方法及材料都可用于实施或检验本发明，但是下文仍还是对合适的方法和材料进行了描述。本申请中引用的全部出版物、 专利申请、专利及其他参考文献其全部内容在此引入作为参考。如有抵触，包括定义，以本申请为准。下列实施例旨在进一步举例说明实现本发明的具体方式，而决不构成对本发明的限制。本领域技术人员应该理解的是，在不违背本发明的精神和原则的前提下，对本发明进行改动得到的技术方案都将落入本发明的待批权利要求范围内。
实施例在本申请中，如无特别说明，本发明的实施都使用分子生物学、微生物学、重组 DNA和免疫学的常规技术，这些技术都是本领域技术人员所掌握的。这些技术在本领域技术人员常用文献中有详细地描述，例如Sambrook等人编著的Molecular Cloning =A LaboratoryManual，^ΙΗ ^。实施例IA β 42肽及其片段的合成根据A β 42 Jft的公开序列(Genebank :ΑΒ066441. 2 ；PMID :8248178)人工合成全长A β42及其片段(包括N端片段、C端片段及中间片段)，全长A β42及其片段由吉尔生化(上海)有限公司合成。实施例2单克隆抗体的制备2.1小鼠免疫全长A β 42可以直接免疫，其它片段与KLH偶联后分别免疫小鼠，免疫方法如下初次免疫50ug抗原加等体积氟氏完全佐剂乳化到滴水不化即可做小鼠腹腔注射，注射体积500ul/只两周后。第二次免疫50ug抗原加等体积氟氏不完全佐剂乳化到滴水不化即可做小鼠腹腔注射，注射体积500ul/只。两周后采小鼠尾静脉血离心取血清测效价(用ELISA方法检测)。效价达一万以上的小鼠融合前三天取抗原25ug加强免疫，注射体积200ul/只。加强免疫两周后采小鼠尾静脉血离心取血清测效价(用ELISA方法检测)。效价达一万以上的小鼠融合前三天取抗原25ug加强免疫，注射体积200ul/只。2. 2细胞融合将培养至对数生长期的SP2/0细胞上清倒掉，加入RPMI1640不完全培养基吹打细胞。(在融合前2周培养SP2/0细胞，培养基内含8-氮鸟嘌呤)计数，2X107。收集细胞， IOOOrpm, IOmin0用20毫升RPMI1640将细胞悬起放入培养箱。摘小鼠的眼球，用EP管收集小鼠的血。将小鼠断颈处死，放入75%酒精浸泡五分钟左右。先用一套剪刀，镊子剪开小鼠的皮毛。再用一套剪刀，镊子取其脾脏。将小鼠脾脏先放入无筛网的培养皿中，用镊子将其脾脏悬于培养皿上方，用无血清RPMI1640培养基进行冲洗。再加入无血清RPMI1640于有筛网的培养皿中，用针芯碾磨。用离心管收集脾细胞，离心，1000rpm，10min。用SP2/0悬液和离心下来的脾细胞悬在一起，离心，IOOOrpm, IOmin0将管慢慢倒立，将上清轻轻的倒掉。 上清倒掉后(除去液体残留)，在手掌上轻击融合管底，使沉淀细胞松散均勻，置37°C水浴中预热。用Iml吸管在1分钟加预热至37°C的50% PEG15001ml，边加边轻轻搅拌滴完后静置2min。用IOml吸管加35ml预热至37°C的不完全培养基，(每隔1分钟分别加入Iml, 3ml, 5ml和10ml)。离心，900rpm，8min。将上清倒掉，用弯头滴管取含HAT完全培养基加入装有细胞的离心管中，轻轻用弯头滴管将细胞悬起，用八道孔排枪加板，铺10块板，200ul/孔，加完板后放入5%的二氧化碳培养箱中。第三天半定量换含HAT的完全培养，第七天换成含HT的完全培养基，第十天换成完全培养基，换液后第三天进行ELISA检测，筛选出针对 A β 42肽N端的抗体。实施例3Dot blot 和 Western blot 实验3. IDot blot 实验将IOng合成的A β 42肽(吉尔生化公司合成)点到PVDF膜上，60 V烘干，5 %脱脂奶粉封闭lh，然后放入实施例2制备抗体的不同稀释度的稀释液中，室温孵育lh，TBST 洗3次后，与1 2000倍稀释的HRP羊抗鼠抗体室温孵育30min，洗涤3次加入ECL发光试剂，暗室中X光片曝光。扫描光片记录DOT Blot实验结果。3. 2flfestern blot 实验3. 2. ITrieine SDS PAGE 电泳由于A β 42肽只有42个氨基酸残基，相对分子量为4200，常规SDS-PAGE无法做出清晰的条带。本实验中我们采用Tricine SDS PAGE电泳。制胶用所有试剂配制根据ShSgger &vonJagow(Anal Biochem. 1987,166 :368-79 ；Acta Farm. Bonaerense,2002, 21 (1) :57-60) 提供的方法。分离胶为16. 5% T，3% C的聚丙烯酰胺凝胶，浓缩胶为5% T，3% C的聚丙烯酰胺凝胶。样品用上样缓冲液稀释到100 μ g/ml，每个样品槽加样10微升，20mA恒流约 30min，样品到达分离胶时，将电流调至40mA，直至样品离胶的下边沿Icm左右，停止电泳。3. 2. 2转膜，与抗体孵育及发光本实验室采用半干转移法，将A β 42肽转移到PVDF膜上。将胶、滤纸、PVDF膜分别在电极缓冲液中浸泡后，按滤纸，胶，PVDF膜，滤纸的顺序铺到转移电泳槽中，1.2mA/ Cm2PVDF膜的比例调节电流进行半干转移，2h后，停止转膜。将PVDF膜放入5 %脱脂奶粉溶液中室温封闭lh。与不同稀释度的12种抗体孵育lh，洗涤3次后与1 2000倍稀释的 HRP标记羊抗鼠抗体孵育30min，洗涤，加ECL发光试剂，暗室中X光片曝光。扫描光片记录 Western Blot 结果。实施例4细胞吞噬实验4. IFITC 标记 A β 42 肽A β 42肽溶于DMS0，然后用碳酸盐缓冲液(CBS ρΗ 9. 6)稀释到2. 5mg/ml。按每毫克A β 42肽60微克FITC的比例加入FITC，室温避光条件下摇动池。用含有NaN3的Tris 缓冲液透析过夜，中间换4次透析液。4. 2细胞培养将Ν9小鼠小胶质细胞培养于含IOuM β -巯基乙醇、5% FBS的IMEM培养基(购自GIBC0)中，待细胞生长到80%时，胰蛋白酶消化，进行传代培养。将处于对数生长期的 Ν9小胶质细胞，消化后加入到M孔板中进行培养，每孔1 X IO5个细胞，培养过夜，细胞贴壁后进行试验。4. 3Ν9细胞对A β 42肽的吞噬作用用1 μ g/ml的FITC标记的A β 42肽单独与Ν9小胶质细胞孵育，37°C,5% CO2培养箱中培养30min。收集细胞，用流式细胞仪检测N9小胶质细胞内荧光强度结果，并分别与不加A β 42肽的Ν9小胶质细胞进行比较，计算出荧光阳性细胞百分比，从而来确定Ν9小胶质细胞对A β 42肽的吞噬作用。
检测结果显示(如图1) :Αβ42肽在lyg/ml时就可以引起N9小胶质细胞1.79% 的吞噬作用(与空白对照组比较)，因而在后续的试验中A β 42肽的浓度都是1 μ g/ml，并且用1 μ g/mlFITC标记的A β 42肽单独作用Ν9细胞作为阴性对照。4. 4同型对照抗体对Ν9小胶质细胞吞噬作用的影响本实验中，为了排除无关抗体对Ν9小胶质细胞的吞噬作用存在影响的可能性，设计了小鼠抗幽门螺旋杆菌毒力相关蛋白CagA抗体(IgG2b)作为同型对照抗体，同型对照抗体与人体内的抗体无同源性，对照抗体与FITC标记的A β 42肽共同孵育Ih后作用于Ν9小胶质细胞。用上述同型对照抗体与1 μ g/ml A β 42共同孵育Ih后，对Ν9小胶质细胞吞噬作用的影响。结果显示(如图2):同型对照抗体小鼠抗幽门螺旋杆菌毒力相关蛋白CagA抗体在10 μ g/ml以下时对N9细胞的吞噬作用的影响不显著。由此可见，无关抗体浓度低于10 μ g/ml时(与阴性对照组比较)，对N9小胶质细胞的吞噬作用影响不显著。4. 5抗体株3F5对N9细胞吞噬作用的影响将1 μ g/ml的FITC标记的A β 42肽与分别与5、10 μ g/ml抗体分别混合后，37 °C 孵育lh。加入到培养N9细胞的M孔板中，37°C，5% CO2培养箱中培养30min。收集细胞， 用流式细胞仪进行检测。测试抗体孵育后，对N9细胞吞噬作用的影响。结果显示，抗体3F5(亚型IgG2b)与Aβ 42肽共同孵育组，N9小胶质细胞吞噬 Αβ42肽的能力比单纯的Αβ42肽组提高了 20.18% (如图3)。这说明抗体株1Η3可以显著促进Ν9小胶质细胞对A β 42的吞噬作用。4. 6流式细胞仪检测0. 05%胰蛋白酶消化后收集各组细胞，1%BSA FBS洗涤两次后，流式细胞仪检测， 以荧光强度为横坐标，以细胞数为纵坐标，并与阴性对照组比较，计算出阳性细胞百分比。 每次试验都设只加A β42肽的阴性对照组和不加42肽及其抗体的空白对照组。为了排除非特异性结合，在实验中设有无关的小鼠抗人抗体作为同型对照。实施例5抗体亲和力实验将Αβ42肽稀释至100ng/ml，酶标板每孔加入lOOul，4°C包被过夜，PBST洗涤3 次，37°C 5% BSA封闭2h，PBST洗涤3次，晾干备用。Aβ 42肽从lug/ml开始倍比稀释，然后加入终浓度为0. 05ug/ml的单克隆抗体 3F5，混勻，4°C孵育过夜。IOOul混合液加入包被好的酶标板条，ELISA方法检测0D495。按公式KJ (A0-A) = 1+1(/ ，其中Atl为无A β 42肽时测的OD值，A为不同浓度A β 42肽时测的 OD值，K为亲和力常数，为A β 42肽浓度，分别求出K值，计算其平均值为亲和力常数。不同浓度的A β 42肽与0. 05ug/ml的抗体竞争抑制ELISA结果所示(如图4)，从图中可以看出，Αβ 42肽在0. 03125ug/ml时就明显抑制抗体与包被抗原的结合。通过计算单克隆抗体3F5的亲和力常数为K3F5 = 0. 082ug/ml。由此可见，本发明所述单克隆抗体3F5具有高亲和力。实施例6抗体序列测定对单克隆抗体3F5的进行序列测定，结果为重链可变区(VH)编码基因的核苷酸序列如SED ID NO :1所示，轻链可变区(VL)编码基因的核苷酸序列如SED ID NO :2。其重链可变区(VH)的氨基酸序列为SED ID NO :3，轻链可变区(VL)氨基酸序列为SED ID NO 4。 实施例7免疫组织化学实验本实验中，以老年痴呆症小鼠模型的脑组织进行免疫组化实验，并以正常小鼠脑组织作为阴性对照组。将组织切成4-6um厚度的切片，放于聚-L-赖氨酸封闭的或者超霜冻的显微载玻片上；在冷风干燥器里干燥至少30min ；干燥过的组织块立即使用，或者置于密封盒子里于-20°C或_80°C保存。将干燥过的组织块置于含有4%多聚甲醛、0.5%葡萄糖的PBS中固定lOmin， PBS-S中漂洗一次。在H2O2A). 02% NaN3的PBS-S中浸泡30min，抑制内源性过氧化物酶活性，用PBS-S漂洗玻片。在封闭液中浸泡IOmin以封闭非特异性结合位点；将多余的封闭液吸掉，加入2-5μ g/ml的稀释于PBS-BSA-S的一抗，4°C孵育过夜；用PBS-S漂洗3次，每次5min ；吸干多余的PBS-S，加入2-5μ g/ml HRP标记的二抗，室温孵育30_60min ；用PBS-S 漂洗3次，每次5min ；加入新配制的二氨基联苯胺3-5min，在一抗结合部位会出现棕黄色沉淀。流水冲洗5min，苏木红染液染色Imin ；分别用70，96，100%的乙醇进行脱水，二甲苯透明、中性树胶封片、镜检。结果显示抗体3F5与正常脑组织无非特异性结合，而与小鼠老年痴呆模型脑组织的斑点特异的结合。实施例8抗原表位鉴定分别用人工合成的多肽A β 42的3种片段，CV-9 (32_40aa)、CA-9 (34_42aa)和 DC-9 (l-9aa)，包被酶标板，常规ELISA方法测抗体3F5的0D，检测单克隆抗体3F5与3种多肽片段结合情况，从而决定该抗体的抗原表位。抗体3F5与不同肽段结合情况证明该抗体都与DC-9结合，而与其它肽段不结合， 说明这株抗体抗原表位是A β 42肽的1-9个氨基酸残基，即是针对A β 42肽N端抗体。
权利要求
1.一种用于治疗老年性痴呆的药物组合物，其包括作为活性成分的单克隆抗体和药用载体，所述单克隆抗体(a)重链可变区包括SEQID NO :3所示氨基酸序列；(b)轻链可变区包括SEQID NO :4所示氨基酸序列；(c)重链可变区包括SEQID NO :3所示氨基酸序列，且轻链可变区包括SEQ ID NO 4 所示氨基酸序列；(d)重链可变区与SEQID NO 3所示氨基酸序列具有至少90%同一性；或(e)轻链可变区与SEQID NO :4所示氨基酸序列具有至少90%同一性。
2.权利要求1所述的药物组合物，其中所述单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列为 SEQ IDNO :3，轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO :4。
3.权利要求2所述的药物组合物，其中编码所述重链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列为SEQ ID NO :1，编码所述轻链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列为SEQ ID NO :2。
4.权利要求1-3任一项中所述的单克隆抗体。。
5.一种杂交瘤细胞，其分泌产生权利要求4中所述的单克隆抗体。
6.一种用于早期诊断老年性痴呆的试剂，其中包括权利要求4中所述的单克隆抗体、 能够产生可检测信号的标记物以及使用说明书。
7.权利要求4所述的单克隆抗体在制备用于治疗老年性痴呆的药物中的用途。
8.权利要求4所述的单克隆抗体在制备老年性痴呆早期诊断试剂中的用途。
全文摘要
本发明属于生物制药领域。本发明提供了一种用于治疗老年性痴呆的药物组合物，其中含有抗老年性痴呆的单克隆抗体，该单克隆抗体是针对Aβ42肽N端表位的特异性单克隆抗体，其与Aβ42肽结合力强，并能显著促进小胶质细胞对Aβ42肽的吞噬作用，溶解和清除Aβ沉积。
文档编号A61K39/395GK102319431SQ201110277498
公开日2012年1月18日 申请日期2011年9月19日 优先权日2011年9月19日
发明者叶庆炜 申请人:徐州逸仕生物技术有限公司