专利名称：红曲活性成分的提取、分离方法及用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及的是一种中草药领域内的中药活性组分的提取、分离方法及用途，具体是一种红曲活性成分的提取、分离方法及用途。
背景技术：
红曲米(red yeast rice),又称红曲或丹曲，是药食两用型传统中药材，以粳米或籼米为原料经红曲霉菌发酵得来，为我国伟大的科学瑰宝，迄今已有逾千年历史。早在北宋年间，陶谷撰写的《清异录》便对它作为食物防腐剂的作用有了最早记载。而红曲米的制备工艺及其健脾活血等药用价值，则在明代李时珍撰写的《本草纲目》中有了较为完善的记录。随着近代对红曲米的研究不断深入，它在食品、医药等领域发挥的卓越功效逐渐受到亚洲其他国家、甚至欧美地区科研工作者的高度重视，并不断探索、阐明其初级与次级代谢物的有益功效。日本远藤章博士在1979年的iThe Journal of Antibiotics))第852页 《Monacolin K, A new hypocholesterolemic agent produced by a monascus species》一文中提到，他成功从红色红曲霉(Monascus ruber)中发现并分离得到Monacolin K(图1，图中R基团为-CH3),并首次提出Monacolin K具有降低血液胆固醇的作用。经证实，Monacolin K是羟甲基戊二酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoA reductase,HMG-CoA reductase)的一种竞争性抑制剂，它阻碍了 HMG-CoA在其还原酶作用下生成甲羟戊酸 (mevalonate)并最终合成胆固醇和其他产物。近年来，随着对红曲中生物活性物质研究的不断发展，各国的学者对其进行了深人而广泛的研究，发现红曲能产生许多有用的次级代谢产物，如红曲色素、胆固醇抑制剂助Lovastatin，及具有降血压、抗菌、降血氨、抗肿瘤、降糖等生理活性的成分，使传统的红曲增添了新的内涵。进一步查阅文献发现，Heveret al.在 1999 年的《Journal of Clinical M/triiio/ 〉〉第 69 期 231 页〈〈Cholesterol—lowering effects of a proprietary Chinese red-yeast rice dietary supplement, American》一文中提至丨J Monacolin K 对 HMG-CoA 还原酶的抑制活性大大优于洛伐他汀(Lovastatin)，并且其毒副作用甚微，从而更安全有效地阻断、减少内源性胆固醇的合成。Man et al.在2002年的《ifohc^ar and Cellular Biochemistry、第 233 期 153 页《Cholestin inhibits cholesterol synthesis and secretion in hepatic cells 0fepG2)》一文中提到，通过临床试验证明功能红曲因其含有强效降脂物质，不仅对HMG-CoA还原酶有良好的抑制作用，使得肝细胞(Hep G2)胆固醇含量降低，从而减少肝细胞OfeP G2)内未酯化的胆固醇和胆固醇酯(cholesteryl ester) 的合成与分泌，进而减轻斑块危险，并且不对肝功能造成扰乱性影响。Hong et al.在2008 年的《JOURNAL OF MEDICINAL FOOD》第 11 期 657 页《Chinese Red Yeast Rice Versus Lovastatin Effects on Prostate Cancer Cells With and Without Androgen Receptor Over expression》一文中证明了 Lovastatin对激素依赖性前列腺癌(LNCaP)及激素非依赖性前列腺癌(LNCaP-AR)细胞增生的抑制作用良好；然而相较而言，同剂量浓度的Monacolin K (5. 93 μ Μ)对 LnCaP 细胞增生抑制作用是 Lovastatin 的 2 倍，而对 LNCaP-AR 型细胞增生的抑制作用则是Lovastatin的4倍，并且药物稳定性更胜一筹。另外，关于功能红曲的其他有益功效如降血压、治疗骨质疏松等在近年来也被多次报道，并受到热切关注。例如，杨萌等就在文献中提到了因红曲霉属中的许多菌株都不同程度产生维生素D2的前体——麦角固醇，当紫外线照射后麦角固醇转化为维生素D2对预防婴儿佝偻病及帮助人体磷吸收有明显作用。资料数据显示，2010-2030年，由于人口老龄化与人口增长等因素，中国心血管疾病发生数还将继续上升；如不加以重视，2030年中国心血管患者将增加2130万、心血管死亡人数将增加770万。这促使人们对降血脂类药品、保健品的需求量增加，使得降血脂药、 食品市场被继续扩张，尤其带给具有天然降脂功效的红曲产品莫大商机。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术存在的不足，提供了一种红曲活性成分的提取、 分离方法及用途。通过初步体外蛋白质酪氨酸磷酸酶IB (PTPlB)抑制试验，确认本发明所提供的一类红曲类PTPlB抑制剂可有效抑制蛋白质酪氨酸磷酸酶IB (PTPlB)的活性，可以用于制备治疗糖尿病和肥胖类药品、保健品。本发明的目的是通过以下技术方案实现的
本发明涉及一种红曲活性成分的提取、分离方法，包括如下步骤
(a)将红曲米干燥粉碎成粉后，经乙醇提取后，浓缩提取得到红曲粉提取物；
(b)步骤(a)中的红曲粉提取物经硅胶柱层析梯度洗脱后得到活性组分。优选的，步骤(a)中的所述乙醇提取，具体为用相对所述红曲米干燥粉质量8 10 倍量的75%乙醇在40°C条件下提取三次，每次两个小时。优选的，步骤(b)中的所述硅胶柱层析梯度洗脱中所用的洗脱剂为石油醚和乙酸乙酯，其重量比分别为10:1、5:1、3:1、2:1、1:1、1:5。优选的，所述步骤(b)中得到的活性组分为6个。本发明还涉及一种根据上述的方法制备而得的红曲类PTPlB抑制剂，所述红曲类 PTPlB抑制剂为采用重量比为10:1的石油醚和乙酸乙酯的洗脱剂洗脱而得的活性组分。本发明还涉及一种根据上述的红曲类PTPlB抑制剂在制备预防和治疗以PTPlB为靶点的糖尿病或肥胖症的药物中的用途。与现有技术相比，本发明具有的有益效果为本发明制备而得的极性较小的黄色色素活性部位F1，经体外PTPlB活性实验证实，具有较强的PTPlB抑制活性，可用于制备预防和治疗以PTPlB (蛋白酪氨酸磷酸酶1B)为靶点的糖尿病或肥胖症的药物。
图1为Monacolin K的结构式；
图2为红曲粉提取、分离及活性测试流程图； 图3为红曲各有效部位体外抑制PTPlB活性结果示意图； 图4为红曲各有效部位交叉实验及细筛结果示意图。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。实施例1、红曲活件组分的提取、分离
本发明中所用的红曲米购于日本郡是健康食品中心。将红曲米在60°C条件下干燥12 后，粉碎成粉状物待用。如图2所示，将干燥的红曲粉用8 10倍量75%乙醇在40°C条件下提取三次，每次两个小时。提取完毕后，过滤去掉残渣，合并滤液，减压浓缩后干燥得到红曲浸膏(即红曲粉提取物)。红曲浸膏经硅胶柱层析，用石油醚乙酸乙酯体系梯度洗脱得到六个活性部位； 所用的洗脱剂配比分别为石油醚/乙酸乙酯=10:1、5:1、3:1、2:1、1:1、1:5，得到的六个活性部位极性由小到大依次为Fl, F2，F3，F4，F5，F6。其中，Fl为极性较小的黄色色素成分； F5为极性较大的褐色色素成分，经HPLC，LC-MS数据分析鉴定为Monacolin K。实施例2、PTPlB抑制活件测试
对实施例1所得的各活性部位进行PTPlB抑制活性测试，如图2所示。采用分子生物学方法，构建基因重组的hGST-PTPlB-BL21 Ε. Coli人类PTPlB工程菌(该工程菌已在《ΡΤΡ1Β 抑制剂及合成和在制备治疗2型糖尿病药物中应用》公开，公开号CN 102018688 A，
公开日
2011.4. 20)，以GST亲和层析柱纯化tiGST-PTPlB蛋白质，利用含有磷酸的多肽pNPP被蛋白质酪氨酸磷酸酶IB (PTPlB)解掉一个磷酸后的产物pNP在波长405nm处有吸收峰的原理， 以PTPlB作用后生成pNP的量表示PTPlB酶活性变化以及化合物对酶活性的抑制情况，计算化合物对PTPlB酶抑制率。测试所用的PTPlB蛋白为重组表达并纯化获得。PTPlB的活性测定体系在测试溶剂(10 mM Tris, 25 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH=7. 5)中加入 7. 5 μ g/mL PTPlB，6 mM PNPP及溶解或稀释于DMSO中待测组分，每个测试浓度均设置3复孔。采用组分浓度的对数值对抑制率作回归方程，计算IC50。本发明化合物对PTPlB抑制活性结果如图3所示，试验所使用阳性对照样品为洛伐他汀和辛伐他汀，对图中数据归纳如表1所示
表权利要求
1.一种红曲活性成分的提取、分离方法，其特征在于，包括如下步骤(a)将红曲米干燥粉碎成粉后，经乙醇提取后，浓缩提取得到红曲粉提取物；(b)步骤(a)中的红曲粉提取物经硅胶柱层析梯度洗脱后得到活性组分。
2.根据权利要求1所述的红曲活性成分的提取、分离方法，其特征在于，步骤(a)中的所述乙醇提取，具体为用相对所述红曲米干燥粉质量8 10倍量的75%乙醇中提取三次， 每次两个小时。
3.根据权利要求1所述的红曲活性成分的提取、分离方法，其特征在于，步骤(b)中的所述硅胶柱层析梯度洗脱中所用的洗脱剂为石油醚和乙酸乙酯，其重量比分别为10:1、 5·1> 3·1、2·1>1.1>1.5 ο
4.根据权利要求3所述的红曲活性成分的提取、分离方法，其特征在于，所述步骤(b) 中得到的活性组分为6个。
5.一种根据权利要求1所述的方法制备而得的红曲类PTPlB抑制剂，其特征在于所述红曲类PTPlB抑制剂为采用重量比为10:1的石油醚和乙酸乙酯的洗脱剂洗脱所得到的活性组分。
6.一种根据权利要求5所述的红曲类PTPlB抑制剂在制备预防和治疗以PTPlB为靶点的糖尿病或肥胖症的药物中的用途。
全文摘要
本发明涉及一种红曲活性成分的提取、分离方法及用途。所述方法包括如下步骤将红曲米干燥粉碎成粉后，经乙醇提取后，浓缩提取得到红曲粉提取物；再经硅胶柱层析梯度洗脱后得到活性组分。所述红曲类PTP1B抑制剂为采用重量比为10:1的石油醚和乙酸乙酯的洗脱剂洗脱所得到的活性组分。该抑制剂可用于制备预防和治疗以PTP1B为靶点的糖尿病或肥胖症的药物。与现有技术相比，通过初步体外PTP1B抑制试验确认本发明所制备的极性较小的黄色色素活性部位F1对PTP1B具有较强的抑制作用，可用于制备预防和治疗以PTP1B为靶点的糖尿病或肥胖症的药物。
文档编号A61K36/899GK102389535SQ20111029761
公开日2012年3月28日 申请日期2011年9月29日 优先权日2011年9月29日
发明者傅磊, 刘井宝, 刘文陆, 刘晶晶, 姜发琴, 金焱 申请人:上海交通大学