专利名称：具有肿瘤靶向、体内示踪和治疗作用的脂质体药物组合物及制备方法
技术领域：
本发明属于生物制药技术领域，具体涉及一种新的具有肿瘤靶向、体内示踪和治疗作用的脂质体药物组合物。具体的说是在抗CD44抗体介导的免疫脂质体上偶联含海肾荧光素酶、红色荧光蛋白和自杀基因胸苷激酶三融合基因的质粒，海肾荧光素酶和红色荧光蛋白具有示踪作用，判断靶向脂质体在体内的分布；自杀基因胸苷激酶具有治疗作用，应用更昔洛韦的靶目标胸苷激酶，诱导肝癌肿瘤干细胞凋亡。同时，抗CD44抗体介导的免疫脂质体包裹阿霉素，能够靶向CD44阳性的肝癌肿瘤干细胞，诱导细胞凋亡。
背景技术：
目前，肿瘤已经成为威胁人类健康的重要疾病，目前的治疗方法主要以手术、放疗、化疗为主，而术后复发、耐药、转移、并发症是治疗失败和病人死亡的主要原因。大部分的化疗药物没有选择性，在杀伤肿瘤细胞的同时，也会对正常的细胞产生杀伤作用，因此会产生严重的副作用。利用脂质体包裹化疗药物，如阿霉素脂质体、柔红霉素脂质体以及紫杉醇脂质体，虽然可以在一定程度上降低毒性，但是无法克服药物的非特异性吸收和无法在肿瘤部位聚集的问题。靶向治疗相对于其他传统治疗手段更具有“治本”的功效，具有能效高并选择性杀伤肿瘤细胞特点，副作用较少，减少对正常组织损伤，更有针对性的治疗肿瘤。肿瘤的分子靶向治疗的关键，就是要找到肿瘤的靶点(靶子)，也就是一种肿瘤分子靶向治疗攻击的是肿瘤细胞的某一个靶点或多个靶点，只要肿瘤含有这个靶点，就适合这种靶向治疗。同时体内分子成像则是一种更进一步微观评价疗效的新技术，它可以检测癌前病变分子异常、细胞生长动力学、血管生长因子、肿瘤细胞标记物、基因的改变，这种成像手段若与分子靶向治疗等新型靶向技术相结合，可用于进行疗效评估以及提供开发新药物的工具。
发明内容
本发明的目的是解决化疗毒副作用大，无法监测其在体内的分布的问题，提供具有肿瘤靶向、体内示踪和治疗作用的脂质体药物组合物及制备方法。该药物安全、有效、能够靶向肿瘤部位、并且可以示踪其在体内的分布和聚集。本发明提供的具有肿瘤靶向、体内示踪和治疗作用的脂质体药物组合物的具体组成包括脂质体药物组合物由磷脂双份子层的脂质体核心和靶标分子抗⑶44抗体组成， 同时携带含有海肾荧光素酶、红色荧光蛋白和自杀基因胸苷激酶三融合基因的报告基因表达质粒，或者由含抗⑶44抗体的脂质体核心包裹阿霉素。本发明提供的具有肿瘤靶向、携带有示踪作用和治疗作用报告基因的靶向脂质体药物组合物的制备方法和体内示踪方法由以下步骤实现1.携带具有示踪作用和治疗作用报告基因的靶向脂质体药物组合物的制备方法，通过以下步骤实现(1) 1，2-油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)、1，2-油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、胆固醇，1， 2-油酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000 (D0PE-PEG2000) ,1,2-油酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰亚胺(D0PE-PEG2000-Mal)，按照原始摩尔比为40 40 40 6 3 的比例混合，溶于甲醇中；(2)利用旋转蒸发仪使步骤(1)的溶液蒸发，形成脂质体膜；(3)步骤⑵形成的脂质体膜用磷酸盐缓冲液(PBS)或300毫摩尔每升的(NH4) 2ΗΡ04水化一小时，使得总脂质浓度为3. 32毫摩尔每升；(4)超声使步骤C3)得到的溶液成为微小均一的脂质球，过100纳米的多聚碳酸酯膜，使其成为粒径在100纳米左右的非靶向均一脂质体；(5)在步骤(4)得到的非靶向脂质体溶液内，按CD44抗体与D0PE_PEG2000-Mal的摩尔比为1 50加入抗⑶44抗体，利用抗⑶44抗体的巯基与脂质体上的PEG链结合，得到靶向脂质体；(6)构建同时含有海肾荧光素酶、红色荧光蛋白和自杀基因胸苷激酶三融合基因的报告基因表达质粒；(7)上述步骤(5)所得到的靶向脂质体和步骤(6)构建的报告基因表达质粒按 100微升脂质体每20微克质粒的比例混合，利用脂质体表面的正电荷与质粒携带的负电荷结合，形成靶向脂质体-DNA复合物。2.携带阿霉素的靶向脂质体药物组合物的制备通过以下步骤实现(1) 1，2_油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)、1，2-油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、胆固醇，1， 2-油酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000 (D0PE-PEG2000) ,1,2-油酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰亚胺(D0PE-PEG2000-Mal)，按照原始摩尔比为40 40 40 6 3 的比例混合，溶于甲醇中；(2)利用旋转蒸发仪使步骤(1)的溶液蒸发，形成脂质体膜；(3)步骤O)中形成的脂质体膜用300毫摩尔每升的(MM)2HPO4水化一小时，使得总脂质浓度为3. 32毫摩尔每升；(4)超声使步骤C3)得到的溶液成为微小均一的脂质球，过100纳米的多聚碳酸酯膜，使其成为粒径在100纳米左右的非靶向脂质体；(5)按照每毫升脂质体1毫克阿霉素(10mg/ml)的比例向步骤⑷得到的脂质体中加入阿霉素，混合均勻，55°C反应1小时，室温放置过夜，利用脂质体内外的磷酸盐梯度， 使阿霉素进入脂质体；(6)过层析柱PD-10纯化，用水洗脱，去除没有被包裹的阿霉素；(7)按抗体与D0PE-PEG2000-Mal的摩尔比为1 50的比例向步骤(6)得到的脂质体中加入抗CD44抗体，利用巯基与脂质体上的PEG链结合，得到阿霉素靶向脂质体。3.体内给药(1)用胰酶消化生长良好的标记萤火虫荧光素酶和绿色荧光蛋白的HepG2细胞株，PBS洗一遍，用RMPI1640基本培养基重悬，使得细胞密度为每毫升培养基1 X IO7个细胞；(2)切开水和氯醛麻醉的N0D/SCID联合免疫缺陷老鼠的左上腹部，暴露出肝叶部分，将10微升上述细胞悬液注射到老鼠肝叶内，缝合，大概一周后，在肝脏原位长出可检测到的肿瘤；(3)将携带报告基因的非靶向脂质体和靶向脂质体分别通过尾静脉注射到长有肿瘤的N0D/SCID联合免疫缺陷老鼠体内。(4)将携带阿霉素的靶向脂质体分别通过尾静脉注射到长有肿瘤的N0D/SCID联合免疫缺陷老鼠体内。4.体内化学发光成像(1)注射了非靶向脂质体和靶向脂质体的老鼠静脉注射海肾荧光素酶底物-肠腔素h (500微克/每千克老鼠)，利用XenOgen200活体成像系统检测化学发光信号，曝光时间为5分钟。(2)注射了携带阿霉素或报告基因脂质体和靶向脂质体的老鼠，给予腹腔注射 D-荧光素钠盐(150毫克/千克体重)，利用XenOgen200活体成像系统检测化学发光信号， 曝光时间为1分钟。5.体外免疫荧光成像(1)处死的老鼠取肿瘤组织，多聚甲醛固定，OCT包埋，切成5微米的冰冻切片。(2) PBS洗三次，每次5分钟；(3)用5 %的BSA封闭30分钟；(4)弃去多余溶液，滴加抗RFP抗体(1 100)，室温静置1小时；(5) TBST缓冲液洗三次，每次5分钟；(6)滴加荧光二抗(1 1000)，室温避光静置半个小时，；(7) TBST缓冲液洗三次，每次5分钟；(8) DAPI复染细胞核，室温避光静置5分钟；(9) TBST缓冲液洗一次；(10)封片，荧光显微镜镜检观察。本发明的优点和积极效果该脂质体药物组合物解决了现有脂质体药物毒副作用大，非特异性吸收和难以定向聚集的问题，其可以定向地在聚集在肿瘤部位发挥杀伤肿瘤的作用，并且可以利用示踪技术实时监测脂质体药物在体内的分布。该药物具有有效的靶向治疗作用、无毒副作用、 损伤小、适合长期应用。
图1携带报告基因的质粒图谱；图2靶向脂质体的粒度分析分布图；图3靶向脂质体的透射电子显微镜图片；图4海肾荧光素酶化学发光示踪靶向脂质体在老鼠体内的分布；图5萤火虫荧光素酶化学发光示踪靶向脂质体治疗后的老鼠肿瘤的变化；图6红色荧光蛋白免疫荧光示踪靶向脂质体在老鼠体内的分布；图7海肾荧光素酶化学发光示踪非靶向脂质体在老鼠体内的分布；图8萤火虫荧光素酶化学发光示踪非靶向脂质体治疗后的老鼠肿瘤的变化；
本发明结合附图和具体实施方式
做进一步详细说明。
具体实施例方式实施例1携带报告基因的靶向脂质体药物组合物的制备(1) DOPC, DOPE,胆固醇，D0PE-PEG2000，D0PE-PEG2000_Mal 按照原始摩尔比为 40 40 40 6 3的比例混合，溶于甲醇中；(2)利用旋转蒸发仪使步骤(1)的溶液蒸发，形成脂质体膜；(3)步骤( 形成的脂质体膜用磷酸盐缓冲液(PBQ水化一小时，使得总脂质浓度为3. 32毫摩尔每升；(4)超声使步骤(3)得到的溶液成为微小均一的脂质泡，过100纳米的多聚碳酸酯膜，使其成为粒径在100纳米左右的均一脂质体；(5)按抗CD44抗体与D0PE-PEG2000_Mal的摩尔比为1 50加入CD44抗体，利用巯基与脂质体上的PEG链结合，得到靶向脂质体；(6)含报告基因质粒的构建，在商业化质粒载体ρ⑶NA3. 1上插入含海肾荧光素酶、红色荧光蛋白和自杀基因胸苷激酶三融合基因，得报告基因表达质粒 pCDNA3. Ι-RL-RFP-tTK ；(如图 1 所示)(7)报告基因与脂质体的偶联，将脂质体与质粒ρ⑶NA3. Ι-RL-RFP-tTK按每100微升脂质体20微克质粒的比例混合，利用脂质体表面的正电荷与质粒携带的负电荷集合，形成靶向脂质体-DNA复合物。脂质体悬液应用透射电子显微镜观察，结果如图2所示，粒径均一，且脂质体为内空的磷脂双分子层。实施例2携带报告基因的非靶向脂质体药物组合物的制备(1) DOPC, DOPE,胆固醇，D0PE-PEG2000，D0PE-PEG2000_Mal 按照原始摩尔比为 40 40 40 6 3的比例混合，溶于甲醇中；(2)利用旋转蒸发仪使其溶液蒸发，形成脂质体膜；(3)形成的脂质体膜用磷酸盐缓冲液(PBS)水化一小时，使得总脂质浓度为3. 32
毫摩尔每升；(4)超声使其成为微小均一的脂质泡，过100纳米的多聚碳酸酯膜，使其成为粒径在100纳米左右的均一非靶向脂质体；(5)报告基因与脂质体的偶联，将脂质体与实施例1构建的质粒 ρ⑶NA3. Ι-RL-RFP-tTK按每100微升脂质体20微克质粒的比例混合，利用脂质体表面的正电荷与质粒携带的负电荷集合，形成非靶向脂质体-DNA复合物。实施例3 靶向脂质体疗效鉴定及体内示踪 建立N0D/SCID联合免疫缺陷老鼠的肝癌原位模型。用胰酶消化生长良好的标记萤火虫荧光素酶和绿色荧光蛋白的H印G2细胞株，PBS洗一遍，用RMPI1640基本培养基重悬，使得细胞密度为每毫升培养基1 X IO7个细胞。水和氯醛麻醉，切开N0D/SCID联合免
6疫缺陷老鼠的左上腹部，暴露出肝叶部分，将10微升上述细胞悬液注射到老鼠肝叶内，缝合，大概一周后，在肝脏原位长出可检测到的肿瘤。将实施例1中准备的100微升靶向脂质体-DNA复合物，通过尾静脉注射到荷瘤老鼠体内，随后每天腹腔注射更昔洛韦，注射剂量为50毫克/千克体重，每天一次。体内化学发光成像(1)海肾荧光素酶成像监测脂质体定位和聚集注射脂质体的老鼠尾静脉注射海肾荧光素酶底物-肠腔素h (500微克/每千克体重)，利用Xenoger^OO活体成像系统检测化学发光信号，曝光时间为5分钟。如图3所示， 发光信号集中在老鼠的上腹部，为肝脏部位，说明抗CD44抗体介导的靶向脂质体富集到肝脏原位肿瘤处。以此来示踪靶向脂质体在老鼠体内的分布。(2)萤火虫荧光素酶成像监测肿瘤生长情况形成肿瘤的N0D/SCID联合免疫缺陷老鼠，给予腹腔注射D-荧光素钠盐(150毫克 /千克体重)，利用仏1108611200活体成像系统检测化学发光信号，曝光时间为1分钟。从注射肿瘤的第二天开始监测荧光素信号，每周监测一次，监测5周。如图4所示，当给予更昔洛韦处理后，和未给药的对照组相比，实验组老鼠的肿瘤生长明显被抑制。体外免疫荧光成像用免疫荧光的方法检测红色荧光蛋白在老鼠体内的定位，具体步骤如下(1)处死的老鼠取肿瘤组织，多聚甲醛固定，OCT包埋，切成5微米的冰冻切片。
(2) PBS洗三次，每次5分钟；(3)用5 %的BSA封闭30分钟；(4)弃去多余溶液，滴加抗RFP抗体(1 100)，室温静置1小时；(5) TBST缓冲液洗三次，每次5分钟；(6)滴加荧光二抗(1 1000)，室温避光静置半个小时，；(7) TBST缓冲液洗三次，每次5分钟；(8) DAPI复染细胞核，室温避光静置5分钟；(9) TBST缓冲液洗一次；(10)封片，荧光显微镜镜检观察。镜检结果如图5所示，在表达抗CD44的肿瘤部位可以检测到红色荧光蛋白(RFP) 的表达，说明携带RFP的靶向脂质体是集中在肿瘤部位，以此示踪抗CD44抗体介导的靶向脂质体在老鼠体内的分布。实施例4非靶向脂质体体内示踪建立N0D/SCID联合免疫缺陷老鼠的肝癌原位模型。用胰酶消化生长良好的标记萤火虫荧光素酶和绿色荧光蛋白的H印G2细胞株，PBS洗一遍，用RMPI1640基本培养基重悬，使得细胞密度为每毫升培养基1 X IO7个细胞。水和氯醛麻醉，切开N0D/SCID联合免疫缺陷老鼠的左上腹部，暴露出肝叶部分，将10微升上述细胞悬液注射到老鼠肝叶内，缝合， 大概一周后，在肝脏原位长出可检测到的肿瘤。将实施例2中准备的100微升非靶向脂质体-DNA复合物，通过尾静脉注射到荷瘤老鼠体内，随后每天腹腔注射更昔洛韦，注射剂量为50毫克/千克体重，每天一次。CN 102429868 A
说明书
6/6页体内化学发光成像(1)海肾荧光素酶成像监测脂质体定位和聚集脂质体治疗后的老鼠尾静脉注射海肾荧光素酶底物-肠腔素h (500微克/每千克体重)，利用Xenoger^OO活体成像系统检测化学发光信号，曝光时间为5分钟。如图6所示，发光信号分散在老鼠的下腹部，携带报告基因的非靶向脂质体没有定向富集在肿瘤部位，说明没有抗CD44抗体介导的非靶向脂质体不能富集到肝脏原位肿瘤处。以此来示踪靶向脂质体在老鼠体内的分布。(2)萤火虫荧光素酶成像监测肿瘤生长情况形成肿瘤的N0D/SCID联合免疫缺陷老鼠，给予腹腔注射D-荧光素钠盐(150毫克 /千克体重)，利用仏1108611200活体成像系统检测化学发光信号，曝光时间为1分钟。从注射肿瘤的第二天开始监测荧光素信号，每周监测一次，监测5周。如图7所示，当给予更昔洛韦处理后，和对照组相比老鼠的肿瘤生长没有被抑制。实施例5携带阿霉素的靶向脂质体的制备及治疗(1)1，2-油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)、1，2-油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、胆固醇，1， 2-油酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000 (D0PE-PEG2000) ,1,2-油酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰亚胺(D0PE-PEG2000-Mal)，按照原始摩尔比为40 40 40 6 3 的比例混合，溶于甲醇中；(2)利用旋转蒸发仪使其溶液蒸发，形成脂质体膜；(3)形成的脂质体膜用300毫摩尔每升的(MM)2HPO4水化一小时，使得总脂质浓度为3. 32毫摩尔每升；(4)超声使其成为微小均一的脂质球，过100纳米的多聚碳酸酯膜，使其成为粒径在100纳米左右的非靶向脂质体；(5)按照每毫升脂质体1毫克阿霉素(10mg/ml)的比例加入阿霉素，混合均勻， 55°C反应1小时，室温放置过夜，利用脂质体内外的磷酸盐梯度，使阿霉素进入脂质体；(6)过层析柱PD-10纯化，用水洗脱，去除没有被包裹的阿霉素；(7)按抗体与D0PE-PEG2000-Mal的摩尔比为1 50加入CD44抗体，利用巯基与脂质体上的PEG链结合，得到阿霉素靶向脂质体；(8)萤火虫荧光素酶成像监测肿瘤生长情况形成肿瘤的N0D/SCID联合免疫缺陷老鼠，给予腹腔注射D-荧光素钠盐(150毫克 /千克体重)，利用仏1108611200活体成像系统检测化学发光信号，曝光时间为1分钟。从注射肿瘤的第二天开始监测荧光素信号，每周监测一次，监测5周。如图8所示，给予携带阿霉素的靶向脂质体治疗以后，和未给药的对照组相比处理组老鼠的肿瘤生长明显被抑制。
权利要求
1.一种具有肿瘤靶向、体内示踪和治疗作用的脂质体药物组合物，其特征在于此脂质体药物组合物由磷脂双份子层的脂质体核心和靶标分子抗CD44抗体组成，并能携带有示踪作用和治疗作用的报告基因，也能包裹阿霉素。
2.一种携带有示踪作用和治疗作用报告基因的靶向脂质体药物组合物的制备方法，其特征在于该方法的具体步骤为(1)1，2-油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)、1，2_油酰基磷脂酰乙醇胺(0(^)、胆固醇、1，2-油酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000 (D0PE-PEG2000)和1，2-油酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰亚胺(D0PE-PEG2000-Mal)，按原始摩尔比为40 40 40 6 3的比例混合，溶于甲醇中；(2)利用旋转蒸发仪使步骤(1)的溶液蒸发，形成脂质体膜；(3)步骤( 形成的脂质体膜用磷酸盐缓冲液(PBQ水化一小时，使得总脂质浓度为 3. 32毫摩尔每升；(4)超声使步骤(3)得到的溶液成为微小均一的脂质球，过100纳米的多聚碳酸酯膜， 成为粒径在100纳米的均一脂质体；(5)按抗体与D0PE-PEG2000-Mal的摩尔比为1 50将抗CD44抗体加入步骤(4)得到的脂质体中，利用巯基与脂质体上的PEG链结合，得到靶向脂质体；(6)构建同时含有海肾荧光素酶、红色荧光蛋白和自杀基因胸苷激酶三融合基因的报告基因表达质粒；(7)报告基因与脂质体的偶联，将脂质体与步骤(6)构建的报告基因表达质粒按每100 微升脂质体20微克质粒的比例混合，利用脂质体表面的正电荷与质粒携带的负电荷集合， 形成靶向脂质体-DNA复合物，即为脂质体药物组合物。
3.一种携带有阿霉素的靶向脂质体药物组合物的制备方法，其特征在于该方法的具体步骤为(1)1，2-油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)、1，2_油酰基磷脂酰乙醇胺(0(^)、胆固醇、1，2-油酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000 (D0PE-PEG2000)和1，2-油酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰亚胺(D0PE-PEG2000-Mal)，按原始摩尔比为40 40 40 6 3的比例混合，溶于甲醇中；(2)利用旋转蒸发仪使步骤(1)的溶液蒸发，形成脂质体膜；(3)步骤O)中形成的脂质体膜用300毫摩尔每升的(MM)2HPO4水化一小时，使得总脂质浓度为3. 32毫摩尔每升；(4)超声使步骤C3)得到的溶液成为微小均一的脂质球，过100纳米的多聚碳酸酯膜， 使其成为粒径在100纳米的非靶向脂质体；(5)按照每毫升脂质体1毫克浓度为10mg/ml的阿霉素的比例向步骤⑷得到的脂质体中加入阿霉素，混合均勻，55°C反应1小时，室温放置过夜，利用脂质体内外的磷酸盐梯度，使阿霉素进入脂质体；(6)过层析柱PD-IO纯化，用水洗脱，去除没有被包裹的阿霉素；(7)按抗体与D0PE-PEG2000-Mal的摩尔比为1 50的比例向步骤(6)纯化后的脂质体中加入抗CD44抗体，利用巯基与脂质体上的PEG链结合，得到阿霉素靶向脂质体。
全文摘要
一种具有肿瘤靶向、体内示踪和治疗作用的脂质体药物组合物及制备方法。所述药物组合物是一种抗CD44抗体偶联的脂质体靶向药物，同时具有分子成像功能，能在活体的状态下实时监测药物在体内的分布。具体说是在抗CD44抗体介导的免疫脂质体上偶联含海肾荧光素酶、红色荧光蛋白和自杀基因胸苷激酶三融合基因的质粒，借助活体成像系统检测海肾荧光素酶信号来监测脂质体纳米颗粒在体内靶向NOD/SCID联合免疫缺陷老鼠的肝癌原位模型的特异性，同时应用更昔洛韦的靶目标胸苷激酶，诱导肝癌细胞凋亡；另外，靶向脂质体还可以包裹阿霉素，诱导肝癌细胞凋亡。本发明提供的脂质体药物组合物，无毒副作用、损伤小、作用佳、适合长期应用。
文档编号A61K48/00GK102429868SQ20111041133
公开日2012年5月2日 申请日期2011年12月9日 优先权日2011年12月9日
发明者向荣, 李宗金, 王丽娜 申请人:南开大学