专利名称：阳离子微泡及其制备方法
阳离子微泡及其制备方法
技术领域：
本发明涉转基因载体和超声造影技术领域，尤其涉及一种阳离子微泡及其制备方法。
背景技术：
基因治疗(gene therapy)是指将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病，达到治疗目的。分离或改建的外源性基因和核酸序列自身不能复制，需要载体携带它们到合适的细胞中复制和表现功能。基因载体作为基因导入细胞进行基因治疗的工具，可以把目的基因送入靶细胞内，从而发挥目的基因的特定功能。基因载体可分为两大类病毒类载体和非病毒类载体。病毒类载体主要包括逆转录病毒，腺病毒、腺相关病毒和单纯疱疹病毒等，是非常有效的转基因载体。非病毒载体通常是利用亲水或疏水的多价阳离子聚合物的静电作用吸附带负电的质粒、或者反义寡核苷酸，形成微粒、胶束或者脂质体被细胞内吞进入细胞。超声造影剂微泡是微米级的氟碳或者氟硫气泡，包裹一层表面活性剂、磷脂或聚合物等为外壳，一般为1 10个微米。微泡通过静脉注射进入全身血液循环，因气体和血液及组织的声阻抗存在极大的差别，能够显著增强超声信号。过去几十年，超声造影剂微泡因可以增强超声图像的对比度和信噪比在疾病诊断方面得到了广泛的应用，同时作为一种可以进行靶向修饰进行超声分子成像及定点控释药物和基因的载体和在治疗方面也得到了广泛而深入的研究，是非常有发展前景的非病毒类基因载体。此外，微泡在声场中会产生振动、空化，微泡崩溃破裂产生微射流、休克波及其他一系列复杂又剧烈的局部效应，这些效应能在细胞膜表面形成暂时性的孔洞，有助于药物和基因的传输。而且微泡可以降低声空化的阈值，减少超声能量输出。使超声声束聚焦于微泡经过的组织器官，通过操控超声作用的能量、时间和区域，药物和基因可以被定向输送到特定的位置，实现特定地点的药物输送，可以有效的将大分子物质如质粒运送出脉管系统。因为超声微泡既能作造影剂，提高超声图像的信噪比，又能作为药物和基因载体，可以实现超声图像引导的药物和基因输送，尤其对于肿瘤的靶向给药和基因治疗，有很大的吸引力。目前用超声联合微泡造影剂进行基因转染已经有很多研究报道。已有文献报道的基因装载到微泡方法包括以下几种1、在微泡制备过程中直接将DNA混入微泡的外壳材料中，或者直接将基因加入制备好的微泡中一起混勻，该方法纯粹靠物理滞留吸附在外壳表面，载DNA量不高，且微泡制备过程的超声及加热可能使DNA链段断裂失活。2、制备微泡时将带正电的磷脂混在微泡的外壳上，然后通过静电吸附的办法吸附 DNA，但带正电磷脂荷电量小吸附力较弱。3、将一层(聚丙烯胺盐酸盐)或者多层阳离子聚合物(聚赖氨酸)沉积在微泡的外壳上，然后静电吸附DNA。4、将DNA包裹在阳离子脂质体中，然后再将脂质体通过生物素亲和素作用连接到微泡外壳上。5、在25KDa的PEI上修饰上巯基，然后通过共价偶联在具有马来酰亚胺基团的微泡上，进行转染到了较好的效果，但是其步骤复杂而且材料成本较高。传统的超声造影剂微泡作为非病毒载体具有很多优势，但现有的膜材料带电基团小，荷电量比较小，DNA结合不牢固，且由于其单层膜结构，携带裸质粒的能力比较小，静脉注射后，由于血流的剪切力、单核巨噬细胞系统和酶降解等原因，很快的被清除掉，转染效率不高。
发明内容基于此，有必要提供一种具有较高转染效率和超声造影剂微泡优点的阳离子微泡。此外，还有必要提供一种上述阳离子微泡的制备方法。一种阳离子微泡，为脂类材料形成的微泡结构，所述脂类材料包括作为主体材料的碳原子数为12 22的磷脂，占所述脂类材料的摩尔百分数的 70% 90% ；作为改性材料的疏水链段修饰的聚乙烯亚胺，占所述脂类材料的摩尔百分数的 20% ；以及聚乙二醇修饰的所述碳原子数为12 22的磷脂，占所述脂类材料的摩尔百分数的 10%。优选的，所述碳原子数为12 22的磷脂为二棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺、二 (二十酰基)磷脂酰胆碱和硬脂酸聚乙二醇单酯中的至少一种。优选的，所述聚乙二醇修饰的碳原子数为12 22的磷脂为聚乙二醇修饰的二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇修饰的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺和聚乙二醇修饰的二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺中的至少一种。优选的，所述疏水链段为碳原子数为12 22的脂肪酸或其对应的脂肪酸聚乙二
醇单脂。优选的，所述聚乙烯亚胺的分子量为600 25000 ；所述聚乙烯亚胺为支化的链结构或线性结构。优选的，所述聚乙二醇的分子量为1000 5000。一种阳离子微泡的制备方法，包括如下步骤步骤一、将碳原子数为12 22的磷脂、疏水链段修饰的聚乙烯亚胺以及聚乙二醇修饰的碳原子数为12 22的磷脂按照摩尔比例为70 90 1 20 1 10溶解在有机溶剂中并混勻；步骤二、用干燥的氮气流或惰性气体流除去有机溶剂，使得脂类混合物附着在容器壁上形成均勻的薄膜，之后干燥；步骤三、加入pH为7. 2 7. 6的缓冲液使得所述脂类混合物薄膜水化，接着将该脂类化合物加热至相变温度以上使其从容器壁上脱落，保持混合体系的温度不变超声震荡使得混合体系彻底分散至透明；
步骤四、将透明的混合体系转移至密封容器中并保持所述密封容器内的溶液体积少于密封容器的容积的一半，将所述密封容器内的空气置换，接着对所述密封容器进行机械震荡，放置至少IOmin后得到阳离子微泡。优选的，步骤一中，所述疏水链段修饰的聚乙烯亚胺通过如下方法制得按照摩尔比约为1 1.2的比例将所述疏水链段对应的脂肪酸与N，N'-羰基二咪唑分别溶解在有机溶剂中，在磁力搅拌下将疏水链段对应的脂肪酸的溶液逐滴加入到N， N'-羰基二咪唑溶液中，氮气或惰性气体氛围下约30°C反应约Mh，然后用饱和氯化钠溶液快速洗涤萃取，得到羧基活化的疏水链段对应的脂肪酸；按照摩尔比约为1 1，将聚乙烯亚胺和所述羧基活化的疏水链段对应的脂肪酸分别溶解在有机溶剂中，在磁力搅拌下将羧基活化的疏水链段对应的脂肪酸溶液逐滴加入到聚乙烯亚胺溶液中，氮气或惰性气体氛围下约30°C反应约Mh，然后乙醚沉淀纯化，得到疏水链段修饰的聚乙烯亚胺。优选的，步骤三中，所述缓冲液为0. IM的PBS磷酸盐缓冲液，或所述缓冲液为含 10%体积比的甘油、10%体积比的丙二醇和80%体积比0. IM的Tris三羟基氨甲烷的混合液。优选的，步骤四中，将所述密封容器内的空气置换所用的气体为六氟化硫、八氟丙烷、十氟丁烷、全氟戊烷和氮气中的至少一种。通过将毒性较低的疏水链段修饰的聚乙烯亚胺通过亲疏水作用结合直接耦合在磷脂微泡的表面，得到阳离子微泡。这种阳离子微泡作为一种新型的基因转染试剂，将超声微泡和聚乙烯亚胺的优势结合起来的同时弥补其不足之处，具有超声造影剂微泡优点，可以进行超声图像引导下的基因转染，同时可以用超声操控微泡进行定点的靶向转染。相对于传统的超声造影剂微泡，具有较高的转染效率。
图1为一实施方式的阳离子微泡的制备方法的流程图；图2为实施例1制得的硬脂酰聚乙烯亚胺酰胺微泡的粒径分布图；图3为实施例1制得的硬脂酰聚乙烯亚胺酰胺微泡吸附质粒DNA后用Hoechst 33258染色的显微镜明场照片；图4为实施例1制得的硬脂酰聚乙烯亚胺酰胺微泡吸附质粒DNA后用Hoechst 33258染色的显微镜荧光照片。
具体实施方式传统的超声造影剂微泡作为非病毒载体具有很多优势，但现有的膜材料带电基团小，荷电量比较小，DNA结合不牢固，且由于其单层膜结构，携带裸质粒的能力比较小，静脉注射后，由于血流的剪切力、单核巨噬细胞系统和酶降解等原因，很快的被清除掉，转染效
率不高。基于此，有必要一种具有较高转染效率和超声造影剂微泡优点的阳离子微泡。下面结合附图和具体实施例对阳离子微泡及其制备方法做进一步的解释说明。聚乙烯亚胺(PEI)是聚阳离子复合物中使用最广泛的非病毒基因载体材料，可以在很宽的PH范围内和DNA紧密结合，相对于其他载体具有价格低廉、体内外转染效果较好的优点。自由PEI的结构在生理条件下有1/5的氨基发生了质子化反应，从而使溶酶体肿胀破裂，从而起到质子海绵的作用，使PEI/DNA复合物得以释放入细胞质，很大程度上减少了 DNA分子在吞噬泡内富集并进而被降解的作用，因而可以提高转染效率。带正电的氨基基团能与DNA分子中带负电的磷酸基团相互作用，形成的复合物能被细胞内吞。PEI还可以抑制溶酶体，在吞噬泡酸性环境中质子化，正电荷增加，对DNA提供更大的保护作用，有利于质粒逃离吞噬泡，具有较高的表达效价。PEI作为一种非病毒转染试剂具有较高的转染效率，如分子量为25KDa的PEI经常作为体外转染的阳性对照，但是其具有较高的细胞毒性，作为基因转染试剂仍有较大的缺陷。通过将毒性较低的疏水链段修饰的聚乙烯亚胺通过亲疏水作用结合直接耦合在磷脂微泡的表面，得到阳离子微泡。这种阳离子微泡，为脂类材料形成的微泡结构；所述脂类材料包括作为主体材料的碳原子数为12 22的磷脂，占所述脂类材料的摩尔百分数的 70% 90% ；作为改性材料的疏水链段修饰的聚乙烯亚胺，占所述脂类材料的摩尔百分数的 20% ；以及聚乙二醇修饰的碳原子数为12 22的磷脂，占所述脂类材料的摩尔百分数的 10%。碳原子数为12 22的磷脂可以为二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二(二十酰基)磷脂酰胆碱和硬脂酸聚乙二醇单酯中的至少一种。疏水链段可以为碳原子数为12 22的脂肪酸或其对应的脂肪酸聚乙二醇单脂。聚乙烯亚胺的分子量为可以600 25000。本实施方式中，聚乙烯亚胺可以为支化的链结构，也可以为线性结构。聚乙二醇修饰的碳原子数为12 22的磷脂可以为聚乙二醇修饰的二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE-PEG)、聚乙二醇修饰的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE-PEG)和聚乙二醇修饰的二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺(DMPE-PEG)中的至少一种。聚乙二醇的分子量可以为1000 5000。微泡结构的粒径可以为1 μ m 10 μ m。微泡内部包覆有气体核，气体核可以为六氟化硫、八氟丙烷、十氟丁烷、全氟戊烷和氮气中的至少一种。将这种阳离子微泡以一定比例与基因混合，室温下孵育20分钟，就可以得到表面吸附有基因的微泡，既可用于超声造影剂，又可用做基因转染试剂，可以实现超声图像引导的药物和基因输送。通过将毒性较低的疏水链段修饰的聚乙烯亚胺通过亲疏水作用结合直接耦合在磷脂微泡的表面，得到阳离子微泡。这种阳离子微泡作为一种新型的基因转染试剂，将超声微泡和聚乙烯亚胺的优势结合起来的同时弥补其不足之处，具有超声造影剂微泡优点，可以进行超声图像引导下的基因转染，同时可以用超声操控微泡进行定点的靶向转染。相对于传统的超声造影剂微泡，具有较高的转染效率。还提供一种上述阳离子微泡的制备方法，如图1所示，该阳离子微泡的制备方法， 包括如下步骤S10、将碳原子数为12 22的磷脂、疏水链段修饰的聚乙烯亚胺以及聚乙二醇修饰的碳原子数为12 22的磷脂按照摩尔百分比例为70 90 1 20 1 10溶解在有机溶剂中并混勻。碳原子数为12 22的磷脂可以为二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二(二十酰基)磷脂酰胆碱和硬脂酸聚乙二醇单酯中的至少一种。疏水链段可以为碳原子数为12 22的脂肪酸或其对应的脂肪酸聚乙二醇单脂。疏水链段修饰的聚乙烯亚胺可以通过如下方法制得按照摩尔比约为1 1.2的比例将疏水链段对应的脂肪酸与N，N'-羰基二咪唑分别溶解在有机溶剂中，在磁力搅拌下将疏水链段对应的脂肪酸的溶液逐滴加入到N， N'-羰基二咪唑溶液中，氮气或惰性气体氛围下约30°C反应约Mh，然后用饱和氯化钠溶液快速洗涤萃取，得到羧基活化的疏水链段对应的脂肪酸。按照摩尔比约为1 1，将聚乙烯亚胺和所述羧基活化的疏水链段对应的脂肪酸分别溶解在有机溶剂中，在磁力搅拌下将羧基活化的疏水链段对应的脂肪酸溶液逐滴加入到聚乙烯亚胺溶液中，氮气或惰性气体氛围下约30°C反应约Mh，然后乙醚沉淀纯化，得到疏水链段修饰的聚乙烯亚胺。聚乙烯亚胺的分子量为可以600 25000。本实施方式中，聚乙烯亚胺可以为支化的链结构，也可以为线性结构。聚乙二醇修饰的碳原子数为12 22的磷脂可以为聚乙二醇修饰的二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE-PEG)、聚乙二醇修饰的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE-PEG)和聚乙二醇修饰的二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺(DMPE-PEG)中的至少一种。聚乙二醇的分子量可以为1000 5000。有机溶剂选择磷脂材料的良溶剂，例如三氯甲烷、二氯甲烷、丙酮等。本实施方式中采用三氯甲烷作为有机溶剂。 混勻采用涡旋混合器进行。S20、用干燥的氮气流或惰性气体流除去有机溶剂，使得SlO得到的脂类混合物附着在容器壁上形成均勻的薄膜，之后干燥。干燥的操作可以选择在真空烘箱中干燥浊以上。S30、加入pH为7. 2 7. 6的缓冲液使得S20得到的脂类混合物薄膜水化，接着将该脂类化合物加热至相变温度以上使其从容器壁上脱落，保持混合体系的温度不变超声震荡使得混合体系彻底分散至透明。脂类化合物的相变温度各有不同，如DSPC为60°C。本实施方式中，缓冲液为含10%体积比的甘油、10%体积比的丙二醇和80%体积比0. IM的Tris三羟基氨甲烷的混合液。在其他的实施方式中，缓冲液还可以为0. IM的 PBS磷酸盐缓冲液。
超声震荡可以采用水浴式超声震荡器。S40、将S30得到的透明的混合体系转移至密封容器中并保持所述密封容器内的溶液不超过密封容器的容积的一半，将密封容器内的空气置换，接着对密封容器进行机械震荡，放置至少IOmin后得到所需的阳离子微泡。本实施方式中，将密封容器内的空气置换所用的气体为六氟化硫、八氟丙烷、十氟丁烷、全氟戊烷和氮气中的至少一种。可以选择容积为2mL的西林瓶作为密封容器，每瓶装入ImL的液体。机械震荡为采用频率为4500次每分钟的机械震荡器震荡4 90s。以下为具体实施例。实施例1(1)聚乙烯亚胺PEI600的修饰改性。硬脂酸的端羧基活化按照硬脂酸与N，N'-羰基二咪唑摩尔比例1 1.2，将硬脂酸和N，N'-羰基二咪唑，分别溶解于三氯甲烷溶剂中。硬脂酸的三氯甲烷溶液在磁力搅拌下逐滴加入到N，N'-羰基二咪唑的三氯甲烷溶液中。反应器在氩气氛围下，30°C反应对小时。然后用饱和氯化钠溶液快速洗涤萃取，制的端羧基活化的硬脂酸。反应方程式如下
权利要求
1.一种阳离子微泡，为脂类材料形成的微泡结构，其特征在于； 所述脂类材料包括作为主体材料的碳原子数为12 22的磷脂，占所述脂类材料的摩尔百分数的70% 90% ；作为改性材料的疏水链段修饰的聚乙烯亚胺，占所述脂类材料的摩尔百分数的 20% ；以及聚乙二醇修饰的所述碳原子数为12 22的磷脂，占所述脂类材料的摩尔百分数的 10%。
2.如权利要求1所述的阳离子微泡，其特征在于，所述碳原子数为12 22的磷脂为二棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺、二(二十酰基)磷脂酰胆碱和硬脂酸聚乙二醇单酯中的至少一种。
3.如权利要求1所述的阳离子微泡，其特征在于，所述聚乙二醇修饰的碳原子数为 12 22的磷脂为聚乙二醇修饰的二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇修饰的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺和聚乙二醇修饰的二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺中的至少一种。
4.如权利要求1所述的阳离子微泡，其特征在于，所述疏水链段为碳原子数为12 22 的脂肪酸或其对应的脂肪酸聚乙二醇单脂。
5.如权利要求1所述的阳离子微泡，其特征在于，所述聚乙烯亚胺的分子量为600 25000 ；所述聚乙烯亚胺为支化的链结构或线性结构。
6.如权利要求1所述的阳离子微泡，其特征在于，所述聚乙二醇的分子量为1000 5000。
7.一种阳离子微泡的制备方法，其特征在于，包括如下步骤步骤一、将碳原子数为12 22的磷脂、疏水链段修饰的聚乙烯亚胺以及聚乙二醇修饰的碳原子数为12 22的磷脂按照摩尔比例为70 90 1 20 1 10溶解在有机溶剂中并混勻；步骤二、用干燥的氮气流或惰性气体流除去有机溶剂，使得脂类混合物附着在容器壁上形成均勻的薄膜，之后干燥；步骤三、加入pH为7. 2 7. 6的缓冲液使得所述脂类混合物薄膜水化，接着将该脂类化合物加热至相变温度以上使其从容器壁上脱落，保持混合体系的温度不变超声震荡使得混合体系彻底分散至透明；步骤四、将透明的混合体系转移至密封容器中并保持所述密封容器内的溶液体积少于密封容器的容积的一半，将所述密封容器内的空气置换，接着对所述密封容器进行机械震荡，放置至少IOmin后得到阳离子微泡。
8.如权利要求7所述的阳离子微泡的制备方法，其特征在于，步骤一中，所述疏水链段修饰的聚乙烯亚胺通过如下方法制得按照摩尔比约为1 1.2的比例将所述疏水链段对应的脂肪酸与N，N'-羰基二咪唑分别溶解在有机溶剂中，在磁力搅拌下将疏水链段对应的脂肪酸的溶液逐滴加入到N， N'-羰基二咪唑溶液中，氮气或惰性气体氛围下约30°C反应约Mh，然后用饱和氯化钠溶液快速洗涤萃取，得到羧基活化的疏水链段对应的脂肪酸；按照摩尔比约为1 1，将聚乙烯亚胺和所述羧基活化的疏水链段对应的脂肪酸分别溶解在有机溶剂中，在磁力搅拌下将羧基活化的疏水链段对应的脂肪酸溶液逐滴加入到聚乙烯亚胺溶液中，氮气或惰性气体氛围下约30°C反应约Mh，然后乙醚沉淀纯化，得到疏水链段修饰的聚乙烯亚胺。
9.如权利要求7所述的阳离子微泡的制备方法，其特征在于，步骤三中，所述缓冲液为 0. IM的PBS磷酸盐缓冲液，或所述缓冲液为含10%体积比的甘油、10%体积比的丙二醇和 80%体积比0. IM的Tris三羟基氨甲烷的混合液。
10.如权利要求7所述的阳离子微泡的制备方法，其特征在于，步骤四中，将所述密封容器内的空气置换所用的气体为六氟化硫、八氟丙烷、十氟丁烷、全氟戊烷和氮气中的至少一种。
全文摘要
本发明公开了一种阳离子微泡，为脂类材料形成的微泡结构；所述脂类材料包括作为主体材料的碳原子数为12～22的磷脂，占所述脂类材料的摩尔百分数的70％～90％；作为改性材料的疏水链段修饰的聚乙烯亚胺，占所述脂类材料的摩尔百分数的1％～20％；以及聚乙二醇修饰的所述碳原子数为12～22的磷脂，占所述脂类材料的摩尔百分数的1％～10％。这种阳离子微泡作为一种新型的基因转染试剂，将超声微泡和聚乙烯亚胺的优势结合起来的同时弥补其不足之处，具有超声造影剂微泡的优点，可以进行超声图像引导下的基因转染，同时可以用超声操控微泡进行定点的靶向转染。本发明还提供一种上述阳离子微泡的制备方法。
文档编号A61K49/22GK102552947SQ20111045656
公开日2012年7月11日 申请日期2011年12月30日 优先权日2011年12月30日
发明者王志勇, 邱本胜, 郑海荣, 靳巧锋 申请人:中国科学院深圳先进技术研究院