专利名称：硫酸乙酰肝素替代疗法的制作方法
技术领域：
本发明涉及硫酸乙酰肝素及其模拟物在治疗I型或II型糖尿病中的用途。具体而言，本发明涉及移植后β细胞功能的维持和胰岛排斥的治疗和预防。背景I型和II型糖尿病具有不同的病因，但是两种疾病的特征均为通过朗格汉斯胰岛β细胞的胰岛素产生受损。在I型糖尿病中，胰岛β细胞由于对胰岛自身抗原的自身免疫应答而被免疫系统损伤。在II型糖尿病中，存活的胰岛β细胞不能产生足以补偿外周组织“胰岛素抵抗”的胰岛素。
胰岛移植是治疗糖尿病的治疗性疗法。需要使用免疫抑制性药物来防止胰岛移植的排斥，这种排斥限制了向糖尿病已经难以控制的成年个体中移植胰岛。从长期看，胰岛功能最终丧失并且再次需要胰岛素疗法。这种移植失败最有可能是由于用于防止免疫排斥的免疫抑制性药物的毒性和/或自身免疫病的复发。如果要产生成功的移植，功能性胰岛的分离是至关重要的，而与接受者针对异体移植物的免疫应答相关的问题无关。本发明人已经表明，在胰岛分离过程中，胰岛内硫酸乙酰肝素的维持是确保保留正常胰岛功能的重要因素，胰岛内硫酸乙酰肝素使得胰岛β细胞耐受活性氧(ROS)。因此，需要对抗在I型和II型糖尿病中与疾病进程相关的胰岛硫酸乙酰肝素损失，以及在分离胰岛β细胞用于移植的过程中保护胰岛β细胞免受硫酸乙酰肝素损失。概述根据第一方面，提供了抑制个体中胰岛β细胞氧化损伤的方法，其包括给予所述个体治疗有效量的硫酸乙酰肝素。根据第二方面，提供了抑制胰岛β细胞氧化损伤的方法，其包括将所述β细胞与硫酸乙酰肝素接触。根据第三方面，提供了治疗糖尿病的方法，其包括给予有需要的个体治疗有效量的硫酸乙酰肝素。在一实施方案中，糖尿病是I型或II型糖尿病。根据第四方面，提供了治疗自身免疫性疾病状态的方法，其包括给予有需要的个体治疗有效量的硫酸乙酰肝素。在一实施方案中，自身免疫性疾病状态可以选自I型糖尿病胰岛炎、胰岛移植排斥或其组合。根据第五方面，提供了维持β细胞功能的方法，其包括给予有需要的个体治疗有效量的硫酸乙酰肝素。β细胞可以在原位或位于移植的胰岛内。根据第六方面，提供了维持分离的胰岛中β细胞功能的方法，其包括在移植入患者之前，用治疗有效量的硫酸乙酰肝素预处理胰岛。根据第七方面，提供了治疗或预防移植排斥的方法，其包括给予有需要的个体治疗有效量的硫酸乙酰肝素。
在一实施方案中，所述移植是胰岛移植。根据第八方面，提供了降低与移植相关的免疫抑制疗法的水平的方法，其包括给予有需要的个体治疗有效量的硫酸乙酰肝素。在一实 施方案中，所述移植是胰岛移植。根据第九方面，提供了维持内源性硫酸乙酰肝素的方法，其包括给予个体治疗有效量的硫酸乙酰肝素。在一实施方案中，所述方法还包括给予活性氧清除剂与硫酸乙酰肝素的组合。活性氧清除剂可以选自褪黑激素、维生素E、维生素C、蛋氨酸、牛磺酸、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)、L-麦角硫因N-乙酰半胱氨酸(NAC)、维生素Α、β胡萝卜素、视黄醇、儿茶素、表儿茶素、表没食子儿茶素-3-没食子酸酯、类黄酮、L-麦角硫因、艾地苯醌、硒、血红素加氧酶I、还原型谷胱甘肽(GSH)、白藜芦醇、钛试剂(4，5- 二羟基-1，3-苯二磺酸)、Tempol (4-羟基-2，2，6，6-四甲基哌啶_1_氧基)、二甲基硫脲(DMTU)和丁基羟基苯甲醚(BHA)。根据第十方面，提供了硫酸乙酰肝素在制备用于维持β细胞功能的药物中的用途。根据第十一方面，提供了硫酸乙酰肝素在制备用于治疗糖尿病的药物中的用途。在一实施方案中，糖尿病是I型或II型糖尿病。根据第十二方面，提供了硫酸乙酰肝素在制备用于治疗移植排斥的药物中的用途。在一实施方案中，移植是胰岛移植。根据第十三方面，提供了硫酸乙酰肝素在制备用于抑制个体中移植排斥的药物中的用途。根据第十四方面，提供了硫酸乙酰肝素在制备用于降低与移植相关的免疫抑制疗法的水平的药物中的用途。在一实施方案中，所述药物还包含活性氧清除剂与硫酸乙酰肝素的组合。活性氧清除剂可以选自褪黑激素、维生素Ε、维生素C、蛋氨酸、牛磺酸、超氧化物歧化酶(S0D)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)、L-麦角硫因N-乙酰半胱氨酸(NAC)、维生素Α、β胡萝卜素、视黄醇、儿茶素、表儿茶素、表没食子儿茶素-3-没食子酸酯、类黄酮、L-麦角硫因、艾地苯醌、硒、血红素加氧酶I、还原型谷胱甘肽(GSH)、白藜芦醇、钛试剂(4，5-二轻基-I, 3-苯二磺酸)、Tempol (4-轻基-2，2, 6, 6-四甲基哌唳-I-氧基)、二甲基硫脲(DMTU)和丁基羟基苯甲醚(BHA)。硫酸乙酰肝素可以是硫酸麦芽六糖。硫酸乙酰肝素可以被共价连接于分子上，以提高所述硫酸乙酰肝素的半衰期。共价连接的硫酸乙酰肝素可以是PEG化的。共价连接的硫酸乙酰肝素可以是过氧化作用-乙二醇分裂(3kDa)肝素。根据第十五方面，提供了用于抑制胰岛β细胞氧化损伤的硫酸乙酰肝素。 根据第十六方面，提供了用于治疗糖尿病的硫酸乙酰肝素。在一实施方案中，糖尿病是I型或II型糖尿病。根据第十七方面，提供了用于维持β细胞功能的硫酸乙酰肝素。根据第十八方面，提供了用于抑制个体中移植排斥的硫酸乙酰肝素。根据第十九方面，提供了硫酸乙酰肝素，其用于通过在移植入患者之前，用硫酸乙酰肝素预处理胰岛而在分离的胰岛中维持β细胞功能。附图简要说明现在，仅通过举例的方式，并参照附图来描述本发明优选的实施方案，其中图I显示了非糖尿病(a)小鼠和(b)人胰腺原位胰岛的胰岛细胞团中硫酸乙酰肝素的阿尔新蓝染色。图2显示了非糖尿病小鼠胰腺原位胰岛中硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(a)XVIII型胶原蛋白和(b)黏结蛋白聚糖I的免疫组化染色。(c)硫酸乙酰肝素的免疫组化染色证实了用阿尔新蓝组织化学所观察到的这种黏多糖的局部化。图3通过阿尔新蓝染色显示了(a) db杂合(正常表型)和(b) II型糖尿病db纯合小鼠胰腺胰岛中硫酸乙酰肝素的局部化。
图4显示了在不存在(对照)或存在50 μ g/ml肝素、高硫酸化硫酸乙酰肝素(HShi)或HS-模拟物PI-88的情况下培养2天之后，分离的BALB/c β细胞活力的流式细胞术分析。活力通过Sytox green摄取或Calcein-AM(活细胞和早期凋亡细胞)和碘化丙唳(PI ;死细胞和凋亡细胞)摄取(下图)来评价。上图所示的计数珠(CB)在染色和FACS分析之前添加到样品中，以确定染色的β细胞数。图5显示了肝素、HShi和ΡΙ-88能够保护胰岛β细胞免于培养诱导的细胞死亡。利用Sytox green染色的流式细胞术分析显示,肝素、HShl和PI-88对β细胞活力的保护作用是剂量依赖的。与HShi和？1-88相反，在培养的2天过程中，5 μ g/ml的肝素保持β细胞存活。图6显示了与肝素或高硫酸化HS的共培养保护分离的胰岛β细胞免于培养诱导的细胞死亡。来自图4(上图)的2天对照培养以及2天含有SOyg/mL肝素、HShi*PI-88的培养中β细胞的绝对数量和死β细胞的数量，β细胞的数量通过在染色和流式细胞术分析之前向样品添加计数珠(在图4上图的上部显示为CB)来计算。图7显示了与高硫酸化HS而不是低硫酸化HS的共培养，保护分离的胰岛β细胞免于培养诱导的细胞死亡。比较HShi (50 μ g/ml)和低硫酸化HSOlS' 50 μ g/ml)保护β细胞免于2天培养诱导的细胞死亡的能力，通过Sytox green摄取(上图)来显示。下图描述了培养的胰岛细胞的不同制剂的细胞内胰岛素含量(绿色柱状图)。还显示了血清对照(红色柱状图)和胰岛细胞自发荧光(黑色柱状图)。85-88%的培养的胰岛细胞是胰岛素+ β细胞。图8显示了来自牛肺和猪肠粘膜的肝素保护胰岛β细胞免于培养诱导的细胞死亡。(A)猪肠粘膜(Pore Int Muc)肝素与牛肺(Bov Lung)肝素在保护β细胞免于在培养2天之后的培养诱导的细胞死亡方面同样有效。活力通过Sytox green摄取(上图)或Calcein-AM(活细胞和早期凋亡细胞)和PI (死细胞和凋亡细胞)摄取(下图)来评价。Sytox green染色的点图上部的无界区域代表在染色和流式细胞术分析之前添加到细胞中的计数珠(CB)。(B)在存在或不存在牛肺肝素(50 μ g/ml)的情况下培养I小时、I天或2天之后，β细胞的绝对数量和死β细胞的数量的时间过程。利用图4(上图)所示的计数珠计算细胞数。图9显示了胰岛β细胞对FITC-肝素的摄取。(A)小鼠β细胞与FITC标记的肝素(50yg/ml)培养2天的共聚焦显微镜分析表明，细胞内大量摄取FITC-肝素。(B)来自A的β细胞的流式细胞术分析显示，89%的β细胞摄取FITC-肝素，其中有86%培养的β细胞是FITC-肝素+ΡΓ，这表明FITC-肝素保护β细胞免于培养诱导的细胞死亡。
图10通过新鲜分离的BALB/c β细胞(第O天)的Sytox green免疫突光染色显示了，它们对过氧化氢诱导的死亡是敏感的(在第O天对照中的59. 5%的细胞死亡对第O天时过氧化氢处理之后的96. 1%的细胞死亡)。β细胞与肝素(50 μ g/ml)的共培养保护β细胞免于培养中的死亡(对照72. 5%死亡对处理的细胞培养物中的5. 3%)以及随后的过氧化氢处理的死亡(5. 0%细胞死亡)。图11显示了高硫酸化HS (HShi)和ΡΙ-88保护胰岛β细胞免于ROS介导的细胞死亡。(A)与对照培养物相比，当与HShi (50 μ g/ml)而不是与HS1。(50 μ g/ml)培养2天之后，小鼠β细胞被保护免于培养诱导的和过氧化氢(ROS)介导的细胞死亡。注意93%的β细胞在培养之前被H2O2处理杀死(数据未显示)。(B)将β细胞与ΡΙ-88 (50 μ g/ml)培养2天也保护β细胞免于培养诱导的和ROS介导的细胞死亡。
图12通过阿尔新蓝染色显示了，与小鼠胰腺原位胰岛相比，其对硫酸乙酰肝素强烈染色(a)，新鲜分离的胰岛表现出其硫酸乙酰肝素的大量丧失(b)。事实上，下图显示了BALB/c原位胰岛(n=50)中阿尔新蓝胰岛内染色的面积显著高于分离的胰岛(n=45)，如通过具有Color Deconvolutionplugin的Image J软件来定量的(Ρ〈0· 0001,和曼-怀二氏检验)。图13通过阿尔新蓝组织化学显示了在移植后3天时，硫酸乙酰肝素在分离胰岛移植物中弱的局部化(a)。到第7天时(b)，植入的胰岛显示出其胰岛内硫酸乙酰肝素的重建。图14显示了分离的β细胞的胰岛素含量的流式细胞术分析表明，与对照β细胞(a)相比，如果细胞是从在存在50μ g/ml肝素的情况下分离的胰岛制备的，β细胞的胰岛素含量显著增加(b)。图15显示了用硫酸乙酰肝素模拟物(过氧化作用-乙二醇分裂(3kDa)肝素衍生物；3x40mg/kg/天)经腹膜内处理接受者四氧嘧啶诱导的糖尿病C57BL/6J小鼠(H_2b)将CBA(H-2k)胰岛异体移植物的存活和功能延长至15天(a)。相比之下，盐水处理的对照接受者到第9天就表现出胰岛异体移植物存活和功能的丧失。蓝色有点的柱代表健康小鼠的正常血糖范围。用硫酸乙酰肝素模拟物的处理因而代表了新的抗排斥疗法。图16通过阿尔新蓝染色显示了，与盐水处理的对照小鼠(其在存在破坏性胰岛炎的情况下显示出胰岛硫酸乙酰肝素的大量丧失)相比，用硫酸乙酰肝素模拟物PI-88 (10mg/kg/天，腹膜内)处理前驱糖尿病NOD小鼠恢复了具有破坏性胰岛炎的胰岛中的硫酸乙酰肝素含量。定义本文使用的某些术语具有下文列出的含义。本文所用的术语“包含(comprising)”表示“主要包括但并非唯一包括”。此外，术语“包含(comprising) ”的变型,例如“包含(comprise) ”和“包含(comprises) ”具有相对应的不同的含义。除非上下文要求并非如此或明确指出相反，本文以单数整数、步骤或元件记载的整数、步骤或元件明确包括所记载的整数、步骤或元件的单数和复数形式。
本文所用的术语“治疗(treating) ”和“治疗(treatment) ”是指治疗疾病状态或症状、预防疾病状态或疾病建立、或其它无论以任何方式预防、阻碍、延迟或逆转疾病状态或疾病或其它不希望的症状的进程的任何和所有用途。在本说明书的上下文中，术语“治疗有效量的”在其含义内包括足量但并非毒性量的本发明的化合物或组合物，从而提供期望的效果。所需的精确量随个体而不同，这取决于这样的因素，诸如期望的效果、 待治疗的物种、个体的年龄和一般状况、待治疗的疾病状态的严重程度、给予的具体药剂、给药方式等。因此，指定精确的“治疗有效量”是不可能的。然而，对于任何给定的病例，合适的“治疗有效量”可以由所述技术领域技术人员仅利用常规实验来确定。本文所用的术语“活性氧”或” R0S”是指由氧的不完全的单电子还原所形成的分子或离子。这些活性氧包括单线态氧、超氧化物、过氧化物、羟基基团、一氧化氮和次氯酸。本文所用的术语“硫酸乙酰肝素”是指硫酸乙酰肝素和能够模拟硫酸乙酰肝素的至少一种生物功能的分子。本文所用的术语“烷基”在其含义内包括单价直链或支链饱和烃基基团，其具有I至10个碳原子，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个碳原子。例如，术语烷基包括但不限于，甲基、乙基、I-丙基、异丙基、I-丁基、2-丁基、异丁基、四丁基、戊基(amyl)、1，2-二甲丙基、1，I-二甲丙基、戊基(pentyl)、异戊基、己基、4-甲基戊基、I-甲基戊基、2-甲基戊基、3-甲基戍基、2，2- _■甲基丁基、3，3- _■甲基丁基、1，2- _■甲基丁基、1，3- _■甲基丁基、1，2, 2- 二甲基丙基、1，1,2-三甲基丙基、2-乙基戊基、3-乙基戊基、庚基、I-甲基己基、2，2-二甲基戊基、3，3- 二甲基戊基、4，4- 二甲基戊基、1，2- 二甲基戊基、1，3- 二甲基戊基、1，4- 二甲基戊基、1，2，3-三甲基丁基、1，I, 2-三甲基丁基、1，I, 3-三甲基丁基、5-甲基庚基、I-甲基庚基、辛基、壬基、癸基等。本文所用的术语“亚烷基”在其含义内包括二价直链或支链饱和烃基基团，其具有I至10个碳原子。本文所用的术语“烯基”在其含义内包括具有至少一个双键的单价直链或支链烃基基团，其具有2至10个碳原子，例如，2、3、4、5、6、7、8、9或10个碳原子。例如，术语烯基包括但不限于乙烯基、丙烯基、2-甲基丁烯基和己烯基。本文所用的术语“烷氧基”是指O-烷基，其中烷基如上文定义。本文所用的术语“卤代”在其含义内包括氟代、氯代、溴代和碘代。本文所用的术语“芳基”或” Ar”在其含义内包括单价、单个、多核、缀合和融合的芳香烃基团，例如苯基、萘基、蒽基、芘基、菲基。本文所用的术语“杂芳基”在其含义内包括具有1-15个碳的单价、单个、多核、缀合和融合的芳香基团，其中1-6个原子是选自0、N和S的杂原子。本文所用的术语“亚芳基”在其含义内包括二价、单个、多核、缀合和融合的芳香烃基团。本文所用的术语“环醇”在其含义内包括在三个或更多个环原子的每个之上含有
一个羟基基团的环烷。本文所用的术语“假糖”在其含义内包括其中一个或多个“糖”单元不包含氧原子
的单糖、二糖或寡糖。
在本说明书的上下文中，“低分子量阴离子聚糖模拟物”是指分子量小于约5kDa的糖或糖模拟物或类似物或糖类化合物。在本说明书的上下文中，术语“开环单糖”、“开环二糖”和“开环寡糖”指各自这样的糖分子，其中至少一个环以开链形式存在。“开环”化合物例如可以是醛醇或乙二醇分裂，或例如由本领域内已知 的反应如硼氢化钠还原所产生的所述单糖、二糖或寡糖完全或部分氧化和/或还原的任何其它产物。详细描述首先应当理解，本文所提供的附图和实施例是为了举例，而并非限制本发明及其各个实施方案。根据本发明，提供了抑制胰岛β细胞氧化损伤的方法。本发明还提供了用于治疗I型和II型糖尿病，分离胰岛以及治疗和/或预防移植后胰岛排斥的组合物和方法。所述方法通常包括使用包含硫酸乙酰肝素的组合物。所述方法还包括使用包含硫酸乙酰肝素与至少一种活性氧清除剂的组合物。I型和II型糖尿病具有共同的病理学特征，即通过朗格汉斯胰岛β细胞的胰岛素产生受损。就I型糖尿病而言，胰岛β细胞由于对胰岛自身抗原的自身免疫应答而被免疫系统损伤。相比之下，在II型糖尿病中，尽管胰岛β细胞是存活的，但是它们不能产生足以补偿外周组织“胰岛素抵抗”的胰岛素。通常，II型糖尿病与肥胖相关。奇怪的是仅有少数肥胖个体患有糖尿病。如本文所描述的，在小鼠和人类中，胰岛含有高水平的黏多糖硫酸乙酰肝素(图I)以及大量的胶原蛋白XVIII和黏结蛋白聚糖I(Syndecan-I)(图2a和2b)，所述胶原蛋白XVIII和黏结蛋白聚糖I是公知的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的核心蛋白。这种高水平的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖表达通常限制于基膜处，并且通常并不是存在于整个组织中。此外，胰岛硫酸乙酰肝素包含在β细胞自身中，而不是被表达在β细胞表面上以及处于细胞外基质中，这是这些分子的正常位置。这些观察结果出人意料地揭示，硫酸乙酰肝素在β细胞功能中起作用。研究糖尿病有用的动物模型是db/db小鼠，这是一种自发患有II型糖尿病的肥胖小鼠品系。来自糖尿病db/db小鼠的胰岛相比来自非糖尿病db杂合小鼠的胰岛含有较少的硫酸乙酰肝素(图3)。在I型糖尿病胰岛的自身免疫性损伤过程中，发生胰岛硫酸乙酰肝素的显著减少，这被认为是由白细胞衍生的内切糖苷酶即肝素酶介导的过程(W0 2008/046162)。肝素酶抑制剂的给药在非肥胖糖尿病(NOD)小鼠中显著降低I型糖尿病的发病率。总之，这些数据出人意料地表明I型和II型糖尿病之间共同的联系，其中胰岛硫酸乙酰肝素的损失与疾病进程相关。硫酸乙酰肝素保护胰岛β细胞免于活性氧诱导的细胞死亡对硫酸乙酰肝素与疾病进程相关这一概念的进一步的支持获自分离的胰岛β细胞的培养物(图4-9，表I)，其表明，在胰岛分离步骤(胶原酶消化和人工挑选)(图12)中胰岛相关的硫酸乙酰肝素的损失导致β细胞存活显著减少，以及通过提供外源性高硫酸化的硫酸乙酰肝素或一些硫酸乙酰肝素衍生物和模拟物，例如不同来源的肝素(图8)、乙二醇分裂肝素和硫酸化寡糖(例如ΡΙ-88)(图4-7以及9，表3)，可以挽救β细胞免于在培养过程中死亡。
细胞代谢与活性氧(ROS)的产生相关，活性氧诱导对细胞、蛋白和核酸的氧化损伤，这可能最终会导致细胞死亡。因此，ROS作为信号转导分子对促进疾病起一定作用。ROS的生成还与氧化应激、凋亡和坏死性细胞死亡相关。就移植而言，移植的胰岛中的细胞死亡在胰岛移植中具有不利后果。活性氧(ROS)包括例如超氧自由基、羟基自由基、一氧化氮、臭氧、含硫自由基和碳中心自由基(例如，三氯甲基自由基)。1^如!1202、02_、· OH和NO具有有害作用，包括通过特定酶的辅助因子的氧化而导致该酶失活、脂质中多不饱和脂肪酸的氧化、蛋白内氨基酸的氧化以及DNA损伤。如实施例4、图10和11以及表2和3中所示，添加肝素、高硫酸化硫酸乙酰肝素、硫酸化寡糖(例如，PI-88)、肝素衍生物以及硫酸化多糖减弱了 H2O2诱导的胰岛细胞死亡。因此，可以看出，硫酸乙酰肝素或硫酸乙酰肝素模拟物单独或与已知的ROS清除剂联合保护胰岛β细胞免于活性氧(ROS)诱导的细胞死亡。还应当注意，一些硫酸乙酰肝素模拟物具有肝素酶抑制活性，但是肝素酶抑制对硫酸乙酰肝素的结构要求与维持β细胞活力并诱导ROS抗性所需要的结构要求完全不同(表3)。 在用于移植的胰岛制备过程中发生硫酸乙酰肝素的消耗胰岛移植是治疗动物和患者I型糖尿病中建立良好的治疗方法。然而，如果要产生成功的移植，重获全功能性胰岛是至关重要的，而不管与接受者对异体移植物免疫应答相关的问题。基于本文所述的数据，胰岛分离过程中胰岛内硫酸乙酰肝素的维持在确保保持正常的胰岛功能中是至关重要的因素。事实上，分离后小鼠胰岛的检测表明，当与胰腺内原位胰岛相比(图12a和柱状图)，它们大幅且显著Γ60%)消耗了硫酸乙酰肝素(Ρ<0. 0001,图12b和柱状图)。事实上，同系移植之后，胰岛内硫酸乙酰肝素在移植3天之后仍被消耗，但在移植后7天回到正常水平(图13)。此外，胰岛分离介质中含有肝素导致分离的胰岛几乎含有2倍多的胰岛素含量(图14)。因此，胰岛分离过程中的硫酸乙酰肝素替代确实似乎保存了胰岛β细胞的功能活性，这表明处理改善了 β细胞的功能状态。此外，从用自由基化学清除剂丁基羟基苯甲醚(BHA;120mg/kg i. p.)预处理的小鼠供体制备并在化学自由基清除剂二甲基硫脲(DMTU;50raM)存在下的体外分离的胰岛表明，硫酸乙酰肝素的阿尔新蓝染色增强。这些观察结果表明，硫酸乙酰肝素和自由基清除剂的联合能够用来在胰岛分离过程中保存β细胞的硫酸乙酰肝素。硫酸乙酰肝素替代疗法将硫酸乙酰肝素模拟物给予胰岛异体移植接受者预期能保持β细胞的功能和/或延长异体移植物的存活期。肝素的抗凝血活性妨碍其在体内长时间使用，但是获得具有较小的抗凝血活性并且具有胰岛保护特性的肝素衍生物是有可能的，例如，过氧化作用-乙二醇分裂(3kDa)肝素和其它肝素衍生物(表3)。的确，在实验诱导的糖尿病小鼠中，用过氧化作用-乙二醇分裂(3kDa)肝素处理小鼠防止胰岛异体移植的急性排斥，延长移植物功能并在接受者中重建正常血糖量(图15)。与对照(盐水处理的前驱糖尿病NOD小鼠)相比，接受用硫酸乙酰肝素模拟物PI-88延时处理的前驱糖尿病NOD小鼠维持胰岛内硫酸乙酰肝素。例如，图16显示了明确的证据，与胰岛内硫酸乙酰肝素大量存在的PI-88处理的小鼠相比，对照小鼠中胰岛内硫酸乙酰肝素显著降低(大约5倍)。
虽然不受任何理论的限制，但是假定这通过直接替代丧失的硫酸乙酰肝素而发生。因此，给予硫酸乙酰肝素或硫酸乙酰肝素模拟物可以导致胰岛内硫酸乙酰肝素的维持。本文所述的实验数据表明，胰岛内硫酸乙酰肝素对于胰岛β细胞的功能和存活是必需的。虽然不受任何理论的限制，但这可能发生的一种机制是通过保护β细胞免受自由基损伤。例如，硫酸乙酰肝素可以充当活性氧的’水槽(sink)’或在保护β细胞中起间接作用。通过I型糖尿病中肝素酶的作用免疫介导的或者由II型糖尿病中代谢应激所诱导的胰岛硫酸乙酰肝素丧失是连接两种类型的糖尿病的共有因素。因此，利用硫酸乙酰肝素模拟物或衍生物的硫酸乙酰肝素替代疗法代表了对与硫酸乙酰肝素丧失相关的任何疾病的治疗，特别是I型和II型糖尿病。硫酸乙酰肝素模拟物 硫酸乙酰肝素是在大多数细胞表面作为蛋白聚糖表达的黏多糖，并且是哺乳动物细胞周围细胞外基质的成分。此外，为了提供结构完整性，硫酸乙酰肝素蛋白聚糖充当多种硫酸乙酰肝素(HS)结合蛋白的储存位点，包括生长因子和趋化因子。硫酸乙酰肝素的多糖成分由交替的葡萄糖醛酸和N-乙酰葡糖胺单元组成，其可以通过以下进行修饰Ν-乙酰葡糖胺残基在多个位置的O-硫酸化作用，N-脱乙酰作用和N-硫酸化作用以及葡萄糖醛酸通过C-5差向异构作用而成为艾杜糖醛酸。这种结构多样性通过黏多糖链长的变异而得到进一步增强。HS中差向异构化或硫酸化的二糖沿分子主链集中在“热点”中，并由低硫酸化的柔韧间隔物隔开，而不是在整个多糖链上均匀分布的。已知HS与大量功能不同的蛋白相互作用，例如生长因子、细胞因子、趋化因子、蛋白酶、脂肪酶和细胞粘附分子，并且可以调节HS结合蛋白的功能。硫酸乙酰肝素模拟物包括能执行硫酸乙酰肝素至少一种生物学功能的任何分子，包括上文提到的那些。还有几种硫酸乙酰肝素模拟物被分离或合成，它们在维持β细胞活力上非常有效，并且致使β细胞对活性氧(ROS)产生抗性(表3)。这些模拟物包括硫酸化寡糖如ΡΙ-88、硫酸麦芽六糖和硫酸麦芽五糖；乙二醇分裂的猪粘膜肝素和其它乙二醇分裂变体(即，N-去硫酸化的、N-重新乙酰化的、6-去硫酸化的)；通过过氧化作用产生的乙二醇分裂的低分子量肝素(3kDa);以及某些硫酸化多糖(即，硫酸葡萄糖和戊聚糖多硫酸酯)。本发明中所用的硫酸乙酰肝素模拟物选自聚糖模拟物、磺基甘露聚糖寡糖、硫酸化多糖、硫酸化寡糖、硫代磷酸寡脱氧核苷酸、硫酸化麦芽糖寡糖、磷酸磺基甘露聚糖、乙二醇分裂肝素、硫酸间隔的寡糖(sulfated spaced oligosaccharide)、硫酸连接的环醇、硫酸化糖氨基酸低聚体、假二糖、苏拉明和苏拉明类似物。硫酸化多糖选自肝素、λ-角叉菜聚糖、K-角叉菜聚糖、岩藻依聚糖、戊聚糖多硫酸酯、6-0-戊羧甲基几丁质III、硫酸海带多糖、螺旋藻含钙藻胶和硫酸葡聚糖。硫酸连接的环醇的实例可以选自式I和3所示的化合物。式2所示的化合物是制
备环醇的起始试剂。
权利要求
1.抑制个体中胰岛β细胞氧化损伤的方法，其包括给予所述个体治疗有效量的硫酸乙酰肝素。
2.抑制胰岛β细胞氧化损伤的方法，其包括将所述β细胞与硫酸乙酰肝素接触。
3.治疗糖尿病的方法，其包括给予有需要的个体治疗有效量的硫酸乙酰肝素。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述糖尿病是I型或II型糖尿病。
5.治疗自身免疫性疾病状态的方法，其包括给予有需要的个体治疗有效量的硫酸乙酰肝素。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述自身免疫性疾病状态可以选自I型糖尿病胰岛炎、胰岛移植排斥或其组合。
7.维持β细胞功能的方法，其包括给予有需要的个体治疗有效量的硫酸乙酰肝素。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述β细胞是移植的β细胞。
9.维持分离的胰岛中β细胞功能的方法，其包括在移植入患者中之前，用治疗有效量的硫酸乙酰肝素预处理所述胰岛。
10.治疗或预防移植排斥的方法，其包括给予有需要的个体治疗有效量的硫酸乙酰肝素。
11.降低与移植相关的免疫抑制疗法的水平的方法，其包括给予有需要的个体治疗有效量的硫酸乙酰肝素。
12.如权利要求10或11所述的方法，其中所述移植是胰岛移植。
13.维持内源性硫酸乙酰肝素的方法，其包括给予个体治疗有效量的硫酸乙酰肝素。
14.如权利要求1-13中任一项所述的方法，还包括给予活性氧清除剂与硫酸乙酰肝素的组合。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述活性氧清除剂选自褪黑激素、维生素Ε、维生素C、蛋氨酸、牛磺酸、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)、L-麦角硫因N-乙酰半胱氨酸(NAC)、维生素Α、β胡萝卜素、视黄醇、儿茶素、表儿茶素、表没食子儿茶素-3-没食子酸酯、类黄酮、L-麦角硫因、艾地苯醌、硒、血红素加氧酶I、还原型谷胱甘肽(GSH)、白藜芦醇、钛试剂(4，5- 二羟基-1，3-苯二磺酸)、Tempol (4-羟基-2，2，6，6-四甲基哌啶-I-氧基)、二甲基硫脲(DMTU)和丁基羟基苯甲醚(BHA)。
16.硫酸乙酰肝素在制备用于维持β细胞功能的药物中的用途。
17.硫酸乙酰肝素在制备用于治疗糖尿病的药物中的用途。
18.如权利要求16所述的用途，其中所述糖尿病是I型或II型糖尿病。
19.硫酸乙酰肝素在制备用于治疗移植排斥的药物中的用途。
20.硫酸乙酰肝素在制备用于抑制个体中移植排斥的药物中的用途。
21.硫酸乙酰肝素在制备用于降低与移植相关的免疫抑制疗法的水平的药物中的用途。
22.如权利要求19-21中任一项所述的用途，其中所述移植是胰岛移植。
23.如权利要求16-22中任一项所述的用途，还包括活性氧清除剂联合硫酸乙酰肝素在制备药物中的用途。
24.如权利要求23所述的用途，其中所述活性氧清除剂选自褪黑激素、维生素Ε、维生素C、蛋氨酸、牛磺酸、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)、L-麦角硫因N-乙酰半胱氨酸(NAC)、维生素Α、β胡萝卜素、视黄醇、儿茶素、表儿茶素、表没食子儿茶素-3-没食子酸酯、类黄酮、L-麦角硫因、艾地苯醌、硒、血红素加氧酶I、还原型谷胱甘肽(GSH)、白藜芦醇、钛试剂(4，5- 二羟基-1，3-苯二磺酸)、Tempol (4-羟基-2，2，6，6-四甲基哌啶-I-氧基)、二甲基硫脲(DMTU)和丁基羟基苯甲醚(BHA)。
25.如权利要求1-15中任一项所述的方法或权利要求16-24中任一项所述的用途,其中所述硫酸乙酰肝素是硫酸麦芽六糖。
26.如权利要求1-15中任一项所述的方法或权利要求16-24中任一项所述的用途，其中所述硫酸乙酰肝素被共价连接于分子上，以提高所述硫酸乙酰肝素的半衰期。
27.如权利要求26所述的方法或用途，其中所述共价连接的硫酸乙酰肝素是PEG化的。
28.如权利要求26所述的方法或用途，其中所述共价连接的硫酸乙酰肝素是过氧化作用-乙二醇分裂(3kDa)肝素。
全文摘要
本发明涉及在个体体内抑制胰岛β细胞氧化损伤的方法，所述方法通过给予个体治疗有效量的能够保护胰岛β细胞免受活性氧的硫酸乙酰肝素，或者涉及在体外抑制胰岛β细胞氧化损伤的方法，所述方法通过在移植之前将分离的胰岛β细胞暴露于保护它们免受活性氧的浓度的硫酸乙酰肝素。
文档编号A61K31/737GK102917711SQ201180023194
公开日2013年2月6日 申请日期2011年3月11日 优先权日2010年3月12日
发明者克里斯托弗·理查德·帕里什, 查梅尼·西米恩维克, 克雷格·杰弗里·弗里曼 申请人:澳大利亚国立大学