再生性组织支架的制备的制作方法

专利名称：再生性组织支架的制备的制作方法
再生性组织支架的制备本申请要求于2010年3月25日提交的美国临时专利申请号61/317，443的优先权。本披露涉及用于治疗组织或器官缺损或损伤的装置和方法，包括用于治疗组织缺损的组织支架。人的、动物的、以及合成的材料当前被用于增进组织修复或矫正组织缺损的医疗和外科手术中。为了某些目的，需要具有稳定的预成型形状的材料。例如，对于某些骨缺损和软组织缺损，稳定的三维结构装置对于符合缺损部位以及允许具有所希望的结构的组织的再生是必需的。然而，用于修复或矫正组织或器官缺损的各种装置和方法已经具有某些缺点。因此，对于用于医学应用的具有更好稳定性的改进的装置存在着需要。在某些实施方案中，提供了一种用于制造组织支架的方法。该方法包括将一种聚合物溶解在一种溶剂中以制成一种溶液；将该溶液与一种颗粒状脱细胞组织基质(ATM)混合以产生一种混合物；将该混合物放入一个模具；将该混合物干燥以形成一种具有稳定的三维形状的组织支架，其中该组织支架当植入人体中时相比于单独的该聚合物具有降低的免疫或炎症应答。在某些实施方案中，提供了一种组织支架。该组织支架包括一种颗粒状ATM和一种聚合物，其中该ATM被包裹在该聚合物中以形成一种用于组织再生的稳定的三维组织支架，并且其中当该组织支架在植入人体中时相比于单独的该聚合物具有降低的免疫或炎症应答。在某些实施方案中，提供了一种用于治疗一种组织缺损的方法。该方法包括选择一种具有稳定的三维形状的组织支架`，该支架包括一种颗粒状ATM ;以及一种聚合物，其中该ATM被包裹在该聚合物中以形成一种用于组织再生的稳定的三维组织支架；识别在一种组织或器官中的一种缺损；以及在该缺损中植入该组织支架。
附图简要说明

图1展示了根据某些实施方案的一种组织支架在一个缺损中的植入。图2是显示了根据某些实施方案的一种组织支架的生产工艺的流程图。图3是根据实例2的用有机溶剂处理的猪脱细胞真皮基质(pADM)的差式扫描量热法(DSC)数据的曲线图。图4是根据实例2的在聚合物存在下pADM的DSC数据的曲线图。图5A是根据在实例2中所述的方法在100X放大倍数下的苏木精伊红染色四周的包含聚-4-羧基丁酸酯(P4HB)的皮下外植体。图5B是根据在实例2中所述的方法在100X放大倍数下的苏木精伊红染色四周的包含pADM和P4HB的皮下外植体。图5C是根据在实例2中所述的方法在400X放大倍数下的苏木精伊红染色四周的包含P4HB的皮下外植体。图是根据在实例2中所述的方法在400X放大倍数下的苏木精伊红染色四周的包含pADM和P4HB的皮下外植体。图6A是根据在实例2中所述的方法在100X放大倍数下的苏木精伊红染色十二周的包含P4HB的皮下外植体。图6B是根据在实例2中所述的方法在100X放大倍数下的苏木精伊红染色十二周的包含PADM和P4HB的皮下外植体。图6C是根据在实例2中所述的方法在400X放大倍数下的苏木精伊红染色十二周的包含P4HB的皮下外植体。图6D是根据在实例2中所述的方法在400X放大倍数下的苏木精伊红染色十二周的包含PADM和P4HB的皮下外植体。图7A是根据在实例2中所述的方法在100X放大倍数下的苏木精伊红染色四周的包含聚己内酯(PCL)的皮下外植体。图7B是根据在实例2所述的方法在100X放大倍数下的苏木精伊红染色四周的包含pADM和PCL的皮下外植体。图7C是根据在实例 2中所述的方法在400X放大倍数下的苏木精伊红染色四周的包含PCL的皮下外植体。图7D是根据在实例2中所述的方法在400X放大倍数下的苏木精伊红染色四周的包含pADM和PCL的皮下外植体。图8A是根据在实例2中所述的方法在100X放大倍数下的苏木精伊红染色十二周的包含PCL的皮下外植体。图8B是根据在实例2中所述的方法在100X放大倍数下的苏木精伊红染色十二周的包含PADM和PCL的皮下外植体。图8C是根据在实例2中所述的方法在400X放大倍数下的苏木精伊红染色十二周的包含PCL的皮下外植体。图8D是根据在实例2中所述的方法在400X放大倍数下的苏木精伊红染色十二周的包含PADM和PCL的皮下外植体。图9A是根据在实例2中所述的方法在100X放大倍数下的苏木精伊红染色四周的包含透明质酸苄酯(BHA)的皮下外植体。图9B是根据在实例2中所述的方法在100X放大倍数下的苏木精伊红染色四周的包含pADM和BHA的皮下外植体。图9C是根据在实例2中所述的方法在400X放大倍数下的苏木精伊红染色四周的包含BHA的皮下外植体。图9D是根据在实例2中所述的方法在400X放大倍数下的苏木精伊红染色四周的包含pADM和BHA的皮下外植体。图1OA是根据在实例2中所述的方法在100 X放大倍数下的苏木精伊红染色十二周的包含BHA的皮下外植体。图1OB是根据在实例2中所述的方法在100 X放大倍数下的苏木精伊红染色十二周的包含PADM和BHA的皮下外植体。图1OC是根据在实例2中所述的方法在400 X放大倍数下的苏木精伊红染色十二周的包含BHA的皮下外植体。
图1OD是根据在实例2中所述的方法在400 X放大倍数下的苏木精伊红染色十二周的包含PADM和BHA的皮下外植体。图1lA是根据在实例2中所述的方法在100X放大倍数下的苏木精伊红染色四周的包含壳聚糖和pADM的皮下外植体。图1lB是根据在实例2中所述的方法在100X放大倍数下的苏木精伊红染色八周的包含壳聚糖和pADM的皮下外植体。图1lC是根据在实例2中所述的方法在400X放大倍数下的苏木精伊红染色四周的包含壳聚糖和pADM的皮下外植体。图1lD是根 据在实例2中所述的方法在400X放大倍数下的苏木精伊红染色八周的包含壳聚糖和pADM的皮下外植体。
示例性实施方案的说明在本申请中，单数的使用包括复数，除非另外特别说明。在本申请中，“或”(“or”)的使用表示“和/或”(“and/or”)，除非另外说明。此外，术语“包括”(“including”)，以及其他术语，如“包括”(“includes”)以及“包括”(“included”)的使用，是非限制性的。在此使用的节标题仅是为了组织目的并且不应该被解释为对所述主题的限制。在本申请中所引用的所有文件、或文件的部分(包括但不限于专利、专利申请、文章、书籍、以及论文)出于任何目的特此通过引用以其全文清楚地结合。应当理解的是，以上说明的益处和优点可以涉及一个实施方案或可以涉及若干实施方案。应当进一步理解的是，提及“一个/ 一种”元件指的是这些元件的一个/ 一种或多个/多种。在此所述的方法的步骤可以按任何适合的顺序进行，或在适当情况下同时进行。在适当情况下，任何以上所述的实施方案的方面可以与任何所述的其他实施方案的方面相组合，从而形成具有可比较的特性或不同特性的并且着手解决同样或不同问题的其他实例。应当理解的是，以上优选实施方案的说明仅仅是通过举例而给出的，并且本领域的技术人员可以作出不同的修改。以上说明书、实例以及数据提供了本发明的示例性实施方案的结构和用途的完整说明。虽然以一定的详细程度或参考一个或多个单独的实施方案已经说明了本发明的不同实施方案，本领域的技术人员能够针对所披露的实施方案做出许多变更，而不背离本发明的范围。如在此使用的术语“脱细胞组织基质”通常是指基本上没有细胞和/或细胞组分的任何组织基质。皮肤、皮肤的部分(如真皮)、以及其他组织如血管、心脏瓣膜、筋膜、软骨、骨、以及神经结缔组织，可以用来产生在本披露的范围之内的脱细胞基质。可以通过许多方式测试或评估脱细胞基质以确定它们是否基本上没有细胞和/或细胞组分。例如，可以用光学显微镜来检查处理的组织以确定是否残留有细胞(活的或死的)和/或细胞组分。另夕卜，可以使用某些分析来鉴定细胞或细胞组分的存在。例如，可以使用DNA或其他核酸分析对在这些组织基质之内的残余核酸物质定量。通常，残余DNA或其他核酸的缺乏将指示完全脱细胞(即去除了细胞和/或细胞组分)。最后，可以使用其他鉴定细胞特异性组分(如表面抗原)的分析来确定这些组织基质是否无细胞。本披露提供了用来治疗在组织或器官中的缺损的三维组织支架。这些组织支架可以包括一种具有用来支持组织再生的生物学能力的ATM。在一些实施方案中，这些组织支架可以支持细胞向内生长和分化。例如，该支架可被用于组织向内生长、矫形外科、牙周应用、组织重塑、组织恢复、整形外科、整容外科、以及如乳房肿瘤切除术(lumpectomy)、腮腺切除术、或肿瘤切除中的缺失组织的代替，如以下进一步所述。在一个实施方案中，正如成纤维细胞样细胞和血管的存在所证明的，这些组织支架产生了一种再生性组织反应。另外，这些组织支架可以包括一种或多种聚合物材料，如以下进一步所述。在某些实施方案中，本披露的这些组织支架可以通过弱化或降低免疫或炎症应答来增加该聚合物组分的可接受性。如在此所使用的，这些聚合物组分可以包括合成聚合物和/或天然存在的聚合物。在某些实施方案中，这些组织支架中的聚合物材料可以为ATM提供一种稳定的三维结构，这增加了植入物的整合性和生物相容性。如在此所使用的，该稳定的三维结构将被理解为是指一种当在静止状态时倾向于保持一种预定形状(例如成形为与一个植入部位一致)的材料。在不同的实施方案中，本披露的这些组织支架可以用于在很多不同解剖部位上的治疗。根据不同的实施方案，这些组织支架可以用于一系列广泛的应用中。某些示例性的应用包括，但不限于:吸收性敷料、真皮再生(例如用于治疗所有类型的溃疡和烧伤)、神经再生、软骨再生、结缔组织再生或修复(例如肌腱/韧带套)、骨再生、牙周应用、伤口 /泡沫衬料、整合的绷带敷料、用于皮肤移植物的基质或基底、血管再生、整容外科、金属和/或聚合物植入物的涂层(例如,增加植入物的整合性和生物相容性)、以及缺失组织的代替(如在创伤、乳房缩小术、乳房切除术、乳房肿瘤切除术、腮腺切除术、或肿瘤切除之后)。在一个实施方案中，使用了包含一种颗粒状无细胞组织基质(ATM)以及一种聚合物的组织支架；其中该ATM被包裹在该聚合物中以形成一种用于组织再生的稳定的三维组织支架，并且其中当该组织支架在植入人体中时相比于单独的该聚合物具有降低的免疫或炎症应答，用于至少一种以下用途:吸收性敷料、真皮再生、神经再生、软骨再生、结缔组织再生或修复、骨再生、牙周应用、伤口 /泡沫衬料、整合的绷带敷料、作为一种用于皮肤移植物的基质或基底、血管再生、整容外科、金属和/或聚合物植入物的涂层、以及缺失组织的代替。该组织支架当植入人体中`时相比于单独用来生产该支架的该聚合物或多种聚合物引出降低的免疫或炎症应答。在一些实施方案中，可以使用许多方法来检测该组织支架在宿主中的作用。在一些实施方案中，可以通过测量对该植入支架的免疫或炎症应答来检测该组织支架在宿主中的作用。在一些实施方案中，可以通过许多方法测量对该组织支架的免疫或炎症应答。在一些实施方案中，可以使用组织学方法测量该免疫或炎症应答。例如，外植支架可以染色并在显微镜下观察以用于组织学评估，如以下进一步所述。在一些实施方案中，可以通过测量炎症细胞(如白细胞)的数目证明对该支架的免疫或炎症应答。在一些实施方案中，可以通过减少的炎症细胞数目证明对该支架的弱化的免疫或炎症应答，如以下进一步所述。例如，可以通过被设计为识别淋巴细胞、巨噬细胞以及中性粒细胞的免疫组化染色方法来测量炎症细胞。免疫组化方法也可以用来确定炎症细胞因子(包括白细胞介素-1、肿瘤坏死因子-α (TNF-α )、以及转化生长因子-β (TGF-β))的存在。在一个实施方案中，提供了当被植入体内时降低一种聚合物材料的免疫应答的ATM的用途。该聚合物组织可以包括合成或天然存在的聚合物。
在一个实施方案中，提供了产生再生性组织反应的一种组织支架。该支架可以包括一种颗粒状脱细胞组织基质(ATM);以及一种聚合物；其中该ATM被包裹在该聚合物中以形成一种用于组织再生的稳定的三维组织支架，并且其中当该组织支架在植入人体中时相比于单独的该聚合物具有降低的免疫或炎症应答。通过成纤维细胞样细胞和血管的存在而证明该再生性组织反应。在不同的实施方案中，本披露的这些组织支架可以被用来治疗广泛的任何失调。组织缺损可起因于多样的医学病症，包括，例如先天畸形、跌打损伤、感染、以及肿瘤切除。因此，这些组织支架可以被用来修复任何软组织中的缺损，如，连接、支持、或围绕其他结构的组织以及身体器官。这些组织支架还可以用来治疗骨缺损，例如，作为一种关节移植物以支持软骨再生。软组织可以是任何非骨组织。这些组织支架可以被用来治疗许多不同器官系统中的软组织。这些器官系统可以包括，但不限于，肌肉系统、生殖泌尿系统、胃肠系统(gastroenterological system)、皮肤系统、循环系统、以及呼吸系统。这些组织支架对于胸部和腹壁的结缔组织(包括筋膜、一种围绕肌肉、骨以及关节的特殊层)的治疗，以及用于在泌尿学的、妇科学的以及肠胃病学的解剖学方面的组织薄弱的修复和增强也是有用的。在另一个实施方案中，该组织或器官缺损选自下组，该组由以下各项组成:皮肤、骨、软骨、半月板、真皮、心肌、骨膜、动脉、静脉、胃、小肠、大肠、膈、肌腱、韧带、神经组织、横纹肌、平滑肌、膀胱、尿道、输尿管、以及牙龈。在一个实施方案中，使用了包含一种颗粒状脱细胞组织基质(ATM)以及一种聚合物的组织支架；其中该ATM被包裹在该聚合物中以形成一种用于组织再生的稳定的三维组织支架，并且其中当该组织支架在植入人体中时相比于单独的该聚合物具有降低的免疫或炎症应答，用于再生、修复、和/或一种缺损的代替，这种缺损存在于皮肤、骨、软骨、半月板、真皮、心肌、骨膜、动脉、静脉、胃、小肠、大肠、膈、肌腱、韧带、神经组织、横纹肌、平滑肌、膀胱、尿道、输尿管、以及牙龈中的至少一种。例如，图1展示了根据某些实施方案的一种组织支架在软骨缺损中的植入。如图所示，一种组织支架180可以被用来治疗在一种长骨500 (如股骨或肱骨)中的软骨缺损。在不同的实施方案中，一种支架180可以被用来治疗任何关节的关节表面或软骨510。在不同的实施方案中，组织支架180可以置于关节表面或软骨510中的缺损或切除区中。正如前面提到的，组织支架180包含一种ATM和一种聚合物。在一些实施方案中，该ATM包含来自两种不同组织来源的组织，例如，软骨190和脱矿骨200。在一些实施方案中，组织支架180可以被用来修复其他组织或器官缺损。在一些实施方案中，组织支架180可以包括真皮和软骨。在一些实施方案中，该组织支架包括软骨190，不包括脱矿骨200。在一些实施方案中，组织支架180可以包括脱矿骨200，不包括软骨190。在一些实施方案中，组织支架180可以包括真皮。在某些实施方案中，一种制造组织支架的方法包括将一种聚合物溶解于一种溶液中；将该溶液与一种颗粒状ATM混合以形成一种混合物；将该混合物放入一种模具；并且通过去除该溶剂将该组织支架成型并且成形以形成一种稳定的三维结构。
图2展示了一种三维组织支架的制备。该支架可以包括一种ATM (步骤100)。在一些实施方案中，该ATM可衍生自，例如，真皮、软骨、骨、脱矿骨、血管、心脏瓣膜、筋膜、或神经结缔组织。在一些实施方案中，该颗粒状ATM包含大小均匀的颗粒。在一些实施方案中，该颗粒状ATM包含一种真皮ATM。在一些实施方案中，该真皮ATM是一种人组织基质。在一些实施方案中，该真皮ATM是一种猪组织基质。在一些实施方案中，该颗粒状ATM是一种可以衍生自人软骨的软骨组织基质。在一些实施方案中，该软骨组织基质衍生自猪软骨。在一些实施方案中，该颗粒状ATM包含一种骨组织基质。在一些实施方案中，该骨组织基质衍生自人骨。在一些实施方案中，该骨组织基质衍生自猪骨。可以选择该ATM以提供多种不同的生物学或力学性能。例如，可以选择该ATM以允许组织向内生长和重塑以便允许通常发现于基质植入部位处的组织的再生。例如，该ATM，当植在软骨上或内部时，可以被选择为允许没有过度纤维化或没有疤痕形成的软骨再生。另外，该ATM不应当引出一种过度的炎症反应，并且应当最终被重塑以产生与原始宿主组织相似的组织。在一些实施方案中，该ATM包含胶原、弹性蛋白、以及血管沟。在某些实施方案中，该ATM可以包括ALLODERMli'或Strattice ，分别为人和猪脱细胞真皮基质。
这样的材料的实例可以在美国专利号6，933，326和7，358，284中找到。可替代地，可以使用其他适合的脱细胞组织基质，如下进一步所述。可以通过低温球磨ATM制备一种颗粒状ATM (步骤110)。该颗粒状ATM可以衍生自许多不同的组织来源。 这些组织来源可以是，例如，真皮、软骨、骨、血管、心脏瓣膜、筋膜、以及神经结缔组织。将它们详细描述如下。在一些实施方案中，可以使用两种或更多种不同类型的组织来制备颗粒状ATM。另外，这些组织支架可包括一种或多种聚合物材料。在一些实施方案中，这些聚合物材料可以选自许多聚合物。在某些实施方案中，这些聚合物可以选自，例如，壳聚糖、透明质酸的苄酯(BHA)、聚己内酯(PCL)、或聚-4-羧基丁酸酯(P4HB)。在一些实施方案中，可以将该聚合物溶解于一种适合的溶剂中(步骤120)，该溶剂选自许多溶剂。在一些实施方案中，该溶剂可以选自，例如，二噁烷、N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)、DMSO或乙酸。在一个实施方案中，将PCL溶解于二噁烷中。在另一个实施方案中，在组织支架制备中所使用的在二噁烷或NMP溶剂中的PCL可以大约为5%-30% (w/v)。在一个另外的实施方案中，在组织支架制备中所使用的在二噁烷或NMP溶剂中的PCL可以大约为5%、8%、10%、12%、15%、18%、20%、25%、或30% (w/v)，5%至30% (w/v)、10%至30% (w/v)以及它们之间的任何值。在另一个实施方案中，将P4HB溶解于二噁烷或NMP中。在又另一个实施方案中，在组织支架的制备中所使用的在二噁烷或NMP溶剂中的P4HB可以大约为5%-40% (w/v)。在一个另外的实施方案中，在组织支架的制备中所使用的在二噁烷或NMP溶剂中的P4HB可以大约为5%、8%、10%、12%、15%、18%、20%、25%、30% 或 40% (w/v),或 5% 至 40% (w/v)、10% 至 30% (w/v)以及它们之间的任何值。在另一个实施方案中，将BHA溶解于DMSO中。在又另一个实施方案中，在组织支架的制备中所使用的在DMSO中的BHA可以大约为5%-50% (w/v)。在一个另外的实施方案中，在组织支架的制备中所使用的在DMSO中的BHA可以大约为5%、8%、10%、12%、15%、18%、20%、25%、30%、40%、或 50% (w/v)，5% 至 50% (w/v)、或 10% 至 40% (w/v)、以及它们之间的任何值。在又另一个实施方案中，将壳聚糖溶解于乙酸中。在一个另外的实施方案中，该乙酸浓度为0.1-0.5M (pH范围2.53-2.88)。在一个另外的实施方案中，该壳聚糖和乙酸混合物的PH可以为4.0-5.5。在又另一个实施方案中，在组织支架的制备中所使用的在乙酸中的壳聚糖可以大约为1%、2%、3%、4%、或5% (w/v)、以及它们之间的任何值。考虑到体内更新/持久性、生物力学性能、以及全面生物反应的操纵，这些支架材料中的每一种可以对终产物赋予不同的特性。这些聚合物溶液可以与颗粒状ATM混合(步骤130)。然后这些ATM和聚合物/溶剂混合物被置于或填充进模具或其他容器中以产生所希望的三维形状(步骤140)。在一些实施方案中，模具可选自许多模具。在一些实施方案中，模具可以选自eppendorf管、金属管、金属管、注射管、或具有组织或器官缺损(该组织支架被设计为对其进行修复)的形状的一种模具。可以通过干燥方法去除该溶剂(步骤150)。在一些实施方案中，可以通过许多干燥方法去除该溶剂。在一些实施方案中，该干燥方法可以选自冷冻干燥、风干、加热干燥、在氩气或氮气中干燥、或真空辅助干燥。生成的组织支架包括包裹在一种聚合物/合成支持支架中的再生性组织颗粒，并且在机械应力下是稳定的。另外，干燥方法可包括被动干燥，其中该溶剂蒸发入标准大气中。在某些实施方案中，该组织支架的形状和稳定性是重要的。在一些实施方案中，所希望的或完成的生成的组织支架的形状和大小是由用来生产该支架的模具的形状和大小决定的。在一些实施方案中，所希望的或完成的该组织支架的形状是一种稳定的三维形状。在一些实施方案中，用来制备该稳定的三维组织支架的模具可以是一种eppendorf管、一种金属管、一种注射管、或具有组织或器官缺损(该组织支架将被植入其中)的形状的一种模具。在一些实施方案中，该组织支架呈一种圆柱形。在一些实施方案中，该组织支架呈一种管状。在一些实施方案中，该组织支架的形状与组织或器官缺损或损伤的形状相符合。在一些实施方案中，通过控制冻结速度、冰点、以及成型容器的构成来控制机械强度、孔隙率、水合作用以及流体电导。在一些实施方案中，该组织支架的大小或形状被确定为使得它能与组织或器官缺损的形状相符合。在一些 实施方案中，可以使用两种或更多种不同类型的组织来制备该组织支架。例如，在该组织支架中的一种组织可以是软骨并且第二种组织可以是脱矿骨。在一些实施方案中，软骨/脱矿骨支架可以用来修复骨软骨缺损(图1)。
脱细胞组织基质术语“脱细胞组织基质”，如在此所使用的，通常是指基本上没有细胞和/或细胞组分的任何组织基质。可以使用皮肤、皮肤的部分(如真皮)、以及其他组织(如血管、心脏瓣膜、筋膜、软骨、骨以及神经结缔组织)来产生在本披露范围之内的脱细胞基质。可以通过许多方式测试或评估脱细胞基质以确定它们是否基本上没有细胞和/或细胞组分。例如，可以使用光学显微镜检查处理的组织以确定是否残留有细胞(活的或死的)和/或细胞组分。另外，可以使用某些分析来鉴定细胞或细胞组分的存在。例如，可以使用DNA或其他核酸分析来对在这些组织基质之内的残余核酸物质定量。通常，残余DNA或其他核酸的缺乏将指示完全脱细胞(即去除了细胞和/或细胞组分)。最后，可以使用其他鉴定细胞特异性组分(如表面抗原)的分析来确定这些组织基质是否无细胞。可以使用皮肤、皮肤的部分(如真皮)、以及其他组织(如血管、心脏瓣膜、筋膜、软骨、骨以及神经结缔组织)来产生在本披露范围之内的脱细胞基质。通常，在生产ATM中涉及的步骤包括从一个供体(如人的尸体或动物来源)收获组织，以及在保存生物和结构功能的条件下去除细胞。例如，所希望的生物和结构功能包括支持细胞向内生长和组织再生、提供机械支持(如为一个手术部位或缺损)、预防过度免疫应答、炎症、纤维化、和/或瘢痕形成的能力。在某些实施方案中，该方法包括与去除细胞一起或在去除细胞之前进行化学处理，以稳定组织并且避免生物化学和结构退化。在不同的实施方案中，该稳定溶液阻止并且预防渗透的、缺氧的、自溶的、以及蛋白质分解的退化，使免受微生物污染，以及减轻可能伴随在含有例如平滑肌组分(例如血管)的组织中的机械损伤。该稳定溶液可以含有一种适当的缓冲剂、一种或多种抗氧化剂、一种或多种肿胀剂、一种或多种抗生素、一种或多种蛋白酶抑制剂、和/或一种或多种平滑肌松弛剂。然后将该组织置于一种脱细胞溶液中以从结构基质中去除活细胞(如上皮细胞、内皮细胞、平滑肌细胞、以及成纤维细胞)，而不损坏胶原基质的生物学和结构完整性。可以通过多种方法测试该胶原基质的完整性。例如，可以使用差示扫描量热法来鉴定热转变温度的变化，这些变化指示交联(转变温度的升高)或胶原降解(转变温度的降低)。另外，电子显微镜可以证明正常胶原模式(collagen pattern)的变化，并且酶消化分析可以证明胶原损坏。此外，各种糖胺聚糖(如硫酸软骨素和透明质酸)的丢失可能指示组织基质中的不良变化。该脱细胞溶液可以含有一种适当的缓冲剂、盐、一种抗生素、一种或多种清洁剂(如曲拉通TRITON X-100 (TRITON X-lOO )、去氧胆酸钠、聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯)、预防交联的一种或多种试剂、一种或多种蛋白酶抑制剂、和/或一种或多种酶。用于生产ATM的适合的方法描述于，例如，H.Xu等人，衍生自猪的支持软组织再生的脱细胞真皮支架:末端半乳糖-a-(1,3)-半乳糖的去除以及基质结构的保留(A Porcine-DerivedAcellular Dermal Scaffold That Supports SoftTissue Regeneration:Removal ofTerminal Galactose-a-(1，3)-Galactose andRetention of Matrix Structure)，TissueEng.Part A 15:1807(2009)。在脱细胞过程之后，将组织样品用盐水彻底洗涤。在一些示例性的实施方案中，例如，当使用异种材料时，然后将该脱细胞组织在室温下用脱氧核糖核酸酶(DNase)溶液处理过夜。在一些实施方案中，将该组织样品用制备在DNA酶缓冲液(20mM HEPES (4-(2-羟乙基)-1_哌嗪乙磺酸)、20mM CaCl2以及20mM MgC)中的DNA酶溶液处理。任选地，可以将一种抗生素溶液(例如庆大霉素)添加至DNA酶溶液中。只要该缓冲剂提供了适合的DNA酶活性，可以使用任何适合的缓冲剂。

虽然一种ATM可以由与该组织支架的受体相同种类的一个或多个个体制成，但这不是必然如此。因此，例如，在该组织支架中的一种ATM可以由猪组织制成。可以作为ATM受体以及用于生产ATM的组织或器官的供体用的种类包括，但不限于:哺乳动物，例如人、非人灵长类(如猴子、狒狒、或黑猩猩)、猪、牛、马、山羊、绵羊、狗、猫、兔、豚鼠、沙鼠、仓鼠、大鼠、或小鼠。α-半乳糖表位从含胶原材料中的消除可以降低针对含胶原材料的免疫应答。α-半乳糖表位表达在非灵长类哺乳动物中以及新世界猴(南美猴)中，在大分子如细胞外组分的糖蛋白上，U.Galili 等人，J.Biol.Chem.263:17755 (1988)。
然而，在旧世界灵长类(亚洲和非洲猴以及猿)以及人类中缺乏这个表位。抗半乳糖抗体是由于在胃肠道细菌上的α-半乳糖表位碳水化合物结构的免疫应答而在人以及灵长类体内产生的，U.Galili 等人,Infect.Tmmun.56:1730 (1988) ; R.M.Hamadeh 等人,J.Clin.1nvest.89:1223(1992)。由于非灵长类哺乳动物(如猪)产生α-半乳糖表位，将含胶原材料从这些哺乳动物异种移植至灵长类中常常会导致排斥反应，这是因为灵长类抗半乳糖结合含胶原材料上的这些表位的缘故。通过补体结合并且通过抗体依赖性细胞细胞毒作用，这种结合导致了含胶原材料的破坏。U.Galili等人，Immunology Today 14:480 (1993) ;M.Sandrin 等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 90:11391 (1993) ;Η.Good 等人，Transplant.Proc.24:559(1992) ;B.H.Collins 等人，J.1mmunol.154:5500(1995)。此外，异种移植导致免疫系统的主要激活而产生增加量的高亲和力抗半乳糖抗体。因此，在一些实施方案中，当使用产生α -半乳糖表位的动物作为组织来源时，来自细胞和来自含胶原材料的细胞外组分的α-半乳糖表位的实质性消除、以及细胞α-半乳糖表位的再表达的预防可以减少针对与结合在α-半乳糖表位上的抗半乳糖抗体相关联的含胶原材料的免疫应答。为了去除α -半乳糖表位，在彻底用盐水洗涤组织以去除DNA酶溶液之后，该组织样品可以经受一次或多次酶处理以去除某些免疫原性抗原(如果在该样品中存在的话)。在一个实施方案中，可以用一种α-半乳糖苷酶处理该组织样品以消除α-半乳糖表位(如果在该组织中存在的话)。在一些实施方案中，用一种制备在pH为6.0的IOOmM磷酸盐缓冲液中的浓度为300U/L的α-半乳糖苷酶处理该组织样品。在其他实施方案中，为了从收获组织充分去除α-半乳糖表位，α-半乳糖苷酶的浓度增加至400U/L。只要实现抗原的充分去除，可以使用任何适合的酶浓度和缓冲剂。可替代地，可以选择已经基因修饰为缺乏一种或更多种抗原表位的动物作为组织来源，而不是用酶处理组织。例如，可以选择已经通过基因工程化为缺乏末端α-半乳糖部分的动物(如猪)作为组织来源。对适当动物的描述参见共同未决的美国申请序列号10/896，594以及美国专利号6，166，288，这些披露以其全文通过引用的方式结合在此。
另外，处理组织以产生具有或不具有减少量的或缺乏α-1，3_半乳糖部分的脱细胞基质的某些示例性方法描述于Xu，Hui等人的“一种支持软组织再生的衍生自猪的脱细胞真皮支架:末端半乳糖-α-(1，3)-半乳糖的去除以及基质结构的保留”，Tissue Engineering,第 15 卷，第 1-13 页(2009) (〃A Porcine-Derived AcellularDermal Scaffold that Supports Soft TissueRegeneration:Removal of TerminalGalactose-a-(1，3)-Galactose a`ndRetention of Matrix Structure,^TissueEngineering, Vol.15, 1-13 (2009))中,通过引用将其全文结合。在形成ATM之后，可以任选地将组织相容性活细胞种在该ATM中，以产生可以被宿主进一步重塑的一种移植物。在一些实施方案中，通过在移植之前的标准体外细胞共培养技术或通过移植后的体内再增殖(r印opulation)可以将组织相容性活细胞添加至基质。体内再增殖可以是将受体自身的细胞迁移至ATM中，或将来自受体的细胞或从另一个供体获得的组织相容性细胞注入或注射至原位ATM中。可以使用各种细胞类型，包括胚胎干细胞、成体干细胞(如间充质干细胞)、和/或神经元细胞。在不同的实施方案中，可以刚好在移植之前或之后将这些细胞直接施用于ATM的内部部分。在某些实施方案中，可以将这些细胞置于待植入的ATM之内，并且在移植之前培养。在一个实施方案中，在移植之前将活细胞添加至组织支架。在一个实施方案中，在支架被植入在一个所希望的解剖学部位之后将活细胞添加至该组织支架。
颗粒状脱细胞组织基质可以采用下列程序使用ALLODERVP(Strattice 生命细胞公司STRATTICE LifeCell Corporation,布兰奇伯格，新泽西)、或其他适合的脱细胞组织基质来制造颗粒状脱细胞组织基质。在去除包装之后，用装有非中断“连续”切割轮的Zimmer网格器(Zimmer mesher)将ATM切成条。将所生成的ATM长条切成在长度上大约I厘米至大约2厘米的长度。装配一种均质器以及灭菌的均质器探头(如一种从OMNI国际、Warrenton Va.可获得的一种LabTeck Macro均质器)并且使用灌入均质器塔中的无菌液氮将其冷却至深冷温度。一旦该均质器达到深冷温度，将先前制备成如以上所述的条的ATM添加至含有无菌液氮的均质器塔。然后起动该均质器从而将这些ATM条深低温破碎。低温分馏步骤的次数和持续时间将取决于所使用的均质器、均质器室的大小、均质器操作的速度和次数，并且应当能够由本领域的一位技术人员通过参数的简单变化来确定，从而实现所希望的结果。通过用液氮将均质器的产物洗涤通过一系列也已冷却至液氮温度的金属丝网，将该低温破碎的颗粒状ATM材料根据粒径进行分类。我们已经发现利用在以上所述类型的均质塔之内的丝网的一种组合是特别有用的，在均质塔中将这些颗粒洗涤并且首先被分类以排除尺寸过大的颗粒， 然后排除尺寸过小的颗粒。一旦分离，移除该颗粒状ATM，并且一旦该无菌液氮已经蒸发，将其置于用于冷冻干燥的小瓶中。这个最后的步骤是为了确保去除在以上程序中已经吸收的任何残余水分。最终产物可以是一种具有粒径大约I微米至大约900微米或粒径大约30微米至大约750微米的粉末。这些颗粒大约分布在大约150-300微米的均值。通过将该材料悬浮在生理盐水或其他相似的适合的再水合试剂中易于将其再水合。该再水合的ATM可以再悬浮于生理盐水或其他适合的药学上相容的载体中。提供了下列实例以更好地解释不同的实施方案，这些实例不应当以任何方式被理解为限制本披露的范围。
实例
实例I再生性组织支架的制备图2展示了合成ATM再生性组织支架的制备方法。使用聚合物支架材料从颗粒状ATM制造三维再生性组织支架。从猪真皮组织制备ATM并且将其冷冻干燥。将干燥的ATM切成约Icm2的块并且置于适当大小的低温球磨小瓶中。然后将该小瓶置于已经用液氮预冷的SPEX6800冷冻研磨机中，并且使其经受低温破碎规程。然后将该颗粒状ATM从小瓶中移除并且保持在干燥储存条件下。将透明质酸的100%的苄酯衍生物以40% (w/v)的浓度溶解在二甲亚砜(DMSO)中。然后将Iml的这种溶液与如以上所制备的300mg的微粒脱细胞真皮基质混合，并且将该混合物转移至一个2ml的小eppendorf管。然后通过一种冷冻干燥方法将该DMSO去除,剩下一种保留着eppendorf管的形状(圆柱形)的组织支架(按重量计40%的透明质酸节酯,60%的脱细胞真皮基质)，将其干燥(步骤150)。
实例2组织支架的功能研究
有机溶剂对组织基质完整性的影响的暈热分析正如通过炎症细胞减少的数目所证明的，体内结果表明再生性组织支架的存在弱化了对该支架材料的免疫或炎症应答。将这些如在实例I中所述制备的pADM用包括二噁烷、NMP>以及DMSO的过量的不同溶剂处理2小时。使用差示扫描量热计(DSC)评估处理的材料以评定组织基质的完整性。图3是用有机溶剂处理的猪脱细胞真皮基质(pADM)的DSC数据的曲线图。同样，这些pADM用不同的聚合物(例如在二噁烷中的聚-4-羧基丁酸酯或在二噁烷或NMP中的聚己内酯)处理，并且通过DSC评估组织基质的完整性。图4是根据实例2在聚合物存在下的pADM的DSC数据的曲线图。DSC分析(图4)显示出聚合物和pADM的热分析图是累加的。
组织学评估在具有免疫能力的皮下大鼠模型中在聚-4-羧基丁酸酯(P4HB)的存在下测试了pADM的移植效果。具有免疫能力的大鼠被植入pADM/P4HB组织支架或P4HB聚合物支架。这个模型允许测定针对植入的测试材料的细胞和免疫应答。通过在具有免疫能力的大鼠(褐家鼠；路易鼠)的背侧面上的小切口将测试材料植入皮下位置。在植入之后4周(图5A-D)和12周(图6A-D)，收集外植体并用PBS洗涤并固定在10%的福尔马林中。将固定的组织包埋在石蜡中，使用标准程序用苏木精和伊红(H和E)将组织基质样品的切片染色。
见 D.C.Sheehan 和 B.B.Hrapchak, Theory and Practice ofHistotechnology,第二版，Columbus, OH, Battelle Press (1987)。然后在 IOOX 放大倍数(图 5A-B 和图 6A-B)和400X放大倍数(图5C-D和图6C-D)的显微镜下观察样品。外植体(图5A-D和图6A-D)的组织学分析显示，在pADM存在下的P4HB相比于单独的P4HB的外植体具有弱化的炎症应答。图7A-D和图8A-D显示了 4周和12周的聚己内酯外植体的组织学评估。在具有免疫能力的皮下大鼠模型中在聚己内酯(PCL)的存在下测试了 pADM的移植效果。具有免疫能力的大鼠被植入pADM/PCL组织支架或PCL聚合物支架。如上所述，在植入之后4周(图7A-D)和12周(图8A-D)收集外植体并处理以用于组织学评估。
然后在IOOX放大倍数(图7A-B和图`8A-B)和400 X放大倍数(图7C-D和图8C-D)的显微镜下观察样品。外植体的组织学分析(图7A-D和图8A-D)显示，在pADM存在下的PCL相比于单独的PCL的外植体具有弱化的炎症应答。图9A-D和图10A-D显示了 4周和12周的透明质酸苄酯(BHA)外植体的组织学评估。在具有皮下免疫能力的大鼠模型中在BHA的存在下测试了 pADM的移植效果。
具有免疫能力的大鼠被植入pADM/BHA组织支架或BHA聚合物支架。如上所述，在植入之后4周(图9A-D)和12周(图10A-D)收集外植体并处理以用于组织学评估。
然后在100X放大倍数(图9A-B和图10A-B)和400 X放大倍数(图9C-D和图10C-D)的显微镜下观察样品。外植体的组织学分析(图9A-D和图10A-D)显示，在pADM存在下的BHA相比于单独的BHA的外植体具有弱化的炎症应答。图1lA-D显示了 4周和8周的壳聚糖/pADM外植体的组织学评估。在具有免疫能力的皮下大鼠模型中在壳聚糖的存在下测试了 PADM的移植效果。具有免疫能力的大鼠被植入pADM/壳聚糖支架。如上所述，在植入之后4周(图11A，C)和8周(图11B，D)收集外植体并处理以用于组织学评估。然后在100X放大倍数(图11A-B)和400X放大倍数(图11C-D)的显微镜下观察样品。正如通过成纤维细胞样细胞和血管的存在所证明的，这些结果显示存在着一种再生性组织反应。如上所述，将再生性组织基质成型和成形为稳定的三维结构的能力将允许开发新颖的产品，这些新颖的产品可以被用于遍及广泛范围的再生医学应用。这些支架材料中的每一种可以对终产物赋予不同的特性，从而允许操纵体内更新/持久、生物力学性能、以及总生物学反应。另外，如上面所示，该再生性组织支架组分降低/弱化了对支架材料的总炎
症 应答。
权利要求
1.一种用于制造组织支架的方法，该方法包括: 将一种聚合物溶解在一种溶剂中以制成一种溶液； 将该溶液与一种颗粒状脱细胞组织基质(ATM)混合以产生一种混合物； 将该混合物放入一个模具中；并且 将该混合物干燥以形成一种具有稳定的三维形状的组织支架，其中当该组织支架被植入人体中时相比于单独的该聚合物具有降低的免疫或炎症应答。
2.如权利要求1所述的方法，其中该聚合物包括一种聚己内酯。
3.如权利要求2所述的方法，其中该溶剂包括二噁烷。
4.如权利要求2所述的方法，其中该溶剂包括N-甲基-2-吡咯烷酮。
5.如权利要求2所述的方法，其中该聚己内酯在溶剂中是以范围从大约5%至30%(w/V)的量存在的。
6.如权利要求2所述的方法，其中该聚己内酯在溶剂中是以范围从大约10%至30%(w/V)的量存在的。
7.如权利要求1所述的方法，其中该聚合物是一种聚-4-羧基丁酸酯。
8.如权利要求7所述的方法，其中该溶剂包括二噁烷。
9.如权利要求7所述的方法，其中该溶剂包括N-甲基-2-吡咯烷酮。
10.如权利要求7所 述的方法，其中该聚-4-羧基丁酸酯在溶剂中是以范围从大约5%至40% (w/v)的量存在的。
11.如权利要求7所述的方法，其中该聚-4-羧基丁酸酯在溶剂中是以范围从大约10%至30% (w/v)的量存在的。
12.如权利要求1所述的方法，其中该聚合物包括一种透明质酸的苄酯衍生物。
13.如权利要求12所述的方法，其中该溶剂包括DMSO。
14.如权利要求12所述的方法，其中该透明质酸的苄酯衍生物在溶剂中是以范围从大约5%至50% (w/v)的量存在的。
15.如权利要求12所述的方法，其中该透明质酸的苄酯衍生物在溶剂中是以范围从大约10%至40% (w/v)的量存在的。
16.如权利要求1所述的方法，其中该聚合物包括壳聚糖。
17.如权利要求16所述的方法，其中该溶剂包括乙酸。
18.如权利要求17所述的方法，其中该乙酸为0.1-0.5M。
19.如权利要求16所述的方法，其中该壳聚糖是以范围从大约1%至5%(w/v)的量存在的。
20.如权利要求1所述的方法，其中该颗粒状ATM包括大小均匀的颗粒。
21.如权利要求1所述的方法，其中该颗粒状ATM包括一种真皮ATM。
22.如权利要求21所述的方法，其中该真皮ATM是一种人组织基质。
23.如权利要求21所述的方法，其中该真皮ATM是一种猪组织基质。
24.如权利要求1所述的方法，其中该颗粒状ATM是一种软骨组织基质。
25.如权利要求24所述的方法，其中该软骨组织基质包括一种人软骨基质。
26.如权利要求24所述的方法，其中该软骨组织基质包括一种猪软骨基质。
27.权利要求1所述的方法，其中该颗粒状ATM包括一种骨组织基质。
28.如权利要求27所述的方法，其中该骨组织基质包括一种人骨。
29.如权利要求27所述的方法，其中该骨组织基质包括一种猪骨。
30.如权利要求1所述的方法，其中将该混合物放入一种模具包括注射成型。
31.如权利要求1所述的方法，其中该颗粒状ATM包括来自两种或更多种不同类型的组织的ATM。
32.如权利要求31所述的方法，其中这两种或更多种不同类型的组织包括真皮和软骨。
33.如权利要求31所述的方法，其中这两种或更多种不同类型的组织包括软骨和骨。
34.如权利要求31所述的方法，其中这两种或更多种不同类型的组织包括人组织基质。
35.如权利要求31所述的方法，其中这两种或更多种不同类型的组织包括猪组织基质。
36.如权利要求31所述的方法，其中这两种或更多种不同类型的组织包括人组织基质和猪组织基质。
37.一种组织支架，包括: 一种颗粒状脱细胞组织基质(ATM);以及 一种聚合物； 其中该ATM被包裹在该聚合物中以形成一种用于组织再生的稳定的三维组织支架，并且其中该组织支架当植入人体中时相比于单独的该聚合物具有降低的免疫或炎症应答。
38.如权利要求37所述的组织支架，其中该聚合物包括一种合成聚合物。
39.如权利要求37所述的组织支架，其中该聚合物包括一种聚己内酯。
40.如权利要求37所述的组织支架，其中该聚合物是一种聚-4-羧基丁酸酯。
41.如权利要求37所述的组织支架，其中该聚合体包括一种透明质酸的苄酯衍生物。
42.如权利要求37所述的组织支架，其中该聚合物包括壳聚糖。
43.如权利要求37 所述的组织支架，其中该颗粒状ATM包括一种真皮ATM。
44.如权利要求43所述的组织支架，其中该真皮ATM是一种人组织基质。
45.如权利要求43所述的组织支架，其中该真皮ATM是一种猪组织基质。
46.如权利要求37所述的组织支架，其中该ATM是一种软骨组织基质。
47.如权利要求46所述的组织支架，其中该软骨组织基质包括一种人软骨。
48.如权利要求46所述的组织支架，其中该软骨组织基质包括一种猪软骨。
49.如权利要求37所述的组织支架，其中该ATM是一种骨组织基质。
50.如权利要求49所述的组织支架，其中该骨组织基质包括一种人骨。
51.如权利要求49所述的组织支架，其中该骨组织基质包括一种猪骨。
52.一种治疗方法，包括:(a)选择一种具有稳定的三维形状的组织支架，该组织支架包括: (i)一种颗粒状脱细胞组织基质(ATM);以及 ( ) 一种聚合物； 其中该ATM被包裹在该聚合物中以形成一种用于组织再生的稳定的三维组织支架，并且其中该组织支架当植入人体中时相比于单独的该聚合物具有降低的免疫或炎症应答；(b)识别在一种组织或器官中的一种缺损；并且 (c)将该组织支架植入该缺损中。
53.如权利要求52所述的方法，其中该缺损是在一种骨之中。
54.如权利要求52所述的方法，其中该缺损是在一种软骨组织之中。
55.如权利要求52所述的方法，其中该缺损是在一种乳房组织之中。
56.如权利要求37所述的组织支架用于治疗组织中的一种缺损的用途，这种组织是选自骨、软骨、以及乳房。
57.一种再生性组织支架，该再生性组织支架是根据权利要求1所述的方法制造的。
58.一种用于制造组织支架的方法，该方法包括: 将一种聚合物溶解在一种溶剂中以制成一种溶液； 将该溶液与一种颗粒状脱细胞组织基质(ATM)混合以产生一种混合物； 将该混合物放入一个模具中；并且 将该混合物干燥以形成一种具有稳定的三维形状的组织支架，其中该组织支架当植入人体时相比于单独的该聚合物具有降低的免疫或炎症应答。
59.如权利要求58所述的方法，其中该溶剂包括二噁烷、N-甲基-2-吡咯烷酮、DMSO或乙酸。
60.如权利要求58至59所述的方法，其中该溶剂是以范围从大约5%至50%(w/v)的量存在的。
61.如权利要求58至60所述的方法，其中该颗粒状ATM包括一种真皮ATM、一种软骨组织基质、或一种骨组织基质、或它们的组合。
62.如权利要求58至61所述的方法，其中该基质是选自一种人组织基质以及一种猪组织基质或它们的组合。
63.如权利要求58至62所述的方法，其中将该混合物放入一种模具包括注射成型。
64.一种组织支架，包括: 一种颗粒状脱细胞组织基质(ATM);以及 一种聚合物； 其中该ATM被包裹在该聚合物中以形成一种用于组织再生的稳定的三维组织支架，并且其中该组织支架当植入人体时相比于单独的该聚合物具有降低的免疫或炎症应答。
65.如权利要求58至64所述的组织支架或方法，其中该聚合物包括一种聚己内酯、一种聚-4-羧基丁酸酯、一种透明质酸的苄酯衍生物、或壳聚糖、或它们的组合。
66.如权利要求58至65所述的组织支架或方法，其中该颗粒状ATM包括一种真皮ATM、一种软骨组织基质、或一种骨组织基质、或它们的组合。
67.如权利要求58至66所述的组织支架或方法，其中该基质是选自一种人组织基质以及一种猪组织基质或它们的组合。
68.如权利要求58至67所述的组织支架或方法，其中该颗粒状ATM包括来自两种或更多种不同类型的组织，如真皮和软骨，或软骨和骨的ATM。
69.如权利要求58至68所述的方法，其中该颗粒状ATM包括大小均匀的颗粒。
70.如权利要求58至69所述的组织支架用于治疗组织中的一种缺损的用途，这种组织是选自骨、软骨、以及乳房。
71.根据权利要求64至70中任一项所述的组织支架用于以下一项或多项中的用途，即:吸收性敷料、真皮再生、神经再生、软骨再生、结缔组织再生或修复、骨再生、牙周应用、伤口 /泡沫衬料、整合的绷带敷料、作为一种用于皮肤移植物的基质或基底、血管再生、整容外科、金属和/或聚合物植入物涂层以及缺失组织的替换。
72.—种再生性组织支架，该再生性组织支架是通过如权利要求58至63所述的方法获得的或可获得的。
73.一种脱细胞组织基质，该基质用于在一个解剖学部位植入时降低一种聚合材料的免疫应答。
74.如权利要求7 3所述的脱细胞组织基质，其中该基质包括真皮组织、骨、软骨、或它们的组合。
全文摘要
在此提供了用于治疗或修复组织或器官缺损或损伤的装置和方法。这些装置可以包括从一种细胞组织基质和聚合物制成的组织支架，这些组织支架具有一种稳定的三维形状并且引出一种有限的免疫或炎症应答。
文档编号A61L27/36GK103108661SQ201180023774
公开日2013年5月15日 申请日期2011年3月24日 优先权日2010年3月25日
发明者里克·T·欧文斯, 温德尔·孙, 刘米克, 勇·马奥 申请人:生命细胞公司