专利名称：脂质囊泡组合物和使用方法
脂质囊泡组合物和使用方法相关申请根据35 U. S. C. § 119(e)，本申请要求于2010年3月19日提交的题为“MICR0-ANDNANOPARTICLES WITH SELF-ASSEMBLED LIPID COATINGS FOR SURFACE DISPLAY OF DRUGSSUCH AS VACCINE ANTIGENS AND ADJUVANTS”的美国临时申请序列号61/315，485和于2010年3月 31 提交的题为 “INTERBILAYER CROSSLINKED MULTI LAMELLAR VESICLES” 的美国临时申请序列号61/319，709的权益，二者的全部内容通过引用并入本文。联邦政府资助研究在NIH的资助No. CA140476和国防部的资助No. W911NF-07-D-0004号的政府支持下进行本发明。政府享有本发明的某些权利。
背景技术：
脂质体被广泛用作小分子的递送载剂；但是，在脂质体中实现许多大分子药物的高水平包封仍然是困难的，而且许多药物制剂从脂质体泄露得太快而不能维持有用的药物递送动力学。虽然通过微颗粒和纳米颗粒进行的药物递送可以包封蛋白质和小分子药物，但其仍通常产生总质量非常低的单位颗粒质量的包封药物，通常为 10 μ g药物/mg颗粒左右。此外，用于合成高分子颗粒的有机溶剂以及这些颗粒中的疏水/酸性环境可破坏治疗。(参见 Zhu 等，Nat. Biotechnol. 2000 18:52-57。)
发明内容
本发明提供了具有较高负载能力和较长释放谱的具有新颖性和创造性的药物递送系统，所述较高负载能力是同时封闭(sequester)高水平的疏水和亲水试剂二者的能力。这些递送系统的一些方面包括具有交联脂质双层的稳定化多层脂质囊泡(在本文中称为双层间交联多层囊泡(interbilayer-crosslinked multilamellar vesicle)或 ICMV)。如实施例所示，本发明的囊泡具有出乎意料的提高的包封效力(例如，在一些情况下，是简单脂质体效率的100倍)，并且它们能够通过缓慢且持续的动力学释放所包封的(或者以另外方式截留的)试剂，即使在血清的存在下也是如此，这使得它们成为高度符合理想的体内持续递送载剂。此外，如在本文中更详细地描述的，本发明的囊泡可以在水性环境中合成，从而避免常见于多种现有技术方法的严苛条件，包括使用有机溶剂和/或酸性环境。因此，这些合成方法更适于多种试剂，包括使用这些现有技术方法通常会在结构上和/或功能上受影响的那些。因此，所得囊泡不含有机溶剂，并可以仅包含脂质(包括生物可降解脂质)和包封或嵌入其中的任意试剂。本发明部分基于如在本文中更详细地描述的本发明囊泡的这些和其他令人惊讶且出乎意料的性质。因此，本发明提供了这些稳定化囊泡，包含这些囊泡的组合物、制造这些囊泡的方法及其使用方法。因此，一方面，本发明提供了在脂质双层之间具有交联的多层脂质囊泡，或者在脂质双层之间具有交联的多个多层脂质囊泡或多层脂质囊泡群。所述多个可以是但不限于1-103、1-104、1-105、1-106、1-107、1-108或1-109。在下文中描述了囊泡的多个方面，应当理解除非另有说明，否则这些方面等同地应用多个囊泡或囊泡群。应当理解，本发明的囊泡包含内部邻近(或并列)双层的组分之间的连接，而非仅仅是外部(或者最外面)的双层或双层表面的组分之间的交联。在一些实施方案中，囊泡包含官能化脂质。在一些实施方案中，官能化脂质是马来酰亚胺官能化脂质。官能化脂质可以是磷酸乙醇胺但不限于此。在一些实施方案中，囊泡包含官能化的脂质双层组分，并优选直接地官能化。在一些实施方案中，囊泡包含磷酸胆碱，例如但不限于D0PC。在一些实施方案中，囊泡包含磷酸甘油，例如但不限于D0PG。在一些实施方案中，囊泡包含DOPC、DOPG和官能化脂质例如但不限于官能化磷酸乙醇胺。官能化脂质可以是包含马来酰亚胺的。在一些实施方案中，囊泡包含DOPC、DOPG和马来酰亚胺官能化脂质。官能化脂质可以是马来酰亚胺官能化的磷酸乙醇胺例如但不限于MPB。在一些实施方案中，DOPC DOPG 官能化脂质的摩尔比是40 10 50。在一些实施方案中，囊泡可以包含DOPC和MPB。在一些实施方案中，囊泡可以包含D0PC、D0TAP和MPB。在一些实施方案中，DOPC DOTAP :官能化脂质的摩尔比是40 10 50。在一些实施方案中，官能化脂质以至少25%的摩尔百分比存在。
在一些实施方案中，囊泡包含试剂，包括一种或者更多种试剂。本文所使用的一种或更多种试剂意指彼此不同的一种或者更多种试剂。在一些实施方案中，所述试剂是预防齐U、治疗剂或诊断剂。在一些实施方案中，所述试剂是抗原。在一些实施方案中，所述试剂是蛋白质抗原，包括全蛋白抗原。在一些实施方案中，所述试剂是佐剂。佐剂可以是但不限于TLR激动剂如TLR4激动剂、TLR7激动剂、TLR8激动剂和TLR9激动剂。在一些实施方案中，囊泡包含抗原和至少两种佐剂如TLR4激动剂和TLR7激动剂。在一些实施方案中，所述试剂是蛋白质。在一些实施方案中，囊泡的每mg脂质(或颗粒)包含超过300 μ g试剂,或者每mg脂质(或颗粒)超过400yg试剂。在一些实施方案中，囊泡的每mg脂质(或颗粒)包含300 试剂。在一些实施方案中，囊泡的每mg脂质(或颗粒)包含325 μ g试剂，或者每mg脂质(或颗粒)407 μ g试剂。在一些相关实施方案中，试剂可以是蛋白质抗原。在一些实施方案中，试剂被包封于囊泡中。在一些实施方案中，试剂存在于囊泡的核心。在一些实施方案中，试剂存在于脂质双层之间。在一些实施方案中，囊泡包含核心中的一种试剂和脂质双层之间的另一种试剂。在一些实施方案中，核心中的试剂可以是抗原如蛋白质抗原，脂质双层之间的试剂可以是佐剂例如但不限于MPLA。在一些实施方案中，抗原在核心中，两种佐剂在内部脂质双层之间。在一些实施方案中，两种佐剂是MPLA和R-848。在一些实施方案中，囊泡包含核心中的一种试剂和外部双层中的另一种试剂。在一些实施方案中，核心中的试剂可以是抗原如蛋白质抗原，外部双层中的试剂可以是佐剂例如但不限于MPLA。在一些实施方案中,抗原在核心中,两种佐剂在外部双层中。在一些实施方案中，抗原在核心中，一种或更多种佐剂在内部双层之间和/或在外部双层表面上。在一些实施方案中，两种佐剂是MPLA和R-848。在一些实施方案中，囊泡缀合聚乙二醇(PEG)。在一些实施方案中，囊泡可以表面缀合PEG。
在另一方面，本发明提供了包含任意前述多层脂质囊泡(或囊泡群)和可药用载体的组合物。在另一方面，本发明提供了包含任意前述多层脂质囊泡(或囊泡群)和适于冻干的赋形剂的组合物。在一些实施方案中，适于冻干的赋形剂包含蔗糖。囊泡可以单独使用或者与其他试剂(包括本文所述的任意试剂)组合使用。在一些实施方案中，他们不与细胞一起施用，他们也不与细胞缀合(或者以另外的方式物理连接)(例如在施用于对象之前)。但是，囊泡可以缀合靶配体以将他们靶向特定细胞或机体中的位点。在另一方面，本发明提供了一种方法，其包括使包含官能化脂质的脂质体与多价(例如，二价)阳离子接触以形成融合脂质体，并使融合脂质体与交联剂接触以形成在脂质双层之间有交联的多层脂质囊泡，包括任意前述囊泡。在一些实施方案中，官能化脂质是马来酰亚胺官能化脂质。在一些实施方案中，官能化脂质是官能化磷酸乙醇胺。在一些实施方案中，官能化脂质是马来酰亚胺官能化脂质。在一些实施方案中，官能化脂质是马来酰亚胺官能化的磷酸乙醇胺。在一些实施方案中，月旨 质体包含磷酸胆碱例如但不限于D0PC。在一些实施方案中，脂质体包含磷酸甘油例如但不限于D0PG。在一些实施方案中，脂质体包含马来酰亚胺官能化脂质、磷酸胆碱和磷酸甘油。在一些实施方案中，脂质体包含摩尔比为40 10 50的DOPC、DOPG和马来酰亚胺官能化脂质(如MPB)。在一些实施方案中，脂质体包含DOPC和马来酰亚胺官能化脂质如MPB。在一些实施方案中，脂质体包含D0PC、D0TAP和马来酰亚胺官能化脂质(如MPB)，任选地以40 10 50的摩尔比。在一些实施方案中，连接剂是膜可渗透性连接剂。在一些实施方案中，交联剂是二硫醇交联剂。在一些实施方案中，交联剂是二硫苏糖醇(DTT)。在一些实施方案中，二硫醇交联剂与马来酰亚胺官能化脂质的摩尔比为I : 2。在一些实施方案中，该方法进一步包括将聚乙二醇(PEG)缀合到在脂质双层之间具有交联的多层脂质囊泡的表面。在一些实施方案中，多价阳离子是二价阳离子例如但不限于Ca2+或Mg2+。这些可以单独使用或组合使用。在一些实施方案中，接触发生于水性缓冲液中。在一些实施方案中，脂质体包含试剂。在一些实施方案中，试剂是预防剂、治疗剂或诊断剂。在另一方面，本发明提供了一种方法，其包括使包含官能化脂质双层组分(如官能化脂质)的多层脂质囊泡与交联剂接触以形成在脂质双层之间具有交联的多层脂质囊泡。在另一方面，本发明提供了一种方法，其包括以有效量将具有交联脂质双层且包含试剂的多层脂质囊泡施用于对象。具有交联脂质双层的多层脂质囊泡可以是任意前述具有交联脂质双层的多层脂质囊泡或者任意本文所述的那些。在一些实施方案中，多层脂质囊泡包含生物可降解脂质。在一些实施方案中，多层脂质囊泡包含磷脂。在一些实施方案中，多层脂质囊泡包含磷酸胆碱、磷酸甘油和/或磷酸乙醇胺。在一些实施方案中，多层脂质囊泡包含官能化脂质。在一些实施方案中，官能化脂质是马来酰亚胺官能化脂质。在一些实施方案中，马来酰亚胺官能化脂质是马来酰亚胺官能化的磷酸乙醇胺。在一些实施方案中，试剂是预防剂。在一些实施方案中，试剂是治疗剂。在一些实施方案中，试剂是抗原。在一些实施方案中，试剂是佐剂。在一些实施方案中，囊泡包含两种或更多种试剂。在一些实施方案中，囊泡包含抗原和佐剂。在一些实施方案中，囊泡包含抗原和两种佐剂。在一些实施方案中，囊泡包含蛋白质抗原以及TLR4激动剂和TLR7激动齐U。在一些实施方案中，抗原如蛋白质抗原存在于囊泡的核心，佐剂存在于囊泡的内部双层之间。
在一些实施方案中，多层脂质囊泡缀合在其外表面上的PEG。在一些实施方案中，对象患有癌症或者有发生癌症的风险。在一些实施方案中，对象有感染或者有发生感染的风险。在一些实施方案中，对象有变态反应或哮喘或者有发生变态反应或哮喘的风险，或者正在经历哮喘发作或有经历哮喘发作的风险。在一些实施方案中，有效量是在对象中刺激免疫应答的量。免疫应答可以是体液应答或细胞应答，或者可以为体液和细胞应答的组合。细胞应答可涉及刺激CD8 T细胞。在另一方面，本发明提供了一种方法，其包括通过对有此需要的对象施用具有交联脂质双层且包含抗原的多层脂质囊泡来在对象中刺激免疫应答，其中将有效量的抗原施用于对象。具有交联脂质双层的多层脂质囊泡可以是任意前述的这样的囊泡或任意本文所述的那些。囊泡可进一步包含一种或更多种佐剂。在一些实施方案中，囊泡包含其核心中的抗原(包括蛋白质抗原)和其脂质双层之间的佐剂。蛋白质抗原可以是全蛋白抗原。佐剂可以是但不限于TLR4激动剂(如MPLA)和TLR7激动剂(如R-848)。在一些实施方案中，囊泡的每mg脂质包含300 400 μ g抗原。在一些实施方案中,囊泡仅施用一次(即，初始(priming)剂量是足够的)。在一些实施方案中，囊泡施用多于一次(例如，初始和加强剂量)。在一些实施方案中，抗原是细菌抗原、病毒抗原、真菌抗原、寄生虫抗原或分枝杆菌抗原。在一些实施方案中，抗原是癌抗原。在一些实施方案中，免疫应答是协同免疫应答。在另一方面，本发明提供了一种方法，其包括在体外使具有交联脂质双层且包含试剂的多层脂质囊泡与细胞或细胞群接触。细胞或细胞群可以是树突状细胞或其他抗原呈递细胞。具有交联脂质双层的多层脂质囊泡可以是任意前述具有交联脂质双层的多层脂质囊泡或任意本文所描述的那些。应当理解，认为在下文中更详细地讨论的前述概念和其他概念的所有组合(前提是这些概念彼此不矛盾)是本发明公开的部分发明主题。特别地，认为在公开内容的末尾出现的所要求保护的对象的所有组合理解是本文公开的部分发明主题。还应当理解，明确地用于本文中且还可出现于通过引用并入的任意公开内容中的术语应当与同本文所公开的特定概念的最一致的含义一致。
图1A.双层间交联多层囊泡(ICMV)的合成的示意图。二价阳离子介导的融合导致形成多层囊泡，其中邻近双层通过DTT交联。在用PEG-硫醇进行的反应中将所得ICMVPEG 化。图1B.通过将多层囊泡中的两个脂质头部基团缀合在一起而形成的ICMV的图示。图2A-D. ICMV的合成。㈧ICMV合成的示意图和冷冻电子显微镜图像⑴从干燥脂质膜制备阴离子的马来酰亚胺官能化脂质体，(ii)添加二价阳离子以诱导脂质体融合并形成MLV，(iii)添加膜可渗透性二硫醇，其在囊泡壁的并列脂质双层上交联马来酰亚胺脂质，以及(iv)用硫醇端化的PEG对所得脂质颗粒进行PEG化。合成的每个步骤的冷冻电子显微镜图像示出⑴初始脂质体，(ii)MLV，以及(iii)具有厚脂质壁的ICMV。比例尺=lOOnm。(iii)的右手边图像示出ICMV壁的放大图像，其中堆叠的双层解析为电子致密条纹；比例尺=20nm。(B)通过动态光散射测量的ICMV颗粒大小柱状图。(C，D)来自冷冻电子显微镜图像ICMV特性的柱状图示出(C)每个颗粒的脂质双层数目，(D)颗粒半径与脂质壁厚度的比率。(η = 165个所分析的颗粒)。图3Α-Β. (A)通过动态光散射测量的颗粒直径的柱状图。⑶ICMV颗粒的冷冻电子显微镜图像。图4Α-Ε.蛋白质包封和从ICMV的释放。(A)在ICMV合成的每个步骤收集的脂质囊泡中球状蛋白质SIV-gag、FLT-3L或OVA的包封效率。(B，C)比较ICMV与脱水-再水化囊泡(DRV)或PLGA纳米颗粒的OVA包封效率(B)和单位颗粒质量的总蛋白质负载(C)。(D)在体外经30天测量的来自在37°C下孵育于具有10%血清的RPMI培养基中的简单脂质 体、MLV或ICMV (均具有基本组成4 5 I DOPC MPB DOPG) OVA释放动力学。还示出用胆固醇和PEG脂质稳定的脂质体(38 57 5D0PC chol PEG-D0PE)的释放动力学的比较。(E)在模拟内溶酶体环境的不同方面的缓冲液中测量来自ICMV的OVA释放还原性缓冲液，IOOmM β -巯基乙醇(β -ME)(在PBS中);酸性缓冲液，50mM柠檬酸钠(ρΗ5· O)；包含脂肪酶的缓冲液、500ng/mL脂肪酶A(在PBS中)。数据表示至少三个实验的平均值土 s_ θ. m (n — 3) ο图5Α-Β.传统脂质体、脂质包被的PLGA颗粒和ICMV中的OVA包封的比较，示出(A)颗粒中包封的OVA的比例和⑶单位总颗粒质量所包封的OVA的量。图6Α-Β6.从(A)PBS和(B)具有10%血清的RPMI培养基中的经超声波处理脂质体、通过Mg2+融合的MLV和通过Mg2+和DTT形成的ICMV释放的0VA。图7A-C.通过添加有TLR激动剂MPLA的ICMV在体外刺激的免疫应答。(A)在存在或不存在O. I μ g/mL MPLA时，用O. 7 μ g/mL可溶性OVA、负载于ICMV中的等剂量OVA或负载有不相关蛋白质(间日疟蛋白，VMP)的ICMV孵育18小时后，脾树突细胞(DC)的细胞表面共刺激标志物⑶40、⑶80和⑶86的表达的流式细胞分析。(B)在存在或不存在0. 05 μ g/mLMPLA 时，将脾 DC 用 10 μ g/mL SI INFEKL 肽(OVA257^264)、5· O μ g/mL 可溶性 OVA、负载于 ICMV中的等量OVA或负载VMP的ICMV孵育18小时，通过流式细胞分析染有识别复合了 H_2Kb的SIINFEKL的25-D1. 16 mAb的细胞来测定OVA的交叉呈递程度。(C)将5-(6)-羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺二酯(CFSE)标记的OVA特异性幼稚OT-I⑶8+T细胞与用与0. I μ g/mLMPLA混合的0. 7 μ g/mL可溶性OVA或等量的与MPLV混合的负载OVA的ICMV脉冲的同基因脾DC共培养。包括无抗原的空ICMV或负载有无关抗原VMP的ICMV作为阴性对照。在第3天通过流式细胞分析OT-I⑶8+ T细胞中CFSE的稀释度来评价⑶8+T细胞的增殖；所示出的是CFSE荧光的柱状图。每个柱状图上的门(gate)示出各样本中分裂细胞的百分数。数据代表至少三个实验的平均值土 s. e. m(n = 3-4)。图8A-B. (A) DC成熟程度和(B)应答于整合有MPLV和/或R-848的ICMV的活化。图9A-F.用ICMV相对于包封于非交联囊泡中的可溶性抗原或抗原进行体内免疫。a, b，通过皮下(s. c.)单次注射可溶性制剂、脂质体制剂、MLV制剂或ICMV制剂(分别与O. I μ gMPLA混合)中递送的10 μ gOVA来免疫C57B1/6小鼠。(A)在用荧光OVA肽-MHC四聚体免疫7天后，通过流式细胞分析外周血单核细胞(PBMC)来测定抗原特异性CD8+T-细胞的百分数。(B)在用OVA特异性IgG免疫21天后，通过ELISA分析来自免疫小鼠的血清。(C，D)用与O. I μ g MPLA混合的10 μ g荧光团缀合OVA作为可溶性制剂、脂质体制剂或ICMV制剂注射C57B1/6小鼠，在第2天测定内化OVA的引流腹股沟淋巴结(dLN)细胞。(C)示出的是OVA摄取阳性的DC(CDllc+)、巨噬细胞(F4/80+)、B细胞(B220+)和浆细胞样DC(CDllc+B220+)的百分数，(D) OVA+群的平均荧光密度(MFI)。(E，F)用与O. I μ g MPLA混合的10μ g OVA作为可溶性制剂、脂质体制剂或ICMV制剂注射C57B1/6小鼠，2天后，通过流式细胞分析分离自引流腹股沟LN的DC以测定DC活化和抗原交叉呈递。(E)重叠频率曲线示出DC中共刺激标记(⑶40和⑶86)和MHC-II的表达。(F)左图示出转染有SIINFEKL-Kb+复合物的腹股沟LN DC的重叠频率曲线，而平均MFI水平示于右图中。数据表示所进行的
2-3 个独立实验的平均值土 s. e. m(n = 3-4), * p < O. 05, * * p < O. 01,按照 Tukey’ sHSD通过单因素ANOVA进行分析。
图10A-B. (A)加强7天后，外周血中的OVA特异性⑶8+T细胞，通过流式细胞分析转染有抗CD8抗体和与OVA衍生肽SIINFEKL复合的肽-MHC四聚体的细胞测定的。(B)在免疫的第21天通过ELISA测量抗OVA抗体滴度。图11A-E.携带水性核心中的抗原和嵌入囊泡壁中的MPLA的ICMV诱发强抗体应答和CD8+T细胞应答。(A)疫苗基团的示意图可溶性OVA与MPLA混合(MPLA)、仅在外表面具有MPLA的负载OVA的ICMV(ext-MPLA LCMV)或者MPLA遍及脂质多层的负载OVA的ICMVQnt-MPLA ICMV) (B-G)在第 0、21 和 35 天用制备为MPLA、ext_MPLA ICMV或 int-MPLAICMV的10 μ g OVA和O. I μ g或I. O μ gMPLA以尾基皮下注射(s. c.)免疫C57B1/6小鼠。(B)血清中总OVA特异性IgG的ELISA分析。(C)通过流式细胞仪分析接种有10 μ gOVA和O. I μ g MPLA的四聚体+⑶8+T细胞随时间测定外周血中OVA特异性T细胞的频数(frequency)。还示出用可溶性0VA+1 μ g MPLA (MPLA 10X)接种的应答用于比较。所示出的是第41天来自一只小鼠的示例性流式细胞散点图，和来自各组小鼠的平均四聚体+值随时间的变化。(D)在第41天，通过染色于来自外周血的四聚体+细胞的⑶44/⑶62L来分析外周血中的T细胞效应因子表型/效应记忆表型/中心记忆表型。所示出的是第41天来自一只小鼠的示例性细胞散点图，和⑶8+ T细胞中tet+CD44+⑶62L+细胞的平均百分数。(E)在第49天，在体外用OVA肽离体再刺激PBMC之后，通过胞内IFN- Y染色测定抗原特异性CD8+T细胞的功能性。示出一只小鼠的IFN- Y +CD8+T细胞的示例性流式细胞柱状图以及得自组的平均结果。数据表示所进行的2个独立实验的平均值±^!11(11 = 3)。与可溶性0VA+MPLV 相比，*，p < O. 05，与 ext-MPLA ICMV 相比，#，p < O. 05，(D，E) *，p < O. 05，**，P < O. 01，按照Tukey ’ s HSD通过两因素ANOVA进行分析。图12A-B.使用“点击”化学的替代性双层间交联反应。(A)从DOPE和炔前体合成炔-头部基团脂质。(B)用炔端化脂质形成脂质体，并由Mg2+诱导形成MLV。然后，用二叠氮化物和如所示出的催化剂孵育含有炔的MLV导致成功地形成ICMV，如用低速离心条件进行颗粒回收后所测量，颗粒产率为83%。发明详述
本发明提供了特别是用于递送试剂的稳定化多层脂质囊泡。基于重组蛋白质的现有技术疫苗避免了毒性和与活疫苗(例如，病毒)载体相关的抗载体免疫，但它们的致免疫力不佳，特别是CD8+T细胞(CD8T)应答。已开发了携带抗原和佐剂分子的合成颗粒以增强亚单位疫苗，但总体来讲这些物质不能在临床前动物模型中引发比得上活载体的CD8T应答。与这些现有技术组合物和方法不同，本发明提供了稳定化多层囊泡，如通过在多层囊泡中交联邻近脂质双层的头部基团而形成的双层间交联多层囊泡(ICMV)。在胞外条件下，这些囊泡稳定地在囊泡核心中截留尤其是蛋白质抗原，并在囊泡壁中截留基于脂质的免疫刺激分子，但在内溶酶体脂肪酶的存在下表现出快速的释放。当用于递送单独的抗原或在佐剂的存在下递送时，本发明的囊泡形成极强的疫苗(例如，全蛋白疫苗)，引发比得上最强疫苗载体的内源T细胞应答和抗体应答。囊泡通过其脂质双层的内部连接(例如，交联)而稳定化。与简单的脂质体或脂质包被的纳米颗粒或微颗粒相比，这些囊泡的稳定化性质使得它们整合更大量的试剂并在更长时间中保留该试剂。它们的持续释放动力学(特别是在血清的存在下)使得它们可用于试剂的体内递送，就体内递送而言，期望缓慢、稳定和延长的释放，或者期望在胞外环境 中缓慢释放而在细胞中快速释放。如在本文中更详细地描述的，本发明涵盖使用具有多个和多种试剂(包括预防剂、治疗剂和/或诊断剂)的这种囊泡。因此，本发明提供了包含前述囊泡的组合物，其合成方法和其使用方法。稳定化多层脂质囊泡(MLV)本发明提供了通过将邻近(或并列)脂质双层彼此连接而稳定化的MLV。如本文所使用的，多层囊泡是具有壳的纳米球或微球，其包含两个或更多个同心排布的脂质双层。如本文所使用的，邻近或并列的脂质双层(或脂质双层表面)意指彼此紧密接近而否则则独立且通常物理分开的双层或表面。该术语并非通常地指一个双层的两个单层之间的关系O如本文所使用的，“连接”意指两个实体通过任意物理化学方式彼此稳定地结合。可使用本领域普通技术人员已知的任意连接包括共价或非共价连接，但优选共价连接。在本文所述的一些重要实施方案中，MLV中邻近(或并列)脂质双层之间的共价连接通过使用交联剂和脂质双层的官能化组分来实现。但是，本发明考虑了可以以其它方式实现连接，包括共价连接。作为示例，本发明考虑了以下方法，其中互补反应基团存在于邻近双层表面的组分上，通过使这些基团彼此反应(即使在不存在交联剂的情况下)来完成双层表面之间的连接。合适的互补反应基团在本领域中已知并描述于本文中。囊泡的内部通常是水性环境的，并且其可包含试剂例如但不限于预防剂、治疗剂或诊断剂。在一些情况中，囊泡不包含固体核心，如固体聚合物核心(例如，合成的聚合物核心)。代替地，如上所述，它们可以具有包含目的试剂的流体核心。在一些情况中，核心可包含用于聚合成为水凝胶核心的单体。在本文中，还可将囊泡称为颗粒，包括纳米颗粒或微颗粒，但应当理解，这样的纳米颗粒或微颗粒具有本发明的稳定化MLV和双层间交联多层脂质囊泡(ICMV)的特性。如图1A、IB和2A所示，囊泡可以在其核心具有空隙体积和/或它们可以在其核心和/或邻近(或并列)脂质双层之间包含一种或更多种试剂。试剂通常在合成过程中包含于脂质溶液中，并且以该方式在合成过程中整合(例如通过包封)入囊泡中。在形成囊泡时亲脂分子还可以被直接整合入脂质双层中，或者在囊泡形成过程中具有亲脂性尾的分子可锚定至脂质双层。可以在不存在烈性(harsh)溶剂(如有机溶剂)时生成囊泡，因此，它们可以包封多种试剂，包括易受有机溶剂等影响的那些。囊泡中试剂的量可以不同并且可取决于试剂的性质。如实施例中所表明的,每mg脂质可将300 400 μ g蛋白质试剂整合入本发明的囊泡中。在一些实施方案中，对于每mg脂质，囊泡可包含约100 μ g试剂，或约150 μ g试剂，或约200 μ g试剂，或约250 μ g试剂，或约300 μ g试剂，或约325 μ g试剂，或约350 μ g试剂，或约375 μ g试剂，或约400 μ g试齐U，或约410 μ g试剂。在一些实施方案中，试剂可以是蛋白质如蛋白质抗原。本发明的囊泡还可以表征为其滞留特性(retention profile)。在一些实施方案中，当置于含血清的基质(例如，10%血清)中且保持在37°C下时，囊泡以每周约25%的速率释放试剂。在一些实施方案中，在这些条件下，囊泡在第一周释放约25 %的试剂，在约30天后释放多至约90%。在一些实施方案中，当在4°C下于缓冲液(如PBS)中保存30天时，囊泡保持其试剂的至少80%、至少85%、至少90%或至少95%。 每个囊泡中脂质双层的数目可不同，通常范围为至少2个至约50个，或者至少2个至约25个，或者至少2个至约15个，或者至少2个至约10个，或者至少2个至约5个。囊泡的直径可不同。在一些情况中，囊泡的直径范围为约IOOnm至约500nm,包括约125nm至约300nm,包括约150nm至约300nm,包括约175nm至约275nm。在一些情况中，直径范围为约150nm至约250nm。如本实施例中所述制备的ICMV的直径特性示于图2B和3A中。应当理解，在任意囊泡制剂中，在涉及囊泡直径、脂质双层数目、所负载的试剂的量等时，囊泡之间会有异质性。这些的分布示于实施例中。如本文所使用的，本发明的囊泡还可以称为脂质体(例如稳定化多层脂质体，或如下所述，双层间交联多层脂质体)。因此，术语“囊泡”的使用并不意在表示囊泡的来源或起源。如将在下文中更详细地描述的，本发明的囊泡是合成囊泡(即，它们在体外生成)。囊泡可以被分离，意指将它们从合成其的环境中整体或部分地物理上分离。作为示例，包含试剂(即，它们的“负载物(cargo)”或“装载物(payload)”)的囊泡可以与缺少试剂的囊泡(即，空囊泡)整体或部分地分离，于是可以被称为“分离的囊泡”。分离可以基于重量(或质量)、密度(包括浮力密度)、大小、颜色(例如其中囊泡的装载物可通过其能量发射检测)等分离。如实施例中所述，可使用离心将本发明的囊泡与简单脂质体或不具有交联双层的相同脂质组成的MLV分离。以约14000g离心约4分钟足以将本发明的囊泡(其沉淀)与这些其它颗粒类型分离。双层间交联多层脂质囊泡本发明的稳定化MLV的一个例子是双层间交联多层(脂质)囊泡(ICMV)。如同上述稳定化MLV, ICMV是具有壳的纳米球或微球，其包含本文所述的彼此缀合的两个或更多个同心排布的脂质双层。稳定化多层囊泡(包括ICMV)中脂质双层的数目可以为约2 30不等，但更通常在2 15的范围内。因此，在多个实施方案中，层的数目可以是2、3、4、
5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多。得自一个ICMV示例性合成的双层数目的频数分布示于图2C中。双层通常包含具有以类似于细胞膜的方式(即，亲水头部通常暴露于水性环境而疏水尾部包埋于双层中)排布的亲水头部和疏水尾部的脂质。ICMV通过其脂质双层之间的交联而稳定化，并且因此将它们称为“双层间交联”MLV。如本文所使用的，这意味着在囊泡的壳中至少两个脂质双层彼此交联。交联的双层通常是彼此并列或邻近的那些。壳中的大多数或所有脂质双层可以与壳中与其并列的脂质双层交联。在脂质双层之间可以有一个或更多个交联。通常，脂质双层之间将有多个交联。这样的交联的排布和位置可以是随机的或非随机的。交联程度(以及所产生的囊泡的稳定性)将取决于用于形成囊泡的官能化脂质(或其它脂质双层组分)的比例和交联条件(包括，例如用交联剂孵育囊泡的时间)。应当理解，所有其它因素和参数相同的情况下，囊泡中官能化脂质(或其它脂质双层组分)的比例越高，就会形成越多交联。类似地，条件越有利于交联，就会获得越大程度的交联。合成方法示例性合成方法如下合并脂质和任选的其它双层组分以形成均匀混合物。这可以在其中脂质被干燥以形成脂质膜的干燥步骤中发生。然后将该脂质与水性溶剂合并(例如，再水化)。水性溶剂的pH可以为约6至约8，包括pH为约7。使用与囊泡融合相容的缓冲液，通常用低浓度盐。实施例中所使用的溶剂是IOmM bis-tris丙烷(BTP)缓冲液(pH7.0)。如表IA所示，缓冲液的性质可以影响孵育时长。例如，所有其它条件相同的情况下，·与缓冲液如BTP相比，缓冲液如PBS可需要更长的孵育时间。如果缓冲液是PBS，孵育时间则可以是约6-24小时，或8-16小时，或10-12小时。如果缓冲液是BTP，孵育时间则可以较短，包括1-4小时或1-2小时。因此，可以使用多种水性缓冲液，前提是还使用足够的孵育时间。该步骤还可以包括存在待被整合入囊泡的试剂。然后，用一种或更多种二价阳离子孵育所得脂质体以将它们融合为多层囊泡。合适的二价阳离子包括Mg2+、Ca2+、Ba2+或Sr2+。多价或聚合阳离子也可用于囊泡融合。囊泡融合也可以通过将阳离子囊泡与二价或更高价阴离子混合来获得；一个例子是将阳离子脂质体与DNA寡核苷酸或DNA质粒融合。这可在搅拌如超声、漩涡等条件下完成。如果脂质体在试剂的存在下制成，那么MLV将在其核心中和/或同心排布的脂质双层之间包含试剂。本发明考虑了融合携带不同试剂的脂质体以形成包含这些试剂的MLV。然后用交联剂孵育所得MLV，优选膜可渗透性交联剂。如本文所述，交联剂的性质根据被连接在一起的反应基团的性质而不同。如实施例中所表明的，可以使用包含二硫醇的交联剂如DTT或(1，4_ 二-[3’_(2’_吡啶基二硫代)-丙酰胺基]丁烷)交联包含马来酰亚胺官能化脂质(或其它官能化脂质双层组分)的MLV，或者如图12所示，可以使用二叠氮化物交联剂通过“点击”化学交联炔头部基团脂质。这些多种孵育均在PH范围为约6至约8或者约6. 5至约7. 5或约7的水性条件下进行。交联步骤可以在室温(例如，20-25°C )或升高的温度(包括例如多至或高于37°C )下进行。然后，可以收集(例如通过离心或其它沉淀方法)所得交联囊泡，洗涤然后通过用硫醇-PEG孵育在其最外面或外表面(例如，如本文所使用的，囊泡可称为“表面PEG化”或与PEG “表面缀合”)PEG化。PEG可以为任意大小，包括但不限于O. l_10kDa、0. 5_5kDa或l-3kDa。2kDa用硫醇官能化的PEG用于实施例中。孵育时间可以为约10分钟至2小时，但根据其它条件如温度、浓度等其可以更短或更长。PEG化步骤可以在室温(例如，20-25°C)或升高的温度(包括例如多至或高于37°C )下进行。在实施例的示例性性合成方法中使用30分钟的孵育时间。然后，可以收集囊泡(例如，通过离心或其他沉淀方法)并用水或其它水性缓冲液洗涤。
可以在4°C下将囊泡保存与缓冲溶液例如但不限于PBS中，或者可以在合适的冻存剂的存在将它们冻干，然后在_20°C下保存。合适的冻存剂包括含蔗糖的那些(例如，1-5%蔗糖溶液，优选约3%蔗糖溶液)。还可以通过使一个双层中的反应基团与邻近双层中的互补反应基团结合来完成交联。例如，包含琥珀酰亚胺酯官能化脂质(A)头部基团和含有伯胺(B)头部基团的融合囊泡可以通过邻近双层的A脂质与B脂质之间的原位反应完成交联。可以以类似的方式使用本领域技术人员公知的多种其它互补官能化脂质。官能化脂质(或脂质双层的其它官能化组分)与交联剂的摩尔比可以根据条件而不同。在一些情况下，它可以为约I至约5。在一些实施方案中，摩尔比为2(即官能化脂质(或组分)与交联剂的摩尔比为2 I)就足够了。一些实施例中描述了使用摩尔比为2 I的马来酰亚胺官能化脂质与DTT来交联囊泡的脂质双层的合成方法。孵育时间可以为I小时至24小时、2-18小时、2小时至12小时，或者2小时至6小时。在一些情况下，其 可以为约2小时。在另一些情况下，其可以为过夜(例如，约12小时)。囊泡中官能化脂质的摩尔％可以为1%至100%，或者在一些情况下为约10%至约60%，或者在一些情况下为约25%至约55%。在一些情况下，囊泡中官能化脂质的摩尔％通常为至少10%，优选至少15%，更优选至少20%，甚至更优选至少25 %。表IA和IB示出在不存在官能化脂质时，未形成囊泡。相反，非官能化脂质可以以约0%至99%的摩尔％存在。更通常地，非官能化脂质可以以约40% -75%或40%至60%的摩尔％存在。在一个重要实施方案中，使用DOPC、DOPG和马来酰亚胺官能化DSPE合成囊泡。这些脂质彼此之间的比率可不同。表IA和IB示出改变DOPC DOPG :马来酰亚胺官能化脂质的比率对囊泡产率的影响。DOPC的摩尔％可以为1-50%，DOPG的摩尔％可以为1-50%，马来酰亚胺官能化脂质的摩尔％可以为1-80%。本发明的一些实施方案提供了DOPC DOPG 马来酰亚胺官能化脂质比率为40 10 50的囊泡。一些实施方案提供了 DOPC DOPG :马来酰亚胺官能化脂质比率为60 15 25的囊泡。一些实施方案提供了包含DOPG和马来酰亚胺官能化脂质的囊泡。脂质囊泡包含一种或更多种脂质。脂质的类型、数目和比率可不同，前提是它们共同形成球状双层(即，囊泡)。脂质可以从天然来源分离，或者它们可以无需任何天然来源地合成。脂质的至少一种(或一些)是两亲脂质，定义为具有亲水部分和疏水部分(通常为亲水头部和疏水尾部)。疏水部分通常朝向疏水相(例如，双层内)，而亲水部分通常朝向水相(例如，双层外，并且可能在邻近并列的双层表面之间)。亲水部分可包含极性或带电基团如碳水化合物、磷酸、羧基、硫酸根、氨基、巯基、硝基、羟基以及其它类似基团。疏水部分可包含非极性基团，包括但不限于长链饱和和不饱和脂肪族烃基和由一种或更多种芳族基团、脂环族基团或杂环基团取代的基团。两亲化合物的例子包括但不限于磷脂、氨脂和鞘脂。通常，脂质是磷脂。磷脂包括但不限于磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸等。应当理解，可以使用其它脂质膜组分，如胆固醇、鞘磷脂、心磷月旨等。脂质可以是阴离子脂质和中性(包括两性离子和极性)脂质，包括阴离子磷脂和中性磷脂。在选定pH下，中性脂质以不带电或中性两性离子的形式存在。在生理pH下，这样的脂质包括例如，二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、二酰磷脂酰胆碱、二酰磷脂酰乙醇胺、神经酰胺、鞘磷脂、脑磷脂、胆固醇、脑苷脂和二酰甘油。两性脂质的例子包括但不限于二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二肉豆蘧酰磷脂酰胆碱(DMPC)和二油酰磷脂酰丝氨酸(DOPS)。阴离子脂质是在生理PH下带负电的脂质。这些脂质包括但不限于磷脂酰甘油、心磷脂、二酰磷脂酰丝氨酸、二酰磷脂酸、N-十二酰磷脂酰乙醇胺、N-琥珀酰磷脂酰乙醇胺、N-戊二酰磷脂酰乙醇胺、赖氨酰磷脂酰甘油、棕榈酰油酰磷脂酰甘油(POPG)以及与中性脂质结合的其它阴离子修饰基团。阴离子脂质和中性脂质在本文中共同称为非阳离子脂质。这样的脂质可以包含磷但它们并不限于此。非阳离子脂质的例子包括卵磷脂、溶血卵磷脂、磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蘧酰磷酸乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)、棕榈酰油酰磷脂酰乙醇胺(POPE)、棕榈 酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)、蛋磷脂酰胆碱(EPC)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、棕榈酰油酰磷脂酰甘油(POPG)、16-0-单甲基PE、16-0- 二甲基PE、18_1_反式PE、棕榈酰油酰磷脂酰乙醇胺(POPE)、I-硬脂酰-2-油酰-磷脂酰乙醇胺(SOPE)、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、鞘磷脂、脑磷脂、心磷脂、磷脂酸、脑苷脂、磷酸二鲸蜡和胆固醇。另一些不含磷的脂质包括硬脂胺、十二胺、十六胺、棕榈酸乙酰酯、蓖麻醇酸甘油酯、硬脂酸十六酯、肉豆蘧酸异丙酯、两性丙烯酸聚合物、三乙醇胺十二烷基硫酸酯、烷基-芳基硫酸酯聚乙氧基化的脂肪酰胺、双十八基二甲基溴化铵等、二酰基磷脂酰胆碱、二酰基磷脂酰乙醇胺、神经酰胺、鞘磷脂、脑磷脂和脑苷脂。在一些情况下，可以使用脂质如溶血磷脂酰胆碱和溶血磷脂酰乙醇胺。非阳离子脂质还包括聚乙二醇基聚合物如PEG 2000、PEG 5000和与磷脂或神经酰胺缀合的聚乙二醇(称为PEG-Cer)。在一些情况下，可以使用经修饰形式的脂质，包括用可检测标记如荧光素修饰的形式。在一些情况下，脂质是发出信号(例如，荧光信号)的脂质类似物。实例包括但不限于1，1’ -双十八基-3，3，3’，3’ -四甲基吲哚苯基三碳菁碘化物(DiR)和1，1’ -双十八基-3，3，3’，3’ -四甲基吲哚二碳菁(DiD)。优选地，脂质是生物可降解的以使得在体内和/或在体外释放所包封的试剂。生物可降解脂质包括但不限于I，2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(二油酰-磷酸胆碱，D0PC)、阴离子I，2-二-(9Z-十八烯酰)-sn-甘油基-3-磷基-(I' -rac-甘油)(二油酰磷酸甘油，D0PG)和1，2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(二硬脂酰磷酸乙醇胺，DSPE)。还可以整合和非脂质膜组分如胆固醇。官能化脂质或双层组分脂质双层的至少一种组分必须是官能化的(或者有反应性)。如本文所使用的，官能化组分是包含可用于交联多层囊泡的邻近双层的反应基团的组分。可将双层组分修饰为包含反应基团。用于合成囊泡的一种或更多种脂质可以是官能化脂质。如本文所使用的，官能化脂质是具有可用于交联多层囊泡的邻近双层的反应基团的脂质。在一些实施方案中，反应基团是与交联剂(或其它部分)反应以在这些官能化脂质之间(因而在囊泡中的脂质双层之间)形成交联。反应基团可以位于允许其接触交联剂并与邻近并列双层中的另一种脂质交联的脂质上的任意位置。在一些实施方案中，其在脂质(包括例如磷脂)的头部基团中。反应基团的一个例子是马来酰亚胺基团。马来酰亚胺基团可以在二硫醇交联剂(例如但不限于二硫醇苏糖醇(DTT))存在下彼此交联。官能化脂质的一个例子是1，2_ 二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[4-(对-马来酰亚胺苯基)丁酰胺，其在本文中称为MPB0这些实施例说明官能化脂质在合成本发明的囊泡中的用途。官能化脂质的另一例子是I，2- 二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[马来酰亚胺(聚乙二醇)2000](也称为马来酰亚胺-PEG 2k-PE)。官能化脂质的又一例子是二油酰基-磷脂酰乙醇胺4-(N-马来酰亚胺甲基)_环己烷-I-羧酸酯(DOPE-mal)。应当理解，本发明涵盖使用其它官能化脂质、其它官能化脂质双层组分、其它反应基团以及其它交联剂。除马来酰亚胺基团以外，反应基团的另一些例子包括但不限于其它硫醇反应基团、氨基如伯胺和仲胺、羧基、羟基、醛基、炔基、叠氮基、羰基、卤代酰基(例如 碘代酰基)、酰亚胺酯基、N-羟基琥珀酰亚胺酯、巯基、吡啶二硫基等。官能化和非官能化脂质可得自多种商业来源，包括Avanti PolarLipids (Alabaster, Alabama)。应当理解，本发明涵盖使多层囊泡中的邻近双层彼此连接的多种方法。在一些情况下，使用交联剂以形成邻近双层之间的连接。但本发明并不限于此。作为示例，可以采用点击化学形成囊泡。如下，一种示例性合成方法使用炔修饰的脂质和炔-叠氮化物化学。通过将脂质如1，2-二油酰基-Sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DOPE，744mg, ImmoI)与丙炔酸的N-轻基琥拍酰亚胺酯(167mg, Immol)和Et3N(202mg, 2mmol)在5mL⑶Cl3中混合以形成炔修饰的脂质。通过NMR监测该反应。室温下3小时之后，反应完成。用5mL 5% Na2CO3^ I % HCl和盐水洗涤该有机溶液之后，经Na2SO4干燥并蒸发，并对炔修饰的DOPE进行称重。制备DOPC与炔-DOPE的摩尔比为I : I的I. 26 μ mo I脂质膜，水化、超声处理并如上所述用IOmM Mg2+诱导融合。在室温下，将具有炔官能化脂质的MLV用
2.5mM CuSO4、铜线和I. 5mM 1，14-二叠氮基-3，6，9，12-四氧杂十四烷孵育24小时。洗涤三次之后通过离心测量颗粒产率。交联剂根据脂质双层中彼此连接的反应基团的性质，交联剂可以是同型双功能交联剂(homobifunctional crosslinker)或异型双功能交联剂(heterobifunctionalcrosslinker)。在本文中可互换使用术语“交联剂”和“交联试剂”。同型双功能交联剂具有两个相同反应基团。异型双功能交联剂具有两个不同反应基团。在一种情况下，邻近双层使用相同官能化脂质(或其它双层组分)和交联剂(如同型双功能交联剂)彼此交联。在另一情况下，邻近双层使用不同官能化脂质(或其它双层组分)和交联剂(如异型双功能交联剂)彼此交联。多种类型的市售交联剂与以下基团中一种或更多种反应马来酰亚胺基、伯胺、仲胺、巯基、羧基、羰基和碳水化合物。胺特异性交联剂的例子是双(璜基琥珀酰亚胺基)辛二酸酯、双[2-(琥珀酰亚胺基氧基羰基氧基)乙基]砜、二琥珀酰亚胺基辛二酸酯、二琥珀酰亚胺基酒石酸酯、二甲基己二酯·2Ηα、二甲基庚二亚胺酯·2Ηα、二甲基辛二亚胺酯·2Ηα和乙二醇双-[琥珀酰亚胺-[琥珀酸酯]]。与巯基反应的交联剂包括双马来酰亚胺基己烧、1，4_ 二-[3' -(2 '-批唳基二硫代)-丙酰胺基)]丁烧、I-[对-叠氮基水杨酰胺基]-4-[碘代乙酰胺基]丁烷和N-[4-(对-叠氮基水杨酰胺基)丁基]-3' -[2'-吡啶基二硫代]丙酰胺。优先与碳水化合物反应的交联剂包括叠氮基苯甲酰肼。优先与羧基反应的交联剂包括4-[对-叠氮基水杨酰胺基]丁胺。二硫醇交联剂如二硫苏糖醇(DTT)、1，4-二-[3’_(2’_吡啶基二硫代)-丙酰胺基]丁烷(DTOPB)，在一些情况下，可以使用包含硫醇的聚合物(如(PEG)-SH2)交联马来酰亚胺反应基团。DTT的结构是
权利要求
1.多层脂质囊泡，其在脂质双层之间具有交联。
2.权利要求I所述的多层脂质囊泡，其中所述囊泡包含官能化脂质。
3.权利要求I或2所述的多层脂质囊泡，其中所述囊泡包含磷酸胆碱。
4.权利要求1、2或3所述的多层脂质囊泡，其中所述囊泡包含磷酸甘油。
5.权利要求2、3或4所述的多层脂质囊泡，其中所述官能化脂质是马来酰亚胺官能化脂质。
6.前述权利要求中任一项所述的多层脂质囊泡，其中所述囊泡包含试剂。
7.权利要求6所述的多层脂质囊泡，其中所述试剂是预防剂、治疗剂或诊断剂。
8.权利要求6所述的多层脂质囊泡，其中所述试剂是抗原。
9.权利要求6所述的多层脂质囊泡，其中所述试剂是佐剂。
10.权利要求6所述的多层脂质囊泡，其中所述试剂是蛋白质。
11.权利要求6所述的多层脂质囊泡，其中所述试剂包封于所述囊泡中。
12.权利要求6或11所述的多层脂质囊泡，其中所述试剂包封于所述脂质双层之间。
13.权利要求I至12中任一项所述的多层脂质囊泡，其中所述囊泡与聚乙二醇(PEG)三双口 ο
14.权利要求I至13中任一项所述的多层脂质囊泡，其中所述囊泡包含DOPC、DOPG和马来酰亚胺官能化脂质。
15.权利要求14所述的多层脂质囊泡，其中所述马来酰亚胺官能化脂质是马来酰亚胺官能化磷酸乙醇胺。
16.组合物，其包含权利要求I至15中任一项所述的多层脂质囊泡和可药用载体。
17.组合物，其包含权利要求I至15中任一项所述的多层脂质囊泡和适于冻干的赋形剂。
18.组合物，其包含权利要求17所述的多层脂质囊泡，其中所述适于冻干的赋形剂包含蔗糖。
19.方法，其包括 使包含官能化脂质的脂质体与二价阳离子接触以形成融合的脂质体，和 使所述融合的脂质体与交联剂接触以形成在脂质双层之间具有交联的多层脂质囊泡。
20.权利要求19所述的方法，其中所述官能化脂质是马来酰亚胺官能化脂质。
21.权利要求19或20所述的方法，其中所述脂质体包含磷酸胆碱。
22.权利要求19、20或21所述的方法，其中所述脂质体包含磷酸甘油。
23.权利要求19所述的方法，其中所述脂质体包含马来酰亚胺官能化脂质、磷酸胆碱和磷酸甘油。
24.权利要求19至23中任一项所述的方法，其中所述官能化脂质是官能化磷酸乙醇胺。
25.权利要求23所述的方法，其中所述马来酰亚胺官能化脂质是马来酰亚胺官能化磷酸乙醇胺。
26.权利要求19至25中任一项所述的方法，其中所述交联剂是二硫醇交联剂。
27.权利要求19至25中任一项所述的方法，其中所述交联剂是二硫苏糖醇(DTT)。
28.权利要求19至27中任一项所述的方法，其还包括使聚乙二醇(PEG)缀合到在脂质双层之间具有交联的所述多层脂质囊泡的表面。
29.权利要求19至28中任一项所述的方法，其中所述二价阳离子是Ca2+。
30.权利要求19至29中任一项所述的方法，其中所述二价阳离子是Mg2+。
31.权利要求19至30中任一项所述的方法，其中所述接触发生于水性缓冲液中。
32.权利要求19至31中任一项所述的方法，其中所述脂质体包含试剂。
33.权利要求32所述的方法，其中所述试剂是预防剂、治疗剂或诊断剂。
34.权利要求I至15中任一项所述的方法，其中使用摩尔比为40 10 50的DOPC、DOPG和马来酰亚胺官能化脂质制备所述脂质体。
35.权利要求8中任一项所述的方法，其中二硫醇交联剂与马来酰亚胺官能化脂质的摩尔比为I : 2。
36.方法，其包括 使包含官能化脂质的多层脂质囊泡与交联剂接触以形成在脂质双层之间具有交联的多层脂质囊泡。
37.方法，其包括 以有效量向对象施用具有交联脂质双层且包含试剂的多层脂质囊泡。
38.权利要求37所述的方法，其中所述多层脂质囊泡包含生物可降解脂质。
39.权利要求37或38所述的方法，其中所述多层脂质囊泡包含磷脂。
40.权利要求37、38或39所述的方法，其中所述多层脂质囊泡包含磷酸胆碱、磷酸甘油和/或磷酸乙醇胺。
41.权利要求37至40中任一项所述的方法，其中所述多层脂质囊泡包含官能化脂质。
42.权利要求41所述的方法，其中所述官能化脂质是马来酰亚胺官能化脂质。
43.权利要求42所述的方法，其中所述马来酰亚胺官能化脂质是马来酰亚胺官能化磷酸乙醇胺。
44.权利要求37至43中任一项所述的方法，其中所述试剂是预防剂。
45.权利要求37至43中任一项所述的方法，其中所述试剂是治疗剂。
46.权利要求37至45中任一项所述的方法，其中所述试剂是抗原。
47.权利要求37至45中任一项所述的方法，其中所述试剂是佐剂。
48.权利要求37至45中任一项所述的方法，其中所述多层脂质囊泡包含多于一种试剂。
49.权利要求37至45中任一项所述的方法，其中所述多层脂质囊泡包含两种试剂。
50.权利要求49所述的方法，其中所述多层脂质囊泡包含抗原和佐剂。
51.权利要求37至50中任一项所述的方法，其中所述多层脂质囊泡在其外表面与PEG三双口 ο
52.方法，其包括 使具有交联脂质双层且包含试剂的多层脂质囊泡与细胞在体外接触。
全文摘要
本发明提供了包含稳定化多层囊泡的递送系统，以及其组合物、合成方法和使用方法。所述稳定化多层囊泡可包含预防剂、治疗剂和/或诊断剂。
文档编号A61K39/00GK102917690SQ201180023709
公开日2013年2月6日 申请日期2011年3月19日 优先权日2010年3月19日
发明者达雷尔·J·欧文, 文宰显 申请人:麻省理工学院