专利名称：方法及组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及真核细胞培养和组织工程的领域，并提供了用于真核细胞培养和制备的方法及组合物(combination),其中蜘蛛丝蛋白的聚合物用作细胞支架材料。背景蜘蛛丝是天然的高性能聚合物，由于强度和弹性的组合物而获得了非同寻常的韧性。蜘蛛具有多达七个不同的腺，这些腺产生具有不同机械性质和功能的多种丝类型。由主壶腹腺产生的拖丝(dragline silk)是最坚韧的纤维，且在重量基础上它胜过人造材料，例如高强度钢(tensile steel)。在用于医疗或技术目的的新材料的开发中，拖丝的性质是有吸引力的。拖丝由两种主要的多肽组成,大多被称为主壶腹腺拖丝蛋白(spidroin) (MaSp) I 和2,但在例如，在十字园蛛(Araneus diadematus)中被称为ADF-3和ADF-4。这些蛋白质具有200_720kDa范围内的分子量。编码黑寡妇蜘蛛(Latrodectus hesperus)的拖丝蛋白的基因是仅有的已被完全表征的基因，且MaSp I和MaSp 2基因分别编码312 9和3779 个氨基酸(Ayoub NA 等人 PLoS ONE 2 (6) : e514, 2007)。Huemmerich, D.等人 Curr.Biol. 14, 2070-2074(2004)中讨论了拖丝多肽的性质。蜘蛛拖丝蛋白质或MaSp具有分成三部分的组成无重复的N-端结构域、由许多重复的聚Ala/Gly区段构成的中心重复区域和无重复的C-端结构域。通常认为重复区域在丝纤维中形成分子间接触，但不太清楚末端结构域的准确功能。还认为与纤维形成相联系地，重复区域经历从无规卷曲和α-螺旋构象到β-折叠结构的结构转化。拖丝蛋白的C端区域在蜘蛛种类和丝类型之间通常是保守的。蜘蛛丝的N端结构域是最保守的区域(Rising, A.等人 Biomacromolecules 7,3120-3124(2006))。W003/057727公开了可溶性重组丝多肽在哺乳动物细胞系和动物中的表达。所获得的丝多肽在含水介质中显示出差的溶解度和/或形成沉淀。因为所获得的丝多肽不自发聚合，所以为获得聚合物或纤维需要离心。W007/078239 和 Stark, M.等人 Biomacromolecules 8,1695-1701，(2007)公开了
由具有高的Ala和Gly含量的重复片段和蛋白质的C端片段组成的微型蜘蛛丝蛋白，以及包含蜘蛛丝蛋白的可溶性融合蛋白。在蜘蛛丝蛋白从其融合配体释放后，自然地获得蜘蛛丝蛋白的纤维。小的融合单元对于纤维形成是充分且必要的。Hedhammar, M.等人 Biochemistry 47, 3407-3417, (2008)研究了热、pH 和盐对重组的N端和C端拖丝蛋白结构域和包含四个富含聚-Ala和Gly的共嵌段的重复性拖丝蛋白结构域的结构和聚集和/或聚合的影响。迄今为止关于重组蜘蛛丝的生物相容性的体外研究很少，且所研究的材料在氨基酸序列、产生方式和形式方面变化很大。发明描述一方面，本发明提供了用于培养真核细胞的方法，包括-提供待培养的真核细胞的样品；
-将所述样品应用到细胞支架材料；以及-在适合细胞培养的条件下保持具有已对其应用的细胞的所述细胞支架材料。该细胞支架材料包含蜘蛛丝蛋白的聚合物。第二方面，本发明提供了用于制备真核细胞的方法，包括-提供真核细胞样品；-将所述样品应用到细胞支架材料；-在适合细胞培养的条件下保持具有已对其应用的细胞的所述细胞支架材料；以及
-由所述细胞支架材料制备细胞样品。该细胞支架材料包含蜘蛛丝蛋白的聚合物。 本发明人已发现包含蜘蛛丝蛋白的聚合物的细胞支架材料提供了对在各种不同条件下培养真核细胞有益的环境。此外，该环境使得能够建立以其他方式建立非常困难、非常昂贵或甚至不可能在实验室中培养的细胞培养物，并且用于建立对组织工程和/或移植有用的包含细胞的材料。在其某些实施方式中，培养或制备方法可在包括将具有已对其应用的细胞的细胞支架材料保持在无血清培养基中的条件下进行。在无血清培养基中培养细胞的可能性提供对使用含血清培养基和/或含特定生长因子或细胞外基质(ECM)组分的培养基的一种有成本效益的且受控的替代方案。这种类型的培养基通常是非常昂贵的，有时甚至过高地昂贵且是不均质的。第三方面，本发明提供了真核细胞和包含蜘蛛丝蛋白的聚合物的细胞支架材料的组合物。根据本发明的该组合物可以各种不同的形式呈现，并被调整为适合特定情况的需要。应设想，例如，本发明的组合物作为用于替代受损或患病组织中的细胞的含细胞植入物可能是有用的。在本文陈述的方法和组合物的某些实施方式中，真核细胞是哺乳动物细胞，例如人细胞。在其他实施方式中，真核细胞是非哺乳动物细胞，例如昆虫或酵母细胞。在下列多级列表中列出了可通过根据本发明的方法培养或制备或被包括在根据本发明的组合物中的哺乳动物细胞的非限制性实例皮肤系统的细胞角化上皮细胞表皮角质形成细胞(分化的表皮细胞)表皮基底细胞(干细胞)指甲和趾甲的角质形成细胞甲床基底细胞(干细胞)髓质头发轴细胞皮质头发轴细胞表皮的头发轴细胞表皮的头发轴细胞赫胥黎层的毛根鞘细胞亨勒层的毛根鞘细胞外毛根鞘细胞
毛发基质细胞(干细胞)湿分层屏障的上皮细胞角膜、舌、口腔、食道、肛管、远端尿道和阴道的分层鳞状上皮的表面上皮细胞角膜、舌、口腔、食道、肛管、远端尿道和阴道的上皮的基底细胞(干细胞)泌尿上皮细胞(衬膀胱和输尿管)腺细胞外分泌件h皮细朐唾液腺粘液细胞(富含多糖性分泌)·
唾液腺浆液细胞(富含糖蛋白酶性分泌)舌中的冯埃布纳腺细胞(冲洗味蕾)乳腺细胞(乳汁分泌)泪腺细胞(泪液分泌)耳中的耵聍腺细胞(蜡分泌)外分泌汗腺暗细胞(糖蛋白分泌)外分泌汗腺亮细胞(小分子分泌)顶分泌汗腺细胞(性激素敏感的气味分泌)眼睑中的睫毛腺细胞(特化汗腺)皮脂腺细胞(富含脂质的皮脂分泌)鼻中的鲍曼腺细胞(冲洗嗅觉上皮)十二指肠中的布伦纳腺细胞(酶和碱性粘液)精囊细胞(分泌精液组分,包括精子游动所需的果糖)前列腺细胞(分泌精液组分)尿道球腺细胞(粘液分泌)巴多林腺细胞(阴道润滑剂分泌)尿道腺细胞(粘液分泌)子宫内膜细胞(碳水化合物分泌)呼吸道和消化道的孤立杯状细胞(粘液分泌)胃壁粘液细胞(粘液分泌)胃腺产酶细胞(胃蛋白酶原分泌)胃腺壁细胞、泌酸细胞(盐酸分泌)肠嗜铬细胞样(ECL)细胞(释放组胺)胰腺泡细胞(碳酸氢盐和消化酶分泌)小肠的帕内特细胞(溶菌酶分泌)肺的II型肺细胞(表面活性物质分泌)肺的克拉拉细胞激素分泌细胞垂体前叶细胞生长激素细胞催乳素细胞
促甲状腺素细胞促性腺素细胞促肾上腺皮质素细胞垂体中叶细胞，分泌黑素细胞刺激性激素大细胞的神经分泌细胞分泌催产素分泌血管升压素肠道和呼吸道细胞包括在朗格汉斯小岛中的细胞α细胞(产生胰高血糖素)、β细胞(产生胰岛素的细胞)、δ细胞(产生促生长素抑制素的细胞)、PP细胞(产生胰多肽)、ε细胞(产生生长素释放肽)分泌血清素分泌内啡肽分泌胃泌素分泌促胰液素分泌缩胆囊素分泌铃蟾肽甲状腺细胞甲状腺上皮细胞滤泡旁细胞甲状旁腺细胞甲状旁腺主细胞嗜酸性细胞肾上腺细胞嗜铬细胞分泌类固醇激素(盐皮质激素、雄性激素和糖皮质激素)分泌睾酮的睾丸间质细胞卵泡的分泌雌性激素的卵泡内膜细胞破裂的卵泡的黄体细胞分泌孕酮颗粒黄体细胞泡膜黄体细胞球旁细胞(肾素分泌)肾的致密斑细胞肾的极周细胞肾的系膜细胞代谢和贮藏细胞肝细胞(肝脏细胞)白色脂肪细胞(脂肪细胞/胚细胞)褐色脂肪细胞
肝脏脂细胞屏障功能细胞(肺、肠、外分泌腺和泌尿生殖道)置肾小球泌酸细胞肾小球足细胞肾近端小管刷状缘细胞髓襻细段细胞肾远端小管细胞肾集合管细胞其他I型肺细胞(肺的内衬气室)
·
胰导管细胞(泡心细胞)非横纹导管细胞(汗腺、唾液腺、乳腺等的)主细胞(principalcell)闰细胞(Intercalatedcell)(精囊、前列腺等的)导管细胞肠刷状缘细胞(具有绒毛)外分泌腺分泌管细胞胆囊上皮细胞输出小管的无纤毛细胞附睾主细胞附睾基底细胞上皮细胞内衬封闭的内部体腔微血管内皮细胞血管和淋巴管内皮有窗细胞血管和淋巴管内皮连续细胞血管和淋巴管内皮脾细胞滑膜细胞(内衬关节腔，盐酸分泌)浆膜细胞(内衬腹膜腔、胸膜腔和围心腔)鳞状细胞(耳的内衬外淋巴隙)鳞状细胞(耳的内衬内淋巴隙)具有微绒毛的内淋巴囊的柱状细胞(耳的内衬内淋巴隙)无微绒毛的内淋巴囊的柱状细胞(耳的内衬内淋巴隙)暗细胞(耳的内衬内淋巴隙)前庭膜细胞(耳的内衬内淋巴隙)血管纹基底细胞(耳的内衬内淋巴隙)血管纹缘细胞(耳的内衬内淋巴隙)克劳迪乌斯细胞(耳的内衬内淋巴隙)伯特歇尔细胞(耳的内衬内淋巴隙)
脉络丛细胞(脑脊液分泌)软蛛网膜鳞状细胞眼睛的色素纤毛上皮细胞眼睛的无色素纤毛上皮细胞角膜内皮细胞居间细胞(输卵管的)具有推进功能的有纤毛细胞
呼吸道的有纤毛细胞输卵管的有纤毛细胞(女性体内)子宫内膜的有纤毛细胞(女性体内)睾丸网的有纤毛细胞(男性体内)输出小管的有纤毛细胞(男性体内)中枢神经系统的有纤毛室管膜细胞(内衬脑腔)细胞外基质的分泌细胞成釉质上皮细胞(牙釉质分泌)耳前庭器官的半月平面上皮细胞(蛋白聚糖分泌)柯蒂氏器官的齿间上皮细胞(分泌覆盖毛细胞的覆膜)
疏松结缔组织成纤维细胞角膜成纤维细胞(角膜的角膜细胞)肌腱成纤维细胞骨髓网状组织成纤维细胞其他非上皮成纤维细胞周细胞椎间盘的髓核细胞成牙骨质细胞/牙骨质细胞(牙根骨样牙骨质分泌)成牙本质细胞/牙本质细胞(牙本质分泌)透明软骨的软骨细胞纤维软骨的软骨细胞弹性软骨的软骨细胞成骨细胞/骨细胞骨原细胞(成骨细胞的干细胞)眼睛玻璃体的玻璃体细胞耳外淋巴隙的星状细胞肝的星状细胞(伊藤细胞)胰的星状细胞收缩细胞骨骼肌细胞红色骨骼肌细胞(慢)白色骨骼肌细胞(快)
中间骨骼肌细胞(快)肌梭的核袋状细胞肌梭的核链状细胞卫星细胞(干细胞)心肌细胞普通心肌细胞节的心肌细胞浦肯野纤维细胞
平滑肌细胞(各种类型)虹膜的肌上皮细胞外分泌腺的肌上皮细胞血液和免疫系统的细胞巨核细胞(血小板前体)单核细胞结缔组织巨噬细胞(各种类型)表皮朗格汉斯细胞破骨细胞(骨中)树突状细胞(淋巴组织中)小胶质细胞(中枢神经系统中)中性粒细胞嗜酸性粒细胞嗜碱性粒细胞肥大细胞辅助型T细胞抑制型T细胞细胞毒性T细胞自然杀伤T细胞B 细胞自然杀伤细胞网织红细胞血液和免疫系统的定向祖细胞(各种类型，例如巨核细胞、原粒细胞)神经系统的细胞感觉转导细胞柯蒂氏器官的听觉内部毛细胞柯蒂氏器官的听觉外部毛细胞嗅觉上皮的基底细胞(嗅觉神经元的干细胞)寒冷敏感性初级感觉神经元热敏感性初级感觉神经元表皮的梅克尔细胞(触觉传感器)
嗅觉受体神经元疼痛敏感性初级感觉神经元(各种类型)眼睛中视网膜的光感受器细胞光感受器视杆细胞眼睛的光感受器蓝色敏感性视锥细胞眼睛的光感受器绿色敏感性视锥细胞眼睛的光感受器红色敏感性视锥细胞本体感受性初级感觉神经元(各种类型)·
触觉敏感性初级感觉神经元(各种类型)
I型颈动脉体细胞(血液pH感受器)II型颈动脉体细胞(血液pH感受器)耳前庭器官的I型毛细胞(加速力和重力)耳前庭器官的II型毛细胞(加速力和重力)I型味蕾细胞自丰件神经元细朐胆碱能神经细胞(各种类型)肾上腺素神经细胞(各种类型)肽能神经细胞(各种类型)感觉器官和外周神经元的支持细胞柯蒂氏器官的内柱细胞柯蒂氏器官的外柱细胞柯蒂氏器官的内指细胞柯蒂氏器官的外指细胞柯蒂氏器官的边缘细胞柯蒂氏器官的汉森细胞前庭器官的支持细胞味蕾支持细胞嗅觉上皮支持细胞施万细胞卫星细胞(围封外周神经细胞体)肠的神经胶质细胞中枢神经系统的神经元和神经胶质细胞星形胶质细胞(各种类型)神经元细胞(尚未清楚分类的多样类型)少突胶质细胞纺锤体神经元松果体细胞(产生褪黑素)晶状体细胞前晶状体上皮细胞
包含晶体蛋白的晶状体纤维细胞色素细胞黑素细胞视网膜色素上皮细胞生殖细胞卵原细胞/卵母细胞精子细胞精母细胞 精原细胞(精母细胞的干细胞)精子滋养细胞卵泡细胞赛托利细胞(睾丸中)胸腺上皮细胞干细胞和祖细胞胚胎干细胞成人胚胎干细胞(例如造血干细胞、内皮干细胞、上皮干细胞、神经干细胞、间充质干细胞)祖细胞(神经祖细胞、淋巴祖细胞、卫星细胞、内皮祖细胞、骨膜祖细胞、胰祖细胞、肌肉内的卫星细胞、造血祖细胞)羊膜干细胞(多能的并可分化成生脂系、成骨系、生肌系、内皮系、肝系且还有神经元系的细胞)诱导多能干细胞在器官中，通常存在主要组织和散发组织。主要组织是特定器官独有的组织。在本发明的一个实施方式中，应设想用于本文公开的方法或组合物的细胞是主要组织细胞，即，促进器官在其天然环境中的功能的细胞。此外，在某个实施方式中，未包括特别是在结缔组织中形成散发组织的细胞，因为结缔组织的作用被认为通过该实施方式中的蜘蛛丝蛋白实现。例如，心脏的主要组织是心肌，而散发组织是神经、血液、结缔组织等。下文随附了器官系统的非限制性实例列表，其主要组织的细胞在本文公开的方法或组合物中可能是有用的。循环系统通过心脏、血液和血管向身体和肺泵送和疏导血液以及泵送和疏导来自身体和肺的血液。消化系统通过唾液腺、食道、胃、肝、胆囊、胰、肠、直肠和肛门消化和处理食物。内分泌系统使用由内分泌腺例如下丘脑、垂体或垂体腺、松果体或松果腺、胰、甲状腺、甲状旁腺和肾上腺(adrenals)，S卩，肾上腺(adrenal gland)产生的激素在身体内通τΗ ο排泄系统参与流体平衡、电解质平衡和尿液分泌的肾、子宫、膀胱和尿道。皮肤系统皮肤、毛发和指甲。
淋巴系统参与淋巴在组织和血流之间转移的结构，淋巴及运输淋巴的淋巴结和淋巴管，包括内皮。免疫系统通过白细胞、扁桃体、腺状体、胸腺和脾防御致病物质。肌肉系统通过肌肉运动。神经系统通过脑、脊髓、外周神经和神经收集、转移和处理信息。生殖系统性器官例如卵巢、输卵管、子宫、阴道、乳腺、睾丸、输精管、精囊、前列腺和阴茎。呼吸系统用于呼吸的器官，咽、喉、气管、支气管、肺和隔膜。骨骼系统通过骨、软骨、韧带和肌腱的结构支撑和保护。本文公开的方法或组合物的各种不同的实施方式可采用来自细胞类型和器官及组织系统的上述总列表的任何亚组或子列表的细胞，或甚至单独的细胞类型。在更具体的实施方式中，所述哺乳动物细胞选自由干细胞和来自朗格汉斯小岛的细胞(例如，β细胞)组成的组。在更具体的实施方式中，所述细胞选自胚胎干细胞、成体干细胞、诱导多能干细胞、羊膜干细胞和祖细胞，且可特别地选自胚胎干细胞、成体干细胞和诱导多能干细胞。在又一个特定的实施方式中，所述细胞是胚胎干细胞。在又一个特定的实施方式中，所述细胞是选自由造血干细胞、神经干细胞、间充质干细胞、乳腺干细胞、内皮干细胞、上皮干细胞和嗅觉干细胞组成的组，特别是选自由造血干细胞、神经干细胞和间充质干细胞组成的组的成体干细胞。在又一个特定的实施方式中，所述细胞是选自由神经祖细胞、间充质祖细胞和造血祖细胞组成的组的祖细胞。在又一个特定的实施方式中，哺乳动物细胞是可以以单一细胞或以至少一个神经球的形式提供的神经干细胞(可互换地称为神经皮质干细胞)。在又一个特定的实施方式中，哺乳动物细胞是可以以单一细胞或以至少一个朗格汉斯小岛的形式提供的产生胰岛素的细胞。在又一个特定的实施方式中，哺乳动物细胞是例如选自由肝细胞、成纤维细胞、角质形成细胞和内皮细胞组成的组的体细胞。在本公开内容的上下文中使用的细胞支架材料包含也称为“拖丝蛋白”的蜘蛛丝蛋白或多肽的聚合物。在细胞支架材料的一个实施方式中，所述拖丝蛋白由140至160个氨基酸残基组成且包含衍生自蜘蛛丝蛋白的重复片段的70至300个氨基酸残基的重复片段；衍生自蜘蛛丝蛋白的C端片段的70至120个氨基酸残基的C端片段；以及任选地衍生自蜘蛛丝蛋白的N端片段的100至160个氨基酸残基的N端片段。拖丝蛋白由140至600个氨基酸残基，优选地280至600个氨基酸残基，例如300至400个氨基酸残基，更优选地340至380个氨基酸残基组成。小尺寸是有利的，因为较长的蜘蛛丝蛋白往往形成无定形的聚集物，这需要使用用于增溶和聚合的苛刻溶剂。蛋白质片段通常通过肽键共价偶联。在特定的优选实施方式中，用于细胞支架材料中的拖丝蛋白选自由式NT-REP-CT和REP-CT定义的蛋白质的组。(任选的)NT与蜘蛛丝蛋白的N-端氨基酸序列具有高度的相似性。如图I中所示，该氨基酸序列在各物种和包括MaSpl和MaSp2的蜘蛛丝蛋白中相当保守。还参见以下表I :表I-拖丝蛋白NT片段
代码物种和拖丝蛋白GenBank登记号
Ea MaSplEuprosthenops australis MaSp IAM259067
Lg MaSpl儿何寇蛛(Lairodecfm geomeiricus) MaSp IABY67420
LhMaSpl黑寡妇 虫来(ioiroi/eci/w hesperus) MaSp IABY67414 Ne MaSpl络新蛛(Nephila clavipes)MaSp IACF19411
At MaSp2三带金蛛"rgz'ope fr|foscrato)MaSp 2AAZ15371
Lg MaSp2几何寇蛛 MaSp 2ABY67417
Lh MaSp2黑寡妇蜘蛛 MaSp 2ABR68855
马达加斯加红腿金色圆网挺B蛛(AfepMa inaurata AAZ15322
NimMaSp2
madagascariemis)MaSp 2 Ne MaSp2络新妇蛛 MaSp 2ACF19413
Ab CySpl横纹金蛛"rgiope hruennichi)圆柱状拖丝蛋白 I BAE86855
Ncl CySpl棒络新i3(Nephila clavata)圆柱状抱丝蛋白 I BAE54451
Lh TuSpl黑寡妇蜘蛛管状拖丝蛋白ABD24296
Ne Flag络新妇蛛鞭形丝蛋白AF027972
NimFlag马达加斯加红腿金色圆网蜘蛛鞭形丝蛋白AF218623 (翻译的)哪一种(如果有的话)特定的NT片段存在于本文公开的细胞支架材料的拖丝蛋白中不是关键的。因此，根据本发明的NT片段可选自图I中所示的氨基酸序列或具有高度相似性的序列中的任意一种。各种各样的N端序列可用作本文公开的细胞支架材料中的拖丝蛋白。基于图I的同源序列，下列序列构成共有NT氨基酸序列QANTPWSSPNLADAFINSF(M/L)SA(A/I)SSSGAFSADQLDDMSTIG(D/N/Q)TLMSAMD(N/S/K)MGRSG(K/R)STKSKLQALNMAFASSMAEIAAAESGG(G/Q)SVGVKTNAISDALSSAFYQTTGSVNPQFV(N/S)EIRSLI(G/N)M(F/L)(A/S)QASANEV(SEQ ID NO 8)。NT片段的序列与基于图I的氨基酸序列的共有氨基酸序列SEQ IDNO 8具有至少50%的同一性,优选地至少60%的同一性。在优选的实施方式中,NT片段的序列与共有氨基酸序列SEQ ID NO 8具有至少65%的同一性，优选地至少70%的同一性。此外，在优选的实施方式中，NT片段与共有氨基酸序列SEQ ID NO 8具有70%，优选80%的相似性。用于本文公开的细胞支架材料中的蛋白质中的代表性NT片段是Euprosthenopsaustralis序列SEQ ID NO 6。根据某个实施方式，NT片段与SEQ ID NO 6或图I中的任何单独的氨基酸序列具有至少80%的同一性。例如，NT片段与SEQ ID NO 6或图I中任何单独的氨基酸序列具有至少90%，例如至少95%的同一性。NT片段与SEQ ID NO 6或图I中任何单独的氨基酸序列，特别是与Ea MaSpl相同。
NT片段包含100至160个氨基酸残基。优选NT片段包含至少100，或多于110，优
选地多于120个氨基酸残基。还优选NT片段包含至多160，或少于140个氨基酸残基。典型的NT片段包含约130-140个氨基 酸残基。REP片段具有在富含丙氨酸的区段和富含甘氨酸的区段之间交替的重复性特征。如以下将更详细地解释的，REP片段通常包含多于70，例如多于140且少于300，优选地少于240，例如少于200个氨基酸残基，且自身可分成几个L (接头)区段、A (富含丙氨酸)区段和G (富含甘氨酸)区段。通常，所述接头区段是任选的，位于REP片段末端，而剩余的区段依次是富含丙氨酸和富含甘氨酸的。因此，REP片段通常可具有以下结构中的任何一种，其中η是整数L (AG) nL，例如 LA1G1A2G2A3G3A4G4A5G5L ；L (AG) nAL,例如 LA1G1A2G2A3G3A4G4A5G5A6L ； L (GA) nL，例如 LG1A1G2A2G3A3G4A4G5A5L ;或L (GA) nGL，例如 LG1A1G2A2G3A3G4A4G5A5G6L。其遵循富含丙氨酸或富含甘氨酸的区段是否与N端或C端接头区段相邻不是关键的。优选η是2至10,优选地2至8,还优选地4至8,更优选地4至6,即η=4、η=5或η=6的整数。在某些实施方式中，REP片段的丙氨酸含量高于20%，优选地高于25%，更优选地高于30%且低于50%，优选地低于40%，更优选地低于35%。应设想更高的丙氨酸含量提供更硬和/或更强和/或不太可延伸的纤维。在某些实施方式中，REP片段不含脯氨酸残基，即REP片段中不存在Pro残基。现在转向构成REP片段的区段，应强调的是每个区段是单独的，即，特定REP片段的任何两个A区段、任何两个G区段或任何两个L区段可以是相同的或可以是不相同的。因此，每种类型的区段在特定REP片段内是相同的不是拖丝蛋白的一般特征。而且，以下公开内容为技术人员提供了如何设计单独的区段并将其聚集成REP片段的指南，该REP片段是用于细胞支架材料的功能性蜘蛛丝蛋白的一部分。每个单独的A区段是具有8至18个氨基酸残基的氨基酸序列。优选每个单独的A区段包含13至15个氨基酸残基。大多数或多于两个的A区段包含13至15个氨基酸残基，且少数例如一或两个A区段包含8至18个氨基酸残基例如8-12或16-18个氨基酸残基也是可能的。这些氨基酸残基中的绝大多数是丙氨酸残基。更特别地，这些氨基酸残基中的O至3个不是丙氨酸残基，且剩余的氨基酸残基是丙氨酸残基。因此，每个单独的A区段中的所有氨基酸残基毫无例外地或除了一、二或三个氨基酸残基可以是任何氨基酸以夕卜，都是丙氨酸残基。优选取代丙氨酸的氨基酸是天然氨基酸，优选地单独选自丝氨酸、谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸的组，更优选地是丝氨酸。当然，A区段中的一个或多个是全丙氨酸区段，而剩余的A区段包含1-3个非丙氨酸的残基，例如丝氨酸、谷氨酸、半胱氨酸或甘氨酸是可能的。在某个实施方式中，每个A区段包含13-15个氨基酸残基，包括10_15个丙氨酸残基和0-3个上述非丙氨酸的残基。在更优选的实施方式中，每个A区段包含13-15个氨基酸残基，包括12-15个丙氨酸残基和0-1个上述非丙氨酸的残基。优选每个单独的A区段与选自SEQ ID NO: 10的氨基酸残基7-19、43_56、71_83、107-120、135-147、171-183、198-211、235-248、266-279、294-306、330-342、357-370、394-406、421-434、458-470、489-502、517-529、553-566、581-594、618-630、648-661、676-688、712-725、740-752、776-789、804-816、840-853、868-880、904-917、932-945、969-981,999-1013,1028-1042和1060-1073的组的氨基酸序列具有至少80%，优选地至少90%,更优选地95%,最优选地100%的同一性。该组的每个序列对应于Euprosthenopsaustralis MaSpl蛋白质的天然存在的序列的区段,该天然存在的序列经过克隆相应的cDNA而推断得来，参见WO 2007/078239。可选择地，每个单独的A区段与选自SEQ ID NO: 3的氨基酸残基143-152、174-186、204-218、233-247和265-278的组的氨基酸序列具有至少80%，优选地至少90%，更优选地95%，最优选地100%的同一性。该组的每个序列对应于表达的、非天然蜘蛛丝蛋白的区段，这些蛋白具有在合适的条件下形成丝纤维的能力。因此，在拖丝蛋白的某些实施方式中，每个单独的A区段与选自上述氨基酸区段的氨基酸序列相同。不期望被任何具体的理论束缚，设想根据本发明的A区段形成螺旋结构或β折叠。
此外，已从实验数据推断出每个单独的G区段是12至30个氨基酸残基的氨基酸序列。优选每个单独的G区段由14至23个氨基酸残基组成。每个G区段的至少40%的氨基酸残基是甘氨酸残基。通常，每个单独的G区段的甘氨酸含量在40-60%的范围内。优选每个单独的G区段与选自SEQ ID NO: 10的氨基酸残基20-42、57-70、84_106、121-134、148-170、184-197、212-234、249-265、280-293、307-329、343-356、371-393、407-420、435-457、471-488、503-516、530-552、567-580、595-617、631-647、662-675、689-711、726-739、753-775、790-803、817-839、854-867、881-903、918-931、946-968、982-998、1014-1027、1043-1059和1074-1092的组的氨基酸序列具有至少80%，优选地至少90%,更优选地95%,最优选地100%的同一性。该组的每个序列对应于Euprosthenopsaustralis MaSpl蛋白质的天然存在的序列的区段,该天然存在的序列从克隆相应的cDNA推断得来，参见WO 2007/078239。可选择地，每个单独的G区段与选自SEQ ID N0:3的氨基酸残基153-173、187-203、219-232、248-264和279-296的组的氨基酸序列具有至少80%，优选地至少90%，更优选地95%，最优选地100%的同一性。该组的每个序列对应于表达的、非天然蜘蛛丝蛋白的区段，所述蛋白具有在合适的条件下形成丝纤维的能力。因此，在细胞支架材料中的拖丝蛋白的某些实施方式中，每个单独的G区段与选自上述氨基酸区段的氨基酸序列相同。在某些实施方式中，每个G区段的前两个氨基酸残基不是-Gln-Gln-。存在G区段的三种亚型。该分类基于对Euprosthenops australis MaSpl蛋白质序列的仔细分析(参见WO 2007/078239)，并已在构建新型、非天然蜘蛛丝蛋白中使用并验证了该信息。G区段的第一种亚型由单字母氨基酸共有序列GQG (G/S) QGG (Q/Y) GG (L/Q)GQGGYGQGAGSS(SEQ ID N0:11)代表。该第一种且通常不是最长的G区段亚型通常包含23个氨基酸残基，但是可包含少至17个氨基酸残基，且缺少带电荷的残基或包含一个带电荷的残基。因此，优选该第一种G区段亚型包含17-23个氨基酸残基，但设想其可包含少至12个或多至30个氨基酸残基。不期望被任何具体的理论束缚，设想该亚型形成卷曲结构或S1-螺旋结构。该第一种亚型的代表性G区段是SEQ ID N0:10的氨基酸残基20-42、84-106、148-170、212-234、307-329、371-393、435-457、530-552、595-617、689-711、753-775、817-839、881-903、946-968、1043-1059 和 1074-1092。在某些实施方式中，根据本发明的该第一种亚型的每个G区段的前两个氨基酸残基不是-Gln-Gln-。G区段的第二种亚型由单字母氨基酸共有序列GQGGQGQG(G/R)YGQG(A/S)G(S/G)S (SEQ ID NO: 12)代表。该第二种通常中间尺寸的G区段亚型通常包含17个氨基酸残基且缺少带电荷的残基或包含一个带电荷的残基。优选该第二种G区段亚型包含14-20个氨基酸残基，但设想其可包含少至1 2个或多至30个氨基酸残基。不期望被任何具体的理论束缚，设想该亚型形成卷曲结构。该第二种亚型的代表性G区段是SEQ IDN0:10的氨基酸残基 249-265、471-488、631-647 和 982-998 ;及 SEQ IDNO: 3 的氨基酸残基 187-203。G区段的第三种亚型由单字母氨基酸共有序列G(R/Q)GQG(G/R)YGQG(A/S/V)GGN(SEQ ID NO: 13)代表。该第三种G区段亚型通常包含14个氨基酸残基，且通常是G区段亚型中最短的。优选该第三种G区段亚型包含12-17个氨基酸残基，但设想其可包含多至23个氨基酸残基。不期望被任何具体的理论束缚，设想该亚型形成转角结构。该第三种亚型的代表性 G 区段是 SEQ ID NO: 10 的氨基酸残基 57-70、121-134、184_197、280-293、343_356、407-420,503-516,567-580,662-675,726-739,790-803,854-867,918-931,1014-1027 ；及SEQ ID NO:3的氨基酸残基219-232。因此，在细胞支架材料中的拖丝蛋白的实施方式中，每个单独的G区段与选自SEQID NO: IUSEQ ID NO: 12和SEQ ID NO: 13的氨基酸序列具有至少80%，优选地90%，更优选95%的同一性。在REP片段的A和G区段的交替序列的某个实施方式中，每隔一个G区段具有第一种亚型，而剩余的G区段具有第三种亚型，例如· · · A1G短A2G长A3G短A4G长A5G短.·.。在REP片段的另一个实施方式中，第二种亚型的一个G区段通过插入而中断G区段的规律性，例如· · · A1G 短 A2G 长 A3G ψ A4G 短 A5G 长· · ·。每个单独的L区段代表可包含O至20个氨基酸残基，例如O至10个氨基酸残基的任选的接头氨基酸序列。虽然该区段是任选的且对于蜘蛛丝蛋白的功能不是关键的，但是其存在仍允许完全功能性的形成纤维(fiber)、膜(film)、泡沫(foam)和其他结构的蜘蛛丝蛋白及其聚合物。在从Euprosthenops australis的MaSpl蛋白质推断的氨基酸序列的重复部分(SEQ ID NO: 10)中也存在接头氨基酸序列。特别地，接头区段的氨基酸序列可能与所描述的A或G区段的任何一种相似，但是通常不足以满足本文对其定义的标准。如WO 2007/078239中表明的，设置在REP片段的C端部分的接头区段可由富含丙氨酸的单字母氨基酸共有序列ASASAAASAASTVANSVS和ASAASAAA代表。实际上，第二序列可被认为是根据本文的定义的A区段，而第一序列与根据该定义的A区段具有高度的相似性。接头区段的另一实例具有富含甘氨酸的单字母氨基酸序列GSAMGQGS并与根据本文的定义的G区段具有高度的相似性。接头区段的另一实例是SASAG。代表性L区段是SEQ ID NO: 10的氨基酸残基1-6和1093-1110 ;及SEQ ID NO:3的氨基酸残基138-142，但是技术人员将易于认识到存在这些区段的许多合适的替代氨基酸序列。在REP片段的一个实施方式中，L区段中的一个包含O个氨基酸，即缺少L区段中的一个。在REP片段的另一个实施方式中，两个L区段都包含O个氨基酸，即不含这两个L区段。因此，根据本发明的REP片段的这些实施方式可示意性地表示如下(AG)nL、(AG)nAU(GA)nL, (GA)nGL ; L(AG) n、L (AG)nA、L(GA) n、L(GA)nG ;和(AG)n、(AG)nA, (GA)n, (GA)nG。这些REP片段中的任何一种适合用于以下定义的任何CT片段。细胞支架材料中拖丝蛋白的CT片段与蜘蛛丝蛋白的C端氨基酸序列具有高度的相似性。如WO 2007/078239中所示，该氨基酸序列在各个物种和蜘蛛丝蛋白，包括MaSpl和MaSp2之间相当保守。以SEQ ID N0:9提供了 MaSpl和MaSp2的C端区域的共有序列。在图2中，比对了以GenBank登记条目(如果可用)表示的下列MaSp蛋白质表2-拖丝蛋白CT片段
物种和拖丝蛋白条目Euprosthenops sp MaSpl (Pouchkina-Stantcheva, NN & McQueen-Mason, SJ,同上、Cthyb EspEuprosthenops australis MaSplCTnat Eau·物种和拖丝蛋白条目
三夢麵 MaSplAF350266—AU
7良字云斑蛛(Qvr 吨moluccensis)SplAY666062_Cml
几何寇蛛 MaSplAF350273_Lgl
黑寡妇嫌蛛 MaSplAY953074_Lhl
赫氏粒突妹{Macrothele ho!sti)SplAY666068_Mhl
络新妇蛛 MaSplU20329_Ncl
斑络新妇{Nephila piIipes)MaSp IAY666076_Npl
马达加斯加金色球餘蛛madagascariensis)M^Sp IAF350277_Nmi
带状褪金色圆 H蜘秦(Nephila senegalensis)MB^\AF350279_Nsi
变异涡蛛(Ο ·細 varians)Sp\AY666057_0v I
中华缕网秦(Psechms sinensis) SplAY666064_Psl
长爪绿色焚光餘蛛(rwmg;犯汝 “ kaaaiemis)MaSp IAF350285_Tkl
多色肖 Hi(Tetragnatha versicolor) MaSplAF350286_Tvl巨头地衣圆蛛(draneMsMcentenarms)Sp2ABU20328_Ab2阿吉普奥兰提亚金蛛 G4rg/却e auranfia)MaSp2AY365016_Aam2悦固金蛛amoena)MdiSp2AF350263_Aau2三带金姝 MaSp2AF350267_At2
多型^M^iGosteracantha /而堺衍osa)MaSp2AF350272_Gm2
几何寇蛛 MaSp2AF350275_Lg2
黑寡妇餘蛛 MaSp2AY953075_Lh2
络新妇蛛 MaSp2AY654293 Nc2
马达加斯加金色球跑蛛MaSp2AF350278_Nm2
带状褪金色圓网蜘蛛MaSp2AF350280_Ns2
褐灰色捕鱼掛蛛tenehrosm)Fb IAF350269_DtFb I
褐灰色捕鱼蜘蛛Fb2AF350270_DtFb2
十字园蛛 ADF-iU47853_ADF1
十字园蛛 ADF-2U47854_ADF2
十字园蛛 ADF-3U47855_ADF3物种和拖丝蛋白条B
十字园蛛 ADF-4U47856_ADF4哪种特定的CT片段存在于细胞支架材料中的蜘蛛丝蛋白中不是关键的。因此，CT片段可选自图2和表2中示出的氨基酸序列或具有高度相似性的序列中的任何一种。各种各样的C端序列可用于蜘蛛丝蛋白中。CT片段的序列与基于图2的氨基酸序列的共有氨基酸序列SEQ IDN0:9具有至少50%的同一性，优选地至少60%，更优选地至少65%的同一性，或甚至至少70%的同一性。 代表性的CT 片段是 Euprosthenops australis 序列 SEQ ID N0:7。因此,在一个实施方式中，CT片段与SEQ ID NO:7或图2和表2中的任何单独的氨基酸序列具有至少80%，优选地至少90%，例如至少95%的同一性。例如，CT片段可与SEQ ID N0:7或图2和表2中的任何单独的氨基酸序列相同。CT片段通常由70至120个氨基酸残基组成。优选CT片段包含至少70，或多于80，优选地多于90个氨基酸残基。还优选CT片段包含至多120，或少于110个氨基酸残基。典型的CT片段包含约100个氨基酸残基。如下计算如本文所用的术语“％同一性”。使用CLUSTAL W算法(Thompson等人，Nucleic Acids Research, 22:4673-4680 (1994))比对查询序列与祀序列。在对应所比对的序列中的最短序列的窗口上进行对比。对比每个位置的氨基酸残基，并将在靶序列中具有相同对应的查询序列中的位置的百分比报告为％同一性。按以上对“％同一性”所描述的计算如本文所用的术语“％相似性”，但以下除外疏水残基 Ala、Val、Phe、Pro、Leu、lie、Trp> Met 和 Cys 是相似的；喊性残基 Lys> Arg 和 His是相似的；酸性残基Glu和Asp是相似的；且亲水性的、不带电荷的残基Gln、Asn、Ser、Thr和Tyr是相似的。在该上下文中剩余的天然氨基酸Gly不与任何其他氨基酸相似。遍布本说明书，根据本发明的替代实施方式满足相应百分比的相似性，而不是指定百分比的同一性。其他替代实施方式满足指定百分比的同一性以及另一个较高百分比的相似性，选自对于每个序列的优选百分比的同一性的组。例如，某序列可能与另一序列70%相似；或其可能与另一序列70%相同；或其可能与另一序列70%相同且90%相似。在本文公开的方法或组合物的某些更特定的实施方式中，细胞支架材料的蜘蛛丝蛋白包含选自由以下组成的组的拖丝蛋白4R印CT、RGD-4R印CT、RGE-4R印CT、IKVAV-4RepCT、YIGSR_4RepCT、NT4RepCTHis、5RepCT、8RepCT、4RepCTMa2、NT8RepCT 和NTNTSRepCT(参见以下所附序列的列表)。在甚至更具体的实施方式中，拖丝蛋白是4R印CT(SEQ ID NO:2)。所附序列的列表SEQ ID NO:I 4Rep2 4RepCT3 NT4Rep4 NT5Rep5 NT4RepCTHis6 NT
7 CT8 共有NT序列9 共有CT序列10 来自 Euprosthenops australis MaSpl 的重复序列11 共有G区段序列I12 共有G区段序列213 共有G区段序列314 5R 印 CT15 8RepCT16 4RepCTMa217 NT8R 印 CT18 NTNT8R 印 CT19 RGD-4R 印 CT20 RGE-4R 印 CT21 IKVA-4R 印 CT22 YIGSR-4R 印 CT在本文公开的方法或组合物的一个实施方式中，所述蜘蛛丝蛋白包含细胞结合基序。结合某些情况中某些细胞的培养，已发现细胞结合基序的存在提高或维持细胞存活，且认为将该基序作为蜘蛛丝蛋白的一部分纳入到细胞支架材料中提供另外的益处。在某些实施方式中，细胞结合基序是通过至少一个肽键偶联到蜘蛛丝蛋白的剩余部分的寡肽。例如，其可被偶联到蜘蛛丝蛋白的剩余部分的N端或C端，或蜘蛛丝蛋白的剩余部分的氨基酸序列内的任何位置。关于寡肽细胞结合基序的选择，技术人员知晓几种替代方案。例如，所述多肽可包含选自由以下组成的组的氨基酸序列RGD、RGE、IKVAV (SEQIDNO:23)、YIGSR(SEQ ID NO:24), EPDIM(SEQ ID NO:25)和 NKDIL(SEQID NO:26) RGD,IKVAV和YIGSR是常用的细胞结合基序，而EroiM和NKDIL称为角质形成细胞特异性基序，其在培养角质形成细胞的背景中可能是特别有用的。可由技术人员使用标准的基因工程或化学偶联技术容易地实现寡肽细胞结合基序与蜘蛛丝蛋白的剩余部分的偶联。因此，在某些实施方式中，细胞结合基序通过基因工程引入，即，在编码“野生型”蜘蛛丝蛋白和细胞结合基序的核酸之间形成部分基因融合。作为这些实施方式的一个额外的有益特征，细胞结合基序将与组成细胞支架材料的聚合物中的蜘蛛丝蛋白单体以1:1的比例存在。用于本文描述的方法或组合物中的细胞支架材料中的聚合物可采取多种物理形态，且特定物理形态的使用可在不同的具体情况中提供另外的优点。例如，在这些方法或组合物的某个实施方式中，所述细胞支架材料处于选自由膜、泡沫、纤维和纤维网(fiber-mesh)组成的组的物理形态。在本发明的上下文中，术语细胞的“培养”、“细胞培养”等应被广义地理解，使得它们包括例如细胞分裂和/或增殖的情况，细胞被保持在保留了该细胞类型当存在于其天然环境时所显示出的至少一种功能特征的分化状态的情况以及干细胞被保持在未分化状态的情况。此外，如从上述公开内容中明显的，应设想细胞可以以单一细胞形式提供，或作为细胞结构或“微器官”的一部分提供。细胞结构或“微器官”的形式的细胞的培养可能需要维持与细胞支架材料结合的整个结构。逐项记录的实施方式列表I.用于培养真核细胞的方法，包括-提供待培养的真核细胞的样品；-将所述样品应用到细胞支架材料；以及-在适合细胞培养的条件下保持具有已其应用细胞的所述细胞支架材料；其特征在于所述细胞支架材料包含由140至600个氨基酸残基组成且包含下列片段的蜘蛛丝 蛋白的聚合物衍生自蜘蛛丝蛋白的重复片段的70至300个氨基酸残基的重复片段；衍生自蜘蛛丝蛋白的C端片段的70至120个氨基酸残基的C端片段；以及任选地衍生自蜘蛛丝蛋白的N端片段的100至160个氨基酸残基的N端片段。2.用于制备真核细胞的方法，包括-提供真核细胞样品；-将所述样品应用到细胞支架材料；-在适合细胞培养的条件下保持已对其应用细胞的所述细胞支架材料；以及-由所述细胞支架材料中制备细胞样品；其特征在于所述细胞支架材料包含由140至600个氨基酸残基组成且包含下列片段的蜘蛛丝蛋白的聚合物衍生自蜘蛛丝蛋白的重复片段的70至300个氨基酸残基的重复片段；衍生自蜘蛛丝蛋白的C端片段的70至120个氨基酸残基的C端片段；以及任选地衍生自蜘蛛丝蛋白的N端片段的100至160个氨基酸残基的N端片段。3.根据第I或第2项的方法，其中所述条件包括将已对其应用细胞的该细胞支架材料保持在无血清培养基中。4.根据任一前述项的方法，其中所述真核细胞是哺乳动物细胞。5.根据第4项的方法，其中所述哺乳动物细胞来源于器官的主要组织。6.根据第4或第5项的方法，其中所述哺乳动物细胞选自由干细胞和包括β_细胞的来自朗格汉斯小岛的细胞组成的组。7.根据第6项的方法，其中所述细胞是选自胚胎干细胞、成体干细胞、诱导多能干细胞、羊膜干细胞和祖细胞，特别地选自胚胎干细胞、成体干细胞和诱导多能干细胞的干细胞。8.根据第7项的方法，其中所述细胞是胚胎干细胞。9.根据第7项的方法，其中所述细胞是选自由神经祖细胞、间充质祖细胞和造血祖细胞组成的组的祖细胞。10.根据第7项的方法，所述细胞是选自由造血干细胞、神经干细胞、间充质干细胞、乳腺干细胞、内皮干细胞、上皮干细胞和嗅觉干细胞组成的组，特别是选自由造血干细胞、神经干细胞和间充质干细胞组成的组的成体干细胞。
11.根据第6项的方法，其中所述细胞是来自朗格汉斯小岛的细胞，例如细胞。12.根据任一前述项的方法，其中所述真核细胞以单一细胞提供。13.根据第10项的方法，其中所述哺乳动物细胞是以至少一个神经球提供的神经干细胞。14.根据第11项的方法，其中所述哺乳动物细胞是以至少一个朗格汉斯小岛提供的β细胞。15.根据第1-5项中任一项的方法，其中所述·哺乳动物细胞是例如选自由肝细胞、成纤维细胞、角质形成细胞和内皮细胞组成的组的体细胞。16.根据任一前述项的方法，其中所述细胞是人细胞。17.根据任一前述项的方法，其中所述蜘蛛丝蛋白选自由式REP-CT和NT-REP-CT定义的蛋白质的组，其中NT是具有100至160个氨基酸残基的蛋白质片段，该片段是衍生自蜘蛛丝蛋白的N端片段；REP是具有70至300个氨基酸残基的蛋白质片段，其中所述片段选自由L(AG)nUL (AG) nAL、L (GA) nL 和 L (GA) nGL 组成的组，其中η是2至10的整数；每个单独的A区段是8至18个氨基酸残基的氨基酸序列，其中O至3个氨基酸残基不是Ala，且剩余的氨基酸残基是Ala ；每个单独的G区段是12至30个氨基酸残基的氨基酸序列，其中至少40%的氨基酸残基是Gly ;且每个单独的L区段是O至20个氨基酸残基的接头氨基酸序列；且CT是具有70至120个氨基酸残基的蛋白质片段，该片段是衍生自蜘蛛丝蛋白的C端片段。18.根据第17项的方法，其中所述蜘蛛丝蛋白选自由41 印(1\见'41 印(1'把8、5R印CT、8R印CT、4R印CTMa2、NT8RepCT 和 NTNT8R印CT 组成的组。19.根据任一前述项的方法，其中所述蜘蛛丝蛋白包含细胞结合基序。20.根据第19项的方法，其中所述细胞结合基序是通过至少一个肽键偶联到蜘蛛丝蛋白的剩余部分的寡肽。21.根据第20项的方法，其中所述寡肽被偶联到蜘蛛丝蛋白的剩余部分的N端。22.根据第20-21项中任一项的方法，其中所述寡肽包含选自由以下组成的组的氨基酸序列RGD、RGE、IKVAV、YIGSR, EPDIM 和 NKDIL。23.根据任一前述项的方法，其中所述细胞支架材料处于选自由膜、泡沫、纤维和纤维网组成的组的物理形态。24.下列的组合物-真核细胞；和-细胞支架材料；其特征在于所述细胞支架材料包含由140至600个氨基酸残基组成且包含下列片段的蜘蛛丝蛋白的聚合物
衍生自蜘蛛丝蛋白的重复片段的70至300个氨基酸残基的重复片段；衍生自蜘蛛丝蛋白的C端片段的70至120个氨基酸残基的C端片段；以及任选地衍生自蜘蛛丝蛋白的N端片段的100至160个氨基酸残基的N端片段。25.根据第24项的组合物，其中所述真核细胞是哺乳动物细胞。26.根据第25项的组合物，其中所述哺乳动物细胞来源于器官的主要组织。27.根据第25或第26项的组合物，其中所述哺乳动物细胞选自由干细胞和包括β细胞的来自朗格汉斯小岛的细胞组成的组。28.根据第27项的组合物，其中所述细胞是选自胚胎干细胞、成体干细胞、诱导多能干细胞、羊膜干细胞和祖细胞，特别地选自胚胎干细胞、成体干细胞和诱导多能干细胞的 干细胞。29.根据第28项的组合物，其中所述细胞是胚胎干细胞。30.根据第28项的组合物，其中所述细胞是选自由神经祖细胞、间充质祖细胞和造血祖细胞组成的组的祖细胞。31.根据第28项的组合物，其中所述细胞是选自由造血干细胞、神经干细胞、间充质干细胞、乳腺干细胞、内皮干细胞、上皮干细胞和嗅觉干细胞组成的组，特别是选自由造血干细胞、神经干细胞和间充质干细胞组成的组的成体干细胞。32.根据第27项的组合物，其中所述细胞是来自朗格汉斯小岛的细胞，例如β细胞。33.根据任一前述项的组合物，其中所述真核细胞以单一细胞提供。34.根据第31项的组合物，其中所述哺乳动物细胞以至少一个神经球提供的神经干细胞。35.根据第30项的组合物，其中所述哺乳动物细胞是以至少一个朗格汉斯小岛提供的β细胞。36.根据第24-26项中任一项的组合物，其中所述哺乳动物细胞是例如选自由肝细胞、成纤维细胞、角质形成细胞和内皮细胞组成的组的体细胞。37.根据第24-36项任一项的组合物，其中所述细胞是人细胞。38.根据第24-37项中任一项的组合物，其中所述蜘蛛丝蛋白选自由式REP-CT和NT-REP-CT定义的蛋白质的组，其中NT是具有100至160个氨基酸残基的蛋白质片段，该片段是衍生自蜘蛛丝蛋白的N端片段；REP是具有70至300个氨基酸残基的蛋白质片段，其中所述片段选自由L(AG)nUL (AG) nAL、L (GA) nL 和 L (GA) nGL 组成的组，其中η是2至10的整数；每个单独的A区段是8至18个氨基酸残基的氨基酸序列，其中O至3个氨基酸残基不是Ala，且剩余的氨基酸残基是Ala ；每个单独的G区段是12至30个氨基酸残基的氨基酸序列，其中至少40%的氨基酸残基是Gly ;且每个单独的L区段是O至20个氨基酸残基的接头氨基酸序列；且CT是具有70至120个氨基酸残基的蛋白质片段，该片段是衍生自蜘蛛丝蛋白的C端片段。39.根据第38项的组合物，其中所述蜘蛛丝蛋白选自由4R印CT、NT4RepCTHis,5R印CT、8R印CT、4R印CTMa2、NT8RepCT 和 NTNT8R印CT 组成的组。40.根据第24-39项中任一项的组合物，其中所述蜘蛛丝蛋白包含细胞结合基序。41.根据第40项的组合物，其中所述细胞结合基序是通过至少一个肽键偶联到蜘蛛丝蛋白的剩余部分的寡肽。42.根据第41项的组合物，其中所述寡肽被偶联到蜘蛛丝蛋白的剩余部分的N端。43.根据第41-42项中任一项的组合物，其中所述寡肽包含选自由以下组成的组的氨基酸序列RGD、RGE、IKVAV、YIGSR, EPDIM 和 NKDIL。44.根据第24-43项中任一项的组合物，其中所述细胞支架材料处于选自由膜、泡 沫、纤维和纤维网组成的组的物理形态。45.根据任一前述项的方法或组合物，其中所述蜘蛛丝蛋白选自由4RepCT、NT4R印CTHis、RGD-4R印CT、RGE-4R印CT、IKVAV-4R印CT 和 YIGSR-4R印CT 组成的组。附图简沭图I示出了拖丝蛋白N端结构域的序列比对。图2示出了拖丝蛋白C端结构域的序列比对。图3是示出了在4RepCT纤维上培养的鼠间充质干细胞的一系列照片。图4是示出了在4RepCT纤维上培养的人间充质干细胞的一系列照片。图5是示出了在4RepCT支架上培养的人间充质干细胞的分化的一系列照片。图6是示出了关于在4RepCT支架上培养的人间充质干细胞的成脂分化的实验结果的一系列照片。图7A-B是示出了关于在4RepCT支架上培养的人间充质干细胞的成骨分化的实验结果的系列照片。图8是在实施例2中描述的实验之前在A)4x和B) IOx放大率下的RCM-IhESC细胞的一对照片。图9是示出了在A) CELLstart CTS 和B) RGD-4R印CT上培养48小时后的RCM-1hESC培养物的在IOx放大率下的一对照片。
图10是示出了在A)CELLstart CTS 和B)R⑶-4R印CT上培养144小时后的RCM-1hESC培养物的在IOx放大率下的一对照片。图11 是示出了 对 A) CELLstart CTS 和 B) RGD-4R印CT 上的 RCM-1 hESC 培养物进行碱性磷酸酶染色的结果的在IOx放大率下的一对照片，如实施例2中所述。图12是示出了 A)在RGD-4ItepCT上培养240小时之后的RCM-lhESC，和B)在RGD-4RepCT上培养240小时之后的RCM-IhESC的碱性磷酸酶染色的在IOx放大率下的一对照片。图13是示出了在所示4ItepCT(WT)泡沫和纤维网、RGD-4R印CT (RGD)泡沫和纤维网上，在MEF (对照)或明胶上培养三代的RlmESC —系列成对照片。图14示出了在如所示4RepCT膜和对照(PORN)上培养的保持未分化(上箭头)和进行神经元分化(下箭头)的NSC。用巢蛋白(上箭头)和TuJl (下箭头)对细胞染色。图15示出了在如所示4RepCT膜和对照(PORN)上培养的保持未分化和进行少突胶质细胞(上箭头)和星形胶质细胞(下箭头)分化的NSC。用MBP (上箭头)和GFAP (下箭头)对细胞染色。另外，示出了在4RepCT泡沫上保持未分化的NSC和进行星形胶质细胞分化的NSC的外观。图16示出了来自生长在4ItepCT膜上的NSC (在接种后48h)的EdU-测定的结果，如实施例4中所述。图17示出了生长在左侧的4ItepCT膜(在接种后72h)和右侧的PORN(接种后48h时)上的NSC的存活/死亡染色。每一列的图片表示相同的区域，分别示出了活细胞和死细胞。图18是示出了分别粘附到4RepCT纤维、泡沫和膜的培养5_7天后的人(A)和小鼠(B)的朗格汉斯小岛的一系列照片。图19是表明了与相应的纤维和泡沫及对照相比，小鼠胰岛在所有时间点都表现出明显更高的对4RepCT泡沫结构的粘附的示意图(η = 16, ***Ρ=0· 001)。·图20是示出了培养1-5天后粘附到不含(WT)和含有如所示不同肽基序的4RepCT的泡沫上的人胰岛的数量的示意图(n = 3+ SEM ;对于RGE, η = 2土标准差)。图21是示出了胰岛对不同支架的粘附的一对示意图；Α :培养1-5天后小鼠胰岛对不含(WT)和含有所示不同肽基序的4ItepCT泡沫的粘附(n=4，土SEM，*=ρ〈0· 05，#==ρ〈0· 01，*#= = ρ〈0· 001) ；Β :与RGD-4R印CT和对照相比，培养2天后小鼠胰岛对NT4R印CT泡沫的粘附(η = I，实验一式三份地进行，土 SEM)图22是示出了在具有不含(WT)和含有所示不同肽基序的4RepCT的孔中培养5天的胰岛经葡萄糖刺激后的胰岛素释放的一系列示意图；A:来自用不含(WT)和含有所示不同肽基序的4RepCT培养5天的所有小鼠胰岛的胰岛素释放；B :用不含(WT)和含有不同肽基序的4RepCT培养5天的小鼠胰岛的刺激指数；C :来自用不含(WT)和含有不同肽基序的4RepCT培养5天的粘附的小鼠胰岛的胰岛素释放(n=2，实验一式两份地进行);D :来自用NT4RepCT支架(NT)培养2天的粘附的小鼠胰岛的胰岛素释放；E :来自用不含(WT)和含有不同肽基序的4RepCT培养5天的所有人胰岛的胰岛素释放；F :来自用不含(WT)和含有不同肽基序的4RepCT培养5天的粘附的人胰岛的胰岛素释放(η = 1，实验一式三份地进行)。图23是示出了在高浓度葡萄糖和KCl刺激RGD_4RepCT上培养I天的一个胰岛后的
图28是示出了在对照组织培养板(A)和RGD_4RepCT (B)上培养单个胰岛细胞(小鼠)后的簇形成的一系列照片。C :与支架紧密接触的4ItepCT (左)、RGD-4R印CT(中)和IKVAV-4R印CT(右)的泡沫中的胰岛素阳性簇(明亮部分；通过箭头指出)的放大图(63x)。图29是处于所指示的放大率下的一对照片，示出了间充质干细胞(MSC)在所示泡沫支架4ItepCT(WT)和RGD-4R印CT(RGD)上的粘附和生长。MSC(灰色)可容易地粘附到该泡沫结构(通过箭头例示的浅灰色部分)并随时间推移继续在其上增殖(第7天，n=2)。图30是示出了通过细胞示踪染料观察到的胰岛β细胞(islet beta cells)、内皮细胞(endothelial cells)和间充质干细胞(mesenchymal stem cells) ( “BEM”)的共培养(β细胞亮白色；内皮细胞浅灰色；间充质细胞灰色)的一对照片。共培养的BEM在4ItepCT泡沫上形成簇。发现BEM簇粘附到4ItepCT泡沫(左)和RGD_4ItepCT泡沫(右，n=2,实验一式两份地进行)上。
图31A-E是示出了培养在膜或泡沫形态的具有不同的细胞结合基序的不同4ItepCT支架和对照平板(细胞培养玻璃)上的内皮细胞的照片；A :膜，左图4ItepCT(野生型)，右图RGD-4R印CT ；B :膜，左图IKVAV-4R印CT，右图YIGSR-4R印CT ；C 泡沫，左图4R印CT(野生型)，右图 RGD-4ItepCT ；D :泡沫，左图 IKVAV-4R印CT，右图 HGSR-4ItepCT ；E :对照。图32是示出了在涂覆了具有所示不同细胞结合基序的4RepCT支架的96孔培养板内分析的总区域的内皮细胞密度比的示意图。图33是由4RepCT制备的细胞支架材料的一系列照片。上图示出了在约25x放大率下的96孔板中的孔。下图示出了在200x放大率下的倒置光学显微镜下观察到的支架。图34和35示出了通过阿尔玛蓝存活测定测量的成纤维细胞在如所示4RepCT支架和对照上的生长的示意图。误差棒表明一式六份的标准差。图36是以15000细胞/cm2的接种密度在如所示4ItepCT支架和对照上培养4天并经用于检测活细胞和死细胞的存活/死亡染色的HDFn的一系列照片。图37示出了在无血清条件下在4ItepCT膜上的SF-HDF生长的示意图。接种密度(细胞/cm2)为如所示。第6天后，细胞数量继续增加，从而超出最高标准并妨碍用于绘制曲线的数据的重新计算。活细胞的数量通过阿尔玛蓝测量。误差棒表明一式六份的标准差。图38示出了通过用AlexaFlour488_鬼笔环肽将丝状肌动蛋白染成绿色(在照片中呈现为灰色线)观察到的附着到4ItepCT纤维(左图)和膜(右图)的HDFn的照片。核被EthD-I染成红色(呈现为亮白色)图39A-D示出了生长在如所示不同的4RepCT支架上的细胞的I型胶原的产生。A是示出了最初的5天培养期间分泌到细胞培养基中的C肽的浓度(未积累)的示意图。B是示出了同一培养时间段内所分泌的C肽的量/生长在不同支架上的细胞的量的示意图。C肽浓度通过EIA测定。误差棒表明一式两份的标准差。C和D是示出了经免疫荧光染色的存在于生长在膜(C)和纤维网(D)上的细胞中的细胞内I型胶原(呈现为白色的点)的照片。核呈现为浅灰色。图40示出了在如所示不同4ItepCT支架上培养14天的成纤维细胞的胶原产生和分泌并然后将其重新接种到组织培养处理(TCT)平板或腔式载玻片上以分别分析I型前胶原C肽(上图)和细胞内I型胶原的产生(下图)。
图41A-C是示出了生长在含有或不含如所示整联蛋白结合基序RGD的4RepCT的纤维网(A)和膜(B-C)支架上的存活HDFn的数量的示意图。通过阿尔玛蓝测定。误差棒表明一式六份的标准差。图42是示出了第3天时生长在野生型4RepCT(wt，空心柱)或RGD-4R印CT (实心柱)膜上的SF-HDF的数量的示意图。接种密度以细胞/cm2提供。活细胞的数量通过阿尔玛蓝测量。误差棒表明一式六份的标准差。图43是示出了生长在具有如所示各种细胞结合基序的4RepCT膜上的成纤维细胞的一系列照片。仅3h后成纤维细胞就在所有的膜变体上显示出黏着斑，指示整联蛋白介导的对该材料的粘附。黏着斑呈现为明亮的长形点。在无任何血清加入下培养细胞。WT:4RepCT ；NRC NT4RepCTHiSo图44是示出了人原代角质形成细胞在含有或不含所示不同细胞结合基序的4ItepCT膜上和在NT4ttepCTHis(NRC)上的生长的示意图。所使用的对照是未处理的细胞塑料(HP)和Pluronic-涂覆的细胞塑料(以防止粘附)。在接种后的第I天和第4天通过阿 尔玛蓝检测活细胞。图45是示出了在具有所示各种细胞结合基序的4RepCT膜上培养3天后的第4代人原代角质形成细胞的一系列照片。WT 4RepCT ；NRC NT4RepCTHis ；CTRL :细胞培养玻璃。图46是示出了在所示材料上接种后第4天的角质形成细胞的一系列照片。对细胞进行黏着斑蛋白染色以观察黏着斑，黏着斑被示为靠近细胞膜的明亮长形点并通过白色箭头指示。WT 4RepCT, RGD RGD-4RepCT, IKVAV IKVAV-4RepCT, CTRL :细胞培养玻璃。图47是示出了肝细胞对4ItepCT膜和纤维(分别是图A和B)的粘附的一组照片。在C和D中可看到肝细胞和纤维之间的密切的相互作用(η = 1，实验一式六份地进行)。图48是示出了在RGD-4ItepCT膜(RGD)上生长16天的hESC(左)和在对照涂层(Cellstart)上生长192小时的hESC(右)的外观的一对照片。这些细胞处于实施例12中所描述的实验的第一次传代。图49是示出了在实施例12中描述的实验的第二次传代时接种后24小时的hESC在各个涂层上的外观的一对照片。左Cellstart涂层(对照)；右RGD_4ItepCT膜(RGD)。图50是示出了在实施例12中描述的实验的第三次传代时接种后24小时的AP染色的hESC在各个涂层上的外观的一对照片。左Cellstart涂层(对照)；右HGSR_4R印CT膜(Y)。阳性AP染色以棕色呈现(图中为深灰色)。图51是示出了在实施例12中描述的实验的第三次传代时接种后24小时的AP染色的hESC在各个涂层上的外观的一对照片。左生长在RGD-4r印CT膜(RGD)上的细胞；右生长在RGE-4ItepCT膜(RGE)上的细胞。阳性AP染色以棕色呈现(图中为深灰色)。图52是示出了在实施例12中描述的实验的第三次传代时接种后24小时的AP染色的hESC在各个涂层上的外观的一对照片。左生长在IKVAV-4r印CT膜(IKVAV)上的细胞；右生长在NT4ttepCTHis膜(NRC)上的细胞。阳性AP染色以棕色呈现(图中为深灰色)。
实施例实施例I重组蜘蛛丝上的造血干细胞和间充质干细胞
在包含上述4RepCT的重组蜘蛛丝基质上培养已知对来自其直接微环境的不利影响极为敏感的造血干细胞(HSC)和已被表明在各种可生物降解的天然和合成支架上粘附并生长的间充质干细胞(MSC)。当与培养在Falcon 1008塑料和retronectin涂覆的平板上的HSC比较时，HSC可在4ItepCT泡沫上培养并保持其分化能力以及其表型。当生长在4RepCT纤维上时，MSC表现出与对照相比相似的细胞计数和分化且当生长在4ItepCT膜和泡沫上时保持其分化成中胚层谱系的细胞，例如骨、软骨和脂肪细胞的能力。材料和方法重组蜘蛛丝蛋白的表达如前所述地制备重组蜘蛛丝蛋白4RepCT(SEQ ID NO:2) (Hedhammar等人(2008),同上)。简单地说，使具有用于4RepCT表达的载体的大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)细胞(Merck Biosciences)在30°C下的含有卡那霉素的LB培养基中生长至0D_为O. 8-1并然后用异丙基β-D-硫代半乳糖苷诱导并进一步在室温孵育多达3h。此后， 收集细胞并重悬在补充有溶菌酶和DNA酶I的20mM Tris-HCl (pH 8.0)中。完全裂解后，将来自15，OOOg下离心的上清液上样到装载有Ni琼脂糖的柱(GE Healthcare, Uppsala,Sweden)上。在用300mM咪唑洗脱结合的蛋白质之前充分洗漆柱。汇集包含革巴蛋白的级分并针对20mM Tris-HCl (pH 8.0)透析。通过使用l:1000(w/w)的凝血酶融合蛋白比在室温下蛋白酶裂解l_2h而从标签上释放4R印CT。为去除释放的HisTrxHis标签，将裂解混合物上样到第二个Ni琼脂糖柱上并收集流出液。从280nm下的吸光度确定蛋白质含量。支架制备如Stark等人(2007)，同上所述，允许纯化的4RepCT蛋白质自我组装成纤维。然后在用于在无组织培养物处理的Falcon平皿(Falcon 1008)中培养之前将纤维切割成更小的片。通过用0. 5-2. Oml的蛋白质溶液涂覆Falcon 1008平皿并空气干燥以允许在平皿底部形成薄层来制备膜。另外，用剧烈混合蛋白质溶液后获得的泡沫涂覆某些Falcon1008平皿并允许空气干燥24小时以在平皿底部形成3D基质。通过暴露于由137Cs源(Gammacell, Atomic Energy of Canada, Ottawa, Canada)释放的 280Gy 的 Y -福射对具有纤维、膜或泡沫的平皿灭菌。造血干细胞的分离和培养处死健康的Balb/c小鼠并取出股骨。用经IOmM HEPES缓冲液(HH ；GIBC0)平衡的Hanks’平衡盐溶液从股骨中冲洗出骨髓(BM)细胞。BM细胞被直接使用或在根据厂家说明用谱系细胞去除试剂盒(Miltenyi Biotec)去除谱系之后使用并分别以3xl05和5xl04细胞/平皿在补充有鼠干细胞因子(mSCF，100ng/ml ;Immunex，Seattle, WA)和mIL-3 (30ng/ml ；Genentech, San Francisco, CA)的无血清 DMEM(Wognum 等人(2000)，HumGene Therll: 2129-2141)中培养 4 天。表面抗原的测量在4ItepCT存在下培养之前和之后收集鼠的骨髓细胞用于表型分析。简单地说，用包含 0. 5%(vol/vol)牛血清白蛋白(BSA ；Sigma, StLouis, MO) >0. 05%(wt/vol)叠氮化钠和 0. 45%(wt/vol)葡萄糖(Merck, Darmstadt, Germany) (HBN)的 Hanks’ 缓冲的 HEPES 溶液(HHBS)洗涤细胞两次，并重悬在包含2%(V01/V01)正常的、热失活的小鼠血清的50 μ IHBN中以防止单克隆抗体(MoAb)的非特异性结合并随后用针对以下表面标志c-kit、sea-K CD4、CD8、CDllb 和 B220 产生的 MoAb (BD Biosciences, San Jose, CA)孵育 30 分钟。在HBN中洗涤细胞两次并从基于碘化丙啶(PI，Sigma)染色的分析中排除死细胞。使用FACSCalibur流式细胞仪测量细胞样品并收集10，000条模式事件并使用Cellquest软件(BD Biosciences, San Jose, CA)分析。体外产克隆祖细胞测定将5xl04鼠BM细胞或IxlO3谱系去除的BM细胞(IirT勺平铺到Falconl008 (35mm直径)陪替式培养皿中的Iml包含0.8%(Wt/vol)的溶于丰富型DMEM的甲基纤维素(Methocel A4M 高级，Dow Chemical Co,Barendrecht,The Netherlands) >l%(wt/vol)BSA>0. 3mg/ml人转铁蛋白、0. I μ mol/1亚硒酸钠、lmg/1核苷(胞苷、腺苷、尿苷、鸟苷、2’-脱氧胞苷、2’ -脱氧腺苷、胸苷和2，-脱氧鸟苷；Sigma)、0· lmmol/1 β -巯基乙醇、15 μ mol/1亚油酸、15 μ mol/1胆固醇、10 μ g/ml胰岛素、lOOU/ml青霉素和100 μ g/ml链霉素的无血清半固体甲基纤维素培养基中。通过添加10ng/ml的mIL-3、100ng/ml的mSCF和20ng/ml的GM-CSF刺激粒细胞/巨噬细胞集落形成(CFU-GM)并在培养的第8_10天打分。通过IOOng/ ml 的 mSCF 和 4U/ml 的人红细胞生成素(hEPO ；Behringwerke, Marburg, Germany)诱导爆发集落形成红细胞(BFU-E)生长并在8-10天后计数，而用单独的hEPO刺激集落形成单位红细胞(CFU-E)生长并在2天后计数。在补充有100ng/ml的mSCF、10ng/ml的mIL_3m和10ng/ml的mTPO(Genentech, SanFrancisco, CA)的O. 275%琼脂培养物中刺激巨核细胞祖细胞(CFU-Meg)。10天后干燥集落并对乙酰胆碱酯酶阳性细胞染色并计算。间充质干细胞的分离和培养从Lonza(Verviers,Belgium)购买人间充质干细胞(hMSC)。将细胞培养在由54%的DMEM-LG、36%的MCDB-201、10%FCS、ImM的L-谷氨酰胺和1%青霉素/链霉素组成的完全培养基-I (CM-I) (Reyes 等人(2001) ,Blood 98:2615-2625)中。当汇合达到 80-90% 时用
胰酶消化细胞并亚培养，并每3-4天更新培养基。通过用HH冲洗Balb/c小鼠的股骨获得鼠间充质干细胞(mMSC)。在补充有10%的FCSUmM L-谷氨酰胺和1%青霉素/链霉素的DMEM-LG(CM-2)的存在下培养全部的BM细胞。亚培养贴壁的细胞并每周传代一次。每3-4天更换培养基。分化测定对于成脂分化，在由DMEM-LG、10%FCS、I μ M地塞米松、60 μ M吲哚美辛、500 μ M异丁基甲基黄嘌呤(IBMX)和5μ g/ml胰岛素(Sigma，St. Louis, USA)组成的成脂培养基的存在下培养MSC 21天并用油红0(Sigma，StLouis，USA)染色。对于成骨分化，将MSC保持在由DMEM-LG、10% FCS、IOOnM地塞米松、IOmM β -甘油磷酸酯和O. 2mM抗坏血酸(Sigma，St. Louis, USA)组成的成骨培养基中21天。用茜素红S (Sigma，St. Louis, USA)对细胞染色以确认磷酸钙沉积物的存在。对于软骨分化，将2. 5x10s细胞离心到15ml聚丙烯管中并在由具有 IOOnM 的地塞米松的 DMEM-HG(Gibco)、10ng/ml TGF β 3 (Peprotech, USA)、50μ g/ml抗坏血酸、50mg/ml ITS+Premix(Becton Dickinson,USA)组成的软骨培养基中培养自发形成的三维沉淀21天。制备沉淀切片用于组织学研究并用爱茜蓝染色以确认软骨谱系。结果4RepCT纤维存在下干细胞的扩增和分化在一式两份地进行的三个单独的实验中，研究了 4RepCT小片存在或不存在下的鼠骨髓细胞的扩增。表3中展示了结果，其表明在4RepCT存在下培养4天对鼠骨髓(BM)细胞在补充有100ng/ml的mSCF和30ng/ml的mIL_3的无血清培养基中扩增的影响。所计数的细胞是集落形成单位红细胞(CFU-E);爆发集落形成单位红细胞(BFU-E);集落形成单位粒细胞/巨噬细胞(CFU-GM);以及集落形成单位巨核细胞(CFU-Meg)。与对照孔相比，未发现在4RepCT纤维存在下培养四天后细胞数量和所形成的集落量之间的差异。
表、 _____
__第O天的BM 第4天的对照BM S.I. 第4天的BM-4RepCT SI
CFU-E1 507.0 士 98.1__2599.7 士 375.35.1__2296.7士1413.0__4.5
BFU-E1__106.7 士 8.5__173.5 士 61.5__L6__282.0士 183.8__2.6·CFU-GM1 210.3 士 50.4__1935.7 士663.49.2__1495.3 士 187.6__7.1
CFU-Meg1 40.3 士 13.6__163.0±17.6__4X)__91.0 士 78.9__2.3
细胞 23.0 士 0.08.2 土 3.6j 27 I_5.5 土 2.6_ 1.8结果被表示为三个单独的实验的平均值土标准差。所有实验都一式两份地进行。1集落每IxlO5BM细胞2 细胞 XlO5S. I.:与第O天的值相比的刺激指数。将鼠MSC保持在培养基中直到亚汇合并然后用胰酶消化。将lxl05mMSC培养在存在或不存在4RepCT纤维的Icm片的6-孔板中7天并然后胰酶消化并计数。对照孔在7天后表现出5. 7倍的扩增，而在4RepCT存在下培养的细胞扩增4. O倍。然而，只有保留在培养皿中的细胞被胰酶消化，而生长在纤维上的细胞未被包括在总的细胞计数中，从而导致对存在于每个孔中的细胞实际数量的低估。为防止由密集近汇合的培养物中的接触抑制引起的抑制信号的分泌，在7天、14天和21天后从培养皿中小心地去除纤维，用PBS冲洗一次并转移到只包含培养基的新鲜的孔中。因此这些培养皿中出现的细胞都来源于单一的源，即重组的蜘蛛丝线(图3)。在与mMSC相似的条件下将人MSC保持在培养基中。每周一次地将纤维转移到新鲜的培养皿中(图4)。在培养的第21天，去除4RepCT纤维。胰酶消化覆盖培养孔的表面并来源于重组蜘蛛丝纤维的剩余的hMSC并测试其分化为成脂、成骨和软骨谱系的能力(图5)。所有实验都一式三份地进行。与来自同一代的在无4ItepCT存在下培养的hMSC相比，从4RepCT纤维获得的细胞展现出与其相当的分化能力。4RepCT-涂覆的组织培养板上的扩增和分化对鼠的骨髓细胞进行谱系去除(Iin+)并培养在覆盖有4RepCT泡沫的培养皿中的包含mSCF和mIL-3的无血清培养基中。将培养4天后lin+BM细胞的扩增和集落形成单位的数量与培养在无组织培养物处理的平皿(35mm，Falcon 1008)和涂覆有浓度为IOyg/cm2 的重组纤连蛋白片段 CH-296 (Retronectin:RN ；Takara Shuzo, Otzu, Japan)的 Falcon1008平皿上的谱系阴性细胞的培养物进行比较。表4中示出了对于体外爆发集落形成单位红细胞(BFU-E)、集落形成单位粒细胞/巨噬细胞(CFU-GM)和集落形成单位巨核细胞(CFU-Meg)的数量的结果。
表权利要求
1.用于培养真核细胞的方法，包括 -提供待培养的真核细胞的样品； -将所述样品应用到细胞支架材料；以及 -在适合细胞培养的条件下保持已对其应用细胞的所述细胞支架材料； 其特征在于 所述细胞支架材料包含由140至600个氨基酸残基组成且包含下列片段的蜘蛛丝蛋白的聚合物 衍生自蜘蛛丝蛋白的重复片段的70至300个氨基酸残基的重复片段； 衍生自蜘蛛丝蛋白的C端片段的70至120个氨基酸残基的C端片段；以及任选地 衍生自蜘蛛丝蛋白的N端片段的100至160个氨基酸残基的N端片段； 且在于 所述真核细胞是选自由干细胞和包括β细胞的来自朗格汉斯小岛的细胞组成的组的哺乳动物细胞。
2.用于制备真核细胞的方法，包括 _提供真核细胞样品； -将所述样品应用到细胞支架材料； -在适合细胞培养的条件下保持已对其应用细胞的所述细胞支架材料；以及 -由所述细胞支架材料制备细胞样品； 其特征在于 所述细胞支架材料包含由140至600个氨基酸残基组成且包含下列片段的蜘蛛丝蛋白的聚合物 衍生自蜘蛛丝蛋白的重复片段的70至300个氨基酸残基的重复片段； 衍生自蜘蛛丝蛋白的C端片段的70至120个氨基酸残基的C端片段；以及任选地 衍生自蜘蛛丝蛋白的N端片段的100至160个氨基酸残基的N端片段； 且在于 所述真核细胞是选自由干细胞和包括β细胞的来自朗格汉斯小岛的细胞组成的组的哺乳动物细胞。
3.下列的组合物 -真核细胞；和 -细胞支架材料； 其特征在于 所述细胞支架材料包含由140至600个氨基酸残基组成且包含下列片段的蜘蛛丝蛋白的聚合物 衍生自蜘蛛丝蛋白的重复片段的70至300个氨基酸残基的重复片段； 衍生自蜘蛛丝蛋白的C端片段的70至120个氨基酸残基的C端片段；以及任选地 衍生自蜘蛛丝蛋白的N端片段的100至160个氨基酸残基的N端片段； 且在于 所述真核细胞是选自由干细胞和包括β细胞的来自朗格汉斯小岛的细胞组成的组的哺乳动物细胞。
4.根据任一项前述权利要求所述的方法或组合物，其中所述细胞是选自胚胎干细胞、成体干细胞和诱导多能干细胞的干细胞。
5.根据任一项前述权利要求所述的方法或组合物，其中所述细胞是胚胎干细胞。
6.根据权利要求1-3中任一项所述的方法或组合物，其中所述细胞是选自由神经祖细胞、间充质祖细胞和造血祖细胞组成的组的祖细胞。
7.根据权利要求1-3中任一项所述的方法或组合物，其中所述细胞是选自由造血干细胞、神经干细胞、间充质干细胞、乳腺干细胞、内皮干细胞、上皮干细胞和嗅觉干细胞组成的组，特别是选自由造血干细胞、神经干细胞和间充质干细胞组成的组的成体干细胞。
8.根据权利要求1-3中任一项所述的方法或组合物，其中所述细胞是来自朗格汉斯小岛的细胞，例如β细胞。
9.根据任一项前述权利要求所述的方法或组合物，其中所述真核细胞以单一细胞提供。
10.根据权利要求1-5中任一项所述的方法或组合物，其中所述哺乳动物细胞是以至少一个神经球提供的神经干细胞。
11.根据权利要求8所述的方法或组合物，其中所述哺乳动物细胞是以至少一个朗格汉斯小岛提供的β细胞。
12.根据任一项前述权利要求所述的方法或组合物，其中所述蜘蛛丝蛋白选自由式REP-CT和NT-REP-CT定义的蛋白质的组，其中 NT是具有100至160个氨基酸残基的蛋白质片段，所述片段是衍生自蜘蛛丝蛋白的N端片段； REP是具有70至300个氨基酸残基的蛋白质片段，其中所述片段选自由L (AG) nL、L (AG)nAL、L (GA) nL和L (GA) nGL组成的组，其中η是2至10的整数； 每个单独的A区段是8至18个氨基酸残基的氨基酸序列，其中O至3个氨基酸残基不是Ala，且剩余的氨基酸残基是Ala ； 每个单独的G区段是12至30个氨基酸残基的氨基酸序列，其中至少40%的氨基酸残基是Gly ;且 每个单独的L区段是O至20个氨基酸残基的接头氨基酸序列；且CT是具有70至120个氨基酸残基的蛋白质片段，所述片段是衍生自蜘蛛丝蛋白的C端片段。
13.根据任一项前述权利要求所述的方法或组合物，其中所述蜘蛛丝蛋白包含细胞结合基序。
14.根据权利要求13所述的方法或组合物，其中所述细胞结合基序是通过至少一个肽键偶联到所述蜘蛛丝蛋白的剩余部分的寡肽。
15.根据权利要求14所述的方法或组合物，其中所述寡肽被偶联到所述蜘蛛丝蛋白的剩余部分的N端。
16.根据权利要求14-15中任一项所述的方法或组合物，其中所述寡肽包含选自由以下组成的组的氨基酸序列RGD、RGE、IKVAV(SEQ IDNO: 23), YIGSR(SEQ ID NO:24),EPDIM(SEQ ID NO:25)和 NKDIL(SEQID NO:26)。
17.根据任一项前述权利要求所述的方法或组合物，其中所述细胞支架材料处于选自由膜、泡沫、纤维和纤维网组成的组的物理形态。
全文摘要
提供了用于培养真核细胞的方法和组合物，以及用于制备真核细胞的方法。这些方法包括提供待培养的真核细胞的样品，将所述样品应用到细胞支架材料，和在适合细胞培养的条件下保持已对其应用细胞的所述细胞支架材料。所述组合物包括真核细胞和细胞支架材料。所述细胞支架材料包含蜘蛛丝蛋白的聚合物。
文档编号A61L27/38GK102946914SQ201180028236
公开日2013年2月27日 申请日期2011年4月12日 优先权日2010年4月12日
发明者扬·约翰松, 安娜·里辛, 麦·赫德哈马尔, 乌尔丽卡·约翰逊, 莫娜·维德 申请人:思百博技术股份公司