干扰素α突变体及其聚乙二醇衍生物的制作方法

专利名称：干扰素α突变体及其聚乙二醇衍生物的制作方法
技术领域：
本发明一般的涉及干扰素α突变体、其聚乙二醇衍生物，后者的制备方法、药物组合物和两者在制备治疗病毒性疾病的药物中的用途，特别的涉及复合干扰素半胱氨酸突变体、其聚乙二醇衍生物，后者的制备方法、药物组合物和两者在制备治疗病毒性疾病的药物中的用途。
背景技术：
干扰素(interferon，IFN)是一种最初由动物机体产生的具有广谱抗病毒作用的细胞因子类药物，根据其产生部位与作用机理不同可以分为α、β、Y、λ等大的类型，而每种大的类型又可分为若干小的亚型，同一大的类型中不同的亚型间在一级结构上差异很小，在二级以上高级结构上非常接近。在几种大的类型中，α型是应用最广的一种，目前临床应用的此型干扰素主要包括干扰素α加、干扰素α 2b、干扰素α lb、复合干扰素等。其中复合干扰素(consensus interferon或integrated interferon)是在对已知的α型干扰素进行序列比对后，把出现频率最高的氨基酸分配到各自相应的位置，并对个别位置进行修改后得到的非天然氨基酸序列的人工设计α型干扰素，包括多种氨基酸序列的分子，但彼此间同源性高，它们的生物学活性为天然α型干扰素的10倍以上。虽然各种α型干扰素在当前治疗病毒性感染疾病的过程中发挥着越来越广泛的疗效，但是其自身稳定性差、半衰期短的特点也限制了其进一步的临床推广应用，给病人用药带来了一些麻烦。鉴于此原因，国内外开展了很多长效干扰素方面的基础研究与产品开发，包括对干扰素分子自身进行改造、研发包括干扰素分子氨基酸序列的融合蛋白、对干扰素分子进行化学修饰、选择适宜的药物输送体系优化干扰素分子的体内输送与药效发挥过程等，其中聚乙二醇修饰干扰素(属于化学修饰的干扰素)的上市是在这一领域取得的最大成功。聚乙二醇(polyethelene glycol, PEG)是一种线性高分子化合物，由于其良好的生物相容性和既亲水又亲酯的双亲特性，得以从众多的化学修饰剂中脱颖而出成为目前研究与应用最广的蛋白多肽类药物的修饰剂。经过多年的研究开发，目前已有两个PEG修饰的干扰素α产品成功上市，分别是美国先灵葆雅(khering-Plough)公司(现已被默沙东公司收购)的PEG修饰的干扰素a2b(商品名为“佩乐能”)和瑞士罗氏(Roche)公司的PEG修饰的干扰素α 2a(商品名为“派罗欣”)，分别于2001年和2002年在美国上市，在 2003年同时进入中国内地销售。关于先灵葆雅公司的PEG修饰的干扰素α 2b，在中国专利申请CN00808452. 1中对其配方组成有所描述；而罗氏公司的PEG修饰的干扰素α 2a则在中国专利CN97113049.3中有详细描述。除此之外，还有更多的PEG修饰的干扰素α产品正在研究开发中，其中最接近上市阶段的是htermime公司开发的PEG修饰的复合干扰素。纵观PEG修饰干扰素α技术的发展，主要是伴随着PEG修饰技术的发展。早期的研究和开发主要围绕非特异性位点PEG修饰技术，所选用的PEG修饰剂纯度低、分子量小 (一般在IOKDa以下)且分布范围宽、修饰位点种类和数量多且形成的修饰衍生物不稳定，造成修饰产物组成不均一、纯度相对较低(85%左右)、质量控制不易实现、长效作用不明显且仍有一定的毒副作用。上述先灵葆雅公司的PEG修饰的干扰素α 2b产品就属于此类型。伴随着PEG修饰剂的发展出现了特异性位点PEG修饰技术，由于所选用的PEG修饰剂的纯度得到了很大提高，分子量可达20KDa以上且分布范围大幅缩窄，且修饰机理的改善使修饰位点种类和数量减少，形成的修饰衍生物稳定性提高，从而使上述非特异性位点PEG 修饰技术的缺点得到了很大程度的改善。特异性位点PEG修饰技术又可分为三种类型，一种是用具有分支结构的PEG修饰剂修饰目标蛋白分子，借助分支结构PEG修饰剂较强的空间位阻效应达到减少修饰位点数量的目的。上述罗氏公司的PEG修饰的干扰素C^a产品就属于此类型。但是由于这种所谓的“特异性位点”修饰技术从修饰机理上既不能做到只修饰单一种类的氨基酸， 也不能做到只修饰单一位点的氨基酸，所以修饰位点的种类与数目依然众多，如中国专利 CN200380103341. 1公开了分支结构PEG修饰的干扰素α 2a (包括罗氏公司的PEG修饰干扰素ah产品“派罗欣”)具有12个修饰位点的异构体。第二种是修饰蛋白质分子N末端氨基酸的自由α-氨基，原理是蛋白质N末端氨基酸的自由α-氨基与蛋白质其它位点中赖氨酸的自由ε-氨基相比具有更低的PKa值， 可以在更低的PH下与氨基修饰剂发生修饰反应。但是由于这种pH选择反应的特异性并不是太高，即使在较低的PH下仍可发生赖氨酸的自由ε -氨基上的修饰反应，且修饰过程可能遮蔽蛋白质分子的活性位点，造成修饰产物活性大大降低，因此这种修饰技术在实际应用中也受到限制。第三种是用巯基修饰剂修饰蛋白质分子半胱氨酸上的巯基，由于蛋白质分子中的半胱氨酸数量很少，且多数半胱氨酸上的巯基用于形成分子内或分子间二硫键，只有极少的游离巯基可供修饰，所以这种修饰反应的特异性很高。如中国专利申请CN200510076676. X公开了一种巯基PEG修饰剂修饰的干扰素a lb，利用了干扰素a Ib分子中只有一个自由巯基的特点用巯基PEG修饰剂对其进行修饰。但是此种技术实际拓展应用的最大问题是天然蛋白质分子中基本上没有游离的半胱氨酸残基，即使有也会因非常明显的影响蛋白质分子的稳定性和纯化过程(容易形成分子内或分子间二硫键)而使用于修饰的蛋白质纯品不易得到，使修饰过程无法实现(因为一旦形成分子内或分子间二硫键就没有可供修饰的游离半胱氨酸)；且选择天然位点的半胱氨酸进行修饰同样可能遮蔽蛋白质分子的活性位点，造成修饰产物活性大大降低。上述PEG修饰的干扰素a Ib就因干扰素alb自身较低的生物活性和修饰后活性残留率也较低，从而使最终的PEG修饰产物活性更低，实际应用效果有待论证。另外干扰素α种类亚型众多，序列中有许多位点可供改变以产生活性更高的突变干扰素α产物，如美国专利US4695623、US4897471、US5372808就公开了一种活性为天然序列干扰素a 10倍以上的复合干扰素分子。所以也可利用干扰素α的这一特点选择活性高、稳定性好与毒性低的突变干扰素α进行PEG修饰，以提高或改善修饰产物的药效、药代与安全性，前述htermime公司的PEG修饰的复合干扰素就属于此类型，又如中国专利申请CN02159951. 3也公开了一种分支结构PEG修饰剂修饰的复合干扰素。但是单一利用此种技术依然不能解决修饰产物组成不均一、纯度差、质量控制不易实现、长效作用不明显且仍有一定毒副作用的问题。

发明内容
本发明的首要目的是提供一种复合干扰素的半胱氨酸突变体，以解决现有的干扰素α中没有游离的半胱氨酸残基可供特异性位点巯基PEG修饰剂修饰或所具有或突变的游离半胱氨酸残基位点不理想，造成蛋白质分子不稳定、活性低、分离纯化困难而不利于特异性位点PEG修饰剂修饰的问题。为实现此目的，在基础的实施方案中，本发明的复合干扰素的半胱氨酸突变体将复合干扰素氨基酸序列中从N端计的第109位或第110位的氨基酸突变为半胱氨酸，分别具有SEQ ID No. 1-2所示的氨基酸序列。本发明选择将复合干扰素氨基酸序列中从N端计的第109位或第110位的氨基酸突变为半胱氨酸基于突变前后分子计算机空间结构预测结果、已知的干扰素α与受体结合原理及已知的干扰素ah与干扰素a 2b的空间结构。为了获得复合干扰素半胱氨酸突变体，需要先后进行表达复合干扰素半胱氨酸突变体分子的基因工程菌或基因工程细胞的构建、基因工程菌或基因工程细胞的发酵和发酵产物的纯化，优选进行表达复合干扰素半胱氨酸突变体分子的大肠杆菌工程菌的构建、发酵和发酵产物的纯化。在基因工程菌或基因工程细胞的构建过程中，首先需要获得并扩增表达复合干扰素半胱氨酸突变体的基因，采用的方法优选本领域技术人员公知的PCR法，并更加优选本领域人员公知的重叠延伸PCR法。在大量获得表达复合干扰素半胱氨酸突变体的基因后选择适宜的载体，用本领域技术人员公知的构建重组载体的方法将表达复合干扰素半胱氨酸突变体的基因转入所述载体从而构建重组载体。所述载体和重组载体优选质粒载体，该质粒载体应具有一组或多组双酶的各自单一的酶切位点，并适宜被转入对应的宿主菌或宿主细胞。然后首先制备感受态的宿主菌或宿主细胞，再利用电穿孔法、PEG法等本领域技术人员公知的方法将重组载体转入宿主菌或宿主细胞构建表达复合干扰素半胱氨酸突变体的基因工程菌或基因工程细胞。所述的宿主菌或宿主细胞优选大肠杆菌、毕赤酵母和CHO 细胞，并更优选大肠杆菌。工程菌或工程细胞的发酵应选择适宜其生长的培养基组成、pH、温度、通气量、培养时间与补料操作等条件。对于大肠杆菌工程菌的发酵，优选LB培养基，培养过程中的温度控制在30-37°C之间，pH控制在6. 0-8. 0之间(必要时选择pH调节剂控制pH，所述的pH 调节剂包括但不限于NaOH、氨水及各种各种有机氮源，优选氨水)，通气量应满足菌体或细胞的生长需要及产物表达合成的需要，培养时间与补料操作的方式相关，在采取适宜的补料操作条件的情况下培养时间为6-48小时之间。复合干扰素半胱氨酸突变体蛋白如果表达在工程菌或工程细胞内，需要对发酵培养收获的菌体或细胞进行破碎处理以释放出其中的复合干扰素半胱氨酸突变体蛋白。而对于大肠杆菌等原核的工程菌，更需要破碎处理以释放出以包涵体形式表达的复合干扰素半胱氨酸突变体蛋白。常用的破碎方法包括但不局限于超声波破碎、球磨机破碎、溶菌酶处理寸。对于以包涵体形式表达的复合干扰素半胱氨酸突变体蛋白，需要对破碎处理得到的粗包涵体进行洗涤操作以尽可能除去其中含有的少量菌体蛋白、膜蛋白等杂蛋白。洗涤过程中使用的缓冲液包括但不局限于Tris-HC1、PB，洗涤过程的pH值应控制在7. 0-9. 0之间。为了溶解较难溶解的疏水蛋白质杂质，可在洗涤缓冲液中加入一定量的盐，常用的为 NaCl，浓度范围在0. 05-0. 5mol/L之间；为了溶解疏水性更强的膜蛋白，可在洗涤缓冲液中加入一定量的表面活性剂，常用的此类表面活性剂包括但不限于吐温-80、十二烷基磺酸钠 (SDS)、TritonX-100，浓度在 0. 01-5%之间。由于在破碎过程中菌体或细胞会释放出一些蛋白水解酶，从而有可能降解复合干扰素半胱氨酸突变体，因此需要在破碎过程中及破碎后的洗涤过程中加入一些物质来抑制这些蛋白水解酶的活性，最直接的方法是加入蛋白酶抑制剂，如胰蛋白酶抑制剂，间接的方法也可加入金属离子螯合剂，如EDTA，因为金属离子螯合剂可以螯合这些蛋白水解酶发挥水解作用所必须依靠的金属离子。洗涤得到的包涵体变性溶解可以使用7-lOmol/L的尿素或5-8mol/L的盐酸胍，必要时还需要加入巯基试剂以提高变性剂的溶解效力，所述的巯基试剂包括但不局限于巯基乙醇、二硫苏糖醇。溶解所采用的包涵体/变性剂的质量/体积比(g/ml)可以在1 3到 1 50之间，优选的在1 5到1 30之间，最佳的在1 7到1 20之间。变性溶解时间应该在2小时以上。包涵体复性可以采用稀释复性法、透析复性法或柱上复性法。稀释复性法是通过一步或多步稀释用复性液将变性剂的浓度稀释到0. 5mol/L以下，以使蛋白质分子在摆脱变性剂影响的情况下逐渐复性；透析复性法是用10倍以上体积的复性液对变性液进行透析以使变性剂的浓度降低到0. 5mol/L以下，同样起到复性的作用；柱上复性法是将变性液直接上离子交换、疏水分子排阻(凝胶)色谱柱，然后用含不断降低变性剂浓度的洗脱溶液进行梯度洗脱以同时实现目标蛋白的分离纯化与复性。复性液的基本组成是pH在5. 0-10. 0之间的缓冲溶液，以保证复性所需的基本碱性环境，可以满足这种要求的缓冲溶液包括但不局限于Tris-HCl、硼酸钠缓冲液。为了防止复性过程中复性速度过快形成二硫键错配，需要在复性液中加入一些氧化型和还原型巯基试剂对组成的氧化还原平衡体系物质，如氧化型谷胱甘肽和还原型谷胱甘肽组成的氧化还原平衡体系。同时为了防止复性速度过快造成蛋白质折叠不完全、二硫键错配，可以在上述基本组成的复性液中添加一些其它物质，如精氨酸、EDTA、金属离子及各种分子伴侣物质等。这些物质的选择及加量在现有技术中有很多报道，这里不再赘述。上述稀释复性法和透析复性法得到的复性液，以及通过破碎直接得到的含有可溶性形式表达的复合干扰素半胱氨酸突变体的离心上清，以及以可溶性形式表达的复合干扰素半胱氨酸突变体的发酵培养液离心上清，都需进行进一步的色谱分离纯化。利用复合干扰素半胱氨酸突变体分子与杂质分子在亲和性质、电荷性质、疏水性质、分子量大小上的差异可以先后选择离子亲和色谱、交换色谱、疏水色谱、凝胶分离色谱中的一种或几种的组合进行纯化。为了更好的达到分离作用，在色谱分离纯化前可对待分离液进行浓缩处理，可以选择的方法包括但不局限于有机溶剂沉淀后反溶、盐析后反溶、聚乙二醇浓缩、超滤及色谱处理等。色谱分离纯化获得的复合干扰素半胱氨酸突变体分子可用本领域技术人员公知的SDS-PAGE电泳加考马斯亮蓝染色法或高效液相色谱法确定纯度；用质谱法确定分子量；用《中华人民共和国药典2010版(三部)》附录部分规定的“干扰素活性测定法”和“蛋白质含量测定法”，以测定得到的干扰素活性除以蛋白质浓度确定复合干扰素半胱氨酸突变体的比活性。其中高效液相色谱纯度检测法可以采用反相高效液相色谱法或分子排阻高效液相色谱法，但优选分子排阻高效液相色谱法，因为此种方法更为方便、准确、快捷。采用分子排阻高效液相色谱法时要求色谱柱的理论板数大于10000，上样量在5-100 μ 1之间，优选 10-50 μ 1之间，色谱分离时间为主峰出峰时间的3倍。稳定性考察是将色谱分离纯化得到的复合干扰素半胱氨酸突变体溶液在20_45°C 的环境下长期存放3-6个月，在此过程中定期取样观察外观的变化，并检测纯度、活性等主要质量控制指标的变化。色谱分离纯化获得的复合干扰素半胱氨酸突变体分子还需进行动物药代试验评价与动物急性毒性试验评价。在一种优选的实施方案中，本发明的复合干扰素半胱氨酸突变体将复合干扰素氨基酸序列中从N端计的第109位的氨基酸突变为半胱氨酸，其具有SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列。在一种优选的实施方案中，本发明的复合干扰素半胱氨酸突变体将复合干扰素氨基酸序列中从N端计的第110位的氨基酸突变为半胱氨酸，其具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。本发明的第二个目的是提供如上所述的复合干扰素半胱氨酸突变体的聚乙二醇修饰衍生物，以解决现有干扰素α聚乙二醇衍生物组成不均一、纯度活性低、质量控制不易实现或长效作用不明显且仍有一定毒副作用等问题。为实现此目的，在基础的实施方案中，本发明的聚乙二醇衍生物由所述的复合干扰素半胱氨酸突变体与聚乙二醇修饰剂连接得到，所述的聚乙二醇修饰剂的分子量在 5KDa-40KDa 之间。在一种优选的实施方案中，所述的聚乙二醇修饰剂是巯基聚乙二醇修饰剂，选自马来酰亚胺PEG修饰剂、乙烯砜基PEG修饰剂、碘乙酰胺PEG修饰剂或邻吡啶基二硫化物 PEG修饰剂中的一种。为获得所述的聚乙二醇衍生物进行的PEG修饰反应主要受修饰剂的种类、温度、 蛋白质浓度、PH、蛋白质/修饰剂质量/摩尔比、搅拌速度、添加剂及修饰反应时间等因素的影响。用于特异性位点巯基修饰的PEG修饰剂根据PEG活化基团与修饰反应机理的不同主要有马来酰亚胺PEG修饰剂(mPEG-maleimide，mPEG-MAL)、乙烯砜基PEG修饰剂 (mPEG-vinylsulfone, mPEG-VS)、碘乙酰胺 PEG 修饰剂(mPEG-iodoacetamide，mPEG-IA)与邻吡啶基二硫化物PEG修饰剂(mPEG-orthopyridyl disulfide, mPEG-OPSS)，结构分别如下(作为示例性结构主要给出活化基团的结构，但活化基团不局限于与一个mPEG连接)。马来酰亚胺PEG修饰剂CN 102532299 AmPEG— N O乙烯砜基PEG修饰剂
O
Il
mPEG—S—CH=CH7
Il
ο碘乙酰胺PEG修饰剂
O
Il
mPEG-NHCCH2l 邻吡啶基二硫化物PEG修饰剂
mPEG—S-S~》前两者修饰巯基的机理是与巯基发生双键加成反应，后两者修饰巯基的机理是与巯基发生二硫键置换反应。其中优选的是用mPEG-MAL，因为其具有更快的反应速度，甚至在酸性条件下也可进行修饰反应。PEG修饰剂的分子量可在5KDa-40KDa之间，但由于低分子量的PEG修饰剂对延长干扰素α半衰期的作用不明显，高分子量的PEG修饰剂修饰干扰素 α后使其生物活性下降严重，因此优选的PEG修饰剂的分子量在10KDa-20KDa之间。修饰过程中提高温度可以提高修饰反应的速度，但同时也会加快修饰剂的水解或氧化速度，还不利于复合干扰素半胱氨酸突变体的稳定，因此适宜的修饰反应温度为 2-40°C，优选的修饰反应温度为2-25°C，最优的修饰反应温度为2-10°C。修饰过程中提高蛋白质浓度可以提高修饰反应的速度，但不利于蛋白质的稳定， 因此适宜的复合干扰素半胱氨酸突变体的浓度为2-20mg/ml，优选的浓度为Ι-lOmg/ml，最优的浓度为2-5mg/ml。为了达到这一蛋白质浓度，需要对复合干扰素半胱氨酸突变体进行浓缩，同时也可将PH和缓冲溶液转换到所需。常用的浓缩方法包括但不限于有机溶剂沉淀后反溶、盐析后反溶、超滤、聚乙二醇浓缩、色谱分离等。修饰过程中需要的pH与修饰反应的机理有关，如前文所述mPEG-MAL修饰时的pH 可以低一些，甚至可以到酸性范围，而mPEG-VS修饰时的pH必须在中型或碱性，但一般来说 7. 0-9. 0的弱碱性环境都比较适宜修饰反应。修饰过程的pH低于此pH范围时修饰反应速度较慢；而高于此PH范围时修饰反应速度虽然快，但复合干扰素半胱氨酸突变体不稳定， 易形成分子间二硫键而显著减少可修饰的复合干扰素半胱氨酸突变体分子的总量。修饰过程中提高或降低蛋白质/修饰剂质量或摩尔比均可以提高反应速度。从提高PEG修饰剂利用率的角度考虑应该增加投入反应的复合干扰素半胱氨酸突变体的量，而从提高复合干扰素半胱氨酸突变体转化率的角度考虑则应该增加投入反应的PEG修饰剂的量，具体如何处理应视具体情况决定(优先考虑修饰剂的利用率还是优先考虑蛋白质的利用率，很大程度上取决于两者的成本比)，但一般情况下适宜的比值应在1 8-8 1之间，优选的比值在1 4-4 1之间，最优的比值在1 2-2 1之间。修饰过程中增加搅拌可以提高修饰反应的速度，尤其是对于从修饰机理上来说反应速度较慢的修饰反应。但过快的搅拌对蛋白质的稳定不利，同时也无法进一步加速修饰反应的速度，因此适宜的修饰反应搅拌速度在0-40转/分之间，优选的速度在1-20转/分之间，最优的速度在2-10转/分之间。修饰过程中添加某些物质或在蛋白质缓冲溶液中存在某些物质也会影响修饰反应的速度，如添加某些类型的表面活性剂或在蛋白质缓冲溶液中存在高浓度的NaCl，但具体影响规律由于添加与存在物质种类众多，可选择浓度范围宽，所以不能一概加以论述，需要具体问题具体研究。修饰反应的时间与上述各影响因素均有关，一般来说延长修饰反应时间均可提高修饰反应得率，但时间超过某一临界值后这一规律会变得不明显，且还会对复合干扰素半胱氨酸突变体的稳定不利，会降低反应过程的经济效益，因此适宜的修饰反应时间在 0. 5-48小时之间，优选的时间在0. 5-24小时之间，最优的时间在1_12小时之间。从原理上讲修饰反应终止后修饰反应混合物中含有未参与修饰反应的PEG修饰齐U、未被修饰的复合干扰素半胱氨酸突变体、单位点修饰的复合干扰素半胱氨酸突变体及少量多位点修饰的复合干扰素半胱氨酸突变体，必须通过后续的分离纯化过程除去单位点 PEG修饰的复合干扰素半胱氨酸突变体以外的成分。利用目标单位点PEG修饰的复合干扰素半胱氨酸突变体分子与杂质分子在分子量上有明显差异的特点，可以采用凝胶色谱(gel filtration chromatography, GFC)或分子排阻色谱(size exclusion chromatography, SEC)对它们进行分离，可以采用的填料包括但不限于 Sephacryl S_100、Sephacryl S-200、Sephadex G~25>Sephadex G~50>Sephadex G-75、Superdex 75、TSKgel 冊_50、TSKgel HW-55 等。由于巯基修饰剂修饰的是蛋白质的半胱氨酸位点，修饰后会使蛋白质失去带负电的可解离基团，且有可能掩蔽蛋白质的其它带电基团，而连接分子量越大的修饰剂或连接较多个数的修饰剂分子的后一效应越明显。因此可以利用修饰前后蛋白质分子这一电荷性质的改变对目标单位点PEG修饰的复合干扰素半胱氨酸突变体分子与杂质进行离子交换色谱(ion exchange chromatography, IEC)分离，可以采用的填料包括但不限于DEAE Sepharose FF> Q Sepharose FF> CM Sepharose FF> SP Sepharose FF> DEAE Sepharose CL-6B、Source 15、Source 30、TSKgel CM-650、TSKgel DEAE-650、TSKgel QAE-550、TSKgel SP-650,TSKgel CM_5PW、TSKgel DEAE-5PW等。在这一纯化过程中，由于PEG修饰剂不带电荷，所以在上样过程中不会被吸附。由于PEG是一个既亲水又亲酯的分子，用于修饰蛋白质分子后会提高蛋白质分子的亲酯性能，且分子量越大，连接的分子个数越多这种提高越明显，因此可以利用修饰前后蛋白质分子这一疏水性能的改变对目标单位点PEG修饰的复合干扰素半胱氨酸突变体分子与杂质进行疏水作用色谱(hydrophobic interaction chromatography, HIC)分离,可以采用的填料包括但不限于 Phenyl S印harose 6FF、Butyl S印harose 4FF、Source 15PHE、 Source 15ETH、TSKgel Ether_5PW、TSKgel Phenyl_5PW 等。纯化获得的复合干扰素半胱氨酸突变体巯基聚乙二醇修饰剂修饰衍生物也需要进行纯度、分子量、生物学活性、稳定性、药代、安全性等评价，方法同前所述的未修饰的复合干扰素半胱氨酸突变体。在一种更加优选的实施方案中，本发明的聚乙二醇修饰剂的分子量在 10KDa-20KDa 之间。本发明的第三个目的是提供上述复合干扰素半胱氨酸突变体聚乙二醇衍生物的制备方法，包括如下步骤1)制备浓缩的所述的复合干扰素半胱氨酸突变体溶液，使其浓度达到2. 0-20mg/ ml，并使所述的复合干扰素半胱氨酸突变体所处的缓冲溶液体系转换为适宜进行聚乙二醇修饰反应的缓冲溶液体系；2)将上述得到的浓缩的复合干扰素半胱氨酸突变体溶液与聚乙二醇修饰剂接触进行修饰反应；3)对修饰反应后得到的混合物进行色谱分离纯化，以除去其中未参与修饰反应的聚乙二醇修饰剂和未参与修饰反应的所述的复合干扰素半胱氨酸突变体，并除去连接有多个聚乙二醇分子的复合干扰素半胱氨酸突变体巯基聚乙二醇衍生物。本发明的第四个目的是提供上述复合干扰素半胱氨酸突变体聚乙二醇衍生物的药物组合物。在基础的实施方案中，本发明的组合物中含有治疗有效量且安全量的所述的复合干扰素半胱氨酸突变体聚乙二醇衍生物，以及适宜量的可药用载体。本发明的最后一个目的是提供上述复合干扰素半胱氨酸突变体及其聚乙二醇衍生物在制备治疗病毒性疾病的药物中的用途。本发明的复合干扰素半胱氨酸突变体及其聚乙二醇衍生物与未突变的复合干扰素具有相同的目标适应症，由于干扰素对病毒复制的广泛抑制作用，所以它们对几乎所有的病毒感染性疾病都有疗效，尤其是在治疗乙型肝炎和/或丙型肝炎方面较天然干扰素α 分子具有相当或更好的体内或体外药效。本发明中使用的术语“ α干扰素”或“干扰素α ”包括人体或动物体在外界病原性物质刺激下由白细胞产生的天然抗病毒活性物质，也包括通过基因工程方法选择适宜的表达载体表达的与上述天然序列完全相同的重组分子，还包括通过基因工程方法选择适宜的表达载体表达的集成了上述天然干扰素α保守序列的人工设计的分子，即复合干扰素分子。本发明中使用的术语“复合干扰素”(consensus interferon或integrated interferon)在除说明书背景技术部分外的申请文件中仅指具有SEQ ID No. 3所示氨基酸序列的复合干扰素，该复合干扰素在中国专利申请CN02159950. 5中对其有详细描述(在其中被称为“新型α干扰素突变体”，对应于序列表中的序列3)。本发明中使用的术语“聚乙二醇修饰剂”，也即“PEG修饰剂”是指单甲氧基聚乙二醇修饰剂，也即用甲氧基封闭聚乙二醇分子一端的一个羟基，而用适宜的活化方法活化另一端的一个羟基后所得的活化聚乙二醇。由于羟基自身的反应活性很低，所以经过活化后的聚乙二醇分子的反应活性有了很大的提高，才可被称为“聚乙二醇修饰剂”。关于活化基团的选择、活化的机理以及活化所得的聚乙二醇修饰剂的修饰反应机理在现有技术中有很多文献报道，如美国Nektar公司(原Siearwater公司)申请并获得授权了多篇有关聚乙二醇修饰剂的专利。本发明所述的“巯基聚乙二醇修饰剂”是专一性的修饰蛋白质分子中未参与形成二硫键的游离巯基的聚乙二醇修饰剂，可通过商业渠道得到或通过已知的活化机理活化制备，尤其是mPEG-MAL和mPEG_VS可从国外Nektar公司购买或从国内包括北京键凯科技有限公司、北京凯正生物工程发展有限责任公司在内的专业活化PEG修饰剂的公司购买。本发明中使用的术语“聚乙二醇修饰”是指将聚乙二醇修饰剂分子与蛋白质分子化学偶联到一起。参与偶联反应的聚乙二醇修饰剂的基团是其在活化过程中引入的活化基团，蛋白质的基团主要是其中游离的氨基基团、巯基基团、羧基基团或羟基基团，优选的是氨基基团或巯基基团。
具体实施例方式通过如下的实施例对本发明的实施作进一步说明，但本发明的实施方式并不局限于如下的实施例。实施例1 复合干扰素109位点半胱氨酸突变体的表达工程菌构建与序列确认提取复合干扰素的质粒作为模板，首轮PCR包括两个反应体系。反应体系1引物为Pl:ATGTGTGACCTGCCGCAGAC,P4 CTATTAGTCTTTACGACGCAG,扩增109位点及其上游的DNA序列。反应体系2引物为P2 GTTCATCAGCGGGCATTCTTCAAC,P3 CCGCTGATGAACGTTGACTG,扩增109位点及其下游的DNA序列。 反应条件为95 °C，4分钟、95 °C，1分钟、然后56 °C，2分钟、72 °C，2分钟共30个循环。第二轮PCR以第一轮PCR的产物为模板，以PI、P2为引物进行PCR扩增。反应条件为95 °C，4分钟、95 °C，1分钟、然后56 °C，2分钟、72 °C，2分钟共30个循环。第二轮PCR产物经琼脂糖电泳分析，选择720bp左右的DNA片段，用Nde I/EcoR I 双酶切，电泳回收500bp左右的目的DNA片段。将pET_2;3b质粒载体用Nde I/EcoR I双酶切，经琼脂糖电泳回收并和上述第二轮 PCR回收的目的DNA片段连接。连接反应条件为2XRapid buffer 4-5 μ 1, T4DNALagase 1 μ 1、目的片段1-2 μ 1、载体3 μ 1，4°C过夜连接。制备大肠杆菌JM109或DH5 α感受态细胞，转化上述连接产物，涂布氨苄平板， 37 °C过夜培养。挑取单菌落作为模板，用上述设计的引物P1、P2进行扩增，产物经琼脂糖电泳检测，阳性克隆在720bp左右出现特异条带；取阳性克隆小量培养，提取质粒用Nde I/EcoR I 双酶切。分别在31Λ左右和500bp左右出现特异性的条带，与预计情况相符，初步说明重组质粒构建成功。为进一步确认其序列，以T7通用引物对ABI377测序仪进行全自动序列测定。
实施例2 复合干扰素109位点半胱氨酸突变体的发酵、纯化与检测将用实施例1的方法构建得到大肠杆菌工程菌，经涂平板活化后挑选单菌落接种于含氨苄青霉素的LB培养基中(每升用蛋白胨10g、酵母粉5g、NaCl IOg配制，调节pH为 7. 0)，37°C、220转/分摇床摇瓶培养至OD6tltlnm为0. 6-0. 8。然后以5%的体积接种量接种于50L的LB培养基中在80L发酵罐中进行发酵培养(每升含0. 1 %的氨苄青霉素)，培养温度为37°C，培养过程中用氨水调节pH在6. 5-7. 5之间，用转速控制溶氧值在3_5%之间。 在OD600nm达到1. 0后按质量体积比1 5000的比例加入IPTG IOg继续诱导培养3小时， 诱导培养温度为35°C，并在此过程中向发酵罐中适当的补加LB培养基。诱导培养时间到后放罐室温5000转/分离心20分钟收集菌体，所得菌体用上述TE缓冲液洗涤两次以除去发酵液中的主要杂质。取上述处理得到的菌体40g以1 15的质量体积比加入600ml上述TE缓冲液并然后按体积质量比100 1的比例加入溶菌酶处理4小时以上，所得破碎液室温6000转/ 分离心20分钟弃上清，沉淀以1 10的质量体积比加入含表面活性剂SDS的TE缓冲液 (50mmol/L Tris-HCl, 5mmol/L EDTA,0. 3%SDS,pH8. 0)洗涤离心两次后再用不含表面活性剂的TE缓冲液洗涤三次以分别除去破碎后上清中引入的杂质与洗涤过程中引入的SDS。所得IOg包涵体以1 15的质量体积比加入150ml含5mmol/L巯基乙醇的8mol/L 尿素后在适度搅拌条件下变性处理4小时，待包涵体完全溶解后室温8000转/分离心20分钟弃沉淀，上清以柱上复性法在室温进行复性处理。具体方法为变性液上DEAE Sepharose FF柱后先用50mol/L Tris-HCl, 5mmol/L EDTA，4M尿素，pH8. 0溶液洗脱3_5个柱体积；再用 50mol/L Tris-HCl, 5mmol/L EDTA，2M尿素，pH8. 0 溶液洗涤 3_5 个柱体积；再用 50mol/L Tris-HCl, 5mmol/L EDTA, IM 尿素，pH8. 0 溶液洗涤 3-5 个柱体积；再用 50mol/L Tris-HCl 缓冲液，3mmol/L氧化型谷胱甘肽，lmmol/L还原型谷胱甘肽，5mmol/L EDTA, 50mmol/L精氨酸，pH 8. 0溶液洗涤5-8个柱体积；在用50mmol/L Tris-HCl, pH8. 0溶液冲洗3_5个柱体积后以含有0. 3mol/L NaCl的50mmol/L Tris-HCl，pH8. 0溶液洗脱收集洗脱峰。上述上样、冲洗与洗脱过程中的线性流速应控制在50-200cm/h之间。DEAE Sepharose FF洗脱峰按2 3的体积比与50%硫酸铵(质量体积浓度)混合，调节pH为8. 0后上用含20%硫酸铵的50mmol/L Tris-HCl, pH8. 0溶液平衡的Wienyl Sepharose 6FF(Low sub)色谱柱，在用含 20%硫酸铵的 50mmol/LTris-HCl，pH8. 0 溶液冲洗柱3-5个体积后用50mmol/L Tris-HCl, pH8. 0溶液洗脱收集目标峰。上述上样、冲洗与洗脱过程中的线性流速应控制在50-200cm/h之间。洗脱收集目标峰若不用于后续聚乙二醇修饰反应而用于保存，则用截留分子量为3000Da的Millipore超滤离心管进行换溶液处理，使缓冲溶液转换为含0. 5mol/LNaCl的25mmol/L醋酸-醋酸钠，pH4. 5溶液，转换后的溶液体积与转换前基本相同。用SDS-PAGE电泳加考马斯亮蓝染色法和分子排阻HPLC法分别检测上述Wienyl Sepharose 6FF(Low sub)色谱柱分离纯化并超滤转换缓冲液得到的复合干扰素109位点半胱氨酸突变体的纯度，结果均在97%以上。用MALDI-T0F质谱法检测其分子量为 19412. 18 (还原状态)，与理论值偏差为0. 43 (还原状态下理论值为19411. 75)。用《中华人民共和国药典2010版(三部)》规定的“干扰素活性测定法”和“蛋白质含量测定法”确定其比活性为7. 4X 108IU/mg，对照未突变复合干扰素的活性为5. 2X 108IU/mg。
实施例3 复合干扰素110位点半胱氨酸突变体的发酵、纯化与检测用同实施例1原理相同的方法构建得到表达复合干扰素110位点半胱氨酸突变体的大肠杆菌工程菌菌种，然后按实施例2的方法进行菌种活化和摇瓶培养。以4%的体积接种量接种50L的LB培养基于80L发酵罐中后进行发酵培养，条件如实施例3，但诱导培养温度为36°C。诱导培养时间到后放罐室温5000转/分离心20分钟收集菌体，所得菌体用上述TE缓冲液洗涤两次以除去发酵液中的主要杂质。取上述处理得到的菌体40g以1 15的质量体积比加入600ml上述TE缓冲液用球磨机破碎处理2小时以上，所得破碎液室温6000转/分离心20分钟弃上清，沉淀以 1 10的质量体积比加入含表面活性剂TritonX-IOO的TE缓冲液(50mmol/L Tris-HCl, 5mmol/L EDTA，0. 5% TritonX-100,pH8. 0)洗涤离心两次后再用不含表面活性剂的TE缓冲液洗涤三次以分别除去破碎后上清中引入的杂质与洗涤过程中引入的SDS。所得IOg包涵体以1 15的质量体积比加入150ml含5mmol/LDTT的8mol/L尿素后在适度搅拌条件下变性处理4小时，待包涵体完全溶解后室温8000转/分离心20分钟弃沉淀，上清先后对10倍体积的25mmol/L Tris-HCl，4mol/L尿素，pH8. 0溶液、25mmol/ L Tris-HCl，2mol/L 尿素，ρΗ8· 0 溶液、25mmol/L Tris-HCl，lmol/L 尿素，ρΗ8·0 溶液禾口 25mmol/L Tris-HCl, pH8. 0溶液进行透析处理，所得透过液加入1/20体积的2mol/L醋酸-醋酸钠，PH4. 5缓冲液后再对100倍体积的25mmol/L醋酸-醋酸钠，pH4. 5缓冲液进行透析处理12小时以上。透过液上用25mmol/L醋酸-醋酸钠，pH4. 5缓冲液平衡的CM Sepharose FF 色谱柱。上样完成后先用平衡缓冲液继续冲洗色谱柱1-3个柱体积，然后在用含有 0. 1-0. 15mol/LNaCl的25mmol/L醋酸-醋酸钠，pH4. 5缓冲液洗脱除去主要杂质峰后用含有0. 5mol/L NaCl的25mmol/L醋酸-醋酸钠，pH4. 5缓冲液洗脱收集目标峰。上述上样、 冲洗与洗脱过程中的线性流速应控制在50-200cm/h之间。用SDS-PAGE电泳加考马斯亮蓝染色法和分子排阻HPLC法分别检测上述CM Sepharose FF色谱柱分离纯化得到的复合干扰素110位点半胱氨酸突变体的纯度，结果均在97%以上。用MALDI-T0F质谱法检测其分子量为19415. 34(还原状态)，与理论值偏差为-0.41(还原状态下理论值为19415.75)。用《中华人民共和国药典2010版(三部)》规定的“干扰素活性测定法”和“蛋白质含量测定法”确定其比活性为6. 8 X 108IU/mg,对照未突变复合干扰素的活性为5. 2X 108IU/mg。实施例4 复合干扰素109、110位点半胱氨酸突变体的25°C稳定性试验结果表1复合干扰素109位点半胱氨酸突变体25°C稳定性试验结果
权利要求
1.复合干扰素突变体，其特征是将复合干扰素氨基酸序列中从N端计的第109位或第 110位的氨基酸突变为半胱氨酸，分别具有SEQ ID No. 1_2所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的复合干扰素突变体，其特征是将复合干扰素氨基酸序列中从 N端计的第109位的氨基酸突变为半胱氨酸，具有SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的复合干扰素突变体，其特征是将复合干扰素氨基酸序列中从 N端计的第110位的氨基酸突变为半胱氨酸，具有SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列。
4.根据权利要求1所述的复合干扰素突变体的聚乙二醇衍生物，其特征是所述的聚乙二醇衍生物由所述的复合干扰素突变体与聚乙二醇修饰剂连接得到，所述的聚乙二醇修饰剂的分子量在5KDa-40KDa之间。
5.根据权利要求4所述聚乙二醇衍生物，其特征是所述的聚乙二醇修饰剂是巯基聚乙二醇修饰剂，选自马来酰亚胺PEG修饰剂、乙烯砜基PEG修饰剂、碘乙酰胺PEG修饰剂或邻吡啶基二硫化物PEG修饰剂中的一种。
6.根据权利要求4所述的聚乙二醇衍生物，其特征是所述的聚乙二醇修饰剂的分子量在 10KDa-20KDa 之间。
7.根据权利要求4-6之一所述的聚乙二醇衍生物的制备方法，包括如下步骤1)制备浓缩的所述的复合干扰素突变体溶液，使其浓度达到2.0-20mg/ml，并使所述的复合干扰素突变体所处的缓冲溶液体系转换为适宜进行聚乙二醇修饰反应的缓冲溶液体系；2)将上述得到的浓缩的复合干扰素突变体溶液与所述的聚乙二醇修饰剂接触进行修饰反应；3)对修饰反应后得到的混合物进行色谱分离纯化，以除去其中未参与修饰反应的聚乙二醇修饰剂和未参与修饰反应的所述的复合干扰素突变体，并除去连接有多个聚乙二醇分子的复合干扰素聚乙二醇衍生物。
8.根据权利要求4-6之一所述的聚乙二醇衍生物的药物组合物，其特征是含有治疗有效量且安全量的所述的聚乙二醇衍生物和适宜量的可药用载体。
9.根据权利要求1-6之一所述的复合干扰素突变体或其聚乙二醇衍生物在制备治疗病毒性疾病的药物中的用途。
全文摘要
本发明属于生物医药领域，涉及复合干扰素半胱氨酸突变体、其聚乙二醇衍生物，后者的制备方法、药物组合物和两者在制备治疗病毒性疾病的药物中的用途。所述的复合干扰素半胱氨酸突变体是将复合干扰素氨基酸序列中从N端计的第109位或第110位的氨基酸突变为半胱氨酸；所述的复合干扰素半胱氨酸突变体的聚乙二醇衍生物是由所述的复合干扰素半胱氨酸突变体与聚乙二醇修饰剂连接得到，所述的聚乙二醇修饰剂的分子量在5KDa-40KDa之间。本发明的复合干扰素半胱氨酸突变体及其聚乙二醇衍生物有更高的生物学活性，更好的药理作用与稳定性，并具有更可靠的安全性。
文档编号A61K47/48GK102532299SQ20121004337
公开日2012年7月4日 申请日期2012年2月23日 优先权日2012年2月23日
发明者刘金毅, 周敏毅, 程永庆 申请人:北京三元基因工程有限公司