专利名称：干扰素α突变体及其聚乙二醇衍生物的制作方法
技术领域：
本发明一般的涉及干扰素α突变体、其聚乙二醇衍生物，后者的制备方法、药物组合物和两者在制备治疗病毒性疾病的药物中的用途，特别的涉及复合干扰素半胱氨酸突变体、其聚乙二醇衍生物，后者的制备方法、药物组合物和两者在制备治疗病毒性疾病的药物中的用途。
背景技术：
干扰素(interferon，IFN)是一种最初由动物机体产生的具有广谱抗病毒作用的细胞因子类药物，根据其产生部位与作用机理不同可以分为α、β、Y、λ等大的类型，而每种大的类型又可分为若干小的亚型，同一大的类型中不同的亚型间在一级结构上差异很小，在二级以上高级结构上非常接近。在几种大的类型中，α型是应用最广的一种，目前临床应用的此型干扰素主要包括干扰素a 2a、干扰素a 2b、干扰素a lb、复合干扰素等。其中复合干扰素(consensus interferon或integrated interferon)是在对已知的α型干扰素进行序列比对后，把出现频率最高的氨基酸分配到各自相应的位置，并对个别位置进行修改后得到的非天然氨基酸序列的人工设计α型干扰素，包括多种氨基酸序列的分子，但彼此间同源性高，它们的生物学活性为天然α型干扰素的10倍以上。虽然各种α型干扰素在当前治疗病毒性感染疾病的过程中发挥着越来越广泛的疗效，但是其自身稳定性差、半衰期短的特点也限制了其进一步的临床推广应用，给病人用药带来了一些麻烦。鉴于此原因，国内外开展了很多长效干扰素方面的基础研究与产品开发，包括对干扰素分子自身进行改造、研发包括干扰素分子氨基酸序列的融合蛋白、对干扰素分子进行化学修饰、选择适宜的药物输送体系优化干扰素分子的体内输送与药效发挥过程等，其中聚乙二醇修饰干扰素(属于化学修饰的干扰素)的上市是在这一领域取得的最大成功。聚乙二醇(polyethelene glycol, PEG)是一种线性高分子化合物，由于其良好的生物相容性和既亲水又亲酯的双亲特性，得以从众多的化学修饰剂中脱颖而出成为目前研究与应用最广的蛋白多肽类药物的修饰剂。经过多年的研究开发，目前已有两个PEG修饰的干扰素α产品成功上市，分别是美国先灵葆雅(Schering-Plough)公司(现已被默沙东公司收购)的PEG修饰的干扰素a2b(商品名为“佩乐能”)和瑞士罗氏(Roche)公司的PEG修饰的干扰素a 2a(商品名为“派罗欣”)，分别于2001年和2002年在美国上市，在 2003年同时进入中国内地销售。关于先灵葆雅公司的PEG修饰的干扰素a 2b，在中国专利申请CN00808452. I中对其配方组成有所描述；而罗氏公司的PEG修饰的干扰素a 2a则在中国专利CN97113049. 3中有详细描述。除此之外，还有更多的PEG修饰的干扰素α产品正在研究开发中，其中最接近上市阶段的是Intermune公司开发的PEG修饰的复合干扰素。纵观PEG修饰干扰素α技术的发展，主要是伴随着PEG修饰技术的发展。早期的研究和开发主要围绕非特异性位点PEG修饰技术，所选用的PEG修饰剂纯度低、分子量小 (一般在IOKDa以下)且分布范围宽、修饰位点种类和数量多且形成的修饰衍生物不稳定，造成修饰产物组成不均一、纯度相对较低(85%左右)、质量控制不易实现、长效作用不明显且仍有一定的毒副作用。上述先灵葆雅公司的PEG修饰的干扰素a 2b产品就属于此类型。伴随着PEG修饰剂的发展出现了特异性位点PEG修饰技术，由于所选用的PEG修饰剂的纯度得到了很大提高，分子量可达20KDa以上且分布范围大幅缩窄，且修饰机理的改善使修饰位点种类和数量减少，形成的修饰衍生物稳定性提高，从而使上述非特异性位点PEG 修饰技术的缺点得到了很大程度的改善。特异性位点PEG修饰技术又可分为三种类型，一种是用具有分支结构的PEG修饰剂修饰目标蛋白分子，借助分支结构PEG修饰剂较强的空间位阻效应达到减少修饰位点数量的目的。上述罗氏公司的PEG修饰的干扰素a2a产品就属于此类型。但是由于这种所谓的“特异性位点”修饰技术从修饰机理上既不能做到只修饰单一种类的氨基酸， 也不能做到只修饰单一位点的氨基酸，所以修饰位点的种类与数目依然众多，如中国专利 CN200380103341. I公开了分支结构PEG修饰的干扰素a 2a (包括罗氏公司的PEG修饰干扰素a2a产品“派罗欣”)具有12个修饰位点的异构体。第二种是修饰蛋白质分子N末端氨基酸的自由α-氨基，原理是蛋白质N末端氨基酸的自由α-氨基与蛋白质其它位点中赖氨酸的自由ε-氨基相比具有更低的pKa值， 可以在更低的PH下与氨基修饰剂发生修饰反应。但是由于这种pH选择反应的特异性并不是太高，即使在较低的PH下仍可发生赖氨酸的自由ε -氨基上的修饰反应，且修饰过程可能遮蔽蛋白质分子的活性位点，造成修饰产物活性大大降低，因此这种修饰技术在实际应用中也受到限制。第三种是用巯基修饰剂修饰蛋白质分子半胱氨酸上的巯基，由于蛋白质分子中的半胱氨酸数量很少，且多数半胱氨酸上的巯基用于形成分子内或分子间二硫键，只有极少的游离巯基可供修饰，所以这种修饰反应的特异性很高。如中国专利申请CN200510076676. X公开了一种巯基PEG修饰剂修饰的干扰素a lb，利用了干扰素a Ib分子中只有一个自由巯基的特点用巯基PEG修饰剂对其进行修饰。但是此种技术实际拓展应用的最大问题是天然蛋白质分子中基本上没有游离的半胱氨酸残基，即使有也会因非常明显的影响蛋白质分子的稳定性和纯化过程(容易形成分子内或分子间二硫键)而使用于修饰的蛋白质纯品不易得到，使修饰过程无法实现(因为一旦形成分子内或分子间二硫键就没有可供修饰的游离半胱氨酸)；且选择天然位点的半胱氨酸进行修饰同样可能遮蔽蛋白质分子的活性位点，造成修饰产物活性大大降低。上述PEG修饰的干扰素alb就因干扰素alb自身较低的生物活性和修饰后活性残留率也较低，从而使最终的PEG修饰产物活性更低，实际应用效果有待论证。另外干扰素α种类亚型众多，序列中有许多位点可供改变以产生活性更高的突变干扰素α产物，如美国专利US4695623、US4897471、US5372808就公开了一种活性为天然序列干扰素a 10倍以上的复合干扰素分子。所以也可利用干扰素α的这一特点选择活性高、稳定性好与毒性低的突变干扰素α进行PEG修饰，以提高或改善修饰产物的药效、药代与安全性，前述Intermune公司的PEG修饰的复合干扰素就属于此类型,又如中国专利申请CN02159951. 3也公开了一种分支结构PEG修饰剂修饰的复合干扰素。但是单一利用此种技术依然不能解决修饰产物组成不均一、纯度差、质量控制不易实现、长效作用不明显且仍有一定毒副作用的问题。
发明内容
本发明的首要目的是提供一种复合干扰素的半胱氨酸突变体，以解决现有的干扰素α中没有游离的半胱氨酸残基可供特异性位点巯基PEG修饰剂修饰或所具有或突变的游离半胱氨酸残基位点不理想，造成蛋白质分子不稳定、活性低、分离纯化困难而不利于特异性位点PEG修饰剂修饰的问题。为实现此目的，在基础的实施方案中，本发明的复合干扰素的半胱氨酸突变体将复合干扰素氨基酸序列中从N端计的第80-82位之一的氨基酸突变为半胱氨酸，分别具有 SEQ ID No. 1-3所示的氨基酸序列。本发明选择将复合干扰素氨基酸序列中从N端计的第80-82位之一的氨基酸突变为半胱氨酸基于突变前后分子计算机空间结构预测结果、已知的干扰素α与受体结合原理及已知的干扰素a 2a与干扰素α 2b的空间结构。为了获得复合干扰素半胱氨酸突变体，需要先后进行表达复合干扰素半胱氨酸突变体分子的基因工程菌或基因工程细胞的构建、基因工程菌或基因工程细胞的发酵和发酵产物的纯化，优选进行表达复合干扰素半胱氨酸突变体分子的大肠杆菌工程菌的构建、发酵和发酵产物的纯化。在基因工程菌或基因工程细胞的构建过程中，首先需要获得并扩增表达复合干扰素半胱氨酸突变体的基因，采用的方法优选本领域技术人员公知的PCR法，并更加优选本领域人员公知的重叠延伸PCR法。在大量获得表达复合干扰素半胱氨酸突变体的基因后选择适宜的载体，用本领域技术人员公知的构建重组载体的方法将表达复合干扰素半胱氨酸突变体的基因转入所述载体从而构建重组载体。所述载体和重组载体优选质粒载体，该质粒载体应具有一组或多组双酶的各自单一的酶切位点，并适宜被转入对应的宿主菌或宿主细胞。然后首先制备感受态的宿主菌或宿主细胞，再利用电穿孔法、PEG法等本领域技术人员公知的方法将重组载体转入宿主菌或宿主细胞构建表达复合干扰素半胱氨酸突变体的基因工程菌或基因工程细胞。所述的宿主菌或宿主细胞优选大肠杆菌、毕赤酵母和CHO 细胞，并更优选大肠杆菌。工程菌或工程细胞的发酵应选择适宜其生长的培养基组成、pH、温度、通气量、培养时间与补料操作等条件。对于大肠杆菌工程菌的发酵，优选LB培养基，培养过程中的温度控制在30-37°C之间，pH控制在6. 0-8. O之间(必要时选择pH调节剂控制pH，所述的pH 调节剂包括但不限于NaOH、氨水及各种各种有机氮源，优选氨水)，通气量应满足菌体或细胞的生长需要及产物表达合成的需要，培养时间与补料操作的方式相关，在采取适宜的补料操作条件的情况下培养时间为6-48小时之间。复合干扰素半胱氨酸突变体蛋白如果表达在工程菌或工程细胞内，需要对发酵培养收获的菌体或细胞进行破碎处理以释放出其中的复合干扰素半胱氨酸突变体蛋白。而对于大肠杆菌等原核的工程菌，更需要破碎处理以释放出以包涵体形式表达的复合干扰素半胱氨酸突变体蛋白。常用的破碎方法包括但不局限于超声波破碎、球磨机破碎、溶菌酶处理
等
对于以包涵体形式表达的复合干扰素半胱氨酸突变体蛋白，需要对破碎处理得到的粗包涵体进行洗涤操作以尽可能除去其中含有的少量菌体蛋白、膜蛋白等杂蛋白。洗涤过程中使用的缓冲液包括但不局限于Tris-HCl、PB，洗涤过程的pH值应控制在7. 0-9. O之间。为了溶解较难溶解的疏水蛋白质杂质，可在洗涤缓冲液中加入一定量的盐，常用的为 NaCl，浓度范围在O. 05-0. 5mol/L之间；为了溶解疏水性更强的膜蛋白，可在洗涤缓冲液中加入一定量的表面活性剂，常用的此类表面活性剂包括但不限于吐温-80、十二烷基磺酸钠 (SDS)、TritonX-IOO，浓度在 O. 01-5%之间。由于在破碎过程中菌体或细胞会释放出一些蛋白水解酶，从而有可能降解复合干扰素半胱氨酸突变体，因此需要在破碎过程中及破碎后的洗涤过程中加入一些物质来抑制这些蛋白水解酶的活性，最直接的方法是加入蛋白酶抑制剂，如胰蛋白酶抑制剂，间接的方法也可加入金属离子螯合剂，如EDTA，因为金属离子螯合剂可以螯合这些蛋白水解酶发挥水解作用所必须依靠的金属离子。洗涤得到的包涵体变性溶解可以使用7-10mol/L的尿素或5_8mol/L的盐酸胍，必要时还需要加入巯基试剂以提高变性剂的溶解效力，所述的巯基试剂包括但不局限于巯基乙醇、二硫苏糖醇。溶解所采用的包涵体/变性剂的质量/体积比(g/ml)可以在I : 3到 I 50之间，优选的在I : 5到I : 30之间，最佳的在I : 7到I : 20之间。变性溶解时间应该在2小时以上。包涵体复性可以采用稀释复性法、透析复性法或柱上复性法。稀释复性法是通过一步或多步稀释用复性液将变性剂的浓度稀释到O. 5mol/L以下，以使蛋白质分子在摆脱变性剂影响的情况下逐渐复性；透析复性法是用10倍以上体积的复性液对变性液进行透析以使变性剂的浓度降低到O. 5mol/L以下，同样起到复性的作用；柱上复性法是将变性液直接上离子交换、疏水、分子排阻(凝胶)色谱柱，然后用含不断降低变性剂浓度的洗脱溶液进行梯度洗脱以同时实现目标蛋白的分离纯化与复性。复性液的基本组成是pH在5. 0-10. O之间的缓冲溶液，以保证复性所需的基本碱性环境，可以满足这种要求的缓冲溶液包括但不局限于Tris-HCl、硼酸钠缓冲液。为了防止复性过程中复性速度过快形成二硫键错配，需要在复性液中加入一些氧化型和还原型巯基试剂对组成的氧化还原平衡体系物质，如氧化型谷胱甘肽和还原型谷胱甘肽组成的氧化还原平衡体系。同时为了防止复性速度过快造成蛋白质折叠不完全、二硫键错配，可以在上述基本组成的复性液中添加一些其它物质，如精氨酸、EDTA、金属离子及各种分子伴侣物质等。这些物质的选择及加量在现有技术中有很多报道，这里不再赘述。上述稀释复性法和透析复性法得到的复性液，以及通过破碎直接得到的含有可溶性形式表达的复合干扰素半胱氨酸突变体的离心上清，以及以可溶性形式表达的复合干扰素半胱氨酸突变体的发酵培养液离心上清，都需进行进一步的色谱分离纯化。利用复合干扰素半胱氨酸突变体分子与杂质分子在亲和性质、电荷性质、疏水性质、分子量大小上的差异可以先后选择亲和色谱、离子交换色谱、疏水色谱、凝胶分离色谱中的一种或几种的组合进行纯化。为了更好的达到分离作用，在色谱分离纯化前可对待分离液进行浓缩处理，可以选择的方法包括但不局限于有机溶剂沉淀后反溶、盐析后反溶、聚乙二醇浓缩、超滤及色谱处理等。色谱分离纯化获得的复合干扰素半胱氨酸突变体分子可用本领域技术人员公知的SDS-PAGE电泳加考马斯亮蓝染色法或高效液相色谱法确定纯度；用质谱法确定分子量；用《中华人民共和国药典2010版(三部)》附录部分规定的“干扰素活性测定法”和“蛋白质含量测定法”，以测定得到的干扰素活性除以蛋白质浓度确定复合干扰素半胱氨酸突变体的比活性。其中高效液相色谱纯度检测法可以采用反相高效液相色谱法或分子排阻高效液相色谱法，但优选分子排阻高效液相色谱法，因为此种方法更为方便、准确、快捷。采用分子排阻高效液相色谱法时要求色谱柱的理论板数大于10000，上样量在5-100 μ I之间，优选 10-50 μ I之间，色谱分离时间为主峰出峰时间的3倍。稳定性考察是将色谱分离纯化得到的复合干扰素半胱氨酸突变体溶液在20_45°C 的环境下长期存放3-6个月，在此过程中定期取样观察外观的变化，并检测纯度、活性等主要质量控制指标的变化。色谱分离纯化获得的复合干扰素半胱氨酸突变体分子还需进行动物药代试验评价与动物急性毒性试验评价。在一种优选的实施方案中，本发明的复合干扰素半胱氨酸突变体将复合干扰素氨基酸序列中从N端计的第80位的氨基酸突变为半胱氨酸，其具有SEQ ID No. I所示的氨基酸序列。在一种优选的实施方案中，本发明的复合干扰素半胱氨酸突变体将复合干扰素氨基酸序列中从N端计的第81位的氨基酸突变为半胱氨酸，其具有SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列。在一种优选的实施方案中，本发明的复合干扰素半胱氨酸突变体将复合干扰素氨基酸序列中从N端计的第82位的氨基酸突变为半胱氨酸，其具有SEQ ID No. 3所示的氨基酸序列。本发明的第二个目的是提供如上所述的复合干扰素半胱氨酸突变体的聚乙二醇修饰衍生物，以解决现有干扰素α聚乙二醇衍生物组成不均一、纯度活性低、质量控制不易实现或长效作用不明显且仍有一定毒副作用等问题。为实现此目的，在基础的实施方案中，本发明的聚乙二醇衍生物由所述的复合干扰素半胱氨酸突变体与聚乙二醇修饰剂连接得到，所述的聚乙二醇修饰剂的分子量在 5KDa-40KDa 顿之间。在一种优选的实施方案中，所述的聚乙二醇修饰剂是巯基聚乙二醇修饰剂，选自马来酰亚胺PEG修饰剂、乙烯砜基PEG修饰剂、碘乙酰胺PEG修饰剂或邻吡啶基二硫化物 PEG修饰剂中的一种。为获得所述的聚乙二醇衍生物进行的PEG修饰反应主要受修饰剂的种类、温度、 蛋白质浓度、pH、蛋白质/修饰剂质量/摩尔比、搅拌速度、添加剂及修饰反应时间等因素的影响。用于特异性位点巯基修饰的PEG修饰剂根据PEG活化基团与修饰反应机理的不同主要有马来酰亚胺PEG修饰剂(mPEG-maleimide，mPEG-MAL)、乙烯砜基PEG修饰剂 (mPEG-vinylsulfone, mPEG-VS)、碘乙酸胺 PEG 修饰剂(mPEG-iodoacetamide, mPEG-IA)与邻批唳基二硫化物PEG修饰剂(mPEG-orthopyridyl disulfide, mPEG-OPSS),结构分别如下(作为示例性结构主要给出活化基团的结构，但活化基团不局限于与一个mPEG连接)。马来酰亚胺PEG修饰剂
权利要求
1.复合干扰素突变体，其特征是将复合干扰素氨基酸序列中从N端计的第80-82位之一的氨基酸突变为半胱氨酸，分别具有SEQ ID No. 1-3所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求I所述的复合干扰素突变体，其特征是将复合干扰素氨基酸序列中从 N端计的第80位的氨基酸突变为半胱氨酸，具有SEQ ID No. I所示的氨基酸序列。
3.根据权利要求I所述的复合干扰素突变体，其特征是将复合干扰素氨基酸序列中从 N端计的第81位的氨基酸突变为半胱氨酸，具有SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列。
4.根据权利要求I所述的复合干扰素突变体，其特征是将复合干扰素氨基酸序列中从 N端计的第82位的氨基酸突变为半胱氨酸，具有SEQ ID No. 3所示的氨基酸序列。
5.根据权利要求I所述的复合干扰素突变体的聚乙二醇衍生物，其特征是所述的聚乙二醇衍生物由所述的复合干扰素突变体与聚乙二醇修饰剂连接得到，所述的聚乙二醇修饰剂的分子量在5KDa-40KDa之间。
6.根据权利要求5所述聚乙二醇衍生物，其特征是所述的聚乙二醇修饰剂是巯基聚乙二醇修饰剂，选自马来酰亚胺PEG修饰剂、乙烯砜基PEG修饰剂、碘乙酰胺PEG修饰剂或邻吡啶基二硫化物PEG修饰剂中的一种。
7.根据权利要求5所述的聚乙二醇衍生物，其特征是所述的聚乙二醇修饰剂的分子量在 10KDa-20KDa 之间。
8.根据权利要求5-7之一所述的聚乙二醇衍生物的制备方法，包括如下步骤1)制备浓缩的所述的复合干扰素突变体溶液，使其浓度达到2.0-20mg/ml，并使所述的复合干扰素突变体所处的缓冲溶液体系转换为适宜进行聚乙二醇修饰反应的缓冲溶液体系；2)将上述得到的浓缩的复合干扰素突变体溶液与所述的聚乙二醇修饰剂接触进行修饰反应；3)对修饰反应后得到的混合物进行色谱分离纯化，以除去其中未参与修饰反应的聚乙二醇修饰剂和未参与修饰反应的所述的复合干扰素突变体，并除去连接有多个聚乙二醇分子的复合干扰素聚乙二醇衍生物。
9.根据权利要求5-7之一所述的聚乙二醇衍生物的药物组合物，其特征是含有治疗有效量且安全量的所述的聚乙二醇衍生物和适宜量的可药用载体。
10.根据权利要求1-7之一所述的复合干扰素突变体或其聚乙二醇衍生物在制备治疗病毒性疾病的药物中的用途。
全文摘要
本发明属于生物医药领域，涉及复合干扰素半胱氨酸突变体、其聚乙二醇衍生物，后者的制备方法、药物组合物和两者在制备治疗病毒性疾病的药物中的用途。所述的复合干扰素半胱氨酸突变体是将复合干扰素氨基酸序列中从N端计的第80-82位之一的氨基酸突变为半胱氨酸；所述的复合干扰素半胱氨酸突变体的聚乙二醇衍生物是由所述的复合干扰素半胱氨酸突变体与聚乙二醇修饰剂连接得到，所述的聚乙二醇修饰剂的分子量在5KDa-40KDa之间。本发明的复合干扰素半胱氨酸突变体及其聚乙二醇衍生物有更高的生物学活性，更好的药理作用与稳定性，并具有更可靠的安全性。
文档编号A61K47/48GK102584980SQ20121004338
公开日2012年7月18日 申请日期2012年2月23日 优先权日2012年2月23日
发明者刘金毅, 周敏毅, 程永庆 申请人:北京三元基因工程有限公司