专利名称：一种预防和控制人乳头瘤病毒感染的生物制剂的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种医药技术领域的新型抗病毒生物制剂，具体是涉及一种预防和控制人乳头瘤病毒感染的生物制剂的制备方法。
背景技术：
人乳头瘤病毒(HPV)属于乳头瘤病毒科(papillomaviridae),是一类嗜上皮性无囊膜双链DNA病毒。目前为止，在人体的皮肤及粘膜组织中分离出的HPV可根据DNA序列的不同被划分为100多个型别。又可根据其致癌性可分为“低危”型和“高危”型。前者低危型流行度高的代表类型为HPV6、HPVll等，主要引起良性的生殖器疣和低度的宫颈上皮 坏死；后者高危型流行度高的代表类型为HPV16、HPV18等，它们的感染是引发组织恶性肿瘤尤其是宫颈癌的主要原因。宫颈癌已成为危害女性健康的第二大恶性肿瘤，研究发现99. 7%以上的宫颈癌病理组织中能够检测到HPV的DNA，因而宫颈癌成为第一个由世界卫生组织(WHO)确认的完全由HPV感染所引起的癌症。目前，该疾病在全球每年新发病例约50万例。我国每年新发病例约13. 5万，约占世界宫颈癌新发病例总数的1/4，死亡人数约为5万人。特别是近十年来，其发病率飙升，增长幅度高达68. 8%，成为死亡率增长最快的疾病，居妇女癌症的首位。随着我国性开放程度的加深，宫颈癌的发病率及发病年龄可能将有明显上升及提前的趋势。因此，目前我国急需能够有效预防和控制HPV病毒感染的药物及生物制剂。人乳头瘤病毒以人作为唯一宿主，感染人体皮肤组织和黏膜组织的上皮细胞，尤其集中在口腔、手脚和男女生殖器等部位。病毒与细胞的直接接触是HPV感染宿主必要的先决条件，当皮肤或黏膜表层的物理组织保护受损，导致组织细胞暴露于游离的成熟病毒，病毒就有机会通过这种上皮细胞的微创伤侵犯并进入细胞，这通常被认为是病毒生命周期的开始阶段，也是预防的最佳阶段。同样，当病毒成熟后也会从细胞中释放，从而感染新的细胞，在口腔、手脚及男女生殖器处造成更多的感染及病变，最后导致病情的扩大、恶化及最后免疫系统无法清除形成尖锐湿疣、宫颈糜烂、慢性宫颈炎甚至肿瘤。目前，在国际上能有效预防和控制HPV病毒感染的药物还相对缺乏，公认疗效显著的主要还是预防型的疫苗，临床证实HPV的疫苗几乎能100%地预防一些HPV病毒株的感染，但是它并不能预防所有类型病毒株的感染，并且价格高昂。而在治疗上由于没有特效药因而采用的免疫调节药物由于普遍存在无法有效地预防HPV感染、疗效不明确、价格昂贵等方面的缺陷而大大限制了其在临床上的使用，特别是在低收入的发展中国家。因此，现在国际国内都倾注了极大的热情在研发新型的对多种HPV毒株都具有预防及控制效应的药物及生物制剂上，但是一直没有突破性的进展。本专利发明人之一的姜世勃教授是国际著名病毒学家，长期从事抗病毒药物的研究，其在国际上发现了第一个抗艾滋病病毒的C-多肽-SJ-2176，用于开发抗HIV药物-恩夫韦肽(Enfuvirtide，T-20)。Enfuvirtide在2003年被美国FDA批准上市成为全世界第一个多肽类HIV进入/融合抑制剂，该药物的发现被视为艾滋病药物研究领域的一个里程碑，姜世勃教授也因此开辟了多肽蛋白类病毒进入/融合抑制剂的新领域。病毒进入/融合抑制剂就是作用在病毒入侵靶细胞的第一阶段，阻断了病毒对细胞的感染，从而达到预防和控制病毒的效果，Enfuvirtide在美国临床上使用的成功证明了该策略对治疗病毒所引发的疾病是非常有效的。本发明专利建立在姜世勃教授多年研究的基础上，是将预防及控制艾滋病病毒的成功经验运用到了对人乳头瘤病毒HPV的预防和控制上，经过实验检测该蛋白药物对HPV的感染具有显著的抑制活性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种预防和控制人乳头瘤病毒感染的生物制剂的制备方
法。 本发明的发明思路是发明人利用多肽蛋白类病毒进入/融合抑制剂，在病毒入侵靶细胞的第一阶段，阻断了病毒对细胞的感染，从而达到预防和控制病毒的效果。使用一种活性酸酐来修饰一种分离和纯化的蛋白质表面带正电荷的氨基酸，从而使其具有阻断人乳头瘤病毒HPV进入和感染靶细胞的功能。本发明是采用如下技术方案实现的
一种预防和控制人乳头瘤病毒感染的生物制剂的制备方法，包括以下步骤
将3_轻基-邻苯二甲酸酐(3-hydroxyphthalicanhydride,缩写HP)溶于二甲基亚讽DMSO中，得到饱和的HP溶液；将￠-乳球蛋白@-1^溶于？118.5，0. IM磷酸钠溶液中，得到蛋白终浓度为20mg/mL的蛋白溶液；再将上述HP溶液分为五等份，每12min加入蛋白溶液中，震荡混匀，每次加完后用IM NaOH调节pH为8. 5，酸酐在反应体系中的终浓度为60mM，在温度为25°C的条件下，放置I小时，pH7. 4磷酸缓冲溶液PBS在4度透析过夜，再用0. 45uM微孔滤膜过滤除菌，4°C保存，即可制得成品。所述的0 -乳球蛋白从牛奶中分离及纯化得到。所述的e -乳球蛋白用鸡血清蛋白0VA、兔血清蛋白RSA、猪血清白蛋白PSA、冷水鱼皮明胶G-FS、猪皮明胶G-PS代替。所述的3-羟基-邻苯二甲酸酐用3-羟基-邻苯二甲酸酐(3-hydroxyphthalicanhydride)的衍生物、玻拍酸酐(Succinic anhydride)、马来酸酐(maleic anhydride)酸酐代替。所述的剂型可以是凝胶制剂、膏霜剂、喷雾剂、搽洗剂、盥洗剂。本发明药物具有阻断HPV病毒入侵细胞、阻止病毒扩大感染、安全无毒副作用、稳定性高、成本低廉等显著优势，可用于开发成为以其为主要活性成分的预防和控制HPV感染的各种剂型，制备方法简单，易于推广。
图I 为 HPV6 (6S)、HPV16 (16S)及 HPV18(18S)假病毒质粒鉴定结果；
图2为对HPV6抑制活性的检测；
图3为对HPV16抑制活性的检测；
图4为对HPV18抑制活性的检测。
具体实施例方式实验例I
一种预防和控制人乳头瘤病毒感染的生物制剂的制备方法，包括以下步骤
(1)从牛奶制品中分离及纯化￠-乳球蛋白为主的稳定性蛋白质；
(2)利用活性酸酐对分离纯化的蛋白质进行酸酐化，透析后再次纯化活性蛋白；
首先将3-羟基-邻苯二甲酸酐(HP)溶于二甲基亚飒DMSO中，浓度达到饱和，然后将
^ -乳球蛋白(P -LG)溶于pH8. 5,0. IM磷酸钠溶液中，使蛋白终浓度为20mg/mL，再将上述HP加入蛋白溶液中，震荡混匀，在温度为25°C的条件下，放置I小时，pH7.4 PBS透析，再用 0. 45uM微孔滤膜过滤除菌，4°C保存，然后按照现有方法制成凝胶剂。实验例2
一种预防和控制人乳头瘤病毒感染的生物制剂的制备方法，包括以下步骤
首先将HP溶于二甲基亚飒DMSO中，浓度达到饱和，然后将鸡血清蛋白OVA溶于pH8. 5，0. IM磷酸钠溶液中，使蛋白终浓度为20mg/mL，再将上述HP溶液分为五等份，每12min加入蛋白溶液中，震荡混匀，IM NaOH调节pH为8. 5，酸酐在反应体系中的终浓度为60mM。在温度为25°C的条件下，放置I小时，pH7. 4磷酸缓冲溶液PBS在4度透析过夜，再用0. 45uM微孔滤膜过滤除菌，4°C保存，然后按照现有方法制成膏霜剂。实验例3
一种预防和控制人乳头瘤病毒感染的生物制剂的制备方法，包括以下步骤
首先将HP溶于二甲基亚飒DMSO中，浓度达到饱和(I. 19M)，然后将兔血清蛋白RSA溶于pH8. 5,0. IM磷酸钠溶液中，使蛋白终浓度为20mg/mL，再将上述HP溶液分为五等份，每12min加入蛋白溶液中，震荡混匀，IM NaOH调节pH为8. 5，酸酐在反应体系中的终浓度为60mM。在温度为25°C的条件下，放置I小时，pH7. 4磷酸缓冲溶液PBS在4度透析过夜，再用0. 45uM微孔滤膜过滤除菌，4°C保存，然后按照现有方法制成喷雾剂。实验例4
一种预防和控制人乳头瘤病毒感染的生物制剂的制备方法，包括以下步骤
首先将HP溶于二甲基亚飒DMSO中，浓度达到饱和(I. 19M)，然后将猪血清白蛋白PSA、冷水鱼皮明胶G-FS、或者猪皮明胶G-PS溶于pH8. 5,0. IM磷酸钠溶液中，使蛋白终浓度为20mg/mL,再将上述HP溶液分为五等份，每12min加入蛋白溶液中，震荡混匀，IM NaOH调节pH为8. 5，酸酐在反应体系中的终浓度为60mM。在温度为25°C的条件下，放置I小时，pH7. 4磷酸缓冲溶液PBS在4度透析过夜，再用0. 45uM微孔滤膜过滤除菌，4°C保存，然后按照现有方法制成搽洗剂。实验例5
一种预防和控制人乳头瘤病毒感染的生物制剂的制备方法，包括以下步骤
首先将3-羟基-邻苯二甲酸酐的衍生物溶于二甲基亚飒DMSO中，浓度达到饱和(I. 19M)，然后将鸡血清蛋白OVA溶于pH8. 5,0. IM磷酸钠溶液中，使蛋白终浓度为20mg/mL，再将上述3-羟基-邻苯二甲酸酐的衍生物溶液分为五等份，每12min加入蛋白溶液中，震荡混匀，IM NaOH调节pH为8. 5，酸酐在反应体系中的终浓度为60mM。在温度为25°C的条件下，放置I小时，PH7. 4磷酸缓冲溶液PBS在4度透析过夜，再用0. 45uM微孔滤膜过滤除菌，4°C保存，然后按照现有方法制成灌洗剂。
实验例6
一种预防和控制人乳头瘤病毒感染的生物制剂的制备方法，包括以下步骤
首先将琥珀酸酐溶于ニ甲基亚飒DMSO中，浓度达到饱和(I. 19M)，然后将兔血清蛋白RSA溶于pH8. 5,0. IM磷酸钠溶液中，使蛋白终浓度为20mg/mL，再将上述琥珀酸酐溶液分为五等份，每12min加入蛋白溶液中，震荡混匀，IM NaOH调节pH为8. 5，酸酐在反应体系中的终浓度为60mM。在温度为25°C的条件下，放置I小吋，pH7. 4磷酸缓冲溶液PBS在4度透析过夜，再用O. 45uM微孔滤膜过滤除菌，4°C保存，然后按照现有方法制成凝胶剂。实验例7
一种预防和控制人乳头瘤病毒感染的生物制剂的制备方法，包括以下步骤 首先将马来酸酐溶于ニ甲基亚飒DMSO中，浓度达到饱和(I. 19M)，然后将猪血清白蛋白PSA、冷水鱼皮明胶G-FS、或者猪皮明胶G-PS溶于pH8. 5，0. IM磷酸钠溶液中，使蛋白终浓度为20mg/mL，再将上述HP溶液分为五等份，每12min加入蛋白溶液中，震荡混匀，IMNaOH调节pH为8. 5，酸酐在反应体系中的终浓度为60mM。在温度为25°C的条件下，放置I小吋，pH7. 4磷酸缓冲溶液PBS在4度透析过夜，再用O. 45uM微孔滤膜过滤除菌，4°C保存，然后按照现有方法制成膏霜剂。实验例8酸酐修饰蛋白浓度測定
合成的酸酐修饰蛋白浓度按照BCA蛋白浓度分析试剂盒的操作步骤測定，具体方法如
下
(1)稀释BSA 蛋白标准品，使终浓度为 0，25，125，250，500，750，1000，2000ug/mL,标准品的稀释与待测蛋白样品溶液相同；
(2)分别将25ul各浓度标准品和25ul待测样品加入96孔圆底细胞板中，复孔对照；
(3)制备反应工作液,将ReagentA与ReagentB按50:1比例混勻;
(4)每孔200ul反应工作液，轻柔震荡30s，混匀；
(5)37°C孵育30min，冷却至室温，680型酶标仪测定0D562nm吸光度；
(6)绘制蛋白质浓度标准曲线，根据标准曲线，计算待测样品浓度。实验例9 TNBS法及ρ-HPG法测定蛋白的酸酐修饰比率，及检测正电荷氨基一酸赖氨酸和精氨酸残基的被修饰率
采用2,4,6—三硝基苯磺酸(TNBS)检测修饰后蛋白末端的赖氨酸残基被相应酸酐修饰的比率。(I)系列稀释的待测酸配修饰蛋白样品与阴性对照未修饰的蛋白各25ul加入96孔圆底细胞培养板中，空白对照孔加入25ul/孔O. IM磷酸钠溶液；
(2)25ul/孔的O. IM四硼酸钠Na2B407:与各待测样品室温混匀5min;各孔加入IOul的，TNBS，室温混匀，5min;
(3)加入 IOOul/ 孔的终止液(O. IM NaH2PO4;和 I. 5mM Na2SO3)，终止反应，测 0D420nm值，根据其与阴性对照蛋白OD值差异，计算赖氨酸的修饰率。(4)赖氨酸修饰率 ％=[l-(0D450nm 样品 _0D450nm 空白)バ0D450nm 阴性 _0D450nm空白)]xlOO
采用p-HPG检测合成的修饰蛋白末端的精氨酸残基被相应酸酐修饰的比率。(I)系列稀释的待测酸配修饰蛋白样品与阴性对照未修饰的蛋白各90ul加入96孔圆底细胞培养板中，空白对照孔加入90uL/孔O. IM磷酸钠溶液，调节各孔溶液pH为9. O;
(2)IOuL/孔50M1 p-HPG, pH9. 0，与各样品室温避光反应90min;
(3)测0D340nm值，计算精氨酸的修饰率。(4)精氨酸修饰率％=[l-(0D450nm样品-0D450nm空白)バ0D450nm阴性_0D450nm空白)]X 100
实验例10 构建不同型HPV的假病毒感染模型(以HPV6、HPV16、HPV18为代表株)目前认为生产假病毒是模拟HPV感染最有效的方法。HPV结构蛋白基因在哺乳动物细胞中可表达衣壳蛋白LI、L2，这两种蛋白在体外具有自我组装成病毒样颗粒(Virus-likeparticle, VLP)并包裹病毒基因组或外源基因的能力，形成与天然病毒结构及免疫原性一致的假病毒(PsV)。Buck等人在国际顶级病毒学期刊〈C/ KirW》上报道他们利用该发现以 及PsV能非特异包装DNA的特性，将含优化的HPV LI、L2基因的质粒与报告基因表达质粒共转染哺乳动物细胞，使LI、L2结构蛋白在哺乳动物细胞中能够高效表达并自我组装成包裹报告质粒的病毒样颗粒，即携带报告基因的假病毒。利用该方法构建的假病毒滴度较高，最高可达到IO7 TU/ml (transdueingunitsperml),且试验操作简单结果稳定可靠，因此该HPV假病毒系统目前被广泛的用于抗HPV疫苗及药物的筛选与鉴定。发明人建立起了 HPV假病毒抑制模型，包括代表毒株HPV6、HPV16、HPV18。具体的方法如下
(1)利用分子生物学技术分别克隆HPV6、HPV16及HPV18的LI及L2衣壳蛋白DNA构建到真核表达载体中，形成可以稳定表达LI及L2的表达质粒HPV6^S) p6sheLLr,HPV16(16S) :pl6sheLL、HPV18(18S)pl8sheLL，用 BamHI 酶切鉴定，如图 I 中所示酶切鉴定结果正确；
(2)利用Qiagen大提质粒试剂盒纯化以上构建正确的重组质粒，检测获得纯度高的质粒准备转染293FT细胞。胰酶消化293FT细胞，计数，将5xl05个细胞/ ml接种于6孔板中，DMEM 培养基，10% FBS (Gibco), 37°C, 5% C02 培养过夜。(3)利用LipofectamineTM2000转染试剂分别将大提的质粒(p6sheLLr、pl6sheLL、pl8sheLL)与报告质粒pCLucf (含有Luciferase报告基因)共转染到293FT细胞，同时设单独转染报告质粒的阴性对照。(4)将6孔板重新置于细胞培养箱中，37°C，5% C02孵育6小时后为细胞换液。转染48小时后收集细胞。(5)转染48小时后的细胞，弃去培养基，用胰酶消化细胞，完全培养基终止，将细胞悬液移至50ml离心管中，离心210g, 5 min,弃上清,用Iml DPBS-Mg(9. 5mM MgC12溶于IxPBS中)将细胞重新悬起，将细胞悬液转移至I. 5ml离心管中，离心弃上清。向含细胞沉淀的离心管中加入与细胞沉淀等体积的细胞裂解液(O. 3% Brij58,9. 5mM MgCl2溶于IxPBS中)，混匀，放至培养箱中，37°C孵育24小吋。取出细胞裂解液，冰浴5 min，加入O. 17倍体积的5M的NaCl溶液，使盐浓度调整为850mmol/L，冰浴10-20 min,离心5000g，10 min。取上清，分装、-80度保存。(6)进行假病毒滴度的測定
1)铺100μ1293ΡΤ细胞于96孔培养板中，每孔细胞数为IxlO5个，37°C，5%C02培养6-8小时；
2)将HPV6、HPV16、HPV18假病毒分别进行梯度稀释，在已有细胞的96孔板中加入50μ1假病毒稀释液，再加入50μ1新鲜的培养基(带血清)；
3)将细胞培养板置于37°C，5%C0的培养箱中培养48-72小时；
4)用PromegaLuciferase报告基因检测试剂盒进行细胞裂解及检测，以此计算TCID50 (病毒感染一半组织细胞时的病毒稀释度。实验例11 :本发明制备的产品对HPV6、HPV16和HPV18抑制活性的检测
利用以上先进的HPV感染模型，检测JBOl对HPV6、HPV16和HPV18的抑制活性，具体方法为
Cl)铺100μ1293ΡΤ细胞于96孔培养板中，每孔细胞数为IxlO5个，37°C，5% C02培养6-8小时；
(2)将100TCID50的HPV6、HPV16、HPV18假病毒(50μ1)分别与不同稀释度的JBOl(50μ1)进行孵育，37 °C，30 min ；将孵育后的混合物加入到预铺的293FT细胞中，37 °C，5%C02培养，培养过夜；
(3)第二天，弃上清，补充150μ 新鲜的培养基，37°C，5% C02培养；
(4)48-72小时后用Promega Luciferase报告基因检测试剂盒进行细胞裂解及检测，利用Compusyn I. O和SigmaPlot软件进行计算抑制病毒的IC50。同样用以上的方法检测不同修饰度的JBOl对HPV6、HPV16和HPV18的抑制活性。从图2-4中我们可以发现酸酐修饰后的β -乳球蛋白(JBOl)对HPV6、HPV16及HPV18病毒具有显著的抑制活性，其IC50 (半数抑制浓度)分别约为5Pg/ml、lPg/ml和Wg/ml ο而其对照蛋白(未修饰的β-乳球蛋白，C protein)没有观察到明显地梯度性抑制，IC50均大于500 Pg/ml。从不同修饰度的JBOl对各种HPV病毒的抑制上看，如表I示，该活性蛋白的抑制活性与其上正电荷氨基酸被修饰的程度密切相关，随着正电荷氨基酸被修饰程度的加深，其抑制活性逐渐增高。我们原先的结果发现JBOl对不同种类的病毒，例如人免疫缺陷病毒(HIV)、猴免疫缺陷病毒(SIV)以及单纯疱疹病毒(HSV-1，HSV-2)等都有显著的抑制活性，因此我们推测该活性蛋白对HPV的作用机制不是特异性的，很可能与其酸酐化修饰后所带的电性相关。本酸酐方法所修饰后的蛋白也可能用于其他病毒的控制。表I JBOl的酸酐化修饰率与其抗HPV活性的关系
权利要求
1.一种预防和控制人乳头瘤病毒感染的生物制剂的制备方法，其特征是包括以下步骤将3-羟基-邻苯二甲酸酐HP溶于二甲基亚飒DMSO中，得到饱和的HP溶液；将β -乳球蛋白β-LG溶于pH8. 5,0. IM磷酸钠溶液中，得到蛋白终浓度为20mg/mL的蛋白溶液；再将上述HP溶液分为五等份，每12min加入蛋白溶液中，震荡混匀，IM NaOH调节pH为8. 5，酸酐在反应体系中的终浓度为60mM，在温度为25°C的条件下，放置I小时，pH7. 4 PBS透析，再用O. 45uM微孔滤膜过滤除菌，4°C保存，即可按照常规方法制成各种剂型的成品。
2.根据权利要求I所述的一种预防和控制人乳头瘤病毒感染的生物制剂的制备方法，其特征是所述的β-乳球蛋白从牛奶中分离及纯化得到。
3.根据权利要求I所述的一种预防和控制人乳头瘤病毒感染的生物制剂的制备方法，其特征是所述的β -乳球蛋白用鸡血清蛋白0VA、兔血清蛋白RSA、猪血清白蛋白PSA、冷水鱼皮明胶G-FS、猪皮明胶G-PS代替。
4.根据权利要求I或2所述的一种预防和控制人乳头瘤病毒感染的生物制剂的制备方法，其特征是所述的3-羟基-邻苯二甲酸酐用3-羟基-邻苯二甲酸酐的衍生物、琥珀酸酐、马来酸酐代替。
5.根据权利要求I或2所述的一种预防和控制人乳头瘤病毒感染的生物制剂的制备方法，其特征是所述的剂型为凝胶制剂、膏霜剂、喷雾剂、搽洗剂、盥洗剂。
全文摘要
本发明公开了一种预防和控制人乳头瘤病毒感染的生物制剂的制备方法。包括以下步骤将3-羟基-邻苯二甲酸酐HP溶于二甲基亚飒DMSO中，得到饱和的HP溶液；将β-乳球蛋白β-LG溶于pH8.5，0.1M磷酸钠溶液中，得到蛋白终浓度为20mg/mL的蛋白溶液；再将上述HP溶液分为五等份，每12min加入蛋白溶液中，震荡混匀，1MNaOH调节pH为8.5，酸酐在反应体系中的终浓度为60mM，在温度为25℃的条件下，放置l小时，pH7.4PBS透析，再用0.45uM微孔滤膜过滤除菌，4℃保存，即得成品。本发明药物具有阻断HPV病毒入侵细胞、阻止病毒扩大感染、安全、稳定、成本低等优点。
文档编号A61P31/20GK102631666SQ20121006669
公开日2012年8月15日 申请日期2012年3月14日 优先权日2012年3月14日
发明者姜世勃, 杨霞, 陆路 申请人:姜世勃, 杨霞, 陆路