专利名称：肺表面活性提取物与肺表面活性物质相关蛋白a的组合物、制备方法及其制药用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及肺表面活性提取物及肺表面活性物质相关蛋白A (surfactant associated protein A, SP-A)的组合物，内容包括三部分⑴肺表面活性提取物和SP-A的组合物，肺磷脂SP-A组合物；(2)组合物的制备方法；⑶组合物在治疗肺表面活性物质缺乏或功能障碍类疾病，如肺炎、胎粪吸入综合征、支气管肺发育不良、婴幼儿体外循环术、肺损伤等所致的急性呼吸窘迫综合征以及慢性阻塞性肺疾病方面的制药用途。本发明适合工业化生产。
背景技术：
肺表面活性物质(pulmonary surfactant，PS)是肺泡II型细胞分泌的磷脂蛋白复合物，有降低肺泡气液界面表面张力，防止肺不张和肺水肿，保持肺泡稳定，参与肺的防御功能等重要作用，组成包括90%左右的脂类和10%左右的蛋白，蛋白中与PS生理功能有关的主要有四种，亲水性的SP-A、SP-D和疏水性的SP-B、SP-C，除SP-D外，其他三种蛋白在 PS 的功能活性中均有重要意义(Kaushik Nag edited Lung Surfactants: function and disorder, Published by Taylor & Francis Group,2005)。现有技术制备的肺表面活性提取物是指牛、猪或其他哺乳动物的肺灌洗液或全肺勻浆提取液，经分离、提取、纯化得到的磷脂蛋白复合物，也称PS制剂，因工艺所限，组成以磷脂为主，仅含有少量疏水性蛋白SP- B和SP-C，是治疗早产儿呼吸窘迫综合征(neonatal respiratory distress syndrome，NRDS)的重要急救药，已在全球大多数国家和地区应用， 自上市以来早产儿死亡率下降一半以上。但是目前临床应用的PS制剂均不含具有免疫调控作用的 SP-A (Bernhard, Mottaghian, Gebert, et al. , Commercial versus native surfactants Surface Activity, Molecular Components, and the Effects of Calcium, Am J Respir Crit Care Med, 2000, Vol 162 :1524)，在 PS 功能障碍类疾病，如肺炎、胎粪吸入综合征、婴幼儿体外循环术、支气管肺发育不良、肺损伤等导致的急性呼吸窘迫综合征 (acute respiratory distress syndrome，ARDS)以及慢性阻塞性肺疾病等的疗效有限，因受到炎症蛋白或因子的抑制，作用持续时间短，仅能在短期内改善肺功能。SP-A在肺表面活性物质蛋白中含量最高，属糖结合蛋白家族，由248个氨基酸组成，等电点4. 6-5. 5，分子量约为26-38kDa，具有多种生理功能，如参与肺泡表面PS膜的形成和代谢，稳定细胞内外肺表面活性物质，参与局部防御，增强PS对各种抑制因子的抵抗， 调节局部免疫和炎症反应等，是近年来的研究热点。分析现有技术，肺表面活性提取物和SP-A的制备技术存在如下问题
(1)对于肺表面活性提取物的制备，无论其来源是全肺勻浆提取液，还是肺灌洗液，均需要处理大量的、含有多组分磷脂和表面活性物质蛋白的混悬液或乳浊液。传统方法主要是采用多级离心或差速离心，然后再使用有机溶剂提取、层析纯化或超临界提纯等。其中多级离心和差速离心耗时长，能耗大，生产成本高，磷脂组分收率低。
(2)对于SP-A的分离和制备，有从动物肺灌洗液中提取得到SP-A ；也有研究者通过基因重组技术将SP-A功能片段融合到工程菌种中，培养、纯化得到高纯度的SP-A。前者实用性不强，会影响动物肺来源的PS制剂的生产，无法实现产业化；后者仅处于实验室阶段，且不能得到完整表达的SP-A，距离产业化还有很长的路要探索。(3)对于肺表面活性提取物与SP-A的组合物，鉴于SP-A为亲水性蛋白，PS制剂中的磷脂和小分子蛋白均为疏水性，两者以怎样的方式、怎样的比例组合，才能得到活性高且稳定的制剂，是目前尚未解决的问题。为此，本发明将肺表面活性提取物与SP-A组合，得到活性更高、治疗范围更广的新组合物。同时选择与现有技术不同的路线和工艺，开发了与传统方法不同、能更有效地制备牛肺表面活性提取物的方法，并利用肺表面活性提取物生产过程中的废弃液，提取得到具有生物活性的高纯度SP-A。本方法不影响肺表面活性提取物的生产，解决了产业化问题。
发明内容
本发明提供了肺表面活性提取物与SP-A的新组合物，及该组合物的制备方法；同时提供了制备肺表面活性提取物的新方法，以及利用肺表面活性提取物制备过程中的废弃物制备SP-A的工艺。本发明所述的新组合物可用于治疗PS缺乏或PS功能障碍类疾病，改善肺表面活性提取物拮抗抑制的活性及疗效。1、肺表面活性提取物的制备
工艺流程为肺灌洗液或全肺勻浆提取液，经低速离心去除血细胞和组织碎片，取上清液经陶瓷滤管浓缩得到浓缩液，高速离心取沉淀，经有机溶剂提取、纯化得到肺表面活性提取物。具体步骤如下
⑴肺灌洗液或全肺勻浆提取液静置或(500-1000) Xg离心，取上清液。⑵上清液使用装有微孔陶瓷滤管的浓缩过滤系统浓缩，透过滤管的滤过液弃去， 收集得到浓缩液，其中
装有陶瓷微孔滤管的浓缩过滤系统(孔径lO-lOOOnm，优选10-350nm ；工作压力 <0. 5MPa，优选0. 1-0. 35Mpa)预先使用平衡液平衡，优选平衡30-60分钟(更优选35-40分钟)，然后加入⑴中的上清液，在0-40°C条件(优选4-35°C )下进行浓缩过滤，最后使用洗脱液洗出残留在系统中的活性成分，并将所得洗脱液循环通过浓缩过滤系统，优选循环20-40 分钟(更优选30分钟)，使系统中的物料充分洗脱下来。上述平衡液和洗脱液使用无机盐溶液，如氯化钠溶液(优选0. 1-0. 5 mol/L，更优选0. 1-0. 2 mol/L，最优选0. 15 mol/L)，氯化钙溶液(优选1. 5-50 mmol/L)，或二者的混合液。(3)将⑵所得浓缩液高速离心(彡10000 X g)，取离心后的沉淀备用。⑷将⑶所得沉淀用有机溶剂进行萃取，有机溶剂优选溶剂A和溶剂B的混合液， 其中溶剂A和溶剂B的体积比优选1 :1至1 :3，最优选1 :2 ；溶剂A选自正己烷、石油醚、甲醇、乙醇等，溶剂B选自二氯乙烷、氯仿、丙酮、乙酸乙酯等。分离出下层含有表面活性磷脂的萃取液备用，剩余废弃液用于制备SP-A。(5)将⑷所得萃取液过滤，真空干燥，制得肺表面活性提取物。
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(6)也可将⑶所得沉淀使用CO2超临界提取技术直接提纯。将1份沉淀与1-3份 (优选1-2份)硅藻土 (或玻璃珠等惰性载体)混勻，干燥，放入提取槽，用(X)2流体萃取获得分离液，萃取压力20-30Mpa (优选25_30Mpa)，温度优选20-50°C (更优选30-50°C，最优选 40°C)。为提高萃取效率，可加入少量极性溶剂(如乙醇、氯仿、丙酮、乙酸乙酯等)作为夹带剂或共溶剂，优选加入乙醇或氯仿。提取结束后用氯仿清洗分离槽，将所得氯仿溶液与分离液合并，过滤，干燥，得到肺表面活性提取物。(7)上述( 或(6)所得肺表面活性提取物，可任选下列方法中的一种，进一步纯化， 得到磷脂含量更高的肺表面活性提取物
方法一使用丙酮、乙醇或乙酸乙酯进一步洗涤、纯化，去除中性脂类，真空干燥，得到磷脂浓度更高的肺表面活性提取物。方法二 用溶剂(优选氯仿和二氯乙烷)溶解，再进行层析纯化，优选使用葡聚糖凝胶色谱柱进行层析纯化，更优选使用kphadex葡聚糖凝胶柱，洗脱液为二氯乙烷-异丙醇-0. 1 N盐酸(其体积比优选1 :1 0. 1);以二极管阵列检测器或蒸发光散射检测器或电喷雾检测器监测，收集馏分，过滤去除病原体，冷冻干燥或真空干燥，即得磷脂浓度更高的肺表面活性提取物。2、肺表面活性物质蛋白A (SP-A)的制备
本发明人在研究中发现，上述1⑷步骤的废弃液中含有亲水性SP-A，我们通过如下步骤在无菌条件下得到SP-A
(1)废弃液高速离心lOOOOXg)，收集得到沉淀。(2)沉淀用少量生理盐水(沉淀与生理盐水重量比为1 :2到1 :10，优选1 :5)混悬 5分钟，然后加入正丁醇(与生理盐水溶液体积比为20 1到60 :1，优选50 :1)，提取60分钟。(3)上述正丁醇提取液低温高速离心O lOOOOXg)，收集不溶性沉淀，真空干燥， 得到SP-A。⑷上述⑶所得的SP-A可通过下述方法进行纯化溶于150mmol/L氯化钠、 1. 5-50mmol/L氯化钙溶液(pH调至7. 4左右)中，为更好地去除杂质，可加入适量β-D-吡喃糖或Tris (三羟甲基氨基甲烷)缓冲液；上述溶液低温下搅拌30-60分钟；然后任选下列方法的一种进行处理
方法一依次用分子量IOkD的膜和分子量300kD的膜进行超滤，收集10kD-300kD之间的SP-A浓缩液。其中分子量IOkD的膜去除离子和小分子杂质，分子量300kD的膜去除大分子杂蛋白。方法二 通过预填充的maltosyl-agarose (麦芽糖-琼脂糖)柱进行亲和层析，以梯度EDTA溶液[含有叠氮钠的lOOmmol/L浓度的EDTA (乙二胺四乙酸)溶液，20mmol/L的 Tris-HCl,pH=7. 4]进行洗脱，收集SP-A溶液；SP-A溶液用分子量IOkD的膜进行超滤，得到 SP-A浓缩液。(5)步骤⑷得到的SP-A浓缩液依次经0. 45 μ m和0. 22 μ m的膜除菌过滤；滤过液冷冻干燥得到纯度更高的SP-A。3、肺表面活性提取物与SP-A组合物
肺表面活性提取物与SP-A按一定的重量比(优选98 2至90 10,最优选95 5至90 10)混合，溶于氯化钠与氯化钙的混合溶液(其中氯化钠优选0. 1-0. 5 mol/L，更优选 0. 1-0. 2 mol/L，最优选0. 15 mol/L ；氯化钙优选1. 5-50 mmol/L)，使用超声、分散等手段混合均勻，热压灭菌，制得肺磷脂SP-A混悬液，或经冷冻干燥制得肺磷脂SP-A冻干粉。为提高组合物的稳定性，可加入适量乳化剂、增溶剂或助悬剂。上述肺表面活性提取物和SP-A可为任意来源，不限于本申请制备方法所得到的肺表面活性提取物和SP-A。其中，肺表面活性提取物是哺乳动物(如牛、猪等)的肺灌洗液或全肺勻浆提取液经分离、提取、纯化制备的磷脂蛋白复合物，例如，可采用现有技术中的PS 制剂；SP-A是从哺乳动物肺提取或通过基因工程技术得到的SP-A或SP-A功能片段。4、SP-A鉴别与检测
(1)采用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测本品的分子量，本品出现两个条带(如附
图1所示)， SP-A以二聚体和三聚体形式存在，从标准曲线计算SP-A 二聚体分子量约为60kD。⑵氨基酸序列比对不同哺乳动物的SP- A序列有一定差异，但主要功能基团--类胶原结构序列大体一致(第观位至第100位)；牛与人的SP-A氨基酸序列最接近。 本发明制备的SP-A，其氨基酸序列与人SP-A氨基酸序列(见序列表)比对相似度在99%以上。⑶使用SP-A酶联免疫吸附试剂盒对本品进行检测，多孔板预先涂布SP-A特异性抗体，各孔中分别加入标准品或样品，再加入键合的辣根过氧化物酶，37°C培养，变色后加入TMB (3，3’，5，5’ -四甲基联苯胺)底物溶液，450nm比色测定。结果表明本品纯度大于 90%。5、肺表面活性提取物与SP-A组合物的活性
表面活性是肺表面活性提取物最重要的指标，直接关系到PS制剂的疗效，检测表面活性的仪器是可控闭泡式表面张力仪，可在体外模拟呼吸过程中肺泡压缩和扩张时的情况。 优良的PS制剂能在较低浓度下，迅速将压缩时的表面张力(最低表面张力)降至5 mN/m以下；但在肺损伤等所致的PS功能障碍时，血浆蛋白等因素会抑制PS的活性，导致最低表面张力升高，通常使用一定浓度的纤维蛋白原代表抑制因素，作为体外PS抑制模型检测PS制剂抵抗抑制的能力。肺损伤是引起PS功能障碍最常见的原因，为此大鼠体内注射大剂量细菌脂多糖 (LPS)制成肺损伤模型，模拟肺损伤导致的急性呼吸窘迫综合征(ARDS)，观察SP-A组合物体内治疗PS功能障碍的活性作用。(1)组合物抵抗牛纤维蛋白原抑制的活性试验
牛肺表面活性提取物以水或生理盐水溶解并稀释为含牛肺表面活性提取物1. 5mg/ml 的测试液a ；牛肺表面活性提取物中加入牛纤维蛋白原，以水或生理盐水稀释为含肺表面活性提取物1. 5mg/ml，含牛纤维蛋白原5 mg/ml的测试液b ；
按实施例一方法制备得到的牛肺磷脂SP-A组合物(牛肺表面活性提取物与SP-A重量比分别为98 :2,95 :5,90 :10) 1. 5mg/ml浓度下加入牛纤维蛋白原(终浓度5mg/ml)，得到测试液C2、C5和ClO ；
使用可控闭泡式表面张力仪(CB-1型，具体参见可控闭泡式表面张力测定仪专利说明书，CN 94200787. 5)，检测上述五个测试液的最低表面张力，结果如表1所示。表1最低表面张力检测结果
权利要求
1.一种治疗肺表面活性物质缺乏或者功能障碍的药物组合物，其中包含肺表面活性提取物和SP-A0
2.如权利要求1所述的药物组合物，其中肺表面活性提取物与SP-A的重量比为982 至 90 :10ο
3.如权利要求2所述的药物组合物，其中肺表面活性提取物与SP— A的重量比为95 5 至 90 :10ο
4.如权利要求1一 3任一项所述的药物组合物，其中的肺表面活性提取物是牛、猪或其他哺乳动物的肺灌洗液或全肺勻浆提取液经分离、提取、纯化制备的磷脂蛋白复合物，SP-A是从哺乳动物肺提取或通过基因工程技术得到的SP-A或SP-A功能片段。
5.一种治疗肺表面活性物质缺乏或者功能障碍的药物制剂，其特征在于，该制剂包含肺表面活性提取物和SP-A，二者溶于0. 1-0. 5 mol/L氯化钠和1. 5-50 mmol/L氯化钙的混合溶液，超声或分散混合均勻，制得混悬液，或者经冷冻干燥制得冻干粉针剂。
6.如权利要求5所述的药物制剂，其特征在于，混合溶液中氯化钠的浓度为0.1-0. 2mol/L0
7.如权利要求6所述的药物制剂，其特征在于，混合溶液中的氯化钠的浓度为0.15mol/L0
8.如权利要求5- 7任一项所述的药物制剂，其特征在于，肺表面活性提取物与SP -A的重量比为98 :2至90 =IO0
9.如权利要求8所述的药物制剂，其特征在于，肺表面活性提取物与SP-A的重量比为 95 :5 至 90 =IOo
10.如权利要求5- 9任一项所述的药物制剂，其中的肺表面活性提取物是牛、猪或其他哺乳动物的肺灌洗液或全肺勻浆提取液经分离、提取、纯化制备的磷脂蛋白复合物，SP-A是从哺乳动物肺提取或通过基因工程技术得到的SP-A或SP-A功能片段。
11.权利要求5所述药物制剂的制备方法，包括如下步骤(1)将肺表面活性提取物与SP-A混合；(2)溶于0.1-0. 5 mol/L氯化钠和1. 5-50 mmol/L氯化钙的混合溶液；(3)使用超声、分散等手段混合均勻，制得混悬液，或经冷冻干燥制得冻干粉。
12.如权利要求11所述的制备方法，其特征在于，混合溶液中氯化钠的浓度为0.1-0.2mol/L0
13.如权利要求12所述的制备方法，其特征在于，混合溶液中的氯化钠的浓度为0.15mol/L0
14.如权利要求11- 13任一项所述的制备方法，其特征在于，肺表面活性提取物与SP-A按照98 2至90 10的重量比进行混合。
15.如权利要求14所述的制备方法，其特征在于，肺表面活性提取物与SP— A的重量比为 95 5 至 90 =IOo
16.如权利要求11- 15任一项所述的制备方法，其中肺表面活性提取物是牛、猪或其他哺乳动物的肺灌洗液或全肺勻浆提取液经分离、提取、纯化制备的磷脂蛋白复合物，SP-A是从哺乳动物肺提取或通过基因工程技术得到的肺表面活性物质相关蛋白A或SP-A功能片段。
17.如权利要求11 - 15任一项所述制备方法中，肺表面活性提取物和SP — A可按下述方法制备⑴牛、猪或其他哺乳动物肺灌洗液或全肺勻浆提取液静置或500-1000Xg离心，取上清液；⑵上清液使用装有微孔陶瓷滤管的浓缩过滤系统浓缩，透过滤管的滤过液弃去，收集得到浓缩液，其中陶瓷微孔滤管孔径lO-lOOOnm，优选10-350nm ；浓缩过滤系统工作压力<0. 5MPa，优选0. 1-0. 35Mpa;预先使用平衡液平衡，上清液在0-40° C条件下进行浓缩过滤，最后使用洗脱液洗出残留在系统中的活性成分，所得洗脱液循环通过浓缩过滤系统，使系统中的物料充分洗脱下来；平衡液和洗脱液为0. 1-0.5 mol/L氯化钠溶液，或1.5-50 mmol/L氯化钙溶液，或二者的混合液；(3)将⑵所得浓缩液高速离心> 10000 X g，取离心后的沉淀备用；⑷将⑶所得沉淀用有机溶剂进行萃取，分离下层含有表面活性磷脂的萃取液备用，剩余废弃液用于制备表面活性物质蛋白A ；其中有机溶剂为溶剂A和溶剂B的混合液，溶剂A和溶剂B的体积比为1 :1至1 :3，优选1 :2，溶剂A选自正己烷、石油醚、甲醇、乙醇，溶剂B选自二氯乙烷、氯仿、丙酮、乙酸乙(5)将⑷所得萃取液过滤，真空干燥，制得肺表面活性提取物；(6)也可将⑶所得沉淀使用(X)2超临界提取技术提纯，将1份沉淀与1-3份硅藻土或玻璃珠惰性载体混勻，干燥，放入提取槽，用CO2流体萃取获得分离液，萃取压力20-30Mpa，优选25-30Mpa，温度20_5(TC，优选30_5(TC，最优选40°C，用氯仿清洗分离槽，将所得氯仿溶液与分离液合并，逐级过滤，干燥，得到肺表面活性提取物；(7)步骤⑷所述废弃液，高速离心>10000 X g，收集得到沉淀；(8)所述沉淀用2-10倍重量比的生理盐水混勻，然后加入生理盐水20- 60倍体积比的正丁醇提取，正丁醇提取液高速离心彡10000X g，收集不溶性沉淀，真空干燥，得SP-A。
18.如权利要求17所述的制备方法，其特征在于，步骤( 或(6)所得提取物也可用下述两种方法之一进一步纯化方法一使用丙酮、乙醇或乙酸乙酯进一步洗涤、纯化，去除中性脂类，真空干燥，得到磷脂浓度更高的肺表面活性提取物；方法二 用氯仿或二氯乙烷溶解，再使用葡聚糖凝胶色谱柱进行层析纯化，洗脱液为体积比1 :1 0. 1的二氯乙烷-异丙醇-0. 1 N盐酸，以二极管阵列检测器或蒸发光散射检测器或电喷雾检测器监测，收集馏分，过滤，冷冻干燥或真空干燥，即得磷脂含量更高的肺表面活性提取物。
19.如权利要求17或18所述的制备方法，其特征在于，其步骤(6)中为提高CO2超临界提取萃取效率，加入少量极性溶剂乙醇、氯仿、丙酮或乙酸乙酯作为夹带剂或共溶剂。
20.如权利要求19所述的制备方法，其特征在于，夹带剂或共溶剂为乙醇或氯仿。
21.如权利要求17所述的制备方法，其特征在于，还包括如下步骤(9)将步骤(8)得到的SP-A溶于pH7. 4的0. 15 mol/L氯化钠和1. 5-50 mmol/L氯化钙溶液中，加入适量β-D-吡喃糖或Tris (三羟甲基氨基甲烷)缓冲液，搅拌，然后采用下述两种方法之一进一步纯化方法一依次用分子量IOkD的膜和分子量300kD的膜进行超滤，收集10kD-300kD之间的SP-A浓缩液；方法二 通过预填充的maltosyl-agarose (麦芽糖-琼脂糖)柱进行亲和层析，以含有叠氮钠的100mmol/L EDTA、20mmol/L的Tris-HCl、pH=7. 4的溶液进行洗脱，洗脱液用分子量IOkD的膜进行超滤，得到SP-A浓缩液；(10)步骤(9)得到的SP-A浓缩液依次经0. 45 μ m和0. 22 μ m的膜除菌过滤；滤过液冷冻干燥得到高纯度SP-A。
22.按照权利要求17- 21的制备方法制备得到的治疗肺表面活性物质缺乏或者功能障碍的药物制剂。
23.权利要求1-10任一项所述包含肺表面活性提取物和SP-A的组合物或药物制剂在制备治疗肺表面活性物质缺乏或肺表面活性物质功能障碍类疾病的药物中的用途。
24.权利要求23所述的包含肺表面活性提取物和SP-A的组合物或药物制剂在制备治疗肺表面活性物质缺乏或肺表面活性物质功能障碍类疾病的药物中的用途，其中所述疾病为肺炎、胎粪吸入综合征、支气管肺发育不良、婴幼儿体外循环术、肺损伤所致的急性呼吸窘迫综合征ARDS以及慢性阻塞性肺疾病。
全文摘要
本发明涉及肺表面活性提取物与肺表面活性物质相关蛋白A(surfactantassociatedproteinA,SP-A)的组合物、药物制剂及其制备方法。采用陶瓷滤管浓缩过滤、有机溶剂提取、纯化等方法制得肺表面活性提取物；同时利用肺表面活性提取物生产过程中的废弃物制得高纯度SP-A；并将肺表面活性提取物与SP-A组合制得肺磷脂SP-A组合物。该组合物具有拮抗活性抑制的作用，在治疗肺表面活性物质缺乏或功能障碍类疾病，如肺炎、胎粪吸入综合征、支气管肺发育不良、婴幼儿体外循环术、肺损伤等所致的急性呼吸窘迫综合征以及慢性阻塞性肺疾病方面的疗效优于不含SP-A的PS制剂。
文档编号A61K9/10GK102552879SQ20121006789
公开日2012年7月11日 申请日期2012年3月15日 优先权日2012年3月15日
发明者于顺廷, 寇同欣, 王梦德, 秦晓君, 胡金艳, 赵海英, 陆文超 申请人:北京双鹤现代医药技术有限责任公司