专利名称：一种猴头菌多糖及其制备方法
技术领域：
本发明涉及食用菌提取及深加工领域，具体地说涉及一种猴头菌多糖及其制备方
法
背景技术：
猴头菌(Zferici仰？ erinaceus)隶属于真菌门、担子菌亚门、猴头菌科、猴燕菌属，是著名的药食两用菌，早在1200年前我国人民就将其列为“山珍”，与熊掌、海參、鱼翅并架齐驱，有“山珍猴头，美味燕窝”之说。猴头菌多糖是猴头菌中最重要的活性成份之一，具有多种生物活性和药理作用，能增强巨噬细胞的吞噬功能，促进溶血素的形成，抗白细胞下降，降血糖，抗凝血，抗血栓、抗突变和抗衰老等。猴头多糖具有很强的免疫调节作用，它对由ConA诱导的T 一淋巴细胞有増殖作用，促进脾脏淋巴细胞的増殖，对脂多糖(LPS)刺激的B淋巴细胞也有协同作用；此外，猴头菌多糖对胃肠粘膜具有保护及损伤修复作用。目前常用的提取猴头菌中多糖的方法主要是常规的水提醇沉，但是这样得到的猴头菌多糖中含有大量的色素，色素的存在不仅影响多糖色泽，且使粗多糖易吸潮；同时影响多糖的纯度及其生物活性，对产品开发带来不利影响。
发明内容
本发明首先提供了ー种猴头菌多糖，其是用如下方法制备得到的
①水提醇沉的方法提取猴头菌，干燥后得到粗多糖；
②将猴头菌粗多糖水溶液加入大孔树脂D315，进行脱色，干燥后得到猴头菌多糖。其中所述的脱色为静态脱色，或为动态脱色。其中静态脱色是将粗多糖水溶液中直接加入大孔树脂D315，室温下，粗多糖浓度为 13. 9 mg/ml，pH 为 4，摇床 120rpm,脱色 6h,即可；
其中动态脱色是采用湿法装柱的方式装柱，层析柱规格为3. 5 X 60cm,浓度为13. 9 mg/ml的粗多糖水溶液4000rpm离心30分钟，上清用盐酸调pH至4. 00，流速为0. 6BV/h,上样量为3.7 g多糖/100 ml树脂。该树脂动态脱色完成后，用IL lmol/L的NaCl冲洗柱子，可连续上样八次以上。本发明使用的大孔弱碱性阴离子交換树脂为丙烯酸-ニこ烯苯共聚体骨架，功能基团为E N，具体是购自上海华震科技有限公司的D315树脂。所述的大孔弱碱性阴离子交换树脂D315在进行脱色前，最好先进行下述步骤的预处理先用蒸馏水清洗至无泡沫，无浑浊，再用3-5%的NaOH溶液浸泡4小时，然后倒出碱液，用蒸馏水漂洗至中性。接着将树脂用3-5%的HCl溶液浸泡4小时，然后倒出酸液，用蒸馏水漂洗至中性；再用3-5%的NaOH溶液浸泡4小时，然后倒出碱液，用蒸馏水漂洗至弱碱性备用。脱色后的猴头菌粗多糖水溶液，使用冷冻干燥机进行冷冻干燥处理，最終得到颜色较浅的猴头菌多糖产品。
本发明还提供了制备上述猴头菌多糖的方法，该方法包括如下步骤
①水提醇沉的方法提取猴头菌，干燥后得到粗多糖；
②将猴头菌粗多糖水溶液加入大孔树脂D315，进行脱色，干燥后得到猴头菌多 糖。本发明提供的经过脱色的猴头菌多糖，制备方法简便、适用于大規模生产。脱色率可达到70%以上，多糖保留率达到75%以上，并且该猴头菌多糖的免疫活性显著提高，优于未脱色的猴头菌多糖和其他方法脱色的猴头菌多糖。
具体实施例方式实施例I水提醇沉法制备猴头菌粗多糖
将猴头菌子实体用粉碎机粉碎成颗粒，按照液料比15 1 (体积升比重量公斤)加入相应体积的蒸馏水，加热煮沸持续2h，之后用滤布(100目)过滤，滤渣重复上述步骤再提取ー次后过滤，合并两次提取的滤液。滤液按浓缩比I :1浓缩后，70%こ醇沉淀，弃上清，沉淀溶于水，喷雾干燥最終得到猴头菌粗多糖干品。实施例2体外刺激巨噬细胞生成NO实验
将实施例I制备得到的猴头菌粗多糖干品配制成10mg/ml的粗多糖水溶液，然后分别进行如下三种方法脱色。①双氧水脱色粗多糖溶液浓度为10mg/ml，用氨水调pH至8. O，加入3%的30%的双氧水，60で水浴180分钟，调pH至7. O，取样。②D315树脂脱色粗多糖溶液浓度为10mg/ml，体积为100ml，加入20ml的大孔树脂，摇床中120rpm， 25 °C，9小时，取样。双氧水脱色、D315树脂脱色及未脱色粗多糖溶液于分子截流量为3500的透析袋透析除去小分子。将脱色后的猴头菌多糖水溶液用旋转蒸发仪浓缩后先放置于_20°C冷冻12h，然后置于-80摄氏度冷冻12h，之后转到冷冻干燥机中进行冷冻干燥处理，最后得到脱色的猴头囷多糖。供试样品的配制
精确称取以上得到的猴头菌多糖样品于灭过菌的印pendorf管中，用PBS缓冲液配置成浓度5mg/mL。充分溶解后以12000 rpm/min离心30分钟,无菌条件下转移至新的无菌eppendorf管中，将样品稀释成25、50、100 u g/mL待用。空白对照为PBS缓冲液，阳性对照为 10 ii g/mL LPS 溶液。小鼠RAW264. 7巨噬细胞的制备
用DMEM培养基在37°C、5% CO2条件下传代培养后，用0. 05%胰蛋白酶消化，混悬液300 X g离心3min后收集细胞，用无色RPMI1640培养基将细胞稀释到一定浓度备用。巨噬细胞释放NO活性的测定
由于NO极不稳定,在体内很快生成亚硝酸基(NO2-)和硝酸基(NO3-),故采用Griess法测定样品中的NO2- /NO3-作为衡量NO水平的指标。( I)用亚硝酸钠制标准曲线
配成不同浓度的亚硝酸钠溶液，浓度梯度为0、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100iiM共11个；取100 y L于96孔板，加入50 i! L Griess试剂，测定543nm吸光值，标准曲线每个浓度3个重复，绘制标准曲线。(2) NO产量测定
吸掉巨噬细胞的培养液，加PBS 2 ml，震荡再吸棹。用0.05%胰酶或5% EDTA溶液在培养箱37°C中3-5min消化巨噬细胞。消化完毕，加入ImL DMEM完全培养基+胎牛血清终止反应，离心，吸掉消化液，加入ImL无色RPMI1640 (10%胎牛血清+1%抗生素液体)，计数。用无色RPMI1640培养基将细胞稀释至5 X 105/ml，加入96孔板，每孔加入180 y L，然后再加入20 ii L待测样品，37°C培养48h。取100 y L上清于96孔板，加入50 u LGriess试剂，显色IOmin后，于波长543nm处测定吸光度，根据标准曲线计算相应的NO量。
实验结果
双氧水脱色猴头多糖与未脱色猴头多糖測定的巨噬细胞中NO的含量(単位iimoL/5. OXlO8Cells)分别为17.30、7. 95 (样品浓度 25 y g/mL) ;23. 61 ,12. 60 (样品浓度50 ii g/mL); 13. 49 ,15.71 (样品浓度100 y g/mL)。可以看出，实施例2中的双氧水脱色猴头菌多糖与实施例I中的相比，刺激巨噬细胞产生NO的活性降低。树脂D315脱色猴头菌多糖与未脱色猴头菌多糖测定的巨噬细胞中NO的含量(单位ymoL/5. OXlO8ceIls)分别为26. 29、8. 64 (样品浓度 10 u g/mL) ；34. 92,24. 70 (样品浓度 25 u g/mL) ；42. 42>31. 89 (样品浓度50ii g/mL)，可以看出，实施例2中的树脂D315脱色猴头多糖与实施例I中的相比，刺激巨噬细胞产生NO的活性显著增強。实施例3
将实施例I得到的猴头菌粗多糖配制成10mg/ml的水溶液。取瓜202，1206，335，0315，0303(购自上海华震科技有限公司)，脱色ー号(购自沧州宝恩吸附材料科技有限公司)六种大孔树脂各20ml，和IOOml 10mg/ml离心后的猴头多糖(4000rpm，30min)溶液混和，迅速摇匀后取样，为初样，将三角瓶放到摇床中，温度设为25°C，120rpm。吸附9小时，用滤布过滤，IOOml蒸馏水清洗，过滤，再用50ml蒸馏水清洗，过滤，合并滤液，旋蒸仪浓缩，定容至100ml，取50ml冻干，另50ml透析。测多糖含量，算出得率。体外刺激巨噬细胞生成NO实验的操作方法同实施例2。体外刺激淋巴细胞增殖实验的操作步骤如下
供试样品的配制
精确称取多糖样品(实施例I、实施例2中得到的猴头多糖)于灭过菌的印pendorf管中，用PBS缓冲液配置成浓度10 mg/mL。充分溶解后以12000 rpm/min离心30分钟，无菌条件下转移至新的无菌eppendorf管中，将样品稀释成200、500、1000 u g/mL待用。空白对照为PBS缓冲液，阳性对照为60 u g/mL PHA溶液。小鼠脾淋巴细胞的制备
小鼠颈椎脱臼处死，取脾脏，用PBS冲洗:T4次。用100目筛在培养皿中将脾脏磨碎，磨碎后的混悬液以400 Xg离心6 min,吸去上清液，加入浓度为0. 83%氯化氨溶液裂解红细胞，反复冲打，静置10 min后400Xg离心6 min，收集的细胞用PBS缓冲液冲洗数遍后，台朌蓝检查活力在95%以上。用RPMI1640将细胞稀释成2X IO6个/mL，加入96孔细胞培养板中，在37°C、5%的CO2下培养。
淋巴细胞増殖率的測定
将180 UL每mL含2X IO6个淋巴细胞的悬浮液加至96孔板中，同时加入20 y L样品，于37°C、含5%的CO2条件下培养3 d，用酶标仪测定其570 nm和600 nm处的吸光度，然后加入20 uL Alamar Blue试剂，再培养，变色后再测定570 nm和600 nm处的吸光度，然后根据Alamar Blue试剂的公式计算各种样品对细胞増殖的影响。计算公式
淋巴细胞增殖率(%) = [117216XA157Q(sample)-80586XA 麵(sample)]
/ [117216 X A1570 (control) -80586 X A1600 (control) ] X 100%
实验结果
六种大孔树脂HZ202、JK206、335、D315、D303、脱色一号脱色后猴头菌多糖测定的巨噬细胞中 NO 的含量(单位u moL/5. OXlO8Cells)分别为:18. 46,12. 77 ,22. 77,26. 59、27. 24,23. 18 (样品浓度 25u g/mL)；24. 32、18. 71、27. 00,31. 63,26. 59,26. 67 (50 u g/mL)；30. 01,22. 53、34. 15、37. 89、35. 86、33. 83 (IOOu g/mL) 可以看出，各树脂脱色猴头多糖相比，D315刺激巨噬细胞产生NO的活性最高。五种大孔树脂HZ202，335，D315，D303，脱色一号脱色后猴头多糖测定的淋巴细胞增值率(％)分别为230%, 226%, 234%, 271%, 251% (样品浓度 50 u g/mL) ;239%，261%, 251%,265%, 308% (100 u g/mL) ；204%, 250%, 273%, 266%, 247% (200 u g/mL)。各树脂脱色后的猴头菌多糖相比，D315，D303，脱色一号脱色后猴头多糖都具有较好的刺激淋巴细胞增殖的活性。实施例4
实施例I的猴头粗多糖干品配成13. 8mg/ml的猴头菌粗多糖溶液，离心除去沉淀部分。大孔弱碱性阴离子交换树脂D315的预处理
先用蒸馏水清洗至无泡沫，无浑浊，再用3-5%的NaOH溶液浸泡4小时，然后倒出碱液，用蒸馏水漂洗至中性。接着将树脂用3-5%的HCl溶液浸泡4小时，然后倒出酸液，用蒸馏水漂洗至中性；再用3-5%的NaOH溶液浸泡4小时，然后倒出碱液，用蒸馏水漂洗至弱碱性备用。IOOmL 13. 85mg/ml的猴头菌粗多糖水溶液加入37mL已预处理好的大孔弱碱性阴离子交换树脂D315，于250mL三角烧瓶中，置于摇床中震荡，120rpm, 25°C、pH4. 0条件下脱色6h，然后用滤布(100目)过滤，收集脱色后的猴头菌多糖水溶液，进行脱色的測定以及多糖保留率的測定。猴头菌多糖水溶液，稀释100倍后用苯酚硫酸法在490nm下測定脱色前后多糖含量，在450nm下測定脱色前后色素含量。计算公式
f Mfe mm. mt ^J
Sfi色寒.<%> = -
脱色_ ItIS-空白義吸光度
脱色翁多■含色湯多糖含蹙r
多纏—窗孿(%) = - *100%
—Ift色鋳多糖含ft _I结果脱色率达到69. 35%，多糖保留率达到80. 16%。3.冷冻干燥
将脱色后的猴头粗多糖水溶液用旋转蒸发仪浓缩后先放置于_20°C冷冻12h，然后置于-80摄氏度冷冻12h，之后转到冷冻干燥机中进行冷冻干燥处理，最后得到颜色较浅的猴头囷多糖。实施例5
实施例I的猴头粗多糖干品配成13. 9mg/ml的猴头菌粗多糖溶液，离心除去沉淀部分。阴离子交换树脂D315的预处理(树脂预处理方法同实施例4)
取IOOml预处理好的大孔树脂D315，采用湿法装柱的方式装柱，层析柱规格为
3.5X60cm，配置浓度为13. 9 mg/ml的粗多糖，4000rpm离心30分钟，取上清，用盐酸调PH至4. 00，流速为0. 6BV/h,上样量为3. 7g多糖/IOOml树脂，该树脂脱色完成后，用IL Imol/L的NaCl冲洗柱子，可连续上样八次以上。脱色后的猴头菌多糖水溶液，使用冷冻干燥机进行冷冻干燥处理，最終可得到颜色较浅的猴头菌多糖产品。測定其多糖含量和色素，与实施例I的相比，计算得到其脱色率为75. 7%，多糖保留率为77. 8%。
权利要求
1.ー种猴头菌多糖，其特征在于其是用如下方法制备得到的 ①水提醇沉的方法提取猴头菌，干燥后得到粗多糖； ②将猴头菌粗多糖水溶液加入大孔树脂D315，进行脱色，干燥后得到猴头菌多糖。
2.根据权利要求I所述的猴头菌多糖，其特征在于步骤②中所述的脱色的方法为 将粗多糖水溶液中加入大孔树脂D315，室温下，pH为4，摇床120rpm，脱色6h，即可。
3.根据权利要求I所述的猴头菌多糖，其特征在于步骤②中所述的脱色的方法为采用湿法装柱的方式装柱，层析柱规格为3. 5 X 60cm,浓度为13. 9 mg/ml的粗多糖水溶液4000rpm离心30分钟，上清用盐酸调pH至4. 00，流速为0. 6BV/h,上样量为3. 7 g多糖/100 ml树脂。
4.ー种制备权利要求1-3任一项所述猴头菌多糖的方法，其特征在于包括如下步骤 ①水提醇沉的方法提取猴头菌，干燥后得到粗多糖； ②将猴头菌粗多糖水溶液加入大孔树脂D315，进行脱色，干燥后得到猴头菌多糖。
全文摘要
本发明公开了一种猴头菌多糖及其制备方法。该猴头菌多糖是采用先水提醇沉，然后用大孔树脂进行脱色的方法制备得到。本发明得到的猴头菌多糖保留率达到75%以上，并且该猴头菌多糖的免疫活性高。
文档编号A61P37/04GK102643359SQ201210103089
公开日2012年8月22日 申请日期2012年4月10日 优先权日2012年4月10日
发明者刘艳芳, 吴迪, 周帅, 唐庆九, 张劲松, 杨焱, 汪雯瀚, 蒋俊 申请人:上海市农业科学院