专利名称：桑枝皮中具有抑制α-糖苷酶活性的水溶性生物碱纯化方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种具有降血糖作用的桑枝皮中水溶性生物碱的分离提纯方法及其应用。
背景技术：
糖尿病是由于胰岛素分泌不足和/或胰岛素作用受损引起的一组以高血糖为特征的代谢性疾病。其表现为血液及尿液中葡萄糖浓度异常升高，血糖、尿糖过高时可出现典型的“三多一少”症状，即多饮、多尿、多食及体重减轻，且伴有疲乏无力。糖尿病一般分为I 型糖尿病、II型糖尿病和妊娠糖尿病等几种类型。糖尿病不仅可以引起微血管并发症，如周围神经病变、眼部病变、糖尿病肾病等，而且也可以引起严重的大血管并发症，如心肌梗死、 中风、下肢血管阻塞性病变等。这些并发症危害极大，降低了人们的生活质量，给人们带来了沉重的经济负担。因此治疗糖尿病、控制糖尿病并发症的发生和发展已显得越来越重要。流行病学的研究表明，空腹血糖水平与餐后血糖水平这两大血糖指标中，餐后血糖水平尤为重要，它是葡萄糖耐受受损(IGT)的病人发展为II型糖尿病的重要因素。而且， 餐后血糖水平是引起糖尿病人大血管并发症和微血管并发症的重要因素，而这些并发症是引起糖尿病死亡率增大的一个主要原因。所以，严格控制餐后血糖对糖尿病的防治具有非常重要的意义，而能够显著降低餐后血糖水平的抗糖尿病药物具有很大的应用价值。食物中的碳水化合物大部分是淀粉、多糖或寡糖。与膳食一起进食后，α-糖苷酶抑制剂可与双糖、多糖或淀粉竞争而与唾液和胰液中的α-糖苷酶结合，占据酶上的结合位点，使双糖、多糖或淀粉的消化受阻。未被消化的碳水化合物被运送至小肠中下段及结肠，从而使碳水化合物的消化吸收发生在整段小肠中，延缓和延长了餐后单糖(葡萄糖)的吸收，餐后血糖的增高被显著减小。桑科植物的根、茎、叶均含有α-糖苷酶抑制成分。经检索中国专利申请号 20061011164. 3的专利公开了一种从桑枝中提取制备α -糖苷酶抑制剂及其应用，该专利是以桑枝为原料进行提取抑制α-糖苷酶有效部位。我们经过实验证实桑枝中的α-糖苷酶抑制成分主要分布在皮质部分，而桑枝木质部分α -糖苷酶抑制成分含量仅是皮质部分的十分之一。桑蚕养殖是我国传统产业之一，在桑蚕养殖地区每年都要进行一至二次桑枝的修剪，大量桑枝用于木材加工，而木材加工只用桑枝的木质部分，皮质部分必须去掉。因此，以桑枝皮为药材，来源广泛，价格便宜。在提取时由于将木质部分去掉，使原料体积减少一半以上，大大节省了提取溶媒用量，以及人工工时和能源；其木质部分可以用于木材加工的原料；皮质部分在提取降血糖作用的水溶性生物碱后还可作为天然纺织纤维的原料，具有良好的综合利用前景。另外，该专利所得到的具有降血糖活性的生物碱有效部位含量占提取物的重量百分比在50%以上,而其代表成分l-deoxynojirmycin(l-脱氧野尻霉素DNJ)最高含量为总生物碱的50%，也就是说DNJ占总提取物的25%。
专利申请号为200810021592. X中描述了从桑皮中得到一种具有降血糖作用的提取物，但未提及有效部位，更未提及有效成分的含量。
发明内容
本发明目的在于提供一种从桑枝皮中提取具有降血糖作用的水溶性生物碱的分离提纯方法及其应用。本发明提供的从桑枝皮中提取、分离、纯化获得具有抑制α-糖苷酶活性的水溶性总生物碱的制备方法，包括如下步骤第I、以桑枝皮为原料，以水醇=100%-20% O %-80 %为提取溶剂，提取溶剂的体积为桑枝皮重量的6-10倍；调节提取液ΡΗ2-7，加热回流，提取液过滤，重复2次提取， 除去药渣,合并2次的滤液；第2、加热减压浓缩第I步获得的提取液，至原桑枝皮重量的1/2 I倍；第3、加入体积百分含量为75% 100%的甲醇或乙醇，加入的量为第2步得到的浓缩提取液体积的3 5倍，在4 30°C进行醇沉淀；离心或过滤，除去残渣和不溶物，得到上清液；第4、取第3步获得的醇沉淀浓缩后的上清液，经阳离子交换树脂柱进行纯化，用去离子水洗去不吸附的杂质，再用O. 2 I. 5mol氨水洗脱，洗脱液上阴离子交换树脂，收集不吸附部分，调PH8 ；第5、采用膜过滤，滤液冷冻干燥成干粉，或将收集液直接喷雾干燥成型制成干粉， 得淡黄色的水溶性总生物碱提取物，该提取物具有对α -糖苷酶的抑制活性。所述淡黄色的水溶性总生物碱提取物中I-脱氧野尻霉素含量占总提取物的 50-70%。以上所述方法获得的桑皮水溶性总生物碱的应用，将所述的桑皮水溶性总生物碱与药物制剂所允许的药物辅料结合，用于制备降血糖药物，可制备成适合于使用的各种剂型。本发明的优点和积极效果I.本发明以桑枝皮为药材，来源广泛，价格便宜。在提取时由于将木质部分去掉， 使原料体积减少一半以上，大大节省了提取溶媒用量，以及人工工时和能源；2.本发明以桑枝皮为药材，通过提纯工艺的改进，使具有α-糖苷酶的抑制活性的水溶性总生物碱提取物中I-脱氧野尻霉素含量达到50%以上；3.本发明为桑蚕养殖业的综合利用提供了一个新的途径桑枝的木质部分可以用于木材加工的原料；皮质部分在提取降血糖作用的水溶性生物碱后还可作为天然纺织纤维的原料，具有良好的综合利用前景。
图I桑枝皮水溶性生物碱总提取物(样品)对α -糖苷酶的抑制曲线。
具体实施例方式一.桑皮水溶性生物碱总提取物的制备及应用
首先将桑枝皮粉碎，加入提取溶剂(水醇=100% -20% 0% -80%为提取溶剂，调节提取液PH2-7)，提取溶剂的体积为桑枝皮重量(Kg)的6-10倍；加热回流，过滤，重复提取2次，合并2次的滤液；提取液浓缩至原桑枝皮重量的1/2 I倍；加入体积百分含量为75% 100%的甲醇或乙醇，加入的量为第2步得到的浓缩提取液体积的3 5倍，在4 30°C进行醇沉淀；离心或过滤，除去残渣和不溶物，得到上清液；取醇沉淀浓缩后的上清液，经阳离子交换树脂柱进行纯化，用去离子水洗去不吸附的杂质，再用O. 2 2mol氨水洗脱，洗脱液经阴离子交换树脂，用去离子水冲洗，收集不吸附部分，收集液调PH8;采用膜过滤，滤液冷冻干燥成干粉，或将滤液直接喷雾干燥成型制成干粉，得淡黄色的水溶性总生物碱提取物，该提取物具有对α -糖苷酶的抑制活性，I-脱氧野尻霉素的含量为水溶性总生物碱提取物的50-70%。实施例I将粉碎的桑枝皮lKg，加水10L，调pH2，加热回流2小时，过滤；重复提取2次，合并2次滤液，浓缩至500mL，加入95%乙醇1500mL，室温静置过夜，过滤，除去不溶物，滤液上ZeiOlit 225阳离子树脂，用去离子水洗去不吸附的杂质，再用Imol氨水洗脱，洗脱液上 D380阴离子树脂，收集不吸附部分，调pH8，过膜，滤液干燥，即得淡黄色水溶性总生物碱提取物 I. 3g，DNJ-含量 62%。实施例2将粉碎的桑枝皮lKg，加80%甲醇8L，调pH7，加热回流2小时，过滤；重复提取2 次，合并2次滤液，浓缩至500mL，加入95%乙醇1500mL，室温静置过夜，过滤，除去不溶物， 滤液上0017阳离子树脂，用去离子水洗去不吸附的杂质，再用O. 5mol氨水洗脱，洗脱液上 D261阴离子树脂，收集不吸附部分，调pH8，用膜过滤，滤液干燥，即得淡黄色水溶性总生物碱提取物llg，DNJ-含量69%。实施例3将粉碎的桑枝皮lKg，加60%乙醇6L，调pH4，加热回流2小时，过滤；重复提取2 次，合并2次滤液，浓缩至500mL，加入95%乙醇1500mL，室温静置过夜，过滤，除去不溶物， 滤液上Amberlite IR120阳离子树脂，用去离子水洗去不吸附的杂质，再用O. 2mol氨水洗脱，洗脱液上D371阴离子树脂，收集不吸附部分，调pH8，用膜过滤，滤液干燥，即得淡黄色水溶性总生物碱提取物I. 6g，DNJ-含量57%实施例4、(水溶性总生物碱提取物用于制备降血糖药物)称取桑枝皮水溶性总生物碱提取物30g，加入羧甲基纤维素钠(内加)5. Og,交联羧甲基纤维素钠(内加)4. 5g，淀粉88g，混匀，用50%乙醇准备软材，过16目筛制粒，干燥， 加入微粉硅胶I. 5g，硬脂酸镁I. 0g，过16目筛整粒压片，制1000片。二、桑枝中DNJ成分的分布实验①称取粉碎过2目筛的不同品种的干燥桑枝100g，每个品种3份，加入pHl的水溶液，加热回流，过滤，重复提取2次，合并2次的滤液，浓缩至一定体积，测定DNJ含量。结果见表I ;
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②称取粉碎过2目筛的不同品种的干燥桑枝木芯100g，每个品种3份，加入pHl的水溶液，加热回流，过滤，重复提取2次，合并2次的滤液，浓缩至一定体积，测定DNJ含量。 结果见表I ;③称取粉碎过2目筛的不同品种的干燥桑枝皮100g，每个品种3份，加入pHl的水溶液，加热回流，过滤，重复提取2次，合并2次的滤液，浓缩至一定体积，测定DNJ含量。结果见表I ;表I、不同品种的桑枝各部位DNJ百分含量
桑树品种桑枝％。桑枝皮％。桑枝木芯％。桂桑优2.3657.2000.892沙二 X伦1091.8325.2360.467桂桑621.7214.4680.474实验结果表明，不同品种桑枝中DNJ的含量虽有差异，但DNJ含量并没有显著性差异；而DNJ在桑枝皮、桑枝木芯中的分布却有明显差异在皮质部分含量最高,而桑枝木芯部分DNJ成分含量仅是皮质部分的十分之一，甚至更低。三、桑皮水溶性生物碱总提取物对α-糖苷酶抑制作用将DNJ标准品、桑皮水溶性生物碱总提取物和阿卡波糖标准品各10毫克，分别用ImLO. 2mol/L PBS (pH = 6. 8)将样品超声溶解，并10倍系列稀释为1,0. 1,0.01,0. 001，
O.0001，O. 00001mg/mL的样品，分别取样品20 μ L加入96孔板中，加入30 μ L肠粗酶溶液， 37°C孵育5min后，加入100 μ L麦芽糖启动反应，37°C反应30min后，加入IOyL 0. lmol/L 的盐酸终止反应，取反应液50 μ L，加入150 μ L的葡萄糖工作液37°C反应15min，490nm测定OD值，根据实验数据作图，见图I。根据α -糖苷酶的抑制曲线结果如图所示，桑枝皮水溶性总生物碱提取物(图中为样品)、1_脱氧野尻霉素(DNJ)标准品、阿卡波糖呈现出相平行的对α-糖苷酶抑制效果，其中桑枝皮水溶性总生物碱提取物(图中为样品)比阿卡波糖的抑制α-糖苷酶IC5tl 的浓度低近一个数量级。
权利要求
1.一种从桑枝皮中提取、分离、纯化获得具有抑制α-糖苷酶活性的水溶性总生物碱的制备方法，其特征是包括如下步骤第I、以桑枝皮为原料，以水醇=100%-20% 0%-80%为提取溶剂，提取溶剂的体积为桑枝皮重量的6-10倍；调节提取液ΡΗ2-7，加热回流，提取液过滤，重复2次提取，除去药渣；第2、加热减压浓缩第I步获得的提取液，至原桑枝皮重量的1/2 I倍；第3、加入体积百分含量为75% 100%的甲醇或乙醇，加入的量为第2步得到的浓缩提取液体积的3 5倍，在4 30°C进行醇沉淀；离心或过滤，除去残渣和不溶物，得到上清液；第4、取第3步获得的醇沉淀浓缩后的上清液，经阳离子交换树脂柱进行纯化，用去离子水洗去不吸附的杂质，再用O. 2 I. 5mol氨水洗脱，洗脱液上阴离子交换树脂，收集不吸附部分，收集液调PH8;第5、采用膜过滤，滤液冷冻干燥成干粉，或将收集液直接喷雾干燥成型制成干粉，得淡黄色的水溶性总生物碱提取物，该提取物具有对α -糖苷酶的抑制活性。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征是所述淡黄色的水溶性总生物碱提取物中I-脱氧野尻霉素含量占总提取物的50% -70%。
3.权利要求I所述方法获得的桑皮水溶性总生物碱的应用，其特征是将所述的桑皮水溶性总生物碱与药物制剂所允许的药物辅料结合，用于制备降血糖药物，制备成适合于使用的各种剂型。
全文摘要
一种从桑枝皮中提取纯化具有抑制α-糖苷酶活性的水溶性总生物碱的方法及应用。该纯化方法以桑枝皮为原料，加入提取溶剂(水醇=100%-20%0%-80%)提取，加热回流，过滤，重复提取2次，合并2次的滤液，浓缩；加入体积百分含量为75%～100%的甲醇或乙醇，在4～30℃进行醇沉淀；离心或过滤，除去残渣和不溶物，取醇沉淀浓缩后的上清液，经阳离子交换树脂柱进行纯化，用去离子水洗去不吸附的杂质，再用0.2～2mol氨水洗脱，洗脱液经阴离子交换树脂，用去离子水冲洗，收集不吸附部分，调pH8；采用膜过滤，滤液干燥，制成干粉，得淡黄色的水溶性总生物碱提取物，该提取物具有对α—糖苷酶的抑制活性，并且DNJ—含量为50-70%。
文档编号A61K36/605GK102600245SQ20121011847
公开日2012年7月25日 申请日期2012年4月20日 优先权日2012年4月20日
发明者刘新元, 周德英, 朱元元, 朱晓丹, 白钢, 聂万达 申请人:南开大学, 天津中新药业集团股份有限公司隆顺榕制药厂