专利名称：川楝素在制备抗肿瘤靶向药物中的用途的制作方法
技术领域：
本发明属于药物领域，涉及一种抗肿瘤靶向药物，尤其是川楝素在制备抗肿瘤靶向药物中的用途。
背景技术：
靶向治疗是指根据已知肿瘤发生中涉及的异常分子和基因，设计针对这些特定分子和基因靶点的药物，选择性地杀伤肿瘤细胞。而化学治疗虽然可以起到明显的抗肿瘤作 用，但其在杀伤肿瘤细胞的同时，也会大面积的杀伤机体的正常细胞，与传统的化学治疗相t匕，革巴向治疗正以其低毒副反应和高治疗效果成为肿瘤治疗研究的热点。川楝素是一种从传统的驱蛔中药楝科植物川楝Melia Toosendan Sieb. et Zucc或楝Melia azedarach L.的树皮或种子中提取的一种四环三職类化合物,具有驱蛔、杀虫、抗肉毒效应、抑制神经递质释放等多种生物活性，广泛应用于农业、医药等行业。近年研究发现，川楝素具有凋亡作用，但是川楝素在肿瘤细胞内的作用靶标仍不是很明确，靶标所参与的信号转导途径尚不清楚，这个问题对于进一步川楝素的抗肿瘤作用，开发抗肿瘤靶向药物具有重要的指导意义。人源脱氧胞苷激酶是嘧啶补救合成途径中的一类关键酶，它能够磷酸化其天然底物dC, dG, dA。除此之外,它还能单磷酸化一些核苷类似物药物前体,使其能够继续三磷酸化其活性形式，结合于DNA链上，抑制DNA聚合酶的活性，终止DNA链的延伸，造成DNA链断裂。最早发现并用与临床的核苷类似物抗肿瘤药物为阿糖胞苷C(Ara-C)，其机制为Ara-C被DCK单磷酸化，继而被其它酶催化为Ara- CTP，进而干扰肿瘤细胞DNA的合成。继此之后，又出现一些新的核苷类似物，如福达他滨，吉西他滨等。研究表明此类核苷类似物抗药性的增加与DCK基因缺陷或其它原因导致的活性缺失有关系，DCK能够催化这些核苷类似物穿膜磷酸化的第一步。由于DCK发挥着如此重要的作用，关于其活性及其抑制剂的研究也越来越多。而目前关于DCK作用的报道也仅限于DCK干扰DNA的合成，进而用于癌症治疗及抗病毒化学治疗。这些药物出现的抗药性通常与DCK的活性丧失或者降低有一定的关系。已有研究发现，DCK与免疫疾病的发生也有一定的关联，它在胸腺及骨髓均有很高的表达水平，预示其在淋巴细胞生成中的作用不可小视。在DCK基因缺陷的小鼠中胸腺及淋巴细胞的数量较野生型小鼠明显减少。而关于DCK在细胞凋亡方面的作用并没有相关报道。因此，综合利用多种手段，阐明DCK在体内新的作用具有重要的意义。目前，寻找药物靶蛋白的方法主要有亲和色谱法、噬菌体展示克隆、酵母三杂交系统、药物印记、DNA芯片技术、磁性纳米探针技术等。其中，亲和色谱法是最经典的一种方法，常见的亲和色谱法有固相特异性洗脱法和药物竞争法。但固相特异性洗脱法易受到“亲和柱-靶蛋白”复合体解离速度的影响，而且还须制备无活性结构类似物药物的对照柱。药物竞争法由于蛋白会随不溶的药物沉淀，对药物溶解性的要求很高。系列亲和色谱法近几年才报道的一种新的能克服以上缺点的亲和色谱法，至今尚未应用于天然化合物的靶标发现。
发明内容
本发明的发明目的是提供一种抗肿瘤靶向药物的制备，即，川楝素的一种新的应
用。 为达到上述发明目的，本发明采用的技术方案是川楝素在制备抗肿瘤靶向药物中的应用。上述技术方案中，以人源脱氧胞苷激酶作为药物靶标。其中川楝素(Toosendanin，C3tlH38O11),分子量为574. 62。川楝素类似物主要包括羊毛脂烷型如茯苓酸、块苓酸和羊毛脂醇；达玛烷型如棒锤三萜A和人参、三七以及西洋参中均含有的人参皂苷；阿菠萝蜜型如环黄芪醇苷；大戟烷型如大戟烷、橄榄科乳香属的乳香二烯酮酸和异乳香二烯酮酸；葫芦烷型如血胆甲素、血胆乙素；原帖烷型如泽泻萜醇A和泽泻萜醇B。川楝素使脱氧胞苷激酶的构象发生变化而使其活性增加。由此获得一种人源脱氧胞苷激酶的突变体。其中，
人源脱氧胞苷激酶的氨基酸序列中第35位丝氨酸突变成谷氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺； 人源脱氧胞苷激酶的氨基酸序列中第74位氨基酸突变成谷氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺； 人源脱氧胞苷激酶的氨基酸序列中第128位精氨酸突变成谷氨酸、丙氨酸。上述靶向药物涉及的肿瘤类型主要包括乳腺癌、结肠直肠癌、非小细胞肺癌和胰腺癌以及淋巴瘤、白血病和多发性骨髓瘤。相关的肿瘤细胞主要包括来自于人的前列腺、肝、中枢神经、血液、肺及大鼠肾上腺的多种肿瘤细胞株如PC3，BEL7404, SH-SY5Y，U251，HL-60, U937, A-549，MDA-MB-468，PC12, K562 等。本发明在研究川楝素抗肿瘤的分子机理的过程中，采用HL-60细胞为研究对象，探索川楝素抑制HL-60细胞增生和促进其凋亡的分子靶点。利用Pull-down实验验证了 TSN与靶蛋白为特异性结合用连接有TSN于柱材S印horaSe-4B为分子探针，采用系列亲和色谱的方法，特异性吸附与HL-60肿瘤细胞内的靶蛋白，并对蛋白进行质朴鉴定，鉴定结果为这种靶蛋白为脱氧胞苷激酶(DCK)。DCK是含两个大小为30. 5kDa的相同亚基的二聚体，含260个氨基酸，其折叠构型与黑腹果蝇的核苷激酶(dNK)和人的dGK相类似，每个单体含5个β折叠，并以此为中心周围围绕着10个α螺旋，每个单体的第4个和第7个α螺旋形成一个4个螺旋组成的二聚体界面。由于DCK具有的对抗肿瘤的核苷类似物药物的磷酸激酶活性，近几年对于其活性以及作用的研究越来越多，而本发明中提到的其作为抗肿瘤药物川楝素的靶点还是第一次。本发明在确定了 TSN的祀蛋白为DCK之后,采用Promega公司的Kinase-Glo 激酶活性检测试剂盒进一步在体外验证了 TSN对DCK的相互作用。该试剂盒是一种通过激酶和底物反应，均质荧光素酶检测的方法。荧光素酶反应中需要ATP的参加，激酶的磷酸化也需要消耗ΑΤΡ，激酶反应结束，加入等体积的Kinase-Glo 试剂，测量发光信号。发光信号与体系中剩余的ATP成正比，与激酶活性成反比。该方法中，激酶为DCK，底物为dC。反应体系中，除了加入反映的激酶和底物，还加入了另外一种小分子，即TSN。有许多种方法可以用来检测激酶的活性，如生物发光，荧光和放射性标记法，而后两种方法在使用的时候，各有局限性，生物发光法因其易于操作，低背景值而且发光值的输出不受荧光复合物的干扰而被应用的越来越广泛，而大多数报 道都是直接在体系中加入酶以及其底物或是抑制剂而反应酶活，在其中加入另外的小分子还是监测其对酶活是否有影响还没有报道。本发明实验结果表明，TSN可以对DCK起到一定的激活作用，而且TSN的加入量与DCK的活性增加程度具有正相关性(TSN浓度由12. 5μΜ到100 μ M两倍倍比递增)，实验结果表明，随川楝素浓度的增加，DCK的活性分别提高到原来的106. 78%，108. 87%，113. 30%, 116. 12%，与对照组相t匕，均有显著性差异。有文献报道，DCK74位丝氨酸的自磷酸化可以提高其自身的活性，因此有针对该位点进行氨基酸定点突变的DCK突变体，本专利中，采用定点突变的方法，构建了 DCK的8个突变体，目的是明确TSN对DCK起到激活作用的机制。除3个已有报道(S74E，S74A，S74Q)，另外的5个均未有报道(S35E，S35A，S35Q，R128E，R128A)。其中，第35位丝氨酸和第128位精氨酸的选取是以TSN和DCK进行相互作用的分子模拟为基础的。经过鉴定，突变体均构建成功。实现成功诱导表达的突变体有7个(S35E，S35A，S35Q，S74E，S74Q，128E，R128A)，我们采用野生型DCK作为对照组，分别检测了 TSN对DCK的7个突变体的活性影响，所用方法同上。结果为，TSN对2个突变体(S74E，S74Q)仍起到激活作用，而对5个突变体(S35E，S35A，S35Q，128E，R128A)未起到激活作用。这表明，TSN对野生型DCK的激活不是通过其自磷酸化的机制进行的，而是通过使其构象变化进行的。由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点
本发明提供了川楝素在制备抗肿瘤靶向药物中的应用，揭示了人源脱氧胞苷激酶(Human Deoxycytidine kinase, dCK)作为治疗肿瘤相关疾病的药物祀标及其突变体在开发抗肿瘤靶向药物中的作用。
图I是实施例利用系列亲和色谱方法寻找与川楝素进行特异性结合的靶蛋白的SDS-PAGE 分析。图2是川楝素特异性结合蛋白水解肽段的质谱分析。图3是实施例二中野生型人源脱氧胞苷激酶的诱导表达并纯化结果的SDS-PAGE分析。图4是实施例三中检测TSN对DCK活性的影响的反应原理图。图5是实施例三中川楝素对野生型人源脱氧胞苷激酶的活性影响的检测(*Ρ〈0· 05，**Ρ〈0· 01 与对照组比较)。图6是实施例四中人源脱氧胞苷激酶的突变体诱导表达并纯化结果的SDS-PAGE分析。图7是实施例五中川楝素对突变体蛋白活性影响的检测(*P〈0. 05，#P〈0. 01与对照组比较)。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步描述
实施例一用系列亲和色谱法寻找与川楝素特异性结合的蛋白
利用川楝素与琥珀酸酐生成带有羧基的琥珀酸酯，川楝素琥珀酸酯与柱材EAH-Sepharose 4B连接，偶联率为39. 8%，偶联量为3. 22mg/ml。选取HL-60细胞进行细胞培养，细胞进行裂解，得细胞裂解液。将LH-60细胞裂解液Iml加入100 μ I亲和柱材中，混合均匀，冰浴振摇反应40min，离心，取柱材沉淀进行鉴定。上清液则再次加入IOOy I亲和柱材中，混匀，冰浴振摇反应40min，离心。依此方法连续进行3次亲和反应，3次反应所得的柱材沉淀分别加细胞裂解液缓冲液Iml,充分振摇,离心(2000rpm, lmin,4°C),弃上清,依此方法连续洗涤5次。洗涤后向沉淀中加入30 μ I SDS-PAGE上样缓冲液，95°C加热5min，充分释放结合在柱材上的蛋白，离心(IOOOOrpm, 2min),上清用于SDS-PAGE鉴定,分离胶浓度为13%。电泳后用银染方法染色，根据银染结果，找出在3个系列中浓度依次减少的蛋白条带即为特异性结合的目的蛋白。结果如图1，图中所示蛋白为与TSN进行特异性结合的目的蛋白。目的蛋白条带经胰蛋白水解酶水解，利用高效液相色谱方法进行分离，对目的蛋白水解的多肽片段进行MALDI-T0F结构鉴定，鉴定此结合蛋白为DCK。结果如图2.
实施例二 人源重组脱氧胞苷激酶的诱导表达及纯化 将含有人源重组脱氧胞苷激酶基因的pET-28a转化进入表达宿主菌BL21，将阳性克隆挑取入含卡那霉素终浓度为50 μ g/ml的LB液体培养基中，37°C培养12 14小时，至OD6tltol值约为O. 4^0. 6时，加入IPTG至终浓度为100 μ M，继续于15°C培养12 16小时进行诱导表达。8000rpm/min离心收集菌体，用PH7. O的O. 05M的磷酸缓冲液洗涤两次。高压细胞破碎仪破碎细胞，以12000rpm/min离心25分钟，离心后取上清，即可得到人源脱氧胞苷激酶的提液。采用镍柱(Ni-NTA)亲和层析纯化法对粗酶进行分离纯化。首先用O. 05M的pH7. O的磷酸盐缓冲液(lysis buffer)平衡镍柱，再将离心后的上清液与镍柱柱材充分混匀吸附，采取含不同浓度咪唑梯度洗脱的方法，洗脱梯度如下1)含IOOmM NaCl的O. 05M的磷酸盐缓冲液(wash buffer)洗脱未吸附蛋白。2)分别含不同浓度咪唑(10Mm，50Mm，lOOMm，200mM，500Mm)的(λ 05Μ的磷酸盐缓冲液(elution buffer)梯度洗脱目的蛋白。3)再次用(λ 05M的ρΗ7· O的磷酸盐缓冲液(lysis buffer)平衡镍柱,备用。用垂直电泳仪进行SDS-PAGE检测蛋白样品。取20 μ L蛋白样品，加入5 μ L蛋白上样上缓冲液进行处理，上样缓冲液为IOyL,标准分子量的蛋白质购于美国Sigma公司。SDS-PAGE的胶浓度为12%，先用85V电压进行浓缩电泳，再用130V电压进行分离电泳。结果表明，人源脱氧胞苷激酶的的表达为可溶性表达，单亚基大小在33kD左右。参见图3，人源脱氧胞苷激酶纯化结果的SDS-PAGE分析。泳道I为200 mM咪唑洗脱流出液，泳道2为不同分子量的蛋白质标准品，泳道3为100 mM咪唑洗脱流出液，泳道4为50 mM咪唑洗脱流出液，泳道5为列细胞裂解液上清。实施例三TSN对DCK活性影响的检测
米用 Kinase-Glo Plus Luminescent Kinase Assay 法检测 TSN 对 DCK 活性的影响。反应原理参见图4所示。通过激酶和底物反应，均质荧光素酶检测的方法。荧光素酶反应中需要ATP的参力口，激酶的磷酸化也需要消耗ATP，反应结束后，检测发光信号，发光信号与体系中剩余的ATP成正比，与激酶活性成反比。反应体系为100 μ L，分别加入终浓度为IOOnM的纯酶、I μ M的ATP和5μΜ的dC, TSN以不同的终浓度(O μ M，12. 5 μ M，25 μ M，50 μ M和100 μ Μ)加入至反应体系中，以 buffer(50mM Tris_HCl，5mM MgCl,0. 5mM DTT，pH 7. 5)补足至 50 μ L，反应30分钟，加入等体积(50 μ L)的Kinase-Glo试剂，充分混匀，室温静置10分钟。利用多功能酶标仪检测发光信号。实验结果如图5显示，TSN对DCK能够起到激活作用，且随着浓度的增加，DCK 活性的增加也愈显著(100%, 106. 78%, 108. 87%, 113. 30%, 116. 12%)。实施例四DCK突变体的构建与表达纯化
利用重叠PCR (overlap extention PCR，0E-PCR)的原理，通过两步PCR反应，获得含有突变位点的人源脱氧胞苷激酶基因。首先，根据DCK的基因序列设计一对上下游引物，再根据突变位点针对每一个突变体设计一对突变引物，设计引物使用的酶切位点为NdeI和EcoRI。第一步反应，以含有DCK 基因的pET-28a为模板进行PCR扩增，将扩增得到的基因片段回收，再以回收到的片段为模板进行PCR扩增，得到目的片段。用NdeI和EcoRI分别将得到的目的基因和pET-28a质粒进行酶切，酶切产物用T4 DNA连接酶进行连接，将连接产物转化到大肠杆菌BL21(DE3)的感受态细胞中，涂布于含有50 μ g/ml的卡那霉素培养皿中，37°C过夜培养。突变得到的单克隆经过测序，比对，突变体蛋白的氨基酸序列与野生型相比均包含所需突变位点。采用实施例二中的方法对突变体蛋白进行诱导表达和纯化。结果显示，除突变体S74A外，其它的7个突变体均实现成功表达纯化。结果如图6显示，泳道1-5分别为突变体蛋白S35E，S35A，S35Q，S74A，S74E，泳道6为不同分子量的蛋白标准品，泳道7-10分别为突变体蛋白S74Q, R128E, R128A, R128Q。实施例五TSN对突变体蛋白活性影响的检测
采用与实施例三中同样的方法，检测TSN对突变体蛋白活性的影响，结果如图7显示，TSN对74位丝氨酸突变的突变蛋白仍然起到激活作用，而对35位丝氨酸和128为精氨酸突变的突变体蛋白未起到激活作用。
权利要求
1.川楝素在制备抗肿瘤靶向药物中的应用。
2.根据权利要求I所述的应用，其特征在于以人源脱氧胞苷激酶作为药物靶标。
全文摘要
本发明公开了川楝素在制备抗肿瘤靶向药物中的用途。揭示了人源脱氧胞苷激酶(HumanDeoxycytidinekinase，dCK)作为治疗肿瘤相关疾病的药物靶标及其突变体在开发抗肿瘤靶向药物中的作用。
文档编号A61K31/58GK102631353SQ20121012588
公开日2012年8月15日 申请日期2012年4月26日 优先权日2012年4月26日
发明者刘楠, 陈依军, 鞠建明, 齐智超 申请人:中国药科大学