CXCL‑10抑制剂在制备治疗和/或预防肺损伤的药物中的用途的制作方法与工艺

CXCL-10抑制剂在制备治疗和/或预防肺损伤的药物中的用途技术领域本发明涉及CXCL-10抑制剂在制备治疗和/或预防哺乳动物包括人肺损伤的药物中的用途。

背景技术：
CXCL-10（C–X-Cmotifchemokine10，CXC趋化因子10，GeneID:3627;Nucleotide:NM_001565.2;Protein:NP_001556.2）是一种重要的细胞趋化因子，又名干扰素γ诱导的蛋白10kDa（Interferonγ-inducedprotein10kDa，缩写为IP10）（术语CXCL-10和IP10在本发明中无差别的使用），微生物(如SARS冠状病毒、流感病毒等)均可诱导肺泡巨噬细胞、中性粒细胞和支气管上皮细胞等表达CXCL-10。微生物同时还可以诱导NK细胞、中性粒细胞和单核巨噬细胞表面的CXCR3的表达量上调，而CXCL-10与其受体CXCR3的结合会产生强烈的趋化性，将这些细胞招募到肺部感染部位，杀伤被感染的细胞，防止病毒扩散，同时合成和释放IFN-γ、TNF-α、GM-CSF等，活化和募集更多的炎症细胞，产生更多的促炎因子和炎性介质，介导肺部的炎症反应。所以，微生物诱导的CXCL-10的长期表达是感染诱导病理免疫的重要介质。FabioMarra等人证明PI3K-Akt-p38信号通路在CXCL-10诱导的星形细胞的趋化作用中发挥重要作用。SARS冠状病毒感染患者的血浆CXCL-10浓度在病人开始出现发热症状后的一个星期内会明显升高，而CXCL-10浓度的升高也与病人不良的预后密切相关；在哮喘的小鼠模型中，在其肺部过表达CXCL-10会导致呼吸道中嗜酸性粒细胞数目的增加，IL-4的含量升高，CD8+T细胞的招募增多，炎症加重；CXCR3在哮喘病人呼吸道平滑肌当中的肺肥大细胞表面是表达最丰富的趋化因子受体，而这些病人的支气管平滑肌细胞中CXCL-10的表达量也明显上调，从而招募肥大细胞到达肺部。急性肺损伤(acutelunginjury，ALI)是各种直接和间接致伤因素导致的肺泡上皮细胞及毛细血管内皮细胞损伤，造成弥漫性肺间质及肺泡水肿，导致急性低氧性呼吸功能不全。急性肺损伤以肺容积减少、肺顺应性降低、通气/血流比例失调为病理生理特征，临床上表现为进行性低氧血症和呼吸窘迫，肺部影像学上表现为非均一性的渗出性病变，其发展至严重阶段（氧合指数<200）被称为急性呼吸窘迫综合征。常见的导致急性肺损伤的因素分直接和间接肺损伤因素，直接肺损伤因素包括例如病毒、细菌和真菌导致的严重的肺部感染、胃内容物误吸、肺挫伤、氧中毒等；间接肺损伤因素包括例如脓毒症、休克、大量输血、体外循环及弥漫性血管内凝血等。肺损伤在临床上的表现为：（1）急性起病，在直接或间接肺损伤后12---48小时内发病；（2）常规吸氧后低氧血症难以纠正；（3）肺部体征无特异性，急性期双肺可闻及湿罗音或呼吸音减低；（4）早期病变以间质性为主，X线胸片常无明显改变，病情进展后可出肺内实变，表现为双肺野普遍密度增高，透亮度减低，肺纹理增多+增粗，可见散在斑片状密度增高阴影；（5）弥漫性肺浸润影，无心功能不全证据。肺损伤的临床诊断标准为：（1）急性起病；（2）氧合指数（PaO2/FiO2）≤200mmHg（（1mmHg=0.133kPa，不管呼气末正压（PEEP）水平）；（3）正位X线胸片显示双肺均有斑片状阴影；（4）肺动脉嵌顿压≤18mmHg，或无左心房压力增高的临床证据，如（PaO2/FiO2≤300mmHg且满足上述其他标准，可诊断急性肺损伤。流感是一种影响人群极其广泛的常见病、多发病，目前流感病毒跨物种感染形势严峻，甲型H1N1流感病毒感染所导致的临床症状，多数患者较轻，表现为典型的流感样症状，可自然恢复。最常见症状包括咳嗽、发热、咽喉痛、头痛及其他不适感。严重肺炎患者x线胸片可见多发性病灶浸润，可快速进展为ARDS、肾或多器官功能衰竭。甲型流感合并ARDS的发生率是普通流感的100倍，肺部损坏主要来源于失控的全身免疫反应。与继发于病毒性肺炎的ARDS一致，包括弥漫性肺泡损伤、细支气管和血管周围淋巴细胞浸润、增生的气道改变和梗阻性细支气管炎。临床和病理学检查均提示重症患者病变主要在呼吸系统。病理学检查可见重症患者的肺部出现实变，常伴有出血、渗出、脓肿等病理改变。肺泡腔内可见浆液性或纤维素性渗出，伴有不同程度的透明膜形成，提示有弥漫性的肺组织损伤。目前认为，甲型H1N1流感病毒所致肺组织损伤基本病变和其他类型的流感、SARS和人禽流感重症病例的肺基本病变相似，均为轻重不等的弥漫性肺组织损伤。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是一种水溶性的糖基化的脂质复合物，是革兰氏阴性菌外膜中的重要成分，由脂质A、核心多糖和O抗原三部分组成。其中，革兰氏阴性菌包括但不限于螺菌属、弯菌属、螺杆菌属，假单胞菌属、军团菌属、奈瑟菌属、莫拉菌属产碱杆菌属、布鲁斯菌属、罗卡利马体属、鲍特菌属、弗郎西斯菌属，埃希菌属、志贺菌属、沙门菌属、克雷伯菌属变形杆菌属、普罗威登斯菌属、耶尔森菌属、弧菌属、巴氏杆菌属、嗜血杆菌属，类杆菌属、梭杆菌属，韦荣球菌属，立克次体属、考克斯体属、衣原体属，密螺旋体属、疏螺旋体属、钩端螺旋体属等革兰氏阴性细菌。脂多糖分子量大于10000道尔顿，结构复杂，脂质A（LipidA）为构成内毒素活性的糖脂，以共价键连接到杂多糖链。人体对细菌内毒素极为敏感，极微量（1-5纳克/公斤体重）内毒素就能引起体温上升，发热反应持续约4小时后逐渐消退。自然感染时，因革兰氏阴性菌不断生长繁殖，同时伴有陆续死亡、释出内毒素，故发热反应将持续至体内病原菌完全消灭为止。内毒素引起发热反应的原因是内毒素作用于体内的巨噬细胞等，使之产生白细胞介素1、白细胞介素6和肿瘤坏死因子α等细胞因子，这些细胞因子作用于宿主下丘脑的体温调节中枢，促使体温升高发热。内毒素血症临床症状主要取决于宿主对内毒素的抵抗力，症状和体征有：发热、白细胞数变化、出血倾向、心力衰竭、肾功能减退、肝脏损伤、神经系统症状以及休克等。内毒素可引起组胺、5-羟色胺、前列腺素、激肽等的释放，导致微循环扩张，静脉回流血量减少，血压下降，组织灌流不足，缺氧及酸中毒等。真菌也同样可以感染肺组织并导致肺损伤，其主要表现为肺和支气管的真菌性炎症或相关病变，也可包括胸膜甚至纵膈。致病性真菌属原发性病原菌，常导致免疫功能正常者的原发性外源性感染，主要有组织胞浆菌、球孢子菌、副球孢子菌、孢子丝菌等。条件致病性真菌或称机会性真菌，其病原性弱，多在易感宿主引起深部真菌感染，如念珠菌属、曲霉属、隐球菌属、毛霉和青霉属、根霉属、镰刀霉属及肺孢子菌等。酵母多糖（zymosan）是从酵母细胞壁提取的大分子多糖复合物，由蛋白质和碳水化合物组成。酵母属于真菌，本发明中所述真菌包括但不限于子囊菌、担子菌、壶菌、球囊菌、结核菌等。酵母多糖在实验中可用来诱导炎症发生，其诱导的反应主要包括炎症细胞因子的表达，花生四烯酸的上调，部分蛋白的磷酸化和肌醇磷脂的形成。同时，酵母多糖还可以上调细胞周期蛋白D2的表达量，表明其在巨噬细胞活化和增殖的过程中也起到了作用。脂多糖和酵母多糖联合感染可以模拟体内由于败血症引起的急性肺损伤。败血症（septicemia）系指致病菌或条件致病菌侵入血循环，并在血中生长繁殖，产生毒素而发生的急性全身性感染。败血症为急性肺损伤的易发因素之一，败血症性肺损伤的一个特征就是多形核中性粒细胞(PMN)在肺微血管内的聚集和激活，引起一系列炎症反应过程和血管损伤。在这一过程中细菌感染，尤其是革兰氏阴性菌感染可能是最初炎症反应的关键因素。革兰氏阴性菌和脂多糖(LPS)进入循环后产生脂多糖结合蛋白(LBP)，LBP与LPS的磷脂-A一部分结合，血浆中LPS-LBP复合物与单核细胞、巨噬细胞和主要的中性粒细胞上的CD14受体结合，促使特定的炎性因子(如TNF-a、IL-1、IL-6）的编码基因翻译。细胞因子分泌到循环中是导致败血症和肺损伤的一系列炎症反应过程中重要的生化特征，如IL-1、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12等，这些细胞因子引起一系列的级联反应，参与肺损伤的过程。因此，使用脂多糖和酵母多糖联合感染可以模拟败血症性肺损伤。1975年Kohler和Milstein首先报道，用细胞杂交技术，使经绵羊红细胞(SRBC)免疫的小鼠的脾细胞与小鼠的骨髓瘤细胞融合，并由此创建了第一个B细胞杂交瘤细胞株，获得了抗SRBC的单克隆抗体。单克隆抗体的特点在于理化性状高度均一、生物活性单一、与抗原结合的特异性强、便于人为处理和质量控制，并且来源容易。这些优点使它一问世就受到高度重视，并广泛应用于生物学和医学研究领域。可将药物等与单克隆抗体直接交联，利用其导向作用，使药物等定位于特异治疗靶位，这不仅提高了疗效，还可降低对正常细胞的毒性反应。RNAi(RNAinterference)即RNA干涉，是近年来发现的在生物体内普遍存在的一种古老的生物学现象，是由双链RNA（dsRNA）介导的、由特定酶参与的特异性基因沉默现象，它在转录水平、转录后水平和翻译水平上阻断基因的表达。SmallinterferingRNA(siRNA，小干扰RNA)是一种小RNA分子（~21-25核苷酸），由Dicer（RNAaseⅢ家族中对双链RNA具有特异性的酶）加工而成。siRNA是siRISC的主要成员，激发与之互补的目标mRNA的沉默。RNA干涉（RNAi）在实验室中是一种强大的实验工具，利用具有同源性的双链RNA（dsRNA）诱导序列特异的目标基因的沉寂，迅速阻断基因活性。siRNA在RNA沉寂通道中起中心作用，是对特定信使RNA（mRNA）进行降解的指导要素。siRNA是RNAi途径中的中间产物，是RNAi发挥效应所必需的因子。RNAi最大以及最终的效果是细胞的代谢过程、生理生化系数等表型参数发生明显的变化。近来RNAi成功用于构建转基因动物模型的报道也日益增多，标志着RNAi将成为研究基因功能不可或缺的工具。不仅如此，RNAi技术还将可能成为研究细胞信号传导通路与基因治疗的新途径。虽然截至目前已经具有肺损伤特别是流感导致的肺损伤的治疗药物，但仍然存在对新类型的肺损伤特别是流感导致的肺损伤的治疗药物的需求。

技术实现要素：
因此，本发明的技术目的在于探究CXCL-10在肺损伤发生发展中的作用并探究CXCL-10的抑制剂在制备预防和/或治疗肺损伤的药物中的用途。因此，本发明的第一方面提供一种CXCL-10的抑制剂在制备治疗和/或预防哺乳动物包括人肺损伤的药物中的用途，其中CXCL-10为CXCL-10蛋白或其核苷酸编码序列，优选地，所述哺乳动物包括人肺损伤由流感病毒感染、细菌感染和/或真菌感染、败血症导致，优选地，所述哺乳动物包括人肺损伤包括、肺水肿、急性肺损伤和严重呼吸系统窘迫综合症。优选地，所述流感病毒为甲型流感病毒；所述细菌为革兰氏阴性菌；所述真菌选自酵母菌。优选地，所述流感病毒为甲型H1、H3、H5、H7或H9亚型毒株。更优选地，所述流感病毒为甲型H1亚型毒株。更优选地，所述流感病毒为甲型H1N1流感病毒。最优选地，所述流感病毒为甲型H1N1流感病毒BJ501株或PR8株。优选地，所述细菌选自螺菌属、弯菌属、螺杆菌属，假单胞菌属、军团菌属、奈瑟菌属、莫拉菌属产碱杆菌属、布鲁斯菌属、罗卡利马体属、鲍特菌属、弗郎西斯菌属，埃希菌属、志贺菌属、沙门菌属、克雷伯菌属变形杆菌属、普罗威登斯菌属、耶尔森菌属、弧菌属、巴氏杆菌属、嗜血杆菌属，类杆菌属、梭杆菌属，韦荣球菌属，立克次体属、考克斯体属、衣原体属，密螺旋体属、疏螺旋体属、钩端螺旋体属等革兰氏阴性细菌的一种或多种。更优选地，所述细菌选自大肠埃希氏菌。最优选地，所述细菌选自大肠杆菌O111：B4。优选地，所述真菌为酿酒酵母。优选地，所述CXCL-10来源于哺乳动物包括人。更优选地，所述CXCL-10的GeneBank编号为GeneID:3627，核苷酸编码序列如NM_001565.2所示，蛋白质编码序列如NP_001556.2所示。优选地，所述CXCL-10的抑制剂选自特异性抗CXCL-10的抗体、siRNA或特异性抑制哺乳动物包括人CXCL-10表达的化学生物物质。优选地，所述特异性抗CXCL-10的抗体选自特异性抗CXCL-10的多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、表面重塑抗体、重构抗体、全人源抗体或其抗原结合部分。更优选地，所述特异性抗CXCL-10的抗体为特异性抗CXCL-10的单克隆抗体。优选地，所述CXCL-10的抑制剂选自siRNA。更优选地，所述siRNA的正义序列如SEQ.ID.NO.1:gauggccuucgauucuggaUU所示，反义序列如SEQ.ID.NO.2:UUguccagaaucgaaggccauc所示。优选地，所述药物的剂型为注射剂、喷雾剂、滴鼻剂、吸入剂、口服剂。本发明的第二方面涉及一种CXCL-10的抑制剂，其用做治疗和/或预防哺乳动物包括人肺损伤的药物，其中CXCL-10为CXCL-10蛋白或其核苷酸编码序列。优选地，所述哺乳动物包括人肺损伤由流感病毒感染、细菌感染和/或真菌感染、败血症导致。优选地，所述流感病毒、细菌、真菌、所述CXCL-10或所述CXCL-10的抑制剂如本发明第一方面所述。本发明的第三方面涉及一种含有治疗有效量的CXCL-10的抑制剂的组合物在制备治疗和/或预防哺乳动物包括人肺损伤的药物中的用途，其中CXCL-10的抑制剂是所述组合物的活性成分，其中CXCL-10为CXCL-10蛋白或其核苷酸编码序列。优选地，所述哺乳动物包括人肺损伤由流感病毒感染、细菌感染和/或真菌感染、败血症导致。优选地，所述流感病毒、细菌、真菌、所述CXCL-10或所述CXCL-10的抑制剂如本发明第一方面所述。本发明的第四方面涉及一种治疗和/或预防哺乳动物包括人肺损伤的方法，其包括给予哺乳动物包括人治疗有效量的CXCL-10的抑制剂，其中CXCL-10为CXCL-10蛋白或其核苷酸编码序列。优选地，所述哺乳动物包括人肺损伤由流感病毒感染、细菌感染和/或真菌感染、败血症导致。优选地，所述流感病毒、细菌、真菌、所述CXCL-10或所述CXCL-10的抑制剂如本发明第一方面所述。换言之，本发明利用CXCL-10基因敲除小鼠和CXCL-10下游的PI3K基因敲除小鼠模型以及利用甲型H1N1流感病毒感染小鼠证明CXCL-10在甲型H1N1流感病毒BJ501株或PR8株感染导致的小鼠急性肺组织病理损伤、死亡的过程中发挥重要作用，针对CXCL-10分子的干预在治疗肺损伤，特别是甲型H1N1流感病毒PR8株感染所导致的损伤中，有可能发挥重要作用。本发明利用特异性抗CXCL-10的单克隆抗体免疫野生型小鼠后再用甲型H1N1流感病毒感染所述小鼠，结果表明，抗CXCL-10抗体对小鼠在感染甲型H1N1流感病毒PR8株导致的急性肺组织病理损伤中发挥了重要保护作用。因此，本发明第一次证明了CXCL-10在甲型流感病理过程中发挥重要作用且特异性抑制CXCL-10的治疗可以阻止或减缓甲型流感病毒感染所造成的严重后果。本发明还利用革兰氏阴性菌的脂多糖和来自酵母菌的酵母多糖A联合感染小鼠，发现针对CXCL-10分子的干预在治疗来自革兰氏阴性菌的脂多糖和来自酿酒酵母的酵母多糖A联合感染所导致的损伤中有可能发挥重要作用。本发明利用特异性抗CXCL-10的单克隆抗体免疫野生型小鼠后再用来自大肠杆菌O111：B4的脂多糖和来自酿酒酵母的酵母多糖A联合感染所述小鼠，结果表明，抗CXCL-10抗体对小鼠在感染来自大肠杆菌O111：B4的脂多糖和来自酿酒酵母的酵母多糖A的组合物导致的急性肺组织病理损伤中发挥了重要保护作用。因此，本发明第一次证明了特异性抑制CXCL-10的治疗可以阻止或减缓由来自大肠杆菌O111：B4的脂多糖和来自酿酒酵母的酵母多糖A联合感染所造成的严重后果。同时，本领域技术人员熟知，当证实CXCL-10在流感病毒感染导致的病理损伤、死亡等过程中发挥重要的促进作用时，尤其是在用特异性抗CXCL-10的抗体中和掉受试者体内的CXCL-10能保护受治者时，针对CXCL-10以消除或降低其影响的其他技术手段也能起到相同或类似的作用。本领域技术人员熟知，这样的技术手段包括其他的特异性中和CXCL-10的抗体、特异性沉默CXCL-10表达的RNAi技术和本领域已知的其他能降低或消除CXCL-10表达的化学和/或生物物质。特异性中和CXCL-10的抗体可以是利用CXCL-10免疫哺乳动物后获得的多克隆抗体、利用杂交瘤技术获得的单克隆抗体、嵌合抗体、表面重塑抗体、重构抗体、全人源抗体或其抗原结合部分，只要这样的抗体或其部分保留了抗原结合能力并能中和所述抗原的活性。针对特定靶基因的siRNA的设计是本领域技术人员已知的操作，这样的序列可能在长度和针对的靶序列的位置上各不相同，但必然能沉默掉CXCL-10基因的表达，这样的siRNA的一个范例是正义序列如SEQ.ID.NO.1:gauggccuucgauucuggaUU所示，反义序列如SEQ.ID.NO.2:UUguccagaaucgaaggccauc所示的siRNA。同时，本领域技术人员也能利用本领域已知的能降低或沉默CXCL-10表达的其他化学物质或利用本领域已知的技术筛选到的能降低或沉默CXCL-10表达的其他化学物质来降低或沉默CXCL-10的表达，从而实现治疗肺损伤，特别是甲流，更特别是甲型H1N1流感的目的。同样地，包含治疗有效量的本发明所述的CXCL-10抑制剂的组合物也能用于治疗甲流，特别是甲型H1N1流感。所述组合物的活性成分是CXCL-10抑制剂，同时也可以包括其他的可以与所述的CXCL-10抑制剂起协同作用的活性成分。本发明的组合物还可以包括防腐剂、稳定剂、缓冲剂等药用物质。附图说明图1：C57BL/6小鼠分别感染病毒滴度为105.5TCID50的甲型H1N1流感病毒BJ501株和相同剂量的鸡胚尿囊液后的CXCL-10蛋白在肺组织中的表达量。图2：野生型C57BL/6小鼠（A图）和CXCL-10基因敲除小鼠（B图）感染TCID50为105.5的甲型H1N1流感病毒BJ501株后小鼠肺组织的组织病理检测结果。图3：野生型C57BL/6小鼠和CXCL-10基因敲除小鼠感染TCID50为105.5的甲型H1N1流感病毒BJ501株后小鼠肺组织的湿干比检测结果。图4：野生型C57BL/6小鼠和CXCL-10基因敲除小鼠感染TCID50为1.33×104的甲型H1N1流感病毒PR8株后小鼠的死亡率曲线。图5：野生型C57BL/6小鼠和CXCL-10基因敲除小鼠感染TCID50为1.33×104的甲型H1N1流感病毒PR8株后小鼠的体重变化曲线。图6：野生型C57BL/6小鼠（A图）和CXCL-10基因敲除小鼠（B图）感染TCID50为1.33×104的甲型H1N1流感病毒PR8株后小鼠肺组织的组织病理检测结果。图7：野生型C57BL/6小鼠和CXCL-10基因敲除小鼠感染TCID50为1.33×104的甲型H1N1流感病毒PR8株后小鼠肺组织的湿干比检测结果。图8：野生型C57BL/6小鼠和PI3K基因敲除小鼠感染TCID50为1.33×104的甲型H1N1流感病毒PR8株后小鼠的死亡率曲线。图9：野生型C57BL/6小鼠和PI3K基因敲除小鼠感染TCID50为1.33×104的甲型H1N1流感病毒PR8株后小鼠的体重变化曲线。图10：野生型C57BL/6小鼠和PI3K基因敲除小鼠感染TCID50为1.33×104的甲型H1N1流感病毒PR8株后小鼠肺组织的湿干比检测结果。图11：野生型C57BL/6小鼠经静脉注射PBS、抗体对照或抗CXCL-10单克隆抗体后，感染病毒滴度为1.33×104TCID50的甲型H1N1流感病毒PR8株后的死亡率曲线。图12：野生型C57BL/6小鼠在静脉注射了鸡胚尿囊液、PBS、抗体对照、抗CXCL-10单克隆抗体后，感染甲型H1N1流感病毒PR8株后小鼠肺组织的湿干比测定结果。图13A-D：野生型C57BL/6小鼠感染滴度为1.33×104TCID50的甲型H1N1流感病毒PR8株后，静脉注射鸡胚尿囊液、PBS、抗体对照和抗CXCL-10单克隆抗体后小鼠的肺组织病理检测结果。图14A-E：野生型C57BL/6小鼠感染来自大肠杆菌O111：B4的脂多糖并于1小时后再次感染来自酿酒酵母的酵母多糖A或相同时间点给予溶剂对照后，分别在感染前12小时，感染前1小时，感染后8小时静脉给予抗CXCL-10抗体或对照抗体。在感染第24小时后，取小鼠肺组织进行肺组织病理检测。每组4只小鼠。具体实施方式下面将通过下述非限制性实施例进一步说明本发明，本领域技术人员公知，在不背离本发明精神的情况下，可以对本发明做出许多修改，这样的修改也落入本发明的范围。下述实验方法如无特别说明，均为常规方法，所使用的实验材料如无特别说明，均可容易地从商业公司获取。实施例实施例1甲型H1N1流感病毒BJ501株感染引起小鼠肺组织CXCL-10蛋白表达升高实验材料：1)主要实验仪器：三级生物安全实验室、三级生物安全柜、动物饲养柜、小鼠饲养笼、小动物手术器械、无菌注射器、移液器、移液管、Bio-PlexMouseCytokine23-PlexArray试剂盒等。2)主要实验试剂：1%（W/V）戊巴比妥钠溶液、病毒稀释液、消毒剂（2.5%碘酒和75%酒精）等。3)病毒：甲型H1N1流感病毒BJ501株http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?mode=Info&id=648856&lvl=3&keep=1&srchmode=1&unlock&lin=s。4)实验动物：SPF级野生型(WT)C57BL/6小鼠（4周龄）：购于军科院动物所，CXCL-10基因敲除小鼠（B6背景，购自美国JacksonLaboratory，货号是006087）。实验方法：1)分组：鸡胚尿囊液对照组、BJ501病毒实验组；2)安全固定小鼠，用1mL无菌注射器腹腔注射1%（W/V）戊巴比妥钠溶液麻醉；3)保持麻醉小鼠头部向上向后倾斜姿势，使其鼻腔向上，便于病毒稳定进入呼吸道。用移液管每侧鼻孔各滴入10μL甲型H1N1流感病毒BJ501株病毒液（滴度为105TCID50）感染，感染病毒滴度为105.5TCID50/只，每组感染4只小鼠；4)保持小鼠此体位15秒，使病毒进入呼吸道。将小鼠置于鼠笼内，待其恢复清醒后，给予水及食物；5)肺灌洗液炎症因子测定实验于染病毒后24小时后进行，用腹腔注射过量麻醉剂的方法使小鼠死亡；6)将小鼠固定于小动物手术台，移除胸部皮肤及骨骼，将气管剪一小口，利用1毫升移液枪从开口处向小鼠注射800微升PBS缓冲液，反复吸取三次后将肺灌洗液吸出；7)利用Bio-PlexMouseCytokine23-Plex试剂盒对肺灌洗液进行CXCL-10蛋白表达量的测定；8)利用GraphPadPrism5软件对数据进行分析处理。实验结果：如图1所示，感染滴度为105.5TCID50/只的BJ501株甲型H1N1流感病毒的小鼠肺组织CXCL-10蛋白的表达量显著高于对照组。*P<0.05。此结果说明，CXCL-10在甲型H1N1流感病毒BJ501株感染导致小鼠死亡的过程中发挥重要作用，针对CXCL-10分子的干预在治疗甲型H1N1流感病毒BJ501株感染所导致的损伤中，有可能发挥重要作用。实施例2CXCL-10-缺陷小鼠中甲型H1N1流感病毒BJ501株感染引起的急性肺损伤得以减轻实验材料：1)主要实验仪器：三级生物安全实验室、三级生物安全柜、动物饲养柜、小鼠饲养笼、小动物手术器械、无菌注射器、移液器、移液管等。2)主要实验试剂：1%（W/V）戊巴比妥钠溶液、病毒稀释液、消毒剂（2.5%碘酒和75%酒精）等。3)病毒：甲型H1N1流感病毒BJ501株http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?mode=Info&id=648856&lvl=3&keep=1&srchmode=1&unlock&lin=s。4)实验动物：SPF级野生型(WT)C57BL/6小鼠（4周龄）：购于军科院动物所，CXCL-10基因敲除小鼠（B6背景，购自美国JacksonLaboratory，货号是006087）。实验方法：1)分组：野生型对照组、CXCL-10基因敲出小鼠实验组；2)安全固定小鼠，用1mL无菌注射器腹腔注射1%（W/V）戊巴比妥钠溶液麻醉；3)保持麻醉小鼠头部向上向后倾斜姿势，使其鼻腔向上，便于病毒稳定进入呼吸道。用移液管每侧鼻孔各滴入10μL甲型H1N1流感病毒BJ501株病毒液（滴度为105TCID50）感染，感染病毒滴度为105.5TCID50/只，每组感染10只小鼠；4)保持小鼠此体位15秒，使病毒进入呼吸道。将小鼠置于鼠笼内，待其恢复清醒后，给予水及食物；5)肺组织病理切片实验于感染病毒后第5d进行，用腹腔注射过量麻醉剂的方法使小鼠死亡；6)将小鼠固定于小动物手术台，移除胸部皮肤及骨骼，暴露胸腔，将小鼠肺脏连同心脏同时取出，用无菌PBS洗去表面血液，置于多聚甲醛固定液中室温固定48h；7)固定后的样品由病理实验室进行包埋、切片、HE染色等处理；8)病理切片置于显微镜下观察，并记录；9)肺组织湿干比实验于感染病毒后第5d进行，用腹腔注射过量麻醉剂的方法使小鼠死亡；10)将小鼠固定于小动物手术台，移除胸部皮肤及骨骼，暴露胸腔，将小鼠完整肺脏取出，去除表面血液及多余结缔组织，称量并记录肺脏湿重；11)肺脏置于55℃高温组织干燥器中干烤，24h后取出，待温度降至室温进行肺脏干重的称量并记录；12)计算小鼠肺脏湿重/干重比值(Wet/dryratio)，进行统计分析。实验结果：图2中（×200倍，HE染色）病理照片显示：感染滴度为105.5TCID50的甲型H1N1流感病毒BJ501株后，野生型C57BL/6小鼠肺组织中出现严重的病理损伤（图2的A图）。肺组织正常结构被破坏，肺组织纹理紊乱，伴随出血、炎性渗出及大量红细胞、炎症细胞浸润等病理损伤。但是，感染相同滴度病毒的CXCL-10基因敲除小鼠肺组织未见显著病理损伤，无显著的出血、渗出或者炎症细胞浸润等病理变化，肺组织纹理清晰，结构完整（图2的B图）。上述结果说明，CXCL-10对小鼠在感染甲型H1N1流感病毒BJ501株导致的急性肺组织病理损伤中发挥了重要作用。检测小鼠肺脏湿干比可以反映小鼠发生急性肺水肿的程度。从图3中也可见，4周龄野生型小鼠在感染甲型H1N1流感病毒BJ501后，其肺脏湿干比相比CXCL-10基因敲除小鼠显著降低，说明CXCL-10的敲除可以显著缓解甲型H1N1流感病毒BJ501株感染后小鼠的肺脏水肿。*P<0.05。此结果进一步说明，CXCL-10分子在甲型H1N1流感病毒BJ501株感染导致小鼠发生急性肺组织损伤的病理过程中发挥了重要作用。实施例3CXCL-10-缺陷小鼠中甲型H1N1流感病毒PR8株感染引起的急性肺损伤得以减轻本实施例实验材料和实验方法等同实施例2基本相同，实验材料区别在于含有甲型H1N1流感病毒PR8株，不含有甲型H1N1流感病毒BJ501株，实验方法区别在于使用甲型H1N1流感病毒PR8株代替甲型H1N1流感病毒BJ501株进行感染，感染前和感染后每天都记录每组小鼠死亡/存活只数以及体重变化情况，连续观察14d，24h内发生死亡的小鼠为非特异性死亡，在进行死亡率统计时不予计算在内，用GraphPadPrism5软件统计小鼠死亡率及体重变化情况。实验结果：野生型C57BL/6小鼠和CXCL-10基因敲除小鼠感染病毒滴度为1.33×104的甲型H1N1流感病毒PR8株后的死亡率结果以及体重变化结果，如图4、图5所示。感染相同滴度的PR8株甲型H1N1流感病毒后，野生型C57BL/6小鼠死亡率明显高于CXCL-10基因敲除小鼠（图4）。*P<0.05。体重变化（降低）结果与死亡率结果一致（图5）。***P<0.001此结果说明，CXCL-10在甲型H1N1流感病毒PR8株感染导致小鼠死亡的过程中发挥重要作用，针对CXCL-10分子的干预在治疗甲型H1N1流感病毒PR8株感染所导致的损伤中，有可能发挥重要作用。图6中（×200倍，HE染色）病理照片显示：感染滴度为1.33×104TCID50的甲型H1N1流感病毒PR8株后，野生型C57BL/6小鼠肺组织中出现严重的病理损伤（图6的A图）。肺组织正常结构被破坏，肺组织纹理紊乱，伴随出血、炎性渗出及大量红细胞、炎症细胞浸润等病理损伤。但是，感染相同滴度病毒的CXCL-10基因敲除小鼠肺组织未见显著病理损伤，无显著的出血、渗出或者炎症细胞浸润等病理变化，肺组织纹理清晰，结构完整（图6的B图）。上述结果说明，CXCL-10对小鼠在感染甲型H1N1流感病毒PR8株导致的急性肺组织病理损伤中发挥了重要作用。检测小鼠肺脏湿干比可以反映小鼠发生急性肺水肿的程度。从图7中也可见，4周龄野生型小鼠在感染甲型H1N1流感病毒PR8后，其肺脏湿干比相比CXCL-10基因敲除小鼠显著降低，说明CXCL-10的敲除可以极显著缓解甲型H1N1流感病毒PR8株感染后小鼠的肺脏水肿。***P<0.001。此结果进一步说明，CXCL-10分子在甲型H1N1流感病毒PR8株感染导致小鼠发生急性肺组织损伤的病理过程中发挥了重要作用。实施例4PI3K-缺陷小鼠中甲型H1N1流感病毒PR8株感染引起的急性肺损伤得以减轻本实施例实验材料和实验方法等同实施例3基本相同，实验材料区别在于含有PI3K-缺陷小鼠（获自奥地利科学院分子生物技术研究所（InstituteofMolecularBiotechnologyoftheAustrianAcademyofSciences）），不含有CXCL-10-缺陷小鼠，实验方法区别在于使用甲型H1N1流感病毒PR8株感染PI3K-缺陷小鼠。野生型C57BL/6小鼠和PI3K基因敲除小鼠感染病毒滴度为1.33×104的甲型H1N1流感病毒PR8株后的死亡率结果以及体重变化结果，如图8、图9所示。感染相同滴度的PR8株甲型H1N1流感病毒后，野生型C57BL/6小鼠死亡率明显高于PI3K基因敲除小鼠（图8）。**P<0.01。体重变化（降低）结果与死亡率结果一致（图9）。***P<0.001。此结果说明，PI3K在甲型H1N1流感病毒PR8株感染导致小鼠死亡的过程中发挥重要作用。检测小鼠肺脏湿干比可以反映小鼠发生急性肺水肿的程度。从图10中也可见，4周龄野生型小鼠在感染甲型H1N1流感病毒PR8后，其肺脏湿干比相比PI3K基因敲除小鼠显著降低，说明PI3K的敲除可以显著缓解甲型H1N1流感病毒PR8株感染后小鼠的肺脏水肿。*P<0.05。PI3K-Akt-p38通路已被证实位于CXCL-10下游，在CXCL-10诱导的趋化性中发挥重要作用，此结果进一步证明CXCL-10分子在甲型H1N1流感病毒PR8株感染导致小鼠发生急性肺组织损伤的病理过程中发挥了重要作用。实施例5抗CXCL-10单克隆抗体可以使甲型H1N1流感病毒PR8株感染引起的急性肺损伤得以减轻实验材料：1)主要实验仪器：三级生物安全实验室、三级生物安全柜、动物饲养柜、小鼠饲养笼、小动物手术器械、无菌注射器、移液器、移液管等。2)主要实验试剂：1%（W/V）戊巴比妥钠溶液、病毒稀释液、消毒剂（2.5%碘酒和75%酒精）等。3)实验动物：SPF级野生型(WT)C57BL/6小鼠（4周龄）：购于军科院动物所。实验方法：1)分组：病毒溶剂（鸡胚尿囊液）对照组、抗体溶剂（PBS）对照组、同型抗体对照组和抗CXCL-10单克隆抗体治疗组；2)感染前1天，给抗CXCL-10单克隆抗体治疗组的小鼠静脉注射0.5mg/ml的抗CXCL-10单克隆抗体100ul，给同型抗体对照组和抗体溶剂对照组分别注射相同剂量的同型对照抗体和PBS。3)安全固定小鼠，用1mL无菌注射器腹腔注射1%（W/V）戊巴比妥钠溶液麻醉；4)保持麻醉小鼠头部向上向后倾斜姿势，使其鼻腔向上，便于病毒稳定进入呼吸道。用移液管每侧鼻孔各滴入10μL甲型H1N1流感病毒PR8株病毒液（滴度为1.33×104TCID50）感染，感染病毒滴度为1.33×104TCID50/只，每组感染10只小鼠；5)保持小鼠此体位15秒，使病毒进入呼吸道。将小鼠置于鼠笼内，待其恢复清醒后，给予水及食物；6)感染后1天和3天，各重复步骤2一次。7)感染后观察，24h内发生死亡的小鼠为非特异性死亡，在进行死亡率统计时不予计算在内；8)存活率和体重变化实验连续观察14d，每天记录每组小鼠死亡/存活只数以及体重变化情况；9)用GraphPadPrism5软件统计小鼠死亡率及体重变化情况；10)肺组织病理切片实验于感染病毒后第5d进行，用腹腔注射过量麻醉剂的方法使小鼠死亡；11)将小鼠固定于小动物手术台，移除胸部皮肤及骨骼，暴露胸腔，将小鼠肺脏连同心脏同时取出，用无菌PBS洗去表面血液，置于多聚甲醛固定液中室温固定48h；12)固定后的样品由病理实验室进行包埋、切片、HE染色等处理；13)病理切片置于显微镜下观察，并记录；14)肺组织湿干比实验于感染病毒后第5d进行，用腹腔注射过量麻醉剂的方法使小鼠死亡；15)将小鼠固定于小动物手术台，移除胸部皮肤及骨骼，暴露胸腔，将小鼠完整肺脏取出，去除表面血液及多余结缔组织，称量并记录肺脏湿重；16)肺脏置于55℃高温组织干燥器中干烤，24h后取出，待温度降至室温进行肺脏干重的称量并记录；17)计算小鼠肺脏湿重/干重比值(Wet/dryratio)，进行统计分析；实验结果：野生型C57BL/6小鼠经静脉注射PBS、抗体对照或抗CXCL-10单克隆抗体后，感染病毒滴度为1.33×104TCID50的甲型H1N1流感病毒PR8株后的死亡率结果，如图11所示。感染相同滴度的PR8株甲型H1N1流感病毒后，静脉注射PBS和静脉注射抗体对照的小鼠死亡率都明显高于静脉注射抗CXCL-10单克隆抗体的小鼠（图11）。*P<0.05。此结果说明，CXCL-10在甲型H1N1流感病毒PR8株感染导致小鼠死亡的过程中发挥重要作用，针对CXCL-10分子的干预在治疗甲型H1N1流感病毒PR8株感染所导致的损伤中，有可能发挥重要作用。检测小鼠肺脏湿干比，可以反映小鼠发生急性肺水肿的程度。从图12中可见，4周龄野生型C57BL/6小鼠在静脉注射了抗CXCL-10单克隆抗体后，感染甲型H1N1流感病毒PR8株，其肺脏湿干比相比抗体对照治疗组小鼠显著降低，说明抗CXCL-10抗体可以显著缓解甲型H1N1流感病毒PR8株感染后小鼠的肺脏水肿。*P<0.05。此结果进一步说明，CXCL-10分子在甲型H1N1流感病毒PR8株感染导致小鼠发生急性肺组织损伤的病理过程中发挥了重要作用。图13A-D中（×200倍，HE染色）病理照片显示：感染滴度为1.33×104TCID50的甲型H1N1流感病毒PR8株后，静脉注射病毒溶剂对照（鸡胚尿囊液）和静脉注射抗体溶剂（PBS）以及对照抗体的4周龄的野生型C57BL/6小鼠肺组织中出现严重的病理损伤（分别如图13A、图13B和图13C所示）。肺组织正常结构被破坏，肺组织纹理紊乱，伴随出血、炎性渗出及大量红细胞、炎症细胞浸润等病理损伤。感染相同滴度病毒静脉注射抗CXCL-10单克隆抗体的小鼠肺组织未见显著病理损伤，无显著的出血、渗出或者炎症细胞浸润等病理变化，肺组织纹理清晰，结构完整（图13D）。鸡胚尿囊液组小鼠肺组织也未见显著病理损伤。结果说明，抗CXCL-10抗体对小鼠在感染甲型H1N1流感病毒PR8株导致的急性肺组织病理损伤中发挥了重要保护作用。实施例6抗CXCL-10单克隆抗体可以缓解由来自大肠杆菌O111：B4的脂多糖和来自酿酒酵母的酵母多糖A联合感染后小鼠的肺组织病理损伤实验材料：1)主要实验仪器：SPF级动物房、SPF级生物安全柜、SPF级动物饲养柜、SPF级小鼠饲养笼、小动物手术器械、高温组织干燥器、无菌注射器、移液器、移液管等。2)主要实验试剂：抗CXCL-10单克隆抗体（AbM50009-1-PU，购自北京华大蛋白质研发中心有限公司）、抗体对照（AbM59538-10-PU，购自北京华大蛋白质研发中心有限公司）、1%（W/V）戊巴比妥钠溶液、病毒稀释液、无菌PBS、消毒剂（2.5%碘酒和75%酒精）等。3)脂多糖(LPS)：L2630，购于Sigma；酵母多糖(ZymosanA)：Z4250，购于Sigma。4)实验动物：SPF级野生型BALB/c小鼠（4周龄）：购于维通利华实验动物技术有限公司。实验方法：1)分组：脂多糖和酵母多糖溶剂空白对照组、脂多糖和酵母多糖溶剂+同型抗体对照组、脂多糖和酵母多糖溶剂+抗CXCL-10单克隆抗体组、脂多糖和酵母多糖组+同型抗体对照组、脂多糖和酵母多糖+抗CXCL-10单克隆抗体组；2)小鼠静脉注射抗体对照或抗CXCL-10单克隆抗体，每只小鼠每次静脉注射50微克，共注射3次，分别为感染前12小时，1小时和感染后8小时；3)安全固定小鼠，用1mL无菌注射器腹腔注射1%（W/V）戊巴比妥钠溶液麻醉；4)保持麻醉小鼠头部向上向后倾斜姿势，使其鼻腔向上。用酒精消毒颈部，用剪刀剪开颈部皮肤，分离气管，用注射器注入50微升含100微克脂多糖的PBS缓冲液，每组感染4只小鼠；5)保持小鼠此体位5分钟，使脂多糖进入呼吸道。将小鼠置于鼠笼内，待其恢复清醒后，给予水及食物；6)给予脂多糖1小时后，按照操作3中方法麻醉小鼠，保持麻醉小鼠头部向上向后倾斜姿势，使其鼻腔向上。用酒精消毒颈部，分离气管，用注射器注入50微升含60微克酵母多糖的PBS缓冲液，每组感染4只小鼠；7)保持小鼠此体位5分钟，使脂多糖进入呼吸道。将小鼠置于鼠笼内，待其恢复清醒后，给予水及食物；8)感染病毒后24小时，用腹腔注射过量麻醉剂的方法使小鼠死亡；9)将小鼠固定于小动物手术台，移除胸部皮肤及骨骼，暴露胸腔，将小鼠肺脏连同心脏同时取出，用无菌PBS洗去表面血液，置于甲醛固定液中室温固定48h；10)固定后的样品由病理实验室进行包埋、切片、HE染色等处理；11)病理切片置于显微镜下观察，并记录。实验结果：图14A-E中（×200倍，HE染色）病理照片显示：脂多糖和酵母多糖溶剂空白对照组、脂多糖和酵母多糖溶剂+同型抗体对照组、脂多糖和酵母多糖溶剂+抗CXCL-10单克隆抗体组的小鼠肺组织未见显著病理损伤，无显著的出血、渗出或者炎症细胞浸润等病理变化，肺组织纹理清晰，结构完整（分别如图14A、图14B和图14C所示），感染来自大肠杆菌O111：B4的脂多糖和来自酿酒酵母的酵母多糖A后，静脉注射抗体对照的4周龄的野生型C57BL/6小鼠肺组织中出现严重的病理损伤（图14D）。肺组织正常结构被破坏，肺组织纹理紊乱，伴随出血、炎性渗出及大量红细胞、炎症细胞浸润等病理损伤。感染相同滴度病毒静脉注射抗CXCL-10单克隆抗体的小鼠肺组织未见显著病理损伤，无显著的出血、渗出或者炎症细胞浸润等病理变化，肺组织纹理清晰，结构完整（图14E）。结果说明，抗CXCL-10抗体对小鼠在感染来自大肠杆菌O111：B4的脂多糖和来自酿酒酵母的酵母多糖A联合导致的急性肺组织病理损伤中发挥了重要保护作用。