专利名称：基于聚酰胺胺树状大分子载体的基因转染方法
技术领域：
本发明属高分子纳米载体靶向基因转染领域，特别是涉及ー种基于聚酰胺胺树状大分子载体的基因转染方法。
背景技术：
目前，细胞的表达调控日益受到重视，其中基因转染是实现细胞表达调控的一种重要手段。用于基因转染的载体分为病毒载体和非病毒载体。病毒载体虽然具有较高的转染效率，但因其本身存在免疫原性、高毒性 及不能大規模生产等缺点而受到限制。非病毒载体，尤其是聚酰胺胺树状大分子(PAMAM)，由于其低毒、高效、可以大規模生产等优点而日益受到重视。在特定部位(如肝组织)的表达调控中，许多基因载体由于无法靶向到特定组织，会降低细胞表达调控的效率，甚至会引起不必要的麻烦。据报道，PAMAM树状大分子经修饰后不仅可以提高转染效率还可以提高其转染特异性。[SantosJL. , Pandita D,Rodrigues J, et al., Receptor-mediated gene delivery using PAMAMdendrimers conjugated with peptides recognized by mesenchymal stem cells. MolPharmaceutics, 2010, 7，763-774.]。近年来,发展ー种具有肝癌细胞祀向功能的纳米载体，实现肝癌细胞的靶向表达调控，已成为研究的热点与难点。肝癌细胞膜表面特异性表达的去唾液酸糖蛋白受体(asialoglycoproteinreceptor, ASGPR)能够专一'丨生识别分子末端带有的半乳糖残基并与之结合。Guo R.等[buo R, Yao Y,しheng G, et al. , synthesis of glycoconjugated poly (amindoamine)dendrimers for targeting human liver cancer cells, RSC Advances, 2012，2，99—102.」报道了乳糖酸修饰的聚酰胺胺树状大分子对肝癌细胞具有很好的靶向作用。聚酰胺胺(PAMAM)树状大分子是ー种高度支化的单分散大分子，它具有良好的水溶性，在使用剂量下没有细胞毒性和免疫原性。PAMAM树状大分子表面有大量可控功能基团，可以化学连接或物理吸附ー些靶向基团、抗体或药物分子等。乳糖酸(La)是ー种含有半乳糖残基的小分子，能够修饰在纳米载体或高分子材料的表面以提高其对肝癌细胞的靶向能力。因此，将乳糖酸修饰在PAMAM树状大分子表面，有望制备ー种具有肝癌细胞靶向功能的基因载体，实现肝癌细胞的靶向表达调控。检索国内外相关文献和专利结果表明以乳糖酸修饰的聚酰胺胺树状大分子为靶向载体，用于肝癌祀向基因转染的方法，尚未见报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种基于聚酰胺胺树状大分子载体的基因转染方法，该基因转染方法具有转染条件温和，易于操作，转染效率高等优点。本发明的一种基于聚酰胺胺树状大分子载体的基因转染方法，包括(I)聚酰胺胺树状大分子(PAMAM)表面的乳糖酸修饰将乳糖酸La溶于磷酸盐缓冲液中，加入1-(3-ニ甲基氨基丙基)-3-こ基碳化ニ亚胺盐酸盐EDC和N-羟基硫代琥珀酰亚胺NHS，强磁力搅拌反应1-5小时，得到活化好的乳糖酸溶液；将第五代聚酰胺-胺树状大分子G5. NH2CSigma公司)溶于蒸馏水中，得到G5. NH2溶液，然后将上述活化好的乳糖酸溶液加入G5. NH2溶液中，室温中磁力搅拌反应1-5天；反应结束后，将反应产物透析，最后进行冷冻干燥，得到反应产物G5. NH2-La ；(2)乳糖酸修饰的聚酰胺胺树状大分子(G5. NH2-La)与质粒复合物的制备将步骤(I)得到的G5. NH2-La用无菌水稀释，得到G5. NH2-La的无菌水稀释液；用无菌水将pDNA稀释，得到pDNA的无菌水稀释液，然后将所述的G5. NH2-La的无菌水稀释液与PDNA的无菌水稀释液混合均匀，再于37°C孵育20-30分钟，得到G5. NH2-La与质粒的复合物 G5. NH2-La/pDNA ；(3)乳糖酸修饰的聚酰胺胺树状大分子质粒复合物的细胞转染 将HepG2细胞(肝癌细胞)铺于6_96孔培养板中，采用不含FBS的MEM培养基(含Earle’s混合盐、2mM谷氨酰胺、O. ImM非必须氨基酸、100U/mL青霉素、100 μ g/mL链霉素)，于37°C、5%C02 (培养箱中CO2的体积浓度)培养20-30小时，然后均匀滴加入G5. NH2-La/PDNA复合物溶液，摇匀，37°C培养2-5小时后更换为含10% (质量浓度)FBS的MEM培养基，继续培养20-30小时，即可。步骤(I)中所述的磷酸盐缓冲液的pH值为6. O。步骤(I)中所述的乳糖酸与磷酸盐缓冲液的用量比为15. 7mg :2mL。步骤(I)中所述的EDC、NHS和乳糖酸羧基的摩尔比约为5:5:1。步骤(I)中所述的G5. NH2溶液中G5. NH2的浓度为10. 4mg/mL。步骤(I)中所述的乳糖酸与G5. NH2的摩尔比为7:1 15:1。步骤(I)中所述的透析为转移至截留分子量为14000的透析袋中，在蒸馏水(2LX6,每天3次)中透析2天。步骤(2)中所述的pDNA的无菌水稀释液中pDNA的浓度为O. 02-0. 10g/L。步骤(2)中所得到的G5. NH2-La/pDNA中G5. NH2的伯氨基与pDNA骨架上磷酸基团摩尔比(N/P)为 O. 25-5:1。步骤(3)中所述的细胞转染后表达时间为24 48小时。本发明以乳糖酸修饰的端基为氨基的第5代聚酰胺胺(PAMAM)树状大分子为基因转染载体，以肝癌细胞H印G2作为靶细胞，进行基因转染。本发明通过核磁共振(NMR)对树状大分子表面基团的类型以及数量进行了表征。凝胶阻滞实验、原子力显微镜(AFM)^Ka力学粒径以及表面电势对基因转染载体与PDNA形成复合物的能力进行表征。此外，用荧光素酶标记的质粒(Luc)和绿色荧光蛋白标记的质粒(EGFP)对基因转染载体的基因转染能力进行测定。和对照的未经乳糖酸修饰的G5. NH2载体的转染效果相比，本发明制备的基因载体能够显著地提高对肝癌细胞的转染能力，因此本发明制备的具有肝癌靶向功能的聚酰胺胺树状大分子能够作为基因载体用于对肝癌细胞的靶向基因输送。核磁共振(NMR)、凝胶阻滞实验、原子力显微镜(AFM)、水动力学粒径与表面电势、荧光素酶基因与绿色荧光蛋白基因转染实验的结果分别如下(I)1H NMR 测试结果1H NMR图谱用于表征乳糖酸对树状大分子表面的修饰。参见说明书附图I:
3.40-4. IOppm范围内的质子峰对应于乳糖酸分子，对相应的化学位移峰进行积分，表明每个树状大分子表面修饰了 10. 4个乳糖酸分子。由此可证明乳糖酸已成功修饰在树状大分子表面，得到了设计合成的G5. NH2-La靶向载体。(2)凝胶阻滞实验测试结果凝胶阻滞实验结果表明，G5. NH2-La和G5. NH2均与DNA具有很好的复合能力。参见说明书附图2。结果表明G5. NH2-La和G5. NH2均可以在较低N/P (N/P=l)下与DNA很好复合，将DNA阻滞，进而为DNA转染进入细胞提供了可能。(3) AFM测试结果AFM对树状大分子/质粒复合物样品的表面形貌进行了测试，參见说明书附图3。
结果表明复合物均呈球形，表明G5. NH2-La与G5. NH2均能复合质粒DNA，使将基因转染进入细胞成为可能。此外，G5. NH2/DNA复合物的粒径比G5. NH2-La/DNA复合物的粒径大，表明G5. NH2-La对DNA有更高的压缩能力。(4)水动力学粒径与表面电势测试结果测试结果如说明书附图4所示。结果表明，G5. NH2/DNA复合物和G5. NH2_La/DNA复合物的大小在合适转染的尺寸范围内。由于乳糖酸的引入，相同N/P下，G5. NH2-La/DNA复合物的电势较G5. NH2/DNA复合物的电势低，但仍在适合转染的电势范围内。(5)荧光素酶基因转染实验以荧光素酶标记的质粒并以具有较强ASGPR表达的人肝癌细胞H印G2细胞为模型细胞来检验两种材料G5. NH2与G5. NH2-La对肝癌细胞的转染效果。參见说明书附图5。测试结果显示两种材料的转染效率均与N/P有夫，且在相同N/P下，G5. NH2-La的转染效率明显高于G5. NH2的转染效率。在Ν/Ρ=2· 5时，G5. NH2-La的转染效率最高。表明G5. NH2-La对H印G2细胞具有更好的靶向转染效果。(6)增强的绿色荧光蛋白(EGFP)基因转染实验以绿色荧光蛋白标记的质粒并以具有较强ASGPR表达的人肝癌细胞H印G2为模型细胞进一步来检验两种材料G5. NH2与G5. NH2-La对肝癌细胞的靶向转染效果。參见说明书附图6。对于具有较强ASGPR表达的H印G2细胞，修饰了乳糖酸的材料G5. NH2-La可以更好地将EGFP质粒转染进入细胞，细胞具有较强的绿色荧光信号表达；而未修饰乳糖酸的材料G5. NH2对EGFP质粒转染的效率较低，细胞几乎没有明显的荧光信号。这ー结果证明只有乳糖酸修饰的G5. NH2-La对肝癌细胞具有特异性的靶向效果，未修饰的材料对肝癌细胞没有革巴向效果。有益效果(I)本方法制备的功能化聚酰胺胺树状大分子对肝癌细胞具有靶向作用，可用于基因分子的靶向输送。(2)本发明的基因转染方法具有转染条件温和，易于操作，转染效率高、特异性好等优点，在肝癌细胞的靶向表达调控等方面具有很好的应用前景。
图I为本发明制备的G5. NH2-La的核磁共振氢谱图；图2为本发明制备的G5. NH2/DNA复合物(a)和G5. NH2_La/DNA复合物(b)的凝胶阻滞实验电泳图谱；
图3为本发明制备的G5. NH2/pDNA复合物AFM图谱(a)和G5. NH2_La/pDNA复合物AFM 图谱(b)；图4为本发明制备的G5. NH2-La与pDNA形成复合物的粒径(a)和电势图谱(b)；G5. NH2/pDNA复合物为对照组。图5为G5. NH2与G5. NH2-La两种材料在不同N/P下对H印G2细胞的荧光素酶基因转染效率比较图；图6为G5. NH2 (a, b)与G5. NH2-La (c，d)两种材料对H印G2细胞的绿色荧光蛋白基因转染的明场照片(a，c)及荧光照片(b，d)。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人 员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。实施例I称取乳糖酸(La)15. 7mg，溶于2mL磷酸盐缓冲液中(ρΗ=6· O)。加入乳糖酸羧基摩尔数五倍当量的EDC (O. 30M，0. 726mL)、NHS (O. 25Μ，0· 892mL)，强磁力搅拌反应3小时。称取第五代聚酰胺胺树状大分子(G5. NH2)41. 5mg，溶于4mL蒸馏水中，配制成浓度为10. 4mg/mL的溶液。按照La/G5. NH2摩尔比为11/1，将活化好的乳糖酸溶液加入G5. NH2溶液中，室温中磁力搅拌，反应3天。反应结束后，将反应产物转移至截留分子量为14000的透析袋中，在蒸馏水(2LX6，每天3次)中透析2天。然后进行冷冻干燥处理，得到G5. NH2-La反应产物。对得到的产品G5. NH2-La进行核磁表征，结果见
书I。在3. 40-4. IOppm范围内的质子峰对应于乳糖酸分子，对相应的质子峰进行积分计算可知，树状大分子表面修饰了 10. 4个乳糖酸分子。因此，乳糖酸已成功修饰在树状大分子表面，得到了设计合成的G5. NH2-La靶向载体。实施例2根据实施例I的方法制备的G5. NH2-La以及第五代端基为氨基的聚酰胺胺树状大分子G5. NH2与pDNA进行凝胶阻滞实验。配制8孔的含溴化乙锭(O. I μ g/mL)的琼脂糖凝胶(I. 0%w/v),室温放置待琼脂糖凝胶凝固。Wlyg DNA为例，分别按照不同N/P (O. 25，0.5,1,2, 3，4，5)配制载体/DNA复合物，并以裸DNA为对照。取实施例I得到的G5. NH2-La,用无菌水稀释至50 μ L，然后用无菌水将Iyg DNA稀释至50 μ L，然后混合均匀，终体积为100 μ L，37°C孵育30分钟。然后将对应的载体/DNA复合物分别加到琼脂糖凝胶的孔中，电压80V，时间35min。使用凝胶成像仪(UVP，USA)对DNA在凝胶中的迁移进行分析。结果如
书2所示。结果表明，G5. NH2-La和G5. NH2均可以在较低N/P (N/P=l)下与DNA很好复合，将DNA阻滞，进而为DNA转入细胞提供了可能。实施例3根据实施例I的方法制备的G5. NH2-La以及G5. NH2与I μ g DNA (N/P=2. 5)复合后，取5μ L复合后的溶液滴至合适大小的云母片中，空气干燥。用原子力显微镜(VeecoInstruments)对复合物的表面形貌进行了观察，结果如
书3所示。结果表明，复合物均呈球形，表明G5. NH2-La与G5. NH2均能复合质粒DNA，使将基因转染进入细胞成为可能。此外，G5. NH2/DNA复合物的粒径比G5. NH2-La/DNA复合物的粒径大，表明G5. NH2-La对DNA的压缩效果更好。实施例4根据实施例I的方法制备的G5. NH2-La以及G5. NH2与5 μ g DNA (N/P=l，2. 5,5)复合后，分别用去离子水调节体积为lmL。采用马尔文激光粒度仪(Malvern，UK，633nm激发光)对其粒径和表面电势进行了表征，结果如
书4所示。结果表明，随着N/P的增力口，所有复合物的尺寸均减少。相同N/P下，G5. NH2-La/DNA复合物尺寸较G5. NH2/DNA复合物的尺寸小。另外随着N/P的增加，G5. NH2-La/DNA复合物与G5. NH2/DNA复合物的表面电势均有所增加。由于乳糖酸的引入，相同N/P下，G5. NH2-La/DNA复合物的电势较G5. NH2/DNA复合物的电势低，但仍在适合转染的电势范围内。 实施例5以荧光素酶标记的质粒并以具有较强ASGPR表达的人肝癌细胞H印G2细胞为模型细胞来检验两种材料G5. NH2与G5. NH2-La对肝癌细胞的靶向转染效果。将模型细胞培养于不含FBS的培养液中，加入一定浓度的G5. NH2/DNA与G5. NH2-La/DNA复合物与细胞共培养4小时，随后更换含10%FBS的培养基，继续培养24小时。将细胞裂解测定荧光素酶活性，结果见
书5。测试结果显示两种材料的转染效率均与N/P有关，且在相同N/P下，G5. NH2-La的转染效率明显高于G5. NH2的转染效率。在N/P=2. 5时，G5. NH2-La的转染效率最闻。实施例6以增强的绿色荧光蛋白(EGFP)标记的质粒并以具有较强ASGPR表达的人肝癌细胞H印G2为模型细胞进一步来检验两种材料G5. NH2与G5. NH2-La对肝癌细胞的靶向转染效果。IfepG2细胞(肝癌细胞)以合适密度铺于24孔板，于37°C、5% CO2培养24小时，将IOOyL G5. NH2_La/pDNA复合物溶液均匀滴加到24孔板中，摇匀，37°C培养4小时后更换为含10%FBS (胎牛血清)的MEM培养基，继续培养24小时。用倒置荧光显微镜观察，结果见
书6。对于具有较强ASGPR表达的HepG2细胞，修饰了乳糖酸的材料G5. NH2-La可以更好地将EGFP质粒转染进入细胞，细胞具有较强的绿色荧光信号表达；而未修饰乳糖酸的材料G5. NH2对EGFP质粒转染的效率较低，细胞几乎没有明显的荧光信号。这一结果证明只有乳糖酸修饰的G5. NH2-La对肝癌细胞具有特异性的靶向效果，未修饰的材料对肝癌细胞没有靶向效果。
权利要求
1.一种基于聚酰胺胺树状大分子载体的基因转染方法，包括 (1)将乳糖酸La溶于磷酸盐缓冲液中，加入I-(3- 二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐和N-羟基硫代琥珀酰亚胺，搅拌反应1-5小时，得到活化好的乳糖酸溶液；将第五代聚酰胺-胺树状大分子G5. NH2溶于蒸馏水中，得到G5. NH2溶液，然后将上述活化好的乳糖酸溶液加入G5. NH2溶液中，室温中搅拌反应1-5天；反应结束后，将反应产物透析，最后进行冷冻干燥，得到反应产物G5. NH2-La ； (2)将步骤(I)得到的G5.NH2-La用无菌水稀释，得到G5. NH2-La的无菌水稀释液；用无菌水将pDNA稀释，得到pDNA的无菌水稀释液，然后将所述的G5. NH2-La的无菌水稀释液与PDNA的无菌水稀释液混合均匀，再于37°C孵育20-30分钟，得到G5. NH2-La与质粒的复合物 G5. NH2-La/pDNA ； (3)将!fepG2细胞铺于6-96孔培养板中，采用不含FBS的MEM培养基，于37°C、5%C02培养20-30小时，然后滴加入G5. NH2-La/pDNA复合物溶液，摇匀，37°C培养2_5小时后更换为含10%FBS的MEM培养基，继续培养20-30小时，即可。
2.根据权利要求I所述的一种基于聚酰胺胺树状大分子载体的基因转染方法，其特征在于步骤(I)中所述的磷酸盐缓冲液的PH值为6. O。
3.根据权利要求I所述的一种基于聚酰胺胺树状大分子载体的基因转染方法，其特征在于步骤(I)中所述的乳糖酸与磷酸盐缓冲液的用量比为15. 7mg :2mL。
4.根据权利要求I所述的一种基于聚酰胺胺树状大分子载体的基因转染方法，其特征在于步骤(I)中所述的EDC、NHS和乳糖酸羧基的摩尔比为5:5:1。
5.根据权利要求I所述的一种基于聚酰胺胺树状大分子载体的基因转染方法，其特征在于步骤(I)中所述的G5. NH2溶液中G5. NH2的浓度为10. 4mg/mL。
6.根据权利要求I所述的一种基于聚酰胺胺树状大分子载体的基因转染方法，其特征在于步骤(I)中所述的乳糖酸与G5. NH2的摩尔比为7:1 15:1。
7.根据权利要求I所述的一种基于聚酰胺胺树状大分子载体的基因转染方法，其特征在于步骤(I)中所述的透析为转移至截留分子量为14000的透析袋中，在蒸馏水中透析2天。
8.根据权利要求I所述的一种基于聚酰胺胺树状大分子载体的基因转染方法，其特征在于步骤(2)中所述的pDNA的无菌水稀释液中pDNA的浓度为O. 02-0. 10g/L。
9.根据权利要求I所述的一种基于聚酰胺胺树状大分子载体的基因转染方法，其特征在于步骤(2)中所得到的G5. NH2-La/pDNA中G5. NH2的伯氨基与pDNA骨架上磷酸基团摩尔比为O. 25-5 lo
全文摘要
本发明涉及一种基于聚酰胺胺树状大分子载体的基因转染方法，包括(1)聚酰胺胺树状大分子表面的乳糖酸修饰，得到G5.NH2-La；(2)乳糖酸修饰的聚酰胺胺树状大分子载体与质粒复合物的制备，得到G5.NH2-La与质粒的复合物G5.NH2-La/pDNA；(3)乳糖酸修饰的聚酰胺胺树状大分子质粒复合物的靶向肝癌细胞转染及表达。本方法制备的功能化聚酰胺胺树状大分子对肝癌细胞具有靶向作用；本发明的基因转染方法具有转染条件温和，易于操作，转染效率高、特异性好等优点，应用前景广阔。
文档编号A61K48/00GK102698290SQ20121018355
公开日2012年10月3日 申请日期2012年6月5日 优先权日2012年6月5日
发明者刘辉, 史向阳, 姜慧欣 申请人:东华大学