具有叶酸靶向功能的ct/mr双模态成像纳米造影剂的制备的制作方法

专利名称：具有叶酸靶向功能的ct/mr双模态成像纳米造影剂的制备的制作方法
技术领域：
本发明属于CT/MR双模态成像纳米造影剤的制备领域，特别涉及ー种具有叶酸靶向功能的CT/MR双模态成像纳米造影剤的制备方法。
背景技术：
癌症已经成为危害全世界人类健康的主要杀手之一，而癌症被检测出的越早，则治愈的可能性就越高。研究表明癌症可以实现早期检测，则将有30%的癌症患者得以生存(Action Plan for the Global Strategy for tne Prevention and Control ofNoncommu-nicable Diseases. World Health Organization, 2008, 2008 - 2013http://www.who. int/nmh/pub I ica-t ions/9789241597418/en/index, html )。因此发展癌症的早期检测 技术是攻克癌症治疗的关键。CT成像和MR成像是目前临床上用于诊断癌症的常用手段，它们具有较高的空间分辨率，因此受到了广泛的研究。但是这种单ー的CT成像或MR成像获取的信息有限，而CT/MR双模态成像可以提高诊断效率、获取更多信息，并降低造影剂对病人的副作用和医疗费用。同时CT成像和MR成像获得的数据可以相互补充、相互验证，从而得到更加准确的诊断信息。CT/MR双模态成像开发的关键是需要研发出合适的造影剤，使其可以同时应用于CT和MR成像。目前已报道的用于CT/MR双模态成像的造影剤有通过巯基集团将钆离子修饰在金纳米颗粒表面的纳米颗粒(Deboutt i6re, P. J. et al. Adv. Funct.Mater. 2006，16，2330-2339)、具有核壳结构的金纳米颗粒(Van Schooneveld, Μ. M. etal. Contrast Media Mol. Imaging. 2010, 5, 231-236)以及 FePt 合金(Chou, S. W. etal. J. Am. Chem. Soc. 2010, 132，13270-13278)。然而这些纳米造影总是存在这样或那样的不足，例如在生物体内的循环周期比较短，很难靶向定位在肿瘤部位。Alric等人(Alric，C.et al. J. Am. Chem. Soc. 2008130, 5908-5915)合成的 AuODTDTPA-Gd 纳米颗粒可以应用于活体CT/MRI双模态成像，但是这种纳米颗粒在钆离子浓度达到MR成像时(例如5mM)，金纳米颗粒的浓度比较低(10mg/mL)，无法达到同时应用与CT成像的要求。而且AuODTDTPA-Gd的代谢速度相对还是较快，在注射45min后有大量造影剤集中在老鼠膀胱处。为了解决纳米造影剂的这些问题，需要寻找合适的材料作为纳米造影剂的载体，要求这种载体剂不仅可以提高造影剤的生物相容性，而且要求载体易于表面功能化，从而可以进行表面修饰以提高造影剤在血液中的循环周期，还可以通过修饰合适的靶向试剂，提高造影剤的选择靶向性，使其满足CT/MR双模态成像的要求。目前受到广泛关注的是聚酰胺-胺型(PAMAM)树状大分子。PAMAM是ー种新颖的高度支化的具有精确的成分和结构的大分子，其表面具有大量的官能团，可以连接药物分子、靶向试剂、染料等，同时其内部具有大量的空腔，可以包裹纳米颗粒，从而提高纳米颗粒的稳定性。例如将PAMAM的表面氨基こ酰化之后可以明显改善树状大分子的生物相容性，将聚こニ醇修饰在树状大分子表面可以较好的延长材料在血液中的循环时间。又如Shi等人(Shi, X. Y. et al. Small. 2007，3 (7)，1245-1252)将叶酸分子修饰在第五代聚酰酰胺树状大分子上，通过实验证明了修饰叶酸后的聚酰酰胺树状大分子具有较好的靶向性。因此树状大分子是ー种优异的纳米颗粒载体。Au纳米颗粒由于具有良好的生物相容性、表面易于修饰、对X射线有较高的吸收等性质，已经被广泛的研究以用于癌症的早期检测。例如，Shi等人(Shi, X. Y. et al. Smal
I.2007, 3(7), 1245-1252; Shi, X. Y. et al. Analyst 134(7)，1373-1379)利用树状大分子包裏、稳定金纳米颗粒不仅可以提高金纳米颗粒的水溶性，而且可以用于CT成像。同时已经有很多报道将Gd离子用于MR成像，而且有研究表明大量钆离子的存在不仅可以用于MR成像，还可利用钆离子对X射线的吸收用于CT成像。因此，可以通过将包裹有Au纳米颗粒的树状大分子表面螯合钆离子，用于CT/MR双模态成像。同时通过表面进ー步修饰聚こニ醇提高材料在血液中的循环周期，并且通过靶向试剂叶酸的修饰，使材料在生物活体内对肿瘤具有靶向作用。因此以PAMAM树状大分子作为CT/MR双模态成像纳米造影剂的载体，开发具有靶向的CT/MR双模态成像造影剤，将为癌症的早期诊断带来了新的曙光。史向阳、温诗辉等已经合成了聚こニ醇修饰的螯合有钆离子的树状大分子包裹的金纳米颗粒(CN102294038A，2011年12月28日公开)，并且将其应用于CT/MR双模态纳米·造影剤，但是这种材料在肿瘤检测方面只能通过实体瘤的高通透性和滞留效应(enhancedpermeability and retention effect,EPR)被动革巴向肿瘤,无法很好的实现对生物体的癌症的早期检测。为了达到更好的早期检测癌症的效果，我们将材料进ー步功能化，通过在树状大分子表面修饰叶酸分子，使材料对具有对叶酸高受体表达的癌细胞的特异性靶向效果，提高材料在肿瘤部位的富集，以达到用CT/MRI双模态的模式对癌症进行早期检测的目的。检索国内外有关CT/MRI双模态造影剤方面的文献和专利结果表明目前还未见使用叶酸修饰包裹有金纳米颗粒的树状大分子用于靶向的CT/MRI双模态成像纳米造影剤的报道。

发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供ー种具有叶酸靶向功能的CT/MR双模态成像纳米造影剤的制备方法，该方法エ艺简単，反应条件温和，具有产业化实施，且制备的金納米颗粒不仅提高了金纳米颗粒的负载量和稳定性，还具有潜在应用于CT/MRI双模态成像来靶向诊断肿瘤的可能。本发明ー种具有叶酸靶向功能的CT/MR双模态成像纳米造影剤的制备方法，包括(I)在叶酸的ニ甲亚砜溶液中加入EDC活化2_5h，然后边搅拌边滴加NH2-PEG-C00H的ニ甲亚砜溶液，反应7(T80h后，将反应产物透析，最后冷冻干燥得到叶酸修饰的聚こニ醇固体产物FA-PEG-C00H ；(2)在树状大分子的ニ甲亚砜溶液中搅拌边滴加DOTA-NHS(购于CheMatech公司，化学名'2,2’，2” -(10-(2-(2, 5- ニ氧代卩比咯烧-I-氧基)-2-氧こ基)-I, 4, 7, 10-四氮杂环十二烷-1，4，7-三)三こ酸)的ニ甲亚砜溶液，反应20-30h，得到树状大分子溶液；然后将步骤(I)得到的FA-PEG-C00H (购于上海炎怡生物科技有限公司)溶解于ニ甲亚砜中，并使用EDC活化后，逐滴加入到上述树状大分子溶液中，反应40-90h后，再加入用EDC活化后的PEG-COOH，反应40-90h后透析，最后冷冻干燥得固体；(3)将步骤(2)所得固体用ニ甲亚砜或水溶解后，加入氯金酸溶液，然后在室温下搅拌20-50min，随后加入NaBH4溶液，再在室温下搅拌反应l_5h后，逐滴加入Gd(NO3)3溶液反应20-30h ;然后加入三こ胺，搅拌混合20-50min后，再向反应液中加入こ酸酐，在室温下搅拌反应20-30h，将反应产物透析，最后冷冻干燥，得到叶酸和聚こニ醇修饰的螯合了钆离子的树状大分子 / 金纳米粒子({(Au0) 200 - G5. NHAc-DOTA (Gd III) 10-PEGn-FA5} DENPs )。

步骤(I)中所述的叶酸的ニ甲亚砜溶液中二甲亚砜与叶酸的用量比为20mL 29 39mg ;所述的NH2-PEg-COOH的ニ甲亚砜溶液中NH2-PEG-C00H的干重与ニ甲亚砜的用量比为 65. 73 88. 40mg lmL ；EDC 的用量为 126 169mg。步骤(I)中所述的NH2-PEg-COOH为一端是羧基另一端是氨基的聚こニ醇，其分子量为2000。步骤(I)中所述的叶酸与NH2-PEg-COOH的摩尔比为3:1。步骤(2)中所述的树状大分子的ニ甲亚砜溶液中树状大分子与ニ甲亚砜的用量比为2(T30mg 15mL ;所述的DOTA-NHS的ニ甲亚砜溶液中DOTA-NHS的干重与ニ甲亚砜的用量比为5. 89 8. 83mg 5mL ;所述的步骤(I)得到的FA-PEG-C00H的用量为14. 99 22. 49mg，PEG-COOH 的干重为 23. 19 34. 80mg。步骤(2)中所述的树状大分子为第5代聚酰胺-胺型树状大分子(美国Dendritech 公司)。步骤(2)中所述的FA-PEG-C00H、DOTA-NHS, PEG-COOH与树状大分子的摩尔比为5:10:6:10步骤(3)所述的氯金酸溶液的浓度为24. 8mg/mL，其用量与树状大分子的用量比为 2. 12 3. 18mL :20 30mg。步骤(3)所述的NaBH4溶液中的溶剂为体积比2:1的H2O与CH3OH的混合液，NaBH4的用量与树状大分子的用量比为29. 25 43. 88mg :2(T30mg。步骤(3)中所述的三こ胺、こ酸酐和树状大分子的用量比为59.27 88.9yL:48. 27 72. 4μ L :20 30mg。步骤(3)中所述的NaBH4与氯金酸的摩尔量之比为5:1 ;氯金酸与树状大分子的摩尔比为200:1 ;Gd(NO3)3与树状大分子的摩尔比为35:1。步骤(3)中所述的三こ胺、こ酸酐和树状大分子的摩尔比为660:50:1。步骤(I)、(2)和(3)中所述的透析均为用透析膜先在PBS缓冲液中透析20_30h，然后再在蒸馏水透析40-60h。上述的透析膜为纤维素透析膜MWcO=IOOO。本发明的一种叶酸修饰的螯合有钆离子的树状大分子包裹的金纳米颗粒用于CT/MR双模态成像。本发明使用核磁共振氢谱(1H NMR)、紫外一可见分光光度计(UV-Vis)、透射电子显微镜(TEM)、元素分析(ICP-AES )、CT成像和MR成像等方法表征本发明制备的叶酸修饰的螯合有Gd的树状大分子包裹的Au纳米颗粒，具体测试结果如下(I) 1H NMR 谱核磁共振氢谱结果证实了 {(Au0) 200-G5. NHAc-DOTA (Gd III) 10-PEGn-FA5} DENPs 的结构正确，见附图I。(2) UV-Vis 测试结果合成的{(Au0) 200-G5. NHAc-DOTA (Gd III) 10-PEGn-FA5} DENPs 在 280nm 和 5IOnm 左右都有ー个特征吸收峰，它们分别是叶酸分子的特征吸收峰和金纳米颗粒的表面等离子体共振峰，參见附图2 ;叶酸修饰的螯合有钆离子的树状大分子包裹的金纳米颗粒能稳定分散在水中，且在不同的pH值(pH=4. 0-8. O)和不同温度(4°C _50°C )范围内均具有非常好的稳定性，这说明合成的金纳米颗粒具有较好的稳定性，參见附图3 ；(4) TEM测试结果{(Au0) 200 - G5. NHAc-DOTA (Gd III) 10-PEGn-FA5} DENPs 的 TEM 图片和粒度分布直方图(參见附图4)表明本方法合成的金纳米颗粒的粒径分布均匀，平均粒径约为4±1. 2nm。{(Au0) 200 - G5. NHAc-DOTA (Gd III) 10-PEGn-FA5} DENPs 的高分辨 TEM 图片(见附图4c)和选区电子衍射图表明所合成的金納米颗粒晶化程度比较高。(111)、(200)、(220)和(311)环说明所合成的金纳米颗粒呈面心立方(fee)晶体结构。(5 )体外CT和MR成像性能将合成的材料((Au0)200 - G5. NHAc-DOTA (Gd III ) 10-PEGn-FA5} DENPs 配制成一系列的浓度，通过CT、MR成像，测量计算材料的X射线吸收性和巧弛豫率(见附图
5);结果发现该材料具有比对比材料{(Au0) 200 - G5. NHAc-DOTA10-PEGn-FA5}DENPs稍高的X射线吸收性以及相对较好的CT成像效果；由于金纳米颗粒的存在，{(Au0) 200 - G5.NHAc-DOTA (Gd III ) 10-PEGn-FA5} DENPs 的巧弛豫率(3· 139ι Μ )约为对比材料G5. NHAc-DOTA (Gd III) 10-PEGn-FA5 (6· 022ι Μ )的一半，但是合成的材料{(Au0) 200 - G5.NHAc-DOTA (Gd III) ^PEG1 rFA5} DENPs 仍然具有较好的 MR 成像效果。(6) MTT细胞活力检测及细胞形貌观察将不同浓度的材料与细胞共培养，通过MTT毒性检测，可以看到在金纳米颗粒的浓度高达200 μ M时也未见较为明显的毒性，同时通过细胞形貌也可以看到材料处理的细胞与对照细胞相比形貌没有明显的变化(见附图6，7 )。(7) ICP分析KB细胞对材料靶向吞噬作用
将高叶酸受体KB细胞(HFKB)和低叶酸受体KB细胞(LFKB)分别与{(Au°) 200-G5.NHAc-DOTA (Gd III ) K1-PEG11-FA5I DENPs (金的浓度分别为 0、10、40μΜ)共培养 3h 后，通过ICP检测单个HFKB和LFKB细胞对金纳米颗粒的吞噬量，结果发现高HFKB对材料的吞噬量要大于LFKB对材料的吞噬量，从而证明了合成的材料{(Au0) 200-G5.NHAc-DOTA (Gd III) 10-PEGn-FA5} DENPs对HFKB细胞具有特异性靶向作用(见图8)。 (8)体外材料靶向KB细胞的CT/MR双模态成像HFKB 和 LFKB 细胞分别与{(Au0) 200 - G5. NHAc-DOTA (Gd III) 10-PEGn-FA5} DENPs (金的浓度分别为10、20、40、8(^10共培养311后，然后将细胞消化离心并用150 μ L PBS缓冲液将其悬浮在离心管中，随后进行CT扫描和MR成像(见图9)，实验结果发现在MR成像中，不同金浓度下与HFKB细胞共培养后处理的细胞悬浮液的MR信号比LFKB细胞悬浮液高；相似的在CT成像中，不同金浓度下与HFKB细胞共培养后处理的细胞悬浮液的CT信号比LFKB细胞悬浮液高。这个结果也证明了合成的材料{(Au0) 200 - G5. NHAc-DOTA (Gd III) 10-PEGn-FA5}DENPs对高受体的KB细胞具有特异性靶向作用。
有益效果(I)本发明的制备エ艺简单，反应条件温和，具有产业化实施的前景；(2)本发明设计合成的叶酸修饰的螯合有钆离子的树状大分子包裹的金纳米颗粒具有较好的水溶性、稳定性、较低的细胞毒性、较高的X-射线衰减系数和合适的弛豫率；(3)本发明的叶酸修饰的螯合有钆离子的树状大分子包裹的金纳米颗粒对叶酸受体过表达的肿瘤细胞具有较好的靶向性，同时可以用于CT/MR双模态成像，具有靶向诊断肿瘤部位的潜力，因此有望应用于肿瘤的早期检测。



图I 为本发明制备的{(Au0) 200 - G5. NHAc-DOTA (Gd III) 10-PEGn-FA5} DENPs 的 1HNMR ；图2 为本发明制备的{(Au0) 200 - G5. NHAc-DOTA (GdIII) 10-PEGn-FA5} DENPs 在 25°C、pH=7. O的紫外吸收光谱图；图3 为本发明制备的{(Au0) 200-G5. NHAc-DOTA (Gd III) ^pEG11-FA5I DENPs 在不同温度(a)和不同pH值(b)下的UV-Vis谱图；图4 为本发明制备的{ (Auci)2qq-GS. NHAc-DOTA (Gd III) 10-PEGn-FA5} DENPs 的(a)TEM图片；(b)粒径分布图；(c)高分辨TEM图片；(d)选区电子衍射；图5 为本发明制备的{(Au°)2QQ-G5· NHAc-DOTA (Gd III) W-PEG11-FA5I DENPs 材料在体外的CT (a)、MR (C)成像及X射线吸收性(b)和巧弛豫率(d);图6 为本发明制备的{(Au0) 200-G5. NHAc-DOTA (Gd III) 10-PEGn-Fk5\ DENPs 材料在金的浓度0-200 μ M与KB细胞共培养24h后的细胞活力；图7 为本发明制备的{(Au0) 200-G5. NHAc-DOTA (Gd III) 10-PEGn-Fk5\ DENPs 材料在金的浓度分别为 O (a)，5 (b)，10 (c)，25 (d)，35 (e)，50 (f)，100 (g)，200 (h) μ M 与 KB 细胞共培养24h后的细胞形貌；图8 为本发明制备的{(Au0) 200 - G5. NHAc-DOTA (Gd III) 10-PEGn-FA5} DENPs 在金的浓度O、10、40 μ M下分别与HFKB和LFKB细胞共培养3h后，通过ICP分析得到的两种细胞对金纳米颗粒的吞噬量；图9 为本发明制备的{(Au0) 200 - G5. NHAc-DOTA (Gd III) 10-PEGn-FA5} DENPs 材料在金的浓度10、20、40、80 μ M分别与HFKB细胞和LFKB细胞共培养3h后，MR成像(a)、MR信号值(b)、CT成像(c)和CT信号值(d)；图10 为本发明制备{(Au0) 200 - G5. NHAc-DOTA (Gd III) W-PEG11-FA5I DENPs 的简易流程图。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进ー步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。实施例I
(I)用20mL的ニ甲亚砜溶液稀释39mg的叶酸，使用169mg的EDC活化3h，然后边搅拌边逐滴滴加溶于ImL ニ甲亚砜的干重为88. 40mg的聚こニ醇(NH2-PEG_C00H)，反应7(T80h后，将反应产物用透析膜在缓冲液中透析24h，然后在用蒸馏水透析48h，最后将纯化的产物冷冻干燥得到叶酸修饰的聚こニ醇固体产物(FA-PEG-C00H)；(2)用15mL的ニ甲亚砜溶液溶解干重为30mg的第5代聚酰胺-胺型(PAMAM)树状大分子，然后边搅拌边滴加溶于5mL ニ甲亚砜溶液的干重为8. 83mg的DOTA-NHS，反应24h，然后取(I)中所得的FA-PEG-C00H 22. 49mg,溶解在5mL ニ甲亚砜溶液并使用EDC活化过后逐滴加入树状大分子溶液，反应72h后再将干重为34. SOmg的使用EDC活化的一端是羧基的聚こニ醇(PEG-COOH)，反应72h后反应产物用透析膜在缓冲液中透析24h，然后在用蒸馏水透析48h，最后将纯化的产物冷冻干燥得固体；(3)将步骤(2)得到的固体用ニ甲亚砜或水将其溶解后，再加入3. ISmL氯金酸溶液(24. 8mg/mL),然后在室温下搅拌30min,随后加入NaBH4溶液(43. 88mg),在室温下搅拌反应2h后逐滴加入18. 22mg Gd (NO3)3溶液反应24h ;然后再加入88. 9 μ L三こ胺，搅拌混合30min后，向反应液中加入72. 4μ Lこ酸酐，在室温下搅拌反应24h，随后将反应产物用透析膜在缓冲溶液和蒸馏水中透析，最后将纯化后的产物冷冻干燥得到叶酸、聚こニ醇修饰的螯合了钆离子的树状大分子/金納米粒子({(Au0) 200 - G5. NHAc-DOTA (Gd III) 10-PEGn-FA5}DENPs)ο合成过程中对表面修饰后的树状大分子使用核磁手段进行表征，并对各个峰进行积分计算可知树状大分子表面修饰了 8. 8个DOTA分子，5个FA-PEG-C00H分子和6个mPEG 分子。对得到的产品{(Au0) 200 - G5. NHAc-DOTA (Gd III) 10-PEGn-FA5} DENPs 进行紫外吸收表征如附图2，纳米金颗粒的表面等离子体共振(SPR)峰约在528nm，证明了金纳米颗粒的形成；叶酸分子的紫外吸收特征峰约在280nm处，证明了金纳米颗粒的形成。同时通过在不同温度、PH值下，产物溶液的紫外吸收特征峰并没有明显的变化，这所所合成的材料具有较好的稳定性(附图3)。通过TEM图片(附图4)表明金纳米颗粒尺寸分布较窄，具有良好的水分散性，粒径尺寸约4. Onm。进ー步以电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP)測定产物中Au和Gd的含量，结果表明平均每个树状大分子的载金量为193个金原子，载钆量为28个Gd(III)离子，这些测试结果表明已成功制备了设计合成的功能化的树状大分子{(Au0) 200 - G5. NHAc-DOTA (Gd III) 10-PEGn_FA5} DENPs。实施例2(I)用20mL的ニ甲亚砜溶液稀释29mg的叶酸，使用125. 67mg的EDC活化3h，然 后边搅拌边逐滴滴加溶于ImL ニ甲亚砜的干重为65. 73mg的聚こニ醇(NH2-PEG-C00H)，反应7(T80h后，将反应产物用透析膜在缓冲液中透析24h，然后在用蒸馏水透析48h，最后将纯化的产物冷冻干燥得到叶酸修饰的聚こニ醇固体产物(FA-PEG-C00H)；(2)用15mL的ニ甲亚砜溶液溶解干重为20mg的第5代聚酰胺-胺型(PAMAM)树状大分子，然后边搅拌边滴加溶于5mL ニ甲亚砜溶液的干重为5. 89mg的DOTA-NHS，反应24h，然后取(I)中所得的FA-PEG-C00H 14. 99mg,溶解在5mL ニ甲亚砜溶液并使用EDC活化过后逐滴加入树状大分子溶液，反应72h后再将干重为23. 20mg的使用EDC活化的一端是羧基的聚こニ醇(PEG-COOH)，反应72h后反应产物用透析膜在缓冲液中透析24h，然后在用蒸馏水透析48h，最后将纯化的产物冷冻干燥；
(3)将步骤(2)得到的固体用水将其溶解后，再加入2. 12mL氯金酸溶液(24. 8mg/mL)，然后在室温下搅拌30min，随后加入NaBH4溶液(29. 25mg)，在室温下搅拌反应2h后逐滴加入12. 15mg Gd(NO3)3溶液反应24h;然后再加入59. 27 μ L三こ胺，搅拌混合30min后，再向反应液中加入48. 27 μ Lこ酸酐，在室温下搅拌反应24h，随后将反应产物用透析膜在缓冲溶液和蒸馏水中透析，最后将纯化后的产物冷冻干燥得到叶酸、聚こニ醇修饰的螯合了钆离子的树状大分子/金納米粒子({(Au0) 200 - G5. NHAc-DOTA (Gd III) 10-PEGn-FA5}DENPs)ο合成过程中对表面修饰后的树状大分子使用核磁手段进行表征，并对各个峰进行积分计算可知树状大分子表面修饰了 8. 8个DOTA分子，5个FA-PEG-C00H分子和6个mPEG 分子。对得到的产品{(Au0) 200 - G5. NHAc-DOTA (Gd III) ^-PEG11-FA5I DENPs 进行紫外吸收表征如附图2，纳米金颗粒的表面等离子体共振(SPR)峰约在528nm，证明了金纳米颗粒的形成；叶酸分子紫外特征吸收峰约在280nm处，证明了叶酸的成功修饰。同时通过在不同温度、PH值下，产物溶液的紫外吸收特征峰并没有明显的变化，这所所合成的材料具有较好的稳定性(附图3)。通过TEM图片(附图4)表明金纳米颗粒尺寸分布较窄，具有良好的水分散性，粒径尺寸约4. Onm。进ー步以电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP)测定产物中Au和Gd的含量，结果表明平均每个树状大分子的载金量为193个金原子，载钆量为28个Gd(III)离子，这些测试结果表明已成功制备了设计合成的功能化的树状大分子{(Au°)2(ici-G5.NHAc-DOTA (Gd III) 1(l-PEGn-FA5} DENPs。实施例3为了研究材料的实例I与对比材料I所合成的材料{(Au0) 200 - G5.NHAc-DOTA (Gd III U-PEG11-FAJ DENPs 与材料((Auci)2cici-Gs-Nhac-DotAici-PEG11-FAsIDENPs的X射线吸收性和CT成像效果，我们使用体外CT成像并通过测量计算HU值进行证明。取实例 I 中{(Au0) 200 - G5. NHAc-DOTA (Gd III ) 10-PEGn-FA5} DENPs 20. 29mg 溶解在IOOOyL PBS溶液中，配制成金纳米的浓度为O. 08M，在通过一系列的稀释形成金浓度分别为O. 05、0. 04、0. 02、0. OlM 的PBS 溶液各200 μ L ;同样的取对比例I中{(Au0) 200-G5. NHAc-DOTA10-PEGn-FA5} DENPs 20. 6 Img 溶解在 1000 μ LPBS 溶液中，配制成金纳米的浓度为O. 08Μ，在通过一系列的稀释形成金浓度分别为O. 05,0. 04,0. 02、
O.OlM的PBS溶液各200 μし通过CT扫描测试(附图5)，可以观察到在一系列浓度下，样品{(Au0) 200-G5. NHAc-DOTA (Gd III) 10-PEGn-FA5} DENPs 的 CT 成像比样品{(Au0) 200-G5.NHAc-DOTA (Gd III ) w- EGn-Fk5} DENPs相对要亮(附图5a)，同时通过测量HU值，可以看到样品{(Au0) 200-G5. Nhac-DOTaio-PEG1 rFA5} DENPs 的 HU 值要比样品{(Au0) 200-G5.Nhac-DOTaio-PEG1 rFA5} DENPs的要略高(附图5b)，这些结果证明了实例I中的样品{(Au0) 200-G5. NHAc-DOTA (Gd III) ^-PEG11-FA5I DENPs 对 X 射线的吸收性较好，具有相对比较好的CT成像效果，同时也说明了钆离子的存在増加了金纳米颗粒的CT成像效果。实施例4为了研究材料的实例I与对比材料2所合成的材料{(Au0) 200 - G5.NHAc-DOTA (Gd III ) 10-PEGn-FA5} DENPs 与材料 G5. NHAc-DOTA (Gd III ) ^PEG1「FA5 的 r!值和MR成像效果，我们使用体外MR成像并通过測量计算^值进行证明。取实例I中{(Au0) 200 - G5. NHAc-DOTA (Gd III) 1(l-PEGn-FA5} DENPs O. 5 Img 溶解在 800 μ L PBS 溶液中，配制成金纳米的浓度为O. 4mM，在通过一系列的稀释形成钆离子浓度分别为O. 2、0. I、
0.05mM 的 PBS 溶液各 200 μ L ;同样的取对比例 2 中 G5. NHAc-DOTA (Gd IID10-PEG11-FA5O. 3Img溶解在800 μ L PBS溶液中，配制成钆离子的浓度为O. 4mM，在通过一系列的稀释形成钆离子浓度分别为O. 2、0. 1、0.05禮的？85溶液各20(^し通过MR扫描测试(附图5)，可以观察到在一系列浓度下，样品G5. NHAc-DOTA (Gd III) 1(l-PEGn-FA5的MR成像比样品((Au0) 200 - G5. NHAc-DOTA (Gd III) 1Q-PEGn-FA5} DENPs 相对要亮(附图 5a)，同时通过计算巧值，可以看到样品{ (Auq)2qq - G5. Nhac-DOTaio-PEG1 rFA5} DENPs 的巧值为 3. 139^-1 s'样品G5. NHAc-DOTA(Gdm)1CrPEG11-FA5的巧值为6· 022ι Μ 。同时通过MR成像图片可以看到虽然合成材料{ (Auq)2qq - G5. NHAc-DOTA (Gd III) 10-PEGn-FA5} DENPs 的 MR 成像效果低于对比材料，但是合成材料仍然具有较好的MR成像效果(附图5b)。 实施例5我们研究了 KB细胞对材料的特异性靶向作用。将HFKB和LFKB两种细胞分别种在24孔板细胞培养板中，培养24h之后分别加不同金浓度下的实例I材料{(Au0) 200 - G5.NHAc-DOTA (Gd III) ^-PEG11-FA5I DENPs (金的浓度分别为10、40 μ M)，同时对照组加入相同体积的PBS溶液(每组三个平行样)。然后再培养3h之后，胰酶消化离心后收集细胞，并通过相差显微镜数出每组细胞的个数，最后将细胞用王水处理后，加入适量的PBS溶液至
1.8mL。通过电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP)测出每个样品中金元素的浓度，最后计算出每个HFKB和LFKB细胞对金的摄取量(见附图8)。通过附图8可以清楚的看到在金的浓度为10、40μΜ吋，HFKB细胞对金的摄取量要高于LFKB细胞对金的摄取量，表明实例I材料{(Au0) 200-G5. NHAc-DOTA (Gd III) ^PEG1 rFA5} DENPs 对叶酸受体过表达的 KB 细胞具有特异性靶向作用。实施例6我们研究了 KB细胞特异性靶向吞噬材料后的MR成像性。将高叶酸受体表达KB细胞(HFKB)和低叶酸受体表达KB细胞(LFKB)两种细胞分别种在25cm2塑料细胞培养瓶中，每瓶种的细胞数为400X 104个，培养24h之后分别加不同金浓度下的实例I材料{(Au0) 200 - G5. NHAc-DOTA(GdIII) 1Q-PEGn-FA5} DENPs (金的浓度分别为 10、20、40、80 μ M)。然后再培养3h之后，胰酶消化离心后收集细胞，并将细胞均匀的分散在I. 5mL PBS缓冲液中。进行MR扫描测试(附图9a，b)，可以观察到在一系列浓度下，与材料共培养后的HFKB的MR成像比LFKB细胞的MR成像要亮，通过测量MR信号值也可以发现，与材料共培养后的HFKB细胞的MR信号值要高于LFKB细胞的MR信号值。这些结果不仅说明了材料{(Au°) 2(|(| - G5.NHAc-DOTA (Gd III) 10-PEGn-FA5} DENPs对HFKB具有特异性的靶向作用，而且可以用于KB细胞的MR成像。实施例7我们研究了 KB细胞特异性靶向作用材料后CT成像性。将HFKB和LFKB两种细胞分别种在25cm2塑料细胞培养瓶中，每瓶种的细胞数为400X IO4个，培养24h之后分别加不同金浓度下的实例 I 材料{(Au0) 200 - G5. NHAc-DOTA (Gd III) 10-PEGn-FA5} DENPs (金的浓度分别为10、20、40、8(^10。然后在培养311之后，胰酶消化离心后收集细胞，并将细胞均匀的分散在I. 5mL PBS缓冲液中。进行CT扫描测试(附图9c，d)，可以观察到在一系列浓度下，与材料共培养后的HFKB CT成像和LFKB细胞的CT成像亮度虽然比较接近，但是通过测量CT信号值可以发现，与材料共培养后的HFKB细胞的CT值要高于LFKB细胞的CT值。这些结果不仅说明了材料{(Au0) 200-G5. NHAc-DOTA (Gd III) ^-PEG11-FAJ DENPs 对 HFKB 具有特异性的靶向作用，而且可以用于KB细胞的CT成像。对比例I(I)用20mL的ニ甲亚砜溶液稀释29mg的叶酸，使用125. 67mg的EDC活化3h，然后边搅拌边逐滴滴加溶于ImL ニ甲亚砜的干重为65. 73mg的聚こニ醇(NH2-PEG-C00H)，反应7(T80h后，将反应产物用透析膜在缓冲液中透析24h，然后在用蒸馏水透析48h，最后将纯化的产物冷冻干燥得到叶酸修饰的聚こニ醇固体产物(FA-PEG-C00H)；(2)用15mL的ニ甲亚砜溶液溶解干重为20mg的树状大分子，然后边搅拌边滴加溶于5mL ニ甲亚砜溶液的干重为5. 89mg的D0TA-NHS，反应24h，然后取(I)中所得的FA-PEG-C00H 14. 99mg,溶解在5mL ニ甲亚砜溶液并使用EDC活化过后逐滴加入树状大分子溶液，反应72h后再将干重为23. 20mg的使用EDC活化的一端是羧基的聚こニ醇(PEG-COOH),反应72h后反应产物用透析膜在缓冲液中透析24h，然后在用蒸馏水透析48h，最后将纯化的产物冷冻干燥；(3)取步骤(2)所得固体，用水将其溶解后，再加入2. 12mL氯金酸溶液(24.8mg/mL)，然后在室温下搅拌30min，随后加入NaBH4溶液(29. 25mg)，在室温下搅拌反应2h后逐滴加入59. 27 μ L三こ胺，搅拌混合30min后，再向反应液中加入48. 27 μ Lこ酸酐，在室温下搅拌反应24h，随后将反应产物用透析膜在缓冲溶液和蒸馏水中透析，最后将纯化后的产物冷冻干燥得到对比产物({(Au0) 200 - G5. NHAc-DOTA1(l-PEGn-FA5} DENPs )。电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP)测定产物中Au和Gd的含量，结果表明平均每个树状大分子的载金量为193个金原子，载钆量为O个Gd(III)离子，这些测试结果表明已成功制备了设计合成的不含钆的成像造影剤对比产物{(Au°)2(ici-G5.Nhac-DOTaio-PEG1 rFA5} DENPs。对比例2(I)用20mL的ニ甲亚砜溶液稀释39mg的叶酸，使用169mg的EDC活化3h，然后边搅拌边逐滴滴加溶于ImL ニ甲亚砜的干重为88. 40mg的聚こニ醇(NH2-PEG_C00H)，反应7(T80h后，将反应产物用透析膜在缓冲液中透析24h，然后在用蒸馏水透析48h，最后将纯化的产物冷冻干燥得到叶酸修饰的聚こニ醇固体产物(FA-PEG-C00H)；(2)用15mL的ニ甲亚砜溶液溶解干重为30mg的树状大分子，然后边搅拌边滴加溶于5mL ニ甲亚砜溶液的干重为8. 83mg的DOTA-NHS，反应24h，然后取(I)中所得的FA-PEG-C00H 22. 49mg,溶解在5mL ニ甲亚砜溶液并使用EDC活化过后逐滴加入树状大分子溶液，反应72h后再将干重为34. 80mg的使用EDC活化的一端是羧基的聚こニ醇(PEG-COOH),反应72h后反应产物用透析膜在缓冲液中透析24h，然后在用蒸馏水透析48h，最后将纯化的产物冷冻干燥得固体；(3)取步骤(2)所得固体，用ニ甲亚砜或水将其溶解后滴加入18. 22mg Gd(NO3)3溶液反应24h ;然后再加入88. 9μ L三こ胺，搅拌混合30min后，向反应液中加入72. 4 μ Lこ酸酐，在室温下搅拌反应24h，随后将反应产物用透析膜在缓冲溶液和蒸馏水中透析，最后 将纯化后的产物冷冻干燥得到对比产物G5. NHAc-DOTA (Gd III) 10-PEGn-FA5O电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP)测定产物中Au和Gd的含量，结果表明平均每个树状大分子的载钆量为13个Gd(III)离子，O个金原子，这些测试结果表明已成功制备了设计合成的不含金的成像造影剤对照产物G5. NHAc-DOTA (Gd III) 1 0-PEGn-FA5O
权利要求
1.一种具有叶酸靶向功能的CT/MR双模态成像纳米造影剂的制备方法，包括 (1)在叶酸的二甲亚砜溶液中加入EDC活化2-5h，然后边搅拌边滴加NH2-PEg-COOH的二甲亚砜溶液，反应7(T80h后，将反应产物透析，最后冷冻干燥得到叶酸修饰的聚乙二醇固体产物fa-peg-cooh ； (2)在树状大分子的二甲亚砜溶液中搅拌边滴加DOTA-NHS的二甲亚砜溶液，反应20-30h,得到树状大分子溶液；然后将步骤(I)得到的FA-PEG-C00H溶解于二甲亚砜中，并使用EDC活化后，逐滴加入到上述树状大分子溶液中，反应40-90h后，再加入用EDC活化后的PEG-C00H，反应40-90h后透析，最后冷冻干燥得固体； (3)将步骤(2)所得固体用二甲亚砜或水溶解后，加入氯金酸溶液，然后在室温下搅拌20-50min,随后加入NaBH4溶液，再在室温下搅拌反应l_5h后，逐滴加入Gd (NO3) 3溶液反应20-30h;然后加入三乙胺，搅拌混合20-50min后，再向反应液中加入乙酸酐，在室温下搅拌反应20-30h，将反应产物透析，最后冷冻干燥即可。
2.根据权利要求I所述的一种具有叶酸靶向功能的CT/MR双模态成像纳米造影剂的制备方法，其特征在于步骤(I)中所述的叶酸的二甲亚砜溶液中二甲亚砜与叶酸的用量比为20mL :29 39mg ;所述的NH2-PEG-C00H的二甲亚砜溶液中NH2-PEG-C00H的干重与二甲亚砜的用量比为65. 73 88. 40mg lmL ；EDC的用量为126 169mg。
3.根据权利要求I所述的一种具有叶酸靶向功能的CT/MR双模态成像纳米造影剂的制备方法，其特征在于步骤(I)中所述的NH2-PEg-COOH为一端是羧基另一端是氨基的聚乙二醇，其分子量为2000。
4.根据权利要求I或2所述的一种具有叶酸靶向功能的CT/MR双模态成像纳米造影剂的制备方法，其特征在于步骤(I)中所述的叶酸与NH2-PEg-COOH的摩尔比为3:1。
5.根据权利要求I所述的一种具有叶酸靶向功能的CT/MR双模态成像纳米造影剂的制备方法，其特征在于步骤(2)中所述的树状大分子的二甲亚砜溶液中树状大分子与二甲亚砜的用量比为2(T30mg 15mL ;所述的DOTA-NHS的二甲亚砜溶液中DOTA-NHS的干重与二甲亚砜的用量比为5. 89 8. 83mg 5mL ;所述的步骤(I)得到的FA-PEG-C00H的用量为14.99 22. 49mg, PEG-COOH 的干重为 23. 19 34. 80mg。
6.根据权利要求I或5所述的一种具有叶酸靶向功能的CT/MR双模态成像纳米造影剂的制备方法，其特征在于步骤(2)中所述的FA-PEG-COOH、DOTA-NHS、PEG-COOH与树状大分子的摩尔比为5:10:6:1。
7.根据权利要求I所述的一种具有叶酸靶向功能的CT/MR双模态成像纳米造影剂的制备方法，其特征在于步骤(2)中所述的树状大分子为第5代聚酰胺-胺型树状大分子。
8.根据权利要求I所述的一种具有叶酸靶向功能的CT/MR双模态成像纳米造影剂的制备方法，其特征在于步骤(3)所述的氯金酸溶液的浓度为24. 8mg/mL，其用量与树状大分子的用量比为2. 12^3. 18mL 20^30mg ;所述的NaBH4溶液中的溶剂为体积比2:1的H2O与CH3OH的混合液，NaBH4的用量与树状大分子的用量比为29. 25 43. 88mg 20^30mg ;所述的三乙胺、乙酸酐和树状大分子的用量比为59. 27 88. 9u L :48. 27 72. 4u L :2(T30mg。
9.根据权利要求I所述的一种具有叶酸靶向功能的CT/MR双模态成像纳米造影剂的制备方法，其特征在于步骤(3)中所述的NaBH4与氯金酸的摩尔量之比为5:1 ;氯金酸与树状大分子的摩尔比为200:1 ;Gd (NO3) 3与树状大分子的摩尔比为35:1 ;所述的三乙胺、乙酸酐和树状大分子的摩尔比为660:50:1。
10.根据权利要求I所述的一种具有叶酸靶向功能的CT/MR双模态成像纳米造影剂的制备方法，其特征在于步骤(I)、(2)和(3)中所述的透析均为用透析膜先在PBS缓冲液中透析20-30h，然后再在蒸馏水透析40-60h ;其中所述的透析膜为纤维素透析膜MWC0=1000。
全文摘要
本发明涉及一种具有叶酸靶向功能的CT/MR双模态成像纳米造影剂的制备方法，包括(1)制备FA-PEG-COOH；(2)用DOTA-NHS、COOH-PEG-FA、mPEG-COOH修饰树状大分子，得到DOTA和叶酸修饰的聚乙二醇化树状大分子；(3)在步骤(2)得到的树状大分子溶液中加入氯金酸溶液、NaBH4溶液、Gd(NO3)3·6H2O；再加入三乙胺、乙酸酐，反应结束后透析、冷冻干燥即可。本发明的制备方法简单，反应条件温和，易于操作，具有产业化实施的前景；本发明的CT/MR双模态成像纳米造影剂具有较好的水溶性、稳定性、对叶酸受体高表达癌细胞具有特异性的靶向作用，有望应用于肿瘤的早期检测。
文档编号A61K49/12GK102671217SQ20121018321
公开日2012年9月19日 申请日期2012年6月5日 优先权日2012年6月5日
发明者史向阳, 张贵祥, 李康安, 温诗辉, 陈潜 申请人:上海市第一人民医院, 东华大学