专利名称：丹参内酯在制备抗肿瘤血管新生药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及丹参内酯(tanshinlactone)的新用途,特备是涉及其在制备抗肿瘤血管新生药物中的应用，属于抗血管新生化合物领域。
背景技术：
肿瘤血管新生是一种高度调节过程，即在短期内发生，然后完全终止。肿瘤生长和转移依赖于血管新生，首个证实肿瘤产生血管生长因子的理论的实验，是Greenblatt等的移植黑素瘤或子宫绒毛膜癌细胞促进血管增殖的试验；结果表明肿瘤细胞的增殖与血管形成密切相关，因而提供了肿瘤血管新生是由肿瘤细胞产生的可扩散因子介导的证据。在主要的血管丛形成后，这些内皮细胞由出芽或从原有血管分裂方式形成新毛细血管。血管新生依赖由宿主和肿瘤细胞释放的多种分子间的平衡，经过一系列步骤，包括从血管周边细胞和基底膜上分离内皮细胞，侵入和移出基底膜，最终扩展入肿瘤实质中。特异的血管生长 分子能启动此过程，特异的抑制分子能终止此过程。目前，肿瘤的治疗手段主要依赖化学治疗，放射治疗，手术治疗的方式，但是，这些手段存在副作用大，特异性差等缺点。目前医药界致力于寻找一种作用靶点明确，副作用小，疗效良好的药物，从天然产物中分离制备新的有血管新生抑制作用的化合物成为医药领域的研究热点。丹参内酯分子式为C17H12O3,白色针状结晶，分子量为264，可由唇形科鼠尾草属(SlaJvia)多种植物(例如丹参iSavia miItiorrhiza)^甘西鼠尾 (.Salvia przewalskii Maxim),云南鼠尾 (.Salvia yunnanensis C.
H.Wright)等)的干燥根或根茎中提取制得；丹参内酯的化学结构式如下
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丹赘 Ctot^aifeclone!
目前，对于丹参内酯的研究，局限于对于其化学结构的研究。在药理活性方面，将丹参内酯单独作为药理活性成分的研究没有报道。近年来，随着对癌症、视网膜病变以及系统性红斑狼疮的发病机理的进一步研究发现，血管新生是一个引发此类疾病的关键生理步骤，所以血管新生抑制剂的研究也成为医药研究领域的一个热点。目前，比较常见的血管新生抑制剂主要为化学药，如地非三唑、普利等；也有部分是来自于生物来源，如肽类、外源色素上皮衍生因子等。
发明内容
本发明目的在于提供一种丹参内酯(tanshinlactone)的新用途，即丹参内酯在制备抗肿瘤血管新生药物中的应用，其作为抗肿瘤血管新生药物的主要活性成分或与其他活性成分配合使用制成药物，作为血管新生抑制剂来治疗癌症。本发明的丹参内酯可以从天然植物提取的，也可以是化学合成的。本发明所述应用中可以加入一种或多种药物上可接受的辅料，所述辅料包括药学领域常规的填充剂、稀释剂、粘合剂、赋形剂、吸收促进剂、填充剂、表面活性剂和稳定剂等，必要时还可加入香味剂、色素和甜味剂等，制成胶囊剂、丸剂、粉剂、片剂、粒剂、口服液和注射液等多种形式。本发明利用人肝癌细胞株H印G-2，通过MTT实验，来测试丹参内酯对肿瘤细胞的增殖影响；实验结果显示，丹参内酯浓度在O. 5、I. 0,2. 5,5. 0U0ug/mL时能够有效的抑制肿瘤细胞的增殖。本发明利用鸡胚尿囊膜实验模型，来测试丹参内酯对于体内实验模型血管新生的影响；实验结果显示，丹参内酯能够有效的抑制鸡胚尿囊膜血管的生长，在10.0、15.0 ug/mL可以显著抑制血管新生，其作用强于阳性药物，显示出良好的血管新生抑制活性。以上实验结果显示，丹参内酯可以抑制血管的异常生长，抑制肿瘤细胞，可以作为血管新生抑制剂的有效成分，单独应用或者合用或与可接受的赋形剂等结合，按照常规方法制成口服剂或非口服性用于治疗癌症及血管异常新生引发的相关疾病。
图I是本发明从云南鼠尾草中分离丹参内酯的工艺流程示意图。图2是本发明丹参内酯用于人肝癌细胞株IfepG-2的实验结果示意图(不同丹参内酯给药浓度的MTT试验测试结果)；
图3是本发明丹参内酯用于人肝癌细胞株!fepG-2的实验结果示意图(不同浓度丹参内酯对!fepG-2细胞株增殖影响的抑制率结果)；
图4是本发明丹参内酯对鸡胚尿囊膜血管新生抑制作用结果示意图(丹参内酯作用于鸡胚尿囊膜，经IPP图像处理软件处理后抑制血管生长的实验结果)，其中a生理盐水组，b地塞米松组，c丹参内酯5 ug/mL组，d丹参内酯10ug/mL组，e丹参内酯15 ug/mL组；
图5是本发明丹参内酯对鸡胚尿囊膜血管新生抑制作用结果示意图(血管生长面积数据统计结果)。
具体实施例方式以下结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明，但在本发明的的保护范围不限于下述的实施例，实施例中，未注明具体条件的实验方法，按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件进行实验。实施例I :丹参内酯的制备(下述实施例中使用的丹参内酯是采用如下方法制备得到的)采用唇形科鼠尾草属植物云南鼠尾草yunnanensis C. H. Wright)的干燥根或根茎10千克，粉碎成粗粉，用25L丙酮冷浸提取，反复三次，浓缩得粗浸膏；浸膏用水配成悬浮液，用乙酸乙酯萃取，得到乙酸乙酯段；该段采用硅胶柱色谱分离，石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，得到5个部分洗脱段，其中9:1洗脱部分再采用硅胶色谱柱，氯仿-丙酮梯度洗脱(依次采用8:1、5:1、3:1洗脱)，将5:1的洗脱部分用RP-C18柱色谱甲醇-水梯度洗脱(依次用80:20、85:15洗脱)，将85:15洗脱部分用葡聚糖凝胶色谱(氯仿-甲醇1:1洗脱)分离纯化，最后用半制备高效液相色谱(semipre-HPLC)制备得到丹参内酯IOmg (见图I);其所得核磁数据与丹参内酯 Luo H-W 等 Tanshinlactone, a novel seco-abietanoid fromSalvia miltiorrhiza. Chem. Pharm. Bull. 1986, 34, 3166-3168.中报道的数据一致，1H-NMR和13C-NMR检测数据如下
1H NMR (400 MHz, CDC13) δH
8. 38 (1Η, d, J = 8. 2，H—1), 7.46 (1H, dd, J = 8. 2，8.2，H—2)，7. 38 (1H, d,J = 8.2，H-3), 7.80 (1H, d, J = 8.8，H-6), 7. 74 (1H, d, J = 8.8，H—7)，7. 37 (1H,s, H-16), 2. 36 (3H, s，Me_17), 2.66 (3H, s, Me-18)
13C NMR (100 MHz, CDC13)
δ C 120.6 (C-I)，126.8(C-2), 128.8 (C_3)，134.5 (C_4)，123.3 (C_5)，120.7(C-6), 116.6 (C-7), 110.2 (C_8), 107.9 (C_9)，133. I (C-IO), 158.6 (C—ll), 158.6(C-13), 149.5( C-14), 141.0 (C-15), 120.3 (C—16)，8.5 (C-17), 19.6 (C-18)
根据以上核磁波谱信息，确定其结构为丹参内酯(Tanshinlactone), CAS No.105351-70-0。
实施例2 :丹参内酯对人肝癌细胞株IfepG-2增殖的影响实验
将人肝癌细胞株H印G-2在37°C，5% CO2培养24小时，将其按照3000个/孔的接种量接种至96孔板中，在上述条件下培养24小时后，将丹参内酯制成0. 5,1. 0,2. 5,5. O、10. 0ug/mL的不同浓度药液加至96孔板中，在37°C，5% CO2的条件下继续培养72小时，小心移出上清液，每孔加入150 μ LDMSO,震荡lh，于酶标仪490nm处测吸光度A值。如图2结果显示当丹参内酯浓度为5. 0ug/mL和10ug/mL时MTT实验的吸光度明显下降，说明肿瘤细胞增殖活性明显下降；根据
抑制率=1-加药组OD值/对照组OD值
计算出抑制率，如图3显示，在丹参内酯浓度为5. 0ug/mL和10ug/mL时该化合物对于细胞的抑制率显著提高。
实施例3 :丹参内酯的鸡胚尿囊膜实验，具体操作如下
1、购买三天内生产的新鲜种蛋，用84消毒液或是新洁尔灭对种蛋进行表面擦拭消毒，之后将种蛋放入恒温培养箱，设置温度37. 8°C，保持一定湿度(60%)，在此条件下孵育7天。2、开窗与给药
2.I空白对照溶液、阳性对照溶液和丹参内酯溶液的制备⑴空白对照溶液制备用空白生理盐水作对照；⑵阳性对照溶液制备用5 mg/mL地塞米松磷酸钠注射液作为阳性对照；(3)丹参内酯溶液制备准确称取丹参内酯2mg用无水乙醇配置成lmg/mL的母液备用，、利用上述母液分别用无水乙醇稀释配置成5 μ g/mL, 10 μ g/mL, 15 μ g/mL的丹参内酯乙醇溶液冷藏备用；
2.2开窗与给药具体操作如下(1)用75%乙醇消毒液对鸡胚大头端表面进行消毒处理，⑵用扁角镊子依次去除蛋壳、壳膜，暴露气室膜，⑶用注射器和弯角镊子分离气室膜与尿囊膜，暴露尿囊膜组织，⑷将药物通过载药片给到尿囊膜上血管相对稀疏的区域；
给药后，用透明胶带封窗，在温度37. 8°C，湿度(60%)的条件下培养48小时；
3、标本制作与图像采集
3. I标本制作揭开封口透明胶带，向给药窗口中滴加2mL固定液(甲醇丙酮=1:1)，固定IOmin后，待血管固定完全后，剥离气室周围的蛋壳，使给药区域的尿囊膜充分暴露，用手术剪剪下以载体为中心的约2. 5X2. 5cm2范围内的尿囊膜组织，平铺于装有PBS缓冲 液的培养皿中，使其充分展开，然后将其转移至载玻片上；
3.2图像采集以白纸为背景，在自然光线条件下用数码照相机进行拍照，原位拍摄以药物载体(载药片)为中心的鸡胚尿囊膜照片；
4、数据处理将采集的尿囊膜照片用软件进行图像处理计算血管面积，之后采用SPSS数据分析软件对数据进行分析。实验结果显示，图4为经IPP软件处理后增强对比度的照片，从图中可以明显看出，当丹参内酯的给药浓度为10. O、15. O ug/mL时，血管生长明显受到抑制；图5显示了经面积计算后血管面积的柱状图，从图中可以看出当给药浓度为10. 0、15. O ug/mL,血管面积明显下降。
权利要求
1.丹参内酯在制备抗肿瘤血管新生药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了丹参内酯在制备抗肿瘤血管新生药物中的应用，实验结果显示将丹参内酯作为一种血管新生的拮抗剂，具有抗血管生成的作用，通过抑制肿瘤组织中的血管生成，从而抑制肿瘤的生长，特别是病理性与血管生成相关或由其引发的肿瘤生长。
文档编号A61P35/00GK102670623SQ20121019174
公开日2012年9月19日 申请日期2012年6月12日 优先权日2012年6月12日
发明者何静, 向诚, 庄文婷, 张林东, 戴伟锋, 李宝才, 李鹏, 角仕云 申请人:昆明理工大学