专利名称：动态观测肿瘤与新生血管的方法
技术领域：
本发明属肿瘤生物学领域，具体涉及一种动态观测肿瘤细胞生长过程和肿瘤宿主血管改变与新生血管形成的方法。
肿瘤是危害人类健康、威胁人类生命的主要疾病。实体瘤无论是原发肿瘤还是转移病灶，由单个的肿瘤细胞进展到肿瘤块的过程十分复杂，除了肿瘤细胞自身须不断增殖并向周围组织浸润、扩展外，宿主特别是靶器官和靶组织还必须发生一系列的适应性变化，不仅容忍肿瘤细胞的存在，而且还向肿瘤细胞提供生长、增殖所需的各种营养成分和O2等，其中肿瘤新生血管被认为是最重要的改变。
对肿瘤新生血管的认识和研究经历了一百多年的历史。一百多年前即已观察到肿瘤组织比正常组织血管更丰富的现象，但认为这是肿瘤的代谢和坏死产物引起的宿主血管扩张所致。1939年Ide用兔耳作实验发现创伤引起的新生血管在伤口愈合后便完全消退，而植入肿瘤常常伴随加快了的新生血管形成。1945年Algire提出在移植肿瘤附近的新生血管来自宿主血管，而非肿瘤起源的。但在当时这一看法没有得到其他人的认可。此后，围绕肿瘤是由原已存在的血管还是新生的血管供血的问题争论了二十余年，虽然少数学者接受了肿瘤可诱导新生血管形成的概念，但还是认为这种血管反应是一种炎症性反应，而非肿瘤生长所必须的。
1971年Folkman根据离体灌注的器官中肿瘤的生长因缺乏新生血管而严重受限，提出肿瘤生长是新生血管依赖性的新概念。此后，人们一直在寻找证据证实肿瘤新生血管是由于肿瘤细胞产生的可弥散的血管生成因子诱导的，并试图通过阻断肿瘤新生血管抑制肿瘤生长和转移。
为了深入研究肿瘤新生血管形成过程和机理，评价抗新生血管药物和治疗方法的疗效，陆续发展了许多研究新生血管的方法，归纳起来可分为两大类，即体外研究方法和体内研究方法。体外研究方法中最常用的是血管内皮细胞培养，其中最常用的是脐静脉内皮细胞，根据内皮细胞的生长速度判断对血管增生的影响。另一种方法为血管环内皮细胞迁移实验，观察动脉环内皮细胞生长与迁移的距离，确定对血管生长的影响。体内研究方法有鸡胚尿囊绒毛膜血管的观察，角膜微囊袋实验和仓鼠颊部打孔实验等。上述各种实验方法虽可从不同的角度反映血管的增生情况，但无法直接反映和观测肿瘤细胞与宿主之间的相互作用，以及在肿瘤生长过程中新生血管数量、分布、功能等的动态变化过程。
目前用于观察和研究肿瘤新生血管形成过程及其机理的方法有1.肿瘤组织病理切片常规及特殊染色后血管计数在同系或免疫功能缺陷的小鼠体内接种肿瘤细胞，待肿瘤生长到一定大小后，切取肿瘤组织及全身其它脏器，经固定、包埋、切片后作HE染色或免疫组织化学染色。其优点是能较好的反映肿瘤局部肿瘤细胞与新生血管的细微结构和相互关系，但是对同一肿瘤而言无法作连续动态观察。也无法反映整个肿瘤血管的全貌。2.肿瘤皮窗模型或肿瘤颅窗模型采用外科手术方法切除小鼠或大鼠背部部分皮肤，然后用特制的金属支架支撑背部皮肤，并在切口处接种肿瘤细胞，然后加盖消毒过的玻璃片，使皮肤切口正好在玻片下，可通过透明的玻璃片观察肿瘤生长和血管生成过程。肿瘤颅窗模型基本与皮窗模型相同，其优点是能动态显示肿瘤生长和新生血管形成过程。但由于肿瘤细胞没有明确的标记很难与宿主细胞区别。因此，只有当肿瘤细胞增长到一定的数量形成肿块或局部密度明显增加后才能作出明确的判断。而且手术创伤本身可启动新生血管形成，所以在观察和评价肿瘤新生血管方面仍然有一定的局限性。
为了标记活的肿瘤细胞近些年来已进行了不少探索和尝试。有报道利用放射性同位素或荧光染料标记肿瘤细胞，由于同位素自身衰减、荧光染料自身淬灭，以及细胞在增殖分裂过程中同位素及荧光染料稀释。因此，标记维持时间不长，不适合作长期体内观察。另有报告将大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因(LacZ)转入肿瘤细胞，筛选稳定转导LacZ基因的肿瘤细胞接种到动物体内。由于LacZ基因已整合到肿瘤细胞DNA中，因此，可随肿瘤细胞分裂而进入子细胞，持续不断地在肿瘤细胞内表达，表达LacZ的肿瘤细胞经过固定及染色后可变为蓝色，因此，很容易与未经染色的宿主细胞区别，等于给肿瘤细胞贴上了一个遗传标签，只要表达LacZ即可确定为肿瘤细胞，简便、准确。但是，显色必须经过固定和染色，因此仍然不适合作活组织及体内动态显示。
绿色荧光蛋白(GFP)来自海洋可自发荧光的水母，通过基因改造产生的突变型GFP能发出更强的绿色荧光，广泛用于标记活细胞。有实验将GFP表达质粒转入大鼠乳腺癌细胞株R3230AC和小鼠乳腺癌细胞株4T1，通过G418筛选出稳定表达GFP的肿瘤细胞。然后将经过GFP标记的肿瘤细胞移植入大鼠和小鼠的皮窗内，建立了新型的肿瘤皮窗模型，由于肿瘤细胞在荧光显微镜下发出绿色荧光，很容易与宿主细胞区别，即使是单个的肿瘤细胞也可以得到清楚的显示和区分，能够很好地显示肿瘤细胞生长过程。由于仍然涉及手术操作，在观察和评价新生血管方面还是没有克服皮窗模型固有的缺点。
本发明的目的是建立一种简便、可靠，特别是无创伤，同时又能直观、实时、动态显示活体内肿瘤细胞生长与瘤体形成过程，尤其是肿瘤局部血管改变及新生血管形成过程的方法。本发明的进一步目的是对体内肿瘤细胞生长、浸润、转移过程中肿瘤细胞与宿主血管间的相互作用的瞬时状态和进展过程进行实时显示和跟踪观测，包括肿瘤细胞的数量、生长方式、生长状态、分布与形态特征等，以及宿主血管形态与通透性改变、新生血管的数量、形态、分布与渗漏情况等。本发明还有一个目的是为评价各种抗肿瘤药物、基因或生物治疗方法，特别是针对肿瘤新生血管的药物和方法的疗效提供有效且可靠的工具和手段。
本发明利用小鼠耳部半透明的结构，以经过GFP基因标记的肿瘤细胞为基础，通过微量注射器将1×102-1×104肿瘤细胞注射到耳部皮下，采用荧光显微镜直接观察移植到耳部皮下发绿色荧光的肿瘤细胞生长、浸润、迁移及瘤体形成过程。同时利用红色荧光素(Rhodomine)标记的大分子物质—葡聚糖(Dextran)作为血管造显的示踪剂，荧光显微镜观察肿瘤局部宿主血管的改变及肿瘤新生血管形成的动态变化过程。由于红色荧光素的存在可以更清晰地显示各级大小血管扩张扭曲等形态改变，并能显示管壁通透性的改变。结合肿瘤的绿色荧光和血管的红色荧光，新的肿瘤耳窗模型将比过去采用的任何方法更简便、更客观、更准确观测到肿瘤生长及肿瘤诱导的宿主血管改变与新生血管形成的动态变化过程。
本发明方法是通过下述步骤实现的。1、建立持续、稳定、高水平表达GFP的肿瘤细胞株，采用阳离子脂质体介导GFP真核表达质粒(PEGFP-N1)转染肿瘤细胞，或采用GFP逆转录病毒感染肿瘤细胞，G418筛选抗性克隆。然后在荧光显微镜下挑选GFP表达水平最高的克隆大量扩增，选择生长速度、生长方式和形态无明显改变的克隆作体内肿瘤生长试验。本发明所涉及的有关肿瘤细胞为小鼠膀胱移行细胞癌细胞株B77-739，人结肠癌细胞株Lovo。(中国专利申请号01105696.7)。2、小鼠耳部皮肤的准备与接种选择体重20g左右的T739小鼠或Balb/c裸小鼠，腹腔注射戊巴比妥钠(50mg/kg)麻醉后用脱毛膏退去耳部皮肤的毛发。次日处于对数生长期的肿瘤细胞经胰蛋白酶消化后，用PBS洗涤二次，按1×103/ml或1×104/ml重悬于PBS中，用微量注射器吸取10ul细胞悬液注射到耳部中央皮下。3、动态观察肿瘤细胞生长过程接种肿瘤细胞后即刻每天或隔天麻醉小鼠，将接种有肿瘤细胞的鼠耳置倒置显微镜(Zeizz)载玻片上，以450-490nm兰光作为激发光，采用546nm滤光片观察肿瘤细胞及生长迁移浸润和瘤体形成过程。使用高倍镜观察单个肿瘤细胞及形态特征。4、观测荧光血管造影及肿瘤局部血管改变选用经Rhodamine标记的Dextran(分子量为150000Da)100ul(1mg/ml)尾静脉注射。注射后立即在570nm绿光照射下，采用nm滤光片观察各级大小血管包括深层的毛细血管，后期根据荧光素渗漏的情况判断肿瘤血管管壁的通透性改变。5、同时观察肿瘤与血管利用肿瘤细胞发绿色荧光和血管发红色荧光的特点，采用组合滤光片或者将肿瘤与血管造影的图象重叠同时观察肿瘤与血管，可以直观、准确、观测和评价肿瘤生长与肿瘤新生血管。
本发明经动物实验，结果可见移植到T739小鼠耳部的膀胱移行细胞癌细胞生长、瘤体形成至肿瘤萎缩消退的全过程。以及在肿瘤生长和消退过程中新生血管形成、分布、形态特征、同透性改变的全过程。
图1是小鼠耳部皮下接种肿瘤细胞后癌细胞生长、瘤体形成以及新生血管形成过程观测结果。
其中耳部皮下接种肿瘤细胞后第2天，接种部位可见少量发绿色荧光的肿瘤细胞，甚至单个的肿瘤细胞也可以被观察到，放大倍数50倍。耳部皮下接种肿瘤细胞后第7天，肿瘤细胞明显增多，肿瘤体积增大，放大倍数50倍。耳部皮下接种接种肿瘤细胞第9天，肿瘤继续增大，放大倍数50倍。耳部皮下接种肿瘤细胞后第14天，肿瘤增大，肿瘤边缘隐约可见新生血管，放大倍数50倍。血管造影可十分清晰地观察到各级大小血管，包括形态、走向，显微镜下还可观察到血流情况。同时观察肿瘤及血管，由于肿瘤发绿色荧光，血管发红色荧光，可明确肿瘤的位置、分布、形态，以及新生血管与肿瘤的关系。耳部皮下接种肿瘤细胞后第17天，肿瘤体积进一步增大，放大倍数50倍。血管造影可见肿瘤周围的血管进一步增多，并扩张，血管通透性增加，渗漏明显。同时观察肿瘤及血管，可见肿瘤内及周围有明显的新生血管形成，肿瘤所在部位管壁通透性增加，渗漏荧光素。
本发明利用鼠耳半透明的结构，结合GFP基因标记肿瘤细胞与Rhodamine标记的Dextran血管造影技术，建立了一种十分简便、可靠，尤其是无创伤，同时又能直观、实时、动态显示活体内肿瘤细胞生长与瘤体形成过程，特别是肿瘤局部血管改变与新生血管形成过程的新方法。不仅能实时显示而且也能动态观测肿瘤的大小、生长状态、生长方式、肿瘤细胞诱导新生血管形成的能力、新生血管形成开始的时间、生长速度、血管网的形成、分布、数量、通透性及其与肿瘤生长速度、转移等的关系。为研究肿瘤生长与新生血管的相互关系及调控机理，为评价抗肿瘤特别是抗新生血管形成药物及基因治疗方法的疗效等提供了一种简便、可靠的工具。
权利要求
1.一种动态观测肿瘤与新生血管的方法，其特征是利用鼠耳半透明的结构，结合GFP基因标记肿瘤细胞与Rhodamine标记的Dextran血管造影技术，建立简便、可靠，无创伤，同时又能直观、实时、动态显示活体内肿瘤细胞生长与瘤体形成过程和肿瘤局部血管改变与新生血管形成过程的方法。
2.按权利要求1所述的动态观测肿瘤与新生血管的方法，其建立的步骤如下(1)建立持续、稳定、高水平表达GFP的肿瘤细胞株。(2)准备小鼠耳部皮肤与接种选择T739小鼠或Balb/c裸小鼠麻醉后退去耳部皮肤的毛发，次日将胰蛋白酶消化后的细胞悬液注射到耳部中央皮下。(3)动态观察肿瘤细胞生长过程接种后即刻每天或隔天麻醉小鼠，将鼠耳置倒置显微镜(Zeizz)载玻片上，以450-490nm兰光作为激发光，采用546nm滤光片观察肿瘤细胞及生长迁移浸润和瘤体形成过程，使用高倍镜观察单个肿瘤细胞及形态特征。(4)观测荧光血管造影及肿瘤局部血管改变选用经Rhodamine标记的Dextran尾静脉注射，在570nm绿光照射下，采用nm滤光片观察各级大小血管和深层的毛细血管以及肿瘤血管壁的通透性改变。(5)同时观察肿瘤与血管采用组合滤光片或者将肿瘤与血管造影的图象重叠，同时观测肿瘤生长与肿瘤新生血管。
3.权利要求1所述的动态观测肿瘤与新生血管的方法，其特征是所述的Rhodamine标记的Dextran血管造影示踪剂分子量为150000Da。
全文摘要
本发明属肿瘤生物学领域,具体涉及采用鼠耳作为肿瘤细胞移植与观察部位,结合GFP基因标记的肿瘤细胞和Rhodamine标记的Dextran作血管造影,非创伤性的、直观、实时、动态显示肿瘤细胞生长和新生血管形成过程的新方法,本发明突出的特征是非创伤性避免了手术创伤诱导的新生血管形成,操作简便、判断准确,为观察和研究肿瘤诱导的新生血管形成过程和机理,为评价抗肿瘤特别是抗新生血管形成药物与基因治疗方法等提供了有效且可靠的手段。
文档编号C12N15/84GK1336158SQ0111320
公开日2002年2月20日 申请日期2001年6月29日 优先权日2001年6月29日
发明者黄倩, 李川源, 李凌 申请人:上海市第一人民医院