一种耐受抗血管新生治疗的肿瘤细胞系及其建立方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种耐受抗血管新生治疗的肿瘤细胞系及其建立方法和应用，通过使用抗血管新生药物治疗荷瘤小鼠，通过体内多次治疗及筛选而成抗药性，最后分离培养获得。本发明通过皮下接种荷瘤小鼠，通过多轮治疗并筛选的方法获得的耐受抗血管新生治疗的小鼠肺癌细胞系更接近临床，通过研究药物耐受细胞系与原始细胞系表达基因的差异，可用于研究导致出现抗血管新生治疗药物耐受的关键基因，为筛选导致药物耐受的靶点奠定了基础，同时也为临床用药指导提供了依据。
【专利说明】一种耐受抗血管新生治疗的肿瘤细胞系及其建立方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于荷瘤小鼠药物耐受模型领域，特别涉及一种耐受抗血管新生治疗的肿瘤细胞系及其建立方法和应用。
【背景技术】
[0002]恶性肿瘤是威胁人类健康的严重疾病。据中国卫生部发布的《2010年中国卫生统计年鉴》，中国恶性肿瘤在所有疾病死亡原因中居首位，其中，统计资料显示死亡率排名前十位的恶性肿瘤中，肺癌居首位，为人民生活和社会发展带来严重的经济和社会负担。近年来，肺癌和其他肿瘤的治疗和基础研究取得了较大发展，其中抗血管新生药物是一类新的药物。
[0003]血管新生(Angiogenesis)是指体内已存在的血管生长出新的血管的过程。在成人体内，血管新生只见于少数病理(例如肿瘤)和生理过程中。美国哈佛大学Folkman教授在四十年前提出，肿瘤的生长和转移依赖于血管新生，肿瘤通过新生血管得到氧气和营养供应，肿瘤生长到一定体积后如果未建立血管便会停止生长，因此，可以通过抑制血管新生达至1J治疗月中瘤的目的[Folkman J.Tumor angiogenesis: therapeutic implications.N EnglJ Med.1971，285:1182-6]、[Folkman J, Angiogenesis in cancer, vascular, rheumatoidand other disease.1995, Nature Medicine.1:27-30]。近几年的临床试验证据证明了这一理论的正确性，抗血管新生(Ant1-angiogenesis)药物是目前肿瘤新药开发的热点之一 [Kerbel RS.Tumor angiogenesis.N Engl J Med.2008，358:2039-49]、[Cao Y.Tumorangiogenesis and molecular targets for therapy.Front Biosc1.2009，14:3962-73]、[Heath VL, Bicknell R.Anticancer strategies involving the vasculature.Nat RevClin Oncol.2009，6:395-404]。
[0004]血管新生过程受多种刺激因子和抑制因子的调节[Hanahan D, FolkmanJ.Patterns and emerging mechanisms of the angiogenic switch duringtumorigenesis.Cell.1996, 86:353-64]。抗血管新生治疗的基本原理在于阻断血管新生刺激因子或者用血管新生抑制因子阻止肿瘤血管的形成和生长。目前已经知道相当数目的血管新生刺激因子,例如血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growthfactor, VEGF)、成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor, FGF)、肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor, HGF)等，这些因子能刺激血管内皮细胞的分裂、分化和血管的形态发生。其中，VEGF是目前所知对血管新生最特异、最有效的生长因子[Ferrara N, Gerber HP, LeCouter J.The biology of VEGF and its receptors.NatMed.2003，9:669-76]、[Ferrara N.Vascular endothelial growth factor as a targetfor anticancer therapy.0ncologist.2004，1:2-10]。在肿瘤组织内的缺氧环境中，肿瘤细胞分泌大量的VEGF，诱导血管内皮细胞的分裂和迁移，最终在肿瘤建立血管网络。众多动物实验证明，抑制VEGF能阻止血管的新生，进而抑制肿瘤的生长。正因为此，VEGF及其受体是目前抗血管新生药物最重要的靶标。至今，美国FDA已经批准了多个具有抗血管新生作用的抗肿瘤药物，它们都直接或间接地作用于VEGF的信号传递。其中，VEGF-Trap(Aflibercept)和Avastin (Bevascizumab)直接阻断VEGF,抑制肿瘤血管的新生，因此是严格意义上的抗血管新生药物，其他几个药物除了抗血管新生外还抑制肿瘤细胞的分裂，
具有多重作用。
[0005]Avastin是一种人源化的抗VEGF的单克隆抗体，由美国著名生物技术公司Genentech生产。在大规模三期临床试验中，Avastin与化疗联合用药可以显著延长多种肿瘤病人的生存时间，包括直肠癌、肺癌、乳腺癌、肾癌等[Jenab-Wolcott J, GiantonioBJ.Bevacizumab: current indications and future development for managementof solid tumors.Expert Opin Biol Ther.2009，9 (4):507-17]、[Summers J,CohenMH, Keegan P, Pazdur R.FDA drug approval summary:bevacizumab plus interferon foradvanced renal cell carcinoma.0ncologist.2010，15 (I): 104-11]。美国生物技术公司Regeneron和Sanof1-Aventis合作的VEGF-Trap在结肠癌、肺癌等癌症的治疗中具有显著的疗效，已经被美国FDA批准进入临床应用。抗血管新生药物在临床上的成功具有重要意义，它证明以肿瘤血管系统为靶标的抗血管新生治疗是在临床上有效的治疗手段，为多种肿瘤的治疗开辟了一个全新的途径。
[0006]虽然以Avastin为代表的抗血管新生药物在肿瘤治疗上取得了很大的成功，但是，大量临床试验也发现了这一药物的局限。从临床效果看，Avastin延长病人的半数生存时间约 3 ~4 个月[Hurwitz H, Fehrenbacher L, Novotny ff, Cartwright T, HainsworthJ, Heim ff, Berlin J,Baron A, Griffing S, Holmgren E, Ferrara N, Fyfe G, Rogers B, RossR, Kabbinavar F.Bevacizumab plus irinotecan,fluorouracil, and leucovorin formetastatic colorectal cancer.N Engl J Med.2004, 350(23):2335-42]> [SandlerA,Gray R, Perry MC, Brahmer J, Schiller JH,Dowlati A, Lilenbaum R,JohnsonDH.Paclitaxel-carbop latin alone or with bevacizumab for non-small-cell lungcancer.N Engl J Med.2006，355 (24): 2542-50]，因此，Avastin 并不能长期有效地抑制肿瘤血管的生长。其中一个重要的原因可能是肿瘤细胞能在治疗过程中获得逃逸抗血管新生治疗的能力，即对抗VEGF治疗出现抗性。肿瘤如何获得对抗血管治疗的抗性是一个非常复杂的问题[Si Z., Liu J.What“helps，，tumors evade vascular targeting treatment?ChinMed J, 2008，121(9):844-849.Mol Ther.2007，15(6):1153-9]。对于大多数肿瘤来说，VEGF是肿瘤血管建立和生长的关键因子，但是由于肿瘤细胞非均质性和肿瘤微环境的复杂性，在抗VEGF的治疗过程中其他刺激血管新生的基因可能会得到表达，从而使肿瘤血管的生长不再依赖于VEGF信号途径。
[0007]了解肿瘤逃逸抗血管新生治疗的分子机理对于研究新一代抗血管新生和抗肿瘤药物，或者科学合理地设计抗肿瘤药物的联合用药具有重要意义。但是，缺乏理想的动物模型是制约系统研究抗血管新生药物耐受现象的重要原因。
【发明内容】
[0008]本发明所要解决的技术问题是提供一种耐受抗血管新生治疗的肿瘤细胞系及其建立方法和应用，该细胞系更接近临床，通过研究药物耐受细胞系与原始细胞系表达基因的差异，可用于研究导致出现抗血管新生治疗药物耐受的关键基因，为筛选导致药物耐受的靶点奠定了基础，同时也为临床用药指导提供了依据。
[0009]本发明的一种耐受抗血管新生治疗的肿瘤细胞系，所述细胞系通过使用抗血管新生药物治疗荷瘤小鼠，通过体内多次治疗及筛选而成抗药性，最后分离培养获得。
[0010]所述抗血管新生药物为血管内皮细胞生长因子抑制剂。
[0011]所述血管内皮细胞生长因子抑制剂为VEGF-Trap。
[0012]所述肿瘤细胞系为小鼠Lewis肺癌细胞系。
[0013]所述小鼠为C57BL/6J、裸鼠或SCID鼠。
[0014]本发明的一种耐受抗血管新生治疗的肿瘤细胞系的建立方法，包括:[0015](I)构建抗血管新生药物VEGF-Trap，详细方法可以参见Holash等的文献(Holash, J., et al., VEGF-Trap: a VEGF blocker with potent antitumor effects.ProcNatl Acad Sci U S A, 2002.99 (17):p.11393-8)。简述如下:将编码 VEGF 受体(VEGFR)-1的第二个免疫球蛋白样结构域、VEGFR2的第三个免疫球蛋白样结构域和人免疫球蛋白(IgG) -1的Fe片段的基因相融合，构建重组表达质粒，转染中国仓鼠卵巢细胞(CH0)，经过细胞筛选等步骤获得稳转细胞株，使用Protein A等方法纯化目的蛋白VEGF-Trap。
[0016](2)在使用VEGF-Trap治疗前，首先使用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测VEGF-Trap 结合 VEGF165 的活性。首先将 20ng/mL VEGF165CR & D 公司)包被于 96 孔 ELISA板上，每孔ΙΟΟμ L，4°C过夜，使用PBST (于IL PBS中加入ImL Tween-20)洗涤液洗涤五次后，每孔加入200 μ L鲜配制的1%BSA (KPL公司)室温封闭I小时，然后加入梯度稀释的每孔100 μ L VEGF-Trap，37°C孵育2小时，使用PBST洗涤液洗涤五次后，每孔加入100 μ L HRP标记的羊抗人IgG Fe抗体(Bethyl公司)，37°C孵育I小时后，使用PBST洗涤五次后，每孔加入100 μ L显色液(KPL公司)，避光反应10-15分钟至颜色出现，加入100 μ L终止液(KPL公司)终止反应,然后于酶标仪上读取450nm吸光度值。
[0017](3)耐受抗VEGF-Trap的Lewis小鼠肺癌细胞系的筛选的步骤:
[0018]I)复苏原始Lewis小鼠肺癌细胞株(购自中科院细胞库)，于含10%FBS的DMEM高糖培养基(Hyclone公司)中培养，及时换液和传代，保证细胞以良好的状态生长，用于接种小鼠。
[0019]2)用0.25%胰酶(GIBC0公司)消化分裂旺盛的贴壁细胞，1000r/min离心5min收集细胞，用PBS洗涤2次后，重悬于无血清的DMEM高糖培养基中，台盼蓝(Sigma公司)染色后用血球计数板观察计数，活细胞数大于95%备用。
[0020]3)使用70%酒精棉球局部消毒接种部位，用一次性ImL无菌注射器吸取细胞悬液，每只小鼠于右侧后肢外侧皮下接种0.2mL (I X IO6)细胞悬液，继续饲养。
[0021]4)接种后用游标卡尺测量肿瘤的长轴(a)和短轴(b)，按公式:肿瘤体积(立方毫米)=0.5 X ab2，计算肿瘤体积，待肿瘤体积长到约100立方毫米时，随机分组，每组10只小鼠并开始治疗。
[0022]5)每周两次腹腔注射10mg/kg VEGF-Trap或PBS，同时测量小鼠的体重和肿瘤大小。
[0023]6)待生长最快的肿瘤达到1500立方毫米时，无菌剥离肿瘤，消化成单细胞悬液，用DMEM培养基培养，为第一轮耐受抗VEGF-Trap治疗的lewis小鼠肺癌细胞，液氮冻存保种。
[0024]7)将第一轮耐受抗VEGF-Trap治疗的Lewis小鼠肺癌细胞按同样的方法接种到小鼠皮下后进行治疗，同样剥离生长速度最快的细胞，制备单细胞悬液，用DMEM培养基培养后冻存保种，从而得到第二轮耐受抗VEGF-Trap治疗的Lewis小鼠肺癌细胞。
[0025]8)以此方法反复在小鼠体内筛选，Lewis小鼠肺癌细胞在VEGF-Trap治疗的小鼠中生长的速度越来越快，相应的半数生存时间也越来越短。最后，按前述方法将第五轮逃逸抗VEGF-Trap治疗的肿瘤细胞分离，培养扩增，液氮冻存，即建成耐受抗血管新生治疗的Lewis小鼠肺癌细胞。
[0026]本发明的一种耐受抗血管新生治疗的肿瘤细胞系的应用，所述细胞系进行测序分析，根据测序结果分析验证出肿瘤药物耐受的靶点，用于研究差异表达基因。
[0027]本发明的一种耐受抗血管新生治疗的肿瘤细胞系的应用，所述细胞系建立小鼠荷瘤模型，用于观察抗血管新生和研究抗肿瘤药物的治疗效果，为临床用药提供指导依据。
[0028]有益.效果
[0029]本发明通过皮下接种荷瘤小鼠，通过多轮治疗并筛选的方法获得的耐受抗血管新生治疗的小鼠肺癌细胞系更接近临床，通过研究药物耐受细胞系与原始细胞系表达基因的差异，可用于研究导致出现抗血管新生治疗药物耐受的关键基因，为筛选导致药物耐受的靶点奠定了基础，同时也为临床用药指导提供了依据。
【专利附图】
【附图说明】
[0030]图1为VEGF-Trap蛋白结构示意图；
[0031]图2 为 ELISA 法检`测 VEGF-Trap 梯度结合 VEGF165 ；
[0032]图3为建立耐受抗VEGF-Trap小鼠肺癌模型示意图；
[0033]图4为第一轮治疗荷瘤小鼠半数生存时间曲线；
[0034]图5为第五轮治疗荷瘤小鼠半数生存时间曲线。
【具体实施方式】
[0035]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
[0036]实施例1
[0037]VEGF-Trap重组蛋白质的制备.[0038]构建抗血管新生药物VEGF-Trap的详细方法参照Holash, J.，et al., Proc NatlAcad Sci U S A，2002。将编码VEGF受体(VEGFR)-1的第二个免疫球蛋白样结构域、VEGFR2的第三个免疫球蛋白样结构域和人免疫球蛋白(IgG)-l的Fe片段的基因相融合，构建重组表达质粒，转染中国仓鼠卵巢细胞(CH0)，经过筛选、加压扩增等步骤获得稳定转染细胞株，使用Protein A等方法纯化目的蛋白VEGF-Trap (见图1)。
[0039]VEGFR-1的第二个免疫球蛋白样结构域的氨基酸序列见SEQ ID NOl0
[0040]VEGFR-2的第三个免疫球蛋白样结构域的氨基酸序列见SEQ ID N02。[0041]人IgGlFc片段的氨基酸序列见SEQ ID N03。
[0042]实施例2
[0043]VEGF Trap的生物学活性确定。
[0044]在使用VEGF-Trap治疗前，首先使用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测VEGF-Trap结合VEGF165的结合能力。首先将20ng/mL VEGF165 (R & D公司)包被于96孔ELISA板上，每孔ΙΟΟμ L，4°C过夜，使用PBST(于IL PBS中加入ImL Tween-20)洗涤液洗涤五次后，每孔加入200 μ L鲜配制的1%BSA (KPL公司)室温封闭I小时，然后加入起点为16000pM，3倍比梯度稀释的VEGF-Trap于96孔板中，每孔100 μ L，37°C孵育2小时，使用PBST洗涤液洗涤五次后，每孔加入100 μ L HRP标记的羊抗人IgG Fe抗体(Bethyl公司)，37°C孵育I小时后，使用PBST洗涤五次后，每孔加入100 μ L显色液(KPL公司)，避光反应10-15分钟至颜色出现，加入ΙΟΟμ L终止液(KPL公司)终止反应，然后于酶标仪上读取450nm吸光度值。结果显示:本发明所用的VEGF-Trap具有结合VEGF的能力(见图2)。
[0045]实施例3
[0046]Lewis小鼠肺癌细胞系的抗血管新生治疗。
[0047]耐受抗VEGF-Trap的Lewis小鼠肺癌细胞系的第一轮筛选的步骤:
[0048]I)复苏冻存于液氮中的Lewis小鼠肺癌细胞株，于含10%FBS的DMEM高糖培养基(Hyclone公司)中培养，每2~3天换液，保证细胞以良好的状态生长，细胞生长至覆盖培养瓶底面积80%左右时,开始传代扩大培养。
[0049]2)处于对数生长期的细胞扩大到足量时，吸出细胞培养液，用PBS洗涤细胞后，加入0.25%胰蛋白酶(GIBC0公司)消化细胞，1000r/min离心5min收集细胞，用PBS洗涤2次后，重悬于无血清的DMEM高糖培养基中，取10 μ L细胞悬液与苔盼蓝染色液(Sigma公司)混合后室温静置5min，加入血球计数板中观察并计数，活细胞数大于95%可用于小鼠接种。
[0050]3)雌性C57BL/6J小鼠，生长至6~8周龄时用于接种。使用70%酒精棉球局部消毒小鼠拟接种部位，用一次性ImL无菌注射器吸取细胞悬液，接种于小鼠右侧后肢外侧的皮下，每只小鼠接种0.2mL (IX IO6)细胞悬液,接种后放回饲养笼继续饲养。
[0051]4)接种后每日用游标卡尺测量小鼠的肿瘤长度(L)和宽度(W)，按公式:肿瘤体积(立方毫米)=LX WX W/2，计算肿瘤体积，待肿瘤体积长到100~200立方毫米时，随机分成两组进行治疗，每组5~10只荷瘤小鼠，每周两次腹腔注射10mg/kg VEGF-Trap或PBS，同时测量小鼠的体重和肿瘤大小。
[0052]5)待治疗组和对照组生长最快的肿瘤分别达到1500立方毫米时，经CO2窒息法处死荷瘤小鼠，70%酒精棉球全身消毒小鼠，特别是肿瘤接种部位，使用眼科剪剪开小鼠皮肤，无菌剥离肿瘤组织用PBS洗涤两次，置于预冷的PBS中，准备分离肿瘤细胞。
[0053]6)用无菌手术刀切开肿瘤组织，去除肿瘤胞膜和内部坏死组织，使用眼科剪将剩余组织剪碎，加入胰蛋白酶37°C消化30min，吸取胰酶细胞混合液，使用完全培养基终止胰蛋白酶反应，1000r/min离心5min，用PBS洗涤两次后过300目细胞滤网，收集单细胞悬液，分成2份，一份1000r/min离心5min后加入含10%DMS0的DMEM完全培养基，放入细胞冻存盒，置于-80°C冰箱中梯度降温，次日置于液氮中长期保存；另一份加入DMEM完全培养基，于37°C、5%C02、饱和湿度细胞培养箱中培养，及时更换新鲜培养基并扩大培养。以此方法所获得的细胞分别为第一代逃逸VEGF-Trap治疗的Lewis小鼠肺癌细胞和第一代对照未治疗VEGF-Trap的Lewis小鼠肺癌细胞。
[0054]实施例4
[0055]抗血管新生治疗的Lewis小鼠肺癌细胞系的体内选择。
[0056]耐受抗VEGF-Trap治疗的Lewis小鼠肺癌细胞系通过反复体内筛选获得:
[0057]I)将第一代逃逸抗VEGF-Trap治疗的Lewi s小鼠肺癌细胞和对照未治疗VEGF-Trap的Lewis小鼠肺癌细胞按同样的方法分别接种到小鼠右侧后肢外侧的皮下，待成瘤后，第一代逃逸VEGF-Trap治疗的Lewis小鼠肺癌荷瘤小鼠按10mg/kg VEGF-Trap进行治疗；同时，为了排除肿瘤在小鼠体内多次传代可能会出现与起始肿瘤细胞不同性状的问题，第一代对照未治疗VEGF-Trap的Lewis小鼠肺癌荷瘤小鼠继续注射PBS。
[0058]2)待治疗组和对照组生长最快的肿瘤分别达到1500立方毫米时，使用上述同样方法分别剥离生长速度最快的细胞，并获得第二代逃逸VEGF-Trap治疗的Lewis小鼠肺癌细胞和第二代对照未治疗VEGF-Trap的Lewis小鼠肺癌细胞。部分细胞中加入DMEM完全培养基后于37°C、5%C02、饱和湿度细胞培养箱中继续培养，用于下一轮接种和细胞的筛选。
[0059]3)以此方法反复在小鼠皮下接种肿瘤细胞，并进行逃逸肿瘤细胞的筛选，经过多轮接种与筛选后，持续使用VEGF-Trap治疗的Lewis小鼠肺癌细胞表现出逃逸抗VEGF治疗或者说对VEGF-Trap药物耐受的性状，即使在使用VEGF-Trap治疗的条件下，细胞的生长速度越来越快，相应的半数生存时间也越来越短，经过五轮筛选，持续使用VEGF-Trap治疗的Lewis小鼠肺癌荷瘤小鼠的半数死亡时间接近于持续传代而未用VEGF-Trap治疗的Lewis小鼠肺癌荷瘤小鼠的半数死亡时间。第一轮荷瘤小鼠使用VEGF-Trap治疗的半数生存时间为54天，对照组治疗的半数生存时间为38天，统计学统计结果显示具有显著差异(见图4)，即表明抗血管新生药物VEGF-Trap对起始Lewis小鼠肺癌细胞的生长具有显著抑制效果。而经过五轮筛选之后，荷瘤小鼠使用VEGF-Trap治疗的半数生存时间为36天，接近于对照组治疗的半数生存时间(32天)，使用统`计学方法进行统计，结果显示两者无显著差异，表明经过五轮筛选，小鼠Lewis肺癌细胞产生了对抗血管新生药物VEGF-Trap的耐受(见图5)。
[0060]实施例5
[0061]耐受抗血管新生治疗的小鼠肺癌细胞系的保存
[0062]经过五轮VEGF-Trap治疗的小鼠肺癌细胞系获得了对VEGF抑制剂VEGF-Trap治疗的抗药性。为了建立细胞库，首先将具有耐受抗血管新生治疗的肿瘤从小鼠剥离，用眼科剪碎肿瘤组织剪，加入胰蛋白酶37°C消化，1000r/min离心5min收集细胞，用PBS洗涤两次后过300目细胞滤网，将收集的单细胞悬液用含有10%FBS的DMEM培养基在37°C 5%C02条件下培养，通过适当的细胞培养传代以扩大细胞数量。但细胞生长到指数生长期时，将肿瘤细胞用胰蛋白酶消化，细胞悬浮于含10%FBS的DMEM培养基，1000r/min离心收获细胞。最后，将细胞悬浮于含10%DMS0的DMEM完全培养液中，将细胞冻存于液氮中，此为建成的逃逸抗血管新生治疗的Lewis小鼠肺癌肺癌细胞的原始细胞库。
【权利要求】
1.一种耐受抗血管新生治疗的肿瘤细胞系，其特征在于:所述细胞系通过使用抗血管新生药物治疗荷瘤小鼠，通过体内多次治疗及筛选而成抗药性，最后分离培养获得。
2.根据权利要求1所述的一种耐受抗血管新生治疗的肿瘤细胞系，其特征在于:所述抗血管新生药物为血管内皮细胞生长因子抑制剂。
3.根据权利要求2所述的一种耐受抗血管新生治疗的肿瘤细胞系，其特征在于:所述血管内皮细胞生长因子抑制剂为VEGF-Trap。
4.根据权利要求1所述的一种耐受抗血管新生治疗的肿瘤细胞系，其特征在于:所述肿瘤细胞系为小鼠Lewis肺癌细胞系。
5.根据权利要求4所述的一种耐受抗血管新生治疗的肿瘤细胞系，其特征在于:所述小鼠为C57BL/6J、裸鼠或SCID鼠。
6.一种耐受抗血管新生治疗的肿瘤细胞系的建立方法，包括: Cl)构建抗血管新生药物VEGF-Trap ； (2)使用酶联免疫吸附试验法检测VEGF-Trap结合VEGF165的活性； (3)使用VEGF-Trap通过体内多次治疗及筛选，得到肿瘤细胞系。
7.—种如权利要求1所述的耐受抗血管新生治疗的肿瘤细胞系的应用，其特征在于:所述细胞系进行测序分析，根据测序结果分析验证出肿瘤药物耐受的靶点，用于研究差异表达基因。
8.—种如权利要求1所述的耐受抗血管新生治疗的肿瘤细胞系的应用，其特征在于:所述细胞系建立小鼠荷瘤模型，用于观察抗血管新生和研究抗肿瘤药物的治疗效果，为临床用药提供指导依据。```
【文档编号】C12N5/09GK103695370SQ201310425831
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2013年9月17日 优先权日:2013年9月17日
【发明者】房健民, 李栋 申请人:同济大学