专利名称：无致病性的重组减毒狂犬病毒株及其构建方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株无致病性的重组减毒狂犬病毒株，还涉及该病毒株的构建方法和应用，本发明利用逆向分子生物技术设计重组活疫苗，在细胞基质中增殖，经冷冻干燥可制备高效的狂犬病疫苗。本发明属于生物疫苗领域。
背景技术：
狂犬病病毒属于弹状病毒科，是一种不分阶段RNA病毒，其基因组编码五种蛋白RNA依赖的RNA酶(L)，核蛋白(N)、磷酸蛋白(P)、基质蛋白(M)、外膜蛋白(G)。狂犬病通过动物咬伤或抓伤传播，沿外围神经至神经中枢引起细胞功能损伤和感染动物的死亡，可逃避免疫识别。 机体抗狂犬病毒的免疫主要是狂犬病病毒糖蛋白诱导产生的中和抗体和CD/、⑶/细胞免疫。机体内在的防御机制在狂犬病免疫应答也重要作用，包括活疫苗L、N和P蛋白引起的保护性免疫。抗病毒免疫与致病性相关，与病毒糖蛋白表达水平相关，尽管糖蛋白表达水平与免疫增效的关系不甚清楚，但糖蛋白基因保留了非嗜神经性基因片段和高效复制的基因片段，使重组活病毒具有更高效的安全性和免疫原性，与传统活疫苗相比，用该重组病毒生产的疫苗具有安全、高效、低廉、方便使用的特点。
发明内容
本发明利用逆向遗传学技术，对国内外的减毒活疫苗株进行定向突变，降低了减毒疫苗株的致病性，提高了病毒在细胞基质中的复制水平，因而增强了免疫原性和病毒基因的稳定性。为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段首先，本发明提供了一种制备无致病性的重组减毒狂犬病毒的方法，其特征在于将狂犬病毒基因组中的糖蛋白基因进行以下位点的突变Arg333 —Gln，Aspl64 —Ser。即将狂犬病毒基因组中的糖蛋白基因中的第333位的Arg突变为Gln，将位于第164位的Asp突变为Ser。在本发明所述的方法中，优选的，是使所述的重组减毒狂犬病毒基因组中包含两个拷贝的含有以下位点突变的糖蛋白基因Arg333 — Gin, Aspl64 — Ser0在本发明所述的方法中，优选的，所述的重组减毒狂犬病毒糖蛋白基因来自狂犬病毒 CTN-I 株、aG 株、SAD 株、EAR 株、Flurg-LEP 株、Flurg-HEP 株或 PM 株。无致病狂犬病病毒的G基因上的333位以及164位的位点突变导致G蛋白基因稳定，不易返祖。其次，本发明提供了由以上任一所述的方法制备得到的无致病性的重组减毒狂犬病毒。按照本发明所述的方法制备得到了一株无致病性的重组减毒狂犬病毒，该病毒在免疫缺陷的动物中传一代或多代无致病性；本发明的一株无致病性的重组减毒狂犬病毒，含有双拷贝的G基因，且G基因中存在以下位点的突变Arg333 —Gln，Aspl64 —Ser，该病毒株命名为CTN-GAGA，分类命名为重组减毒狂犬病毒，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路I号院中科院微生物研究所，其菌种保藏编号为=CGMCC No. 6209，保藏日期为2012年6月14日。再次，本发明还提供了所述的重组狂犬病毒在制备预防由狂犬病毒引起的疾病药物中的应用。其中，优选的，所述的药物可包括注射制剂和口服制剂。本发明的药物可口服，也可注射，口服制剂包括加饵料，注射制剂可通过包括肌肉、脑内、皮下腹腔进行注射。最后，本发明还提供了一种疫苗组合物，其特征在于含有以上任一所述的重组狂 犬病毒。优选的，所述的疫苗为冻干疫苗，其还包括药学上可接受的赋形剂或载体。优选的，所述的疫苗可用于包括狗、猫、狼、狐狸或松鼠等在内的动物的免疫。
具体实施例方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。本发明具体实施例所涉及的材料来源病毒株狂犬病毒CTNl株、CVS-Il株购买自中国生物制品检定所。实施例I狂犬病毒全长cDNA克隆质粒pSDI-1 包含 CTN-I 株基因组 3 '和 5'末端(CTN1-200 和 11750-11200)插在I7RNA聚合酶和Delta肝炎病毒抗原核酶序列之间。为了获得5'末端基因序列，首先用引物 5 ' -ACGTTAACAA-3 '、引物 5 ' -AATTCCTGCAGTAACGACTCACTATAGGG-3 ' PCR扩增插入酶切位点(EcoRI)，产物进行EcoRI/Smal酶切并插入到质粒PX8dT，该质粒的是PBluescrpit II的衍生质粒，BssHII-Cla I片段被删除。PSDI-I的MunI-BgI片段被 CTNl 株的 MunI-Bg/ II 克隆 PZAD1-9 (40_482nt)、Sph I -Aat II 克隆、PSCTN(4041-4273nt)、PSCTN Aat II -Bg/ II 克隆(11475-11759)取代产生克隆 PSD1-1170，通过在482-4041nt4273-11472nt插入Aat II，XhoI限制性酶切位点构建含有狂犬病毒全长cDNA克隆的重组表达载体pCTN-1。实施例2高度减毒表达2拷贝相同糖蛋白基因的重组狂犬病毒的构建采用PCR方法进行狂犬病毒G基因Arg333 — Gin (相应密码子由AGA突变为CAG)，Aspl64 — Serl64 (相应密码子由GAU突变为AGU)的突变，I、含有双拷贝的G基因的载体的构建引物5 ' -CGATGTATACGTACGAAGATGTTCCTCAGCTCTCCTG-3 ' (B siWI 位点)，引物 5 ' -CTTATCAGCTAGCTAGCTAGCTAGTTACAGTCTGTCTCACCCCCA-3 ' (NheI 位点)，模板为PCTN-I，产物用NheI和BsiWI限制内切酶切，克隆形成PCTN-G，二次克隆形成PCTN-G-G，双拷贝的G基因可测序。PCR的条件94°C预变性I分钟，变性30s，45°C退火60s，72°C延伸120s，35次循环。2、含有双拷贝的G基因的载体的定点突变
模板p CTN-G,弓丨物I:5' -AGGAATTCCCCGGGAAGATGGTTCCTGAGGCTCTCCTATTTGTA-3'引物2:5' -ACGCTCTAGAGCCCTTAATTAACGTTAACAGTCTGGTCTCACCCCA 3'，G基因中插入EcoRI和XbaI位点，PCR产物酶切连接到pBlue-Script II K ( + )形成克隆pAG。用QuickChange XL定点试剂盒进行突变，引物3:5' -GTCTTGTGACATTTTTACCAAGAGTAGAGGGAAGAGAGC-3'，引物4:5' -GCTCTCTTCCCTCACTCTTGGTAAAAATGTCACAAGAC-3'引物5:5' -GATGTCTTGTGACATTTTTACCTCCAGTAGAGGGAAGAGAGCATC-3'引物6:5' -GATGCTCTCTTCCCTCTACTGGAGGTAAAAATGTCACAAGACATC-3'突变后产物质粒用XamI和PacI酶切连接后得到含有突变位点的双拷贝G基因的重组狂犬病毒载体PCTN-GAGA以及含有突变位点的单拷贝G基因的重组狂犬病毒载体pCTN-GA。实施例3转染BHK-21或BSR细胞用3. 2cm直径的固体培养皿培养过夜，培养基MEM+10%小牛血清。细胞80%铺满，按0.5M0I接种痘病毒天然毒株，感染I小时后，用不含小牛血清的细胞培养液洗涤3次，洗涤细胞并继续培养。用5. Oii g含有突变位点的重组狂犬病毒载体pCTNGA-GA或pCTNGA、pCTN_P、pCTN_N、pCTN_L、pCTN-G质粒按磷酸钙转染试剂盒说明转染培养，37°C培养4天后，上清移到BHK-21细胞在37°C培养4天。实施例4重组病毒G基因分析BHK-21细胞培养的重组病毒CTN-GAGA，用PBS 洗涤，再用RNeasyMiniKitCQiagen 按说明操作提取重组病毒 RNA。用 Superscript One StepRT-PCRkit (Invitrogen)，引物 1:5' -AACATGTTATGGTGCCATTAAACCGCT-3'和引物 2:5' -GGGTGTTAGTTTTTTTCATGGACTTGG-3'进行RT-PCR，PCR产物测序。测序结果与预期相符，所述的重组病毒CTN-GAGA中含有双拷贝的G基因，且G基因中存在以下位点的突变Arg333 — Gln(相应密码子由AGA突变为CAG)，Aspl64 — Serl64 (相应密码子由GAU突变为AGU)。该重组病毒CTN-GAGA株，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路I号院中科院微生物研究所，其菌种保藏编号为=CGMCCNo. 6209，保藏日期为2012年6月14日。
实施例5重组狂犬病毒对新生小鼠的致病性新生小鼠15只脑部注射5 ill PBS含IO4个感染性病毒颗粒，感染3天后，用乙醚麻醉取脑按4倍体积加入PBS研磨离心，上清存于-80°C以确定病毒滴度。成年小鼠10只乙醚麻醉，脑腔注射10 U IPBS含IO5个感染性病毒颗粒，观察30天是否有临床症状，结果如表I所示。表I.重组狂犬病病毒对成年鼠的致病性
权利要求
1.一种制备无致病性的重组减毒狂犬病毒的方法，其特征在于将狂犬病毒基因组中的糖蛋白基因进行以下位点的突变Arg333 — Gin, Aspl64 — Ser。
2.如权利要求I所述的方法，其特征在于在所述的狂犬病毒基因组中包含两个拷贝的含有以下位点突变的糖蛋白基因Arg333 — Gin, Aspl64 — Ser。
3.如权利要求I或2所述的方法，其特征在于所述的狂犬病毒糖蛋白基因来自狂犬病毒 CTN-I 株、aG 株、SAD 株、EAR 株、Flurg-LEP 株、Flurg-HEP 株或 PM 株。
4.由权利要求1-3任一项所述的方法制备得到的无致病性的重组减毒狂犬病毒。
5.如权利要求4所述的重组减毒狂犬病毒，命名为CTN-GAGA，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路I号院中科院微生物研究所，其菌种保藏编号为=CGMCC No. 6209，保藏日期为2012年6月14日。
6.权利要求4或5所述的重组减毒狂犬病毒在制备预防由狂犬病毒引起的疾病药物中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述的药物包括注射制剂和口服制剂。
8.一种疫苗组合物，其特征在于含有权利要求4或5所述的重组减毒狂犬病毒。
9.如权利要求8所述的疫苗组合物，其特征在于所述的疫苗组合物为冻干疫苗，其还包括药学上可接受的赋形剂或载体。
全文摘要
本发明公开了一种无致病性的重组减毒狂犬病毒株及其构建方法和应用，属于生物疫苗领域，本发明的方法是将狂犬病固定毒经逆向遗传学克隆产生重组的狂犬病毒，其中狂犬病毒糖蛋白上决定免疫原性或致病性的位点的氨基酸333(Arg333→Gln)和164(Asp164→Ser)位点经过定点突变，使其致病性降低，回复毒力返阻风险率降低，更优选的，是将该突变的糖蛋白基因双拷贝化，实验结果证明，由本发明方法制备得到的重组狂犬病毒株可用于制备低廉、适于口服或注射的狂犬病疫苗。
文档编号A61P31/14GK102796710SQ20121022078
公开日2012年11月28日 申请日期2012年6月28日 优先权日2012年6月28日
发明者吕宏亮, 张澍, 高斌战 申请人:北京健翔和牧生物科技有限公司, 山西隆克尔生物制药有限公司