专利名称：单链胰岛素的制作方法
技术领域：
本发明涉及单链胰岛素，它具有胰岛素的活性，可以用于糖尿病的治疗。单链胰岛素具有高的物理稳定性以及低的原纤维形成倾向，在中性PH下是可溶的。本发明还涉及了编码单链胰岛素的DNA序列、它们制备的方法以及含有单链胰岛素的药物组合物。
背景技术：
胰岛素是由胰腺的β -细胞分泌的多肽激素，由两个多肽链A和B组成，它们由链间二硫桥连接起来。此外，A链具有一个链内二硫桥。 该激素作为单链前体胰岛素原(前胰岛素原)合成，它由含24个氨基酸的前肽以及其后的含86个氨基酸的胰岛素原按照以下的构型组成』i_B_Arg Arg-C-Lys Arg-A,其中C是31个氨基酸的连接肽。Arg-Arg和Lys-Arg是用于从A和B链切割连接肽形成双链胰岛素分子的切割位点。胰岛素在维持正常的代谢调控中是必需的。胰岛素的两条链结构使胰岛素可以呈现多种构象，一些发现已经表明胰岛素具有发生相当大的构象改变倾向，对这种改变能力的限制显著降低了胰岛素受体与配基的亲和性。与天然胰岛素相比，胰岛素原对胰岛素受体的亲和性降低了 100倍。封闭胰岛素中的氨基酸残基Al导致与受体结合较弱，这与“Α链的自由N端和B链的自由C端对于与胰岛素受体的结合是非常重要的”这个法则一致。胰岛素分子的内在物理和化学稳定性是糖尿病的胰岛素疗法的基本条件。这些基本性质对于胰岛素的形成和可应用的胰岛素给药方法，以及药物制剂的保存期和储存条件是重要的。在胰岛素的给药中溶液的使用使分子暴露于一些因素的组合中，例如升高的温度、可变的气液固界面以及剪切力，这些可以导致不可逆的构象改变例如原纤维形成。这对于滴注泵(无论是在体外携带还是移植的)中的胰岛素溶液是有重要意义的，滴注泵使胰岛素暴露在这些因子的组合中以及由于泵的长时间移动产生的剪切力中。因此在使用滴注泵作为胰岛素的给药系统时原纤维形成特别成为人们关注的问题。此外，胰岛素的溶解性受到多种因子的影响，在PH范围从4. 2到6. 6溶解性显著降低。pH沉淀区一般限制了制剂，但是在开发某些类似物的制剂中也被有意使用。因此，胰岛素的稳定性和溶解性性质对于目前的胰岛素治疗是重要的根本方面。本发明通过在B和A链之间引入C肽降低分子弹性，同时降低原纤维形成倾向并且限制或者改变PH沉淀区，以提供稳定的单链胰岛素类似物而解决这些问题。具有胰岛素活性的单链胰岛素在EP 1，193，272中公开。这些单链胰岛素具有
5-18个氨基酸的修饰的C肽，据报道它们具有最多42%的胰岛素活性。EP 1，193，272公开了下列连接 B 30 和 A21 的修饰的 C 肽=Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Lys-Arg (SEQ ID NO 1),Arg-Arg-Gly-Pro-Gly-Gly-Gly(SEQ ID NO 2), Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Lys-Arg(SEQ IDNO 3),Arg-Arg-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly(SEQ ID NO 4),Gly-Gly-Ala-Pro-Gly-Asp-Val-Lys-Arg(SEQ ID NO :5)，Arg-Arg-Ala-Pro-Gly-Asp-Val-Gly-Gly(SEQ ID NO :6)，Gly-Gly-Tyr-Pro-Gly-Asp-Val-Lys-Arg(SEQ ID NO 7), Arg-Arg-Tyr-Pro-Gly-Asp-Val-Gly-Gly(SEQ ID NO 8), Gly-Gly-His-Pro-Gly-Asp-Val-Lys-Arg(SEQ ID NO :9)，和 Arg-Arg-His-Pro-Gly-Asp-Val-Gly-Gly (SEQ ID NO :10)。EP 741，188 公开的单链胰岛素具有 10-14 个氨基酸残基的修饰的C肽，并且具有14到34%胰岛素活性且具有以下连接肽Gln-PiO-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys-Arg(SEQ ID NO 11)和 Gly-Tyr-Gly-Ser-Ser-Ser-Arg-Arg-Ala-Pro-Gln-Thr (SEQ ID N0:12)。WO 95/16708 公开了具有 1-15 个氨基酸残基的连接肽且连接肽中C末端氨基酸残基非Lys或Arg的单链胰岛素。WO 95/16708公开了以下的 C妝序列 Gly-Tyr-Gly-Ser-Ser-Ser-Arg-Arg-Ala-Pro-Gln-Thr (SEQ ID NO 13)和Gly-Tyr-Gly-Ser-Ser-Ser-Ala-Ala-Ala-Pro-Gln-Thr(SEQ ID NO: 14)。据报道这些单链胰岛素具有胰岛素活性，但是与IGF-I受体也具有相当高的亲和性。本发明的目的是提供与已知化合物相比具有改良性质的单链胰岛素，涉及到胰岛素的活性、物理稳定性和溶解性以及药代动力学例如延长或者迅速 作用特征。本发明的另一个目的是提供单链胰岛素的制备方法以及含有这些化合物的药物组合物。发明概述本发明一方面涉及了具有生物胰岛素活性并且包含由连接肽连接的人胰岛素或者其类似物或衍生物的B和A链的单链胰岛素，其中的连接肽具有5-11个氨基酸残基并且不含有两个相邻的碱性氨基酸残基并且其中单链胰岛素对人胰岛素受体的亲和性是人胰岛素的至少大约20% (如果单链胰岛素分子没有被酰化化学修饰的话)。在另一个方面中，本发明涉及具有生物胰岛素活性并且包含由连接肽连接的人胰岛素或者其类似物或衍生物的B和A链的单链胰岛素，其中的连接肽具有5-11个氨基酸残基，前提是如果连接肽含有两个相邻的碱性氨基酸残基则B和/或A链中的至少一个天然氨基酸残基被另一个可编码的氨基酸残基替代，或者A链、B链或者连接肽中的至少一个赖氨酸残基已经被酰化化学修饰，或者连接肽不是以下的序列 Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Lys-Arg(SEQ ID NO 1),Arg-Arg-Gly-Pro-Gly-Gly-Gly(SEQ ID NO 2), Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Lys-Arg(SEQ IDNO 3),Arg-Arg-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly(SEQ ID NO 4),Gly-Gly-Ala-Pro-Gly-Asp-Val-Lys-Arg (SEQ ID NO 5),Arg-Arg-Ala-Pro-Gly-Asp-Val-Gly-Gly(SEQ ID NO 6),Gly-Gly-Tyr-Pro-Gly-Asp-Val-Lys-Arg(SEQ ID NO 7), Arg-Arg-Tyr-Pro-Gly-Asp-Val-Gly-Gly (SEQ ID NO :8)，Gly-Gly-His-Pro-Gly-Asp-Val-Lys-Arg(SEQ ID NO :9),或Arg-Arg-His_Pro-Gly-Asp-Val-Gly-Gly(SEQ ID NO :10)。在另一个方面中本发明涉及具有生物胰岛素活性并且包含由连接肽连接的人胰岛素或者其类似物或衍生物的B和A链的单链胰岛素，其中的连接肽具有5-11个氨基酸残基，前提是Pl在大约6. 5以上的该单链胰岛素与人胰岛素的A和B链相比在A和/或B链中包含至少一个氨基酸残基替代和/或缺失，或者A链、B链或者连接肽中至少一个赖氨酸残基已经被酰化化学修饰。在另一个方面中本发明涉及具有生物胰岛素活性并且包含由连接肽连接的人胰岛素或者其类似物或衍生物的B和A链的单链胰岛素，其中的连接肽具有5-14，5-11，6-10，
6-8，6-7，7-9或者7-8个氨基酸残基，且其中A链、B链或者连接肽中至少一个赖氨酸残基已经被酰化化学修饰。在一个实施方案中，单链胰岛素在单链胰岛素分子中至少一个赖氨酸基团上被酰化。在另一个实施方案中，B29Lys被酰化。在另一个实施方案中，在单链胰岛素分子中插入的赖氨酸被酰化或者BlN-末端氨基酸残基被酰化。—方面单链胰岛素被具有6-24,6-20,6-18或者6_14个碳原子的脂肪酸酰化。另一方面本发明涉及在中性pH下可溶、pi低于大约6. 5的单链胰岛素。另一方面,单链胰岛素的pi从大约4. 5到低于大约6. 5。另一方面本发明涉及了单链胰岛素，其中至少一个赖氨酸残基被酰化修饰。另一方面，具有未化学修饰A和B链的单链胰岛素与人胰岛素受体的亲和性是人胰岛素的至少30%。另一方面，单链胰岛素在连接肽中最多含有两个碱性氨基酸·残基，它们由至少一个非碱性氨基酸残基隔开。本发明的另一个方面中，单链胰岛素与天然人胰岛素的A和B链相比，在A或B链中含有至少一个额外的碱性氨基酸。优选通过替代B链的C末端或者A链的N末端中的一个天然氨基酸残基弓I入碱性氨基酸，在本发明的一个实施方案中B27位置的残基被Arg替代。在本发明的另一个方面中单链胰岛素在A链的A21位置具有的氨基酸残基与天然的氨基酸残基Asn不同。因此位置A21中的Asn可以被除Cys外的任何其他可编码氨基酸残基替代。在一个实施方案中位置A21的氨基酸残基可以选自由Ala，Gln，Glu，Gly，His，He, Leu, Met, Ser, Thr, Trp, Tyr 或者 Val 组成，特别是由 Gly, Ala, Ser,和 Thr 组成的组。在另一个实施方案中A21是Gly。在本发明的一个实施方案中单链胰岛素在连接肽中含有至少一个碱性氨基酸残基并且在位置A21上是Gly。在本发明的另一个实施方案中单链胰岛素在连接肽中含有两个碱性氨基酸残基并且在位置A21上是Gly。在另一个实施方案中单链胰岛素具有的连接肽有6-10，6-9，6-8，或6_7个氨基酸残基。在另一个实施方案中单链胰岛素具有的连接肽有7-10，7-9或7-8个氨基酸残基。在另一个实施方案中连接肽在相对于A链中第一个氨基酸残基(Al)的倒数第二个位置上具有Gly。在另一个实施方案中连接肽包含选自AGRGSGK(SEQ ID NO :15) ；AGLGSGK(SEQ IDNO 33) ；AGMGSGK(SEQ ID NO :45) ；ASWGSGK(SEQ ID NO :48) ；TGLGSGQ(SEQ ID NO :22)；TGLGRGK(SEQ ID NO :23) ；TGLGSGK(SEQ ID NO :21) ；HGLYSGK(SEQ ID NO :50) ；KGLGSGQ(SEQID NO 51) ；VGLMSGK(SEQ ID NO :56) ；VGLSSGQ(SEQ ID NO :27) ；VGLYSGK(SEQ ID NO :28)；VGLSSGK(SEQ ID NO :30) ；VGMSSGK(SEQ ID NO :65) ；VffSSSGK(SEQ ID NO :76) ；VGSSSGK(SEQID NO 16)和 VGMSSGK (SEQ ID NO :106)的序列。在另一个实施方案中单链胰岛素具有式B (1_26) _X「X2_X3_X4_A (1_21)其中X1 是 Thr, Lys 或 Arg, X2 是 Pro, Lys 或 Asp, X3 是 Lys, Pro 或 Glu, X4 是 6-11个氨基酸的肽序列，B (1-26)是由人胰岛素B链的从B链N末端开始的前26个氨基酸残基组成的肽链或者其类似物或衍生物，A(l-21)是天然胰岛素的A链或者其类似物或者衍生物，其中X4不含有两个相邻的碱性氨基酸残基且其中的单链胰岛素对人胰岛素受体的亲和性是人胰岛素的至少大约20%，如果单链胰岛素分子没有被酰化化学修饰的话。
在另一个实施方案中单链胰岛素具有式B (1_26) -XfX2-X3-X4-A (1_21)其中X1 是 Thr, Ly s 或 Arg, X2 是 Pro, Ly s 或 Asp, X3 是 Ly s, Pro 或 Glu, X4 是 6-11 个氨基酸的肽序列，B(l-26)是由人胰岛素B链的从B链N端开始数前26个氨基酸残基组成的肽链或者其类似物或衍生物，A(l-21)是天然胰岛素的A链或者其类似物或者衍生物，前提是如果X4含有两个相邻的碱性氨基酸残基则B和/或A链中的至少一个天然氨基酸残基被另一个可编码氨基酸残基替代或者A链、B链或者连接肽中至少一个赖氨酸残基已经通过酰化被化学修饰或者X4不是下列序列中的一个Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Lys_Arg(SEQ ID NO I),Arg-Arg-Gly-Pro-Gly-Gly-Gly(SEQ ID NO 2),Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Lys-Arg(SEQ IDNO 3),Arg-Arg-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly(SEQ ID NO :4),Gly-Gly-Ala-Pro-Gly-Asp-Val-Lys-Arg(SEQ ID NO 5),Arg-Arg-Ala-Pro-Gly-Asp-Val-Gly-Gly(SEQ ID NO :6)，Gly-Gly-T yr-Pro-Gly-Asp-Val-Lys-Arg (SEQ ID NO 7), Arg-Arg-Tyr-Pro-Gly-Asp-Val-Gly-Gly(SEQ ID NO :8)，Gly-Gly-His-Pro-Gly-Asp-Val-Lys-Arg(SEQ ID NO :9),或Arg-Arg-His_Pro-Gly-Asp-Val-Gly-Gly(SEQ ID NO :10)。在另一个实施方案中单链胰岛素具有式B (1_26) _X「X2_X3_X4_A (1_21)其中X1 是 Thr, Lys 或 Arg, X2 是 Pro, Lys 或 Asp, X3 是 Lys, Pro 或 Glu, X4 是 6-11个氨基酸的肽序列，B (1-26)是由人胰岛素B链的从B链N端开始的前26个氨基酸残基组成的肽链或者其类似物或衍生物，A(l-21)是天然胰岛素的A链或者其类似物或者衍生物，前提是Pl在大约6. 5以上的单链胰岛素与人胰岛素的A和B链相比在A和/或B链中包含至少一个氨基酸残基替代和/或缺失，或者A链、B链或者连接肽中至少一个赖氨酸残基已经被酰化化学修饰。在另一个实施方案中单链胰岛素具有式B (1_26) -XfX2-X3-X4-A (1_21)其中X1 是 Thr, Lys 或 Arg, X2 是 Pro, Lys 或 Asp, X3 是 Lys, Pro 或 Glu, X4 是 5-14,5-11，6-10，6-8，6-7，7-9或7-8个氨基酸的肽序列，B (I-26)是由人胰岛素B链的从B链N端开始的前26个氨基酸残基组成的肽链或者其类似物或衍生物，且A(l-21)是天然胰岛素的A链或者其类似物或者衍生物，其中A链、B链或者连接肽中至少一个赖氨酸残基已经通过酰化被化学修饰。在其中一个方面中，X1是Thr，X2是Pro，且X3是Lys。在另一个实施方案中，X4是具有下式Xa-Xb-Xe-Xd-Xe-Xf-Xg (SEQ ID NO :129)的肽序列，其中Xa 选自由 L，R，T，A，H，Q，G，S 和 V 组成的组；Xb选自由W，G，S，A，H，R和T组成的组；X。选自由 L，Y，M，H，R，T，Q，K，V, S，A，G 和 P 组成的组；Xd选自由R，A，Y，M，S，N，H和G组成的组；Xe 选自由 S，R，A，T，K P，N M，H，Q，V 和 G 组成的组；Xf选自由G和A组成的组；且Xg 选自由 K，R，P，H，F，T，I，Q，W和 A 组成的组
在另一个实施方案中父3选自由1^，1 ，1'，八，!1和￥组成的组；Xb选自由W，G，S，A，H，R和T组成的组；X。选自由 L，Y，M，H，R，T，Q，K，V, S，A，G 和 P 组成的组；Xd选自由R，A，Y，M，S，N，H和G组成的组；Xe选自由S，R，A，T，K P和N组成的组；Xf是G;且Xg选自由K，R，Q和P组成的组；在另一个实施方案中Xa选自由T，A V，K组成的组；Xb 是 G ;Xc选自由L，Y，M，H，R K，W组成的组；Xd 是 G ;Xe选自由S，K组成的组；父{是6;且Xg选自由K，R，Q组成的组在另一个实施方案中X4 具有序列 X5-G-X6-G-X7-G-X8(SEQ ID NO :130)其中X5 选自由 Val, Leu, Arg, Thr, Ala, His, Gin, Gly 或 Ser 组成的组，X6 选自由 Leu, Tyr, Met, His, Arg, Thr, Gin, Lys, Val, Ser, Ala, Gly, Pro 组成的组，X7 选自由 Ser, Arg, Ala, Thr, Lys, Pro, Asn, Met, His, Gin, Val, Gly 组成的组，且X8 是 Lys 或 Arg。在另一个实施方案中X5选自由Val, Leu, Arg, Thr, Ala和His组成的组，X6选自由Leu, Tyr, Met和His组成的组，X7 选自由 Ser, Arg, Ala, Thr, Lys, Pro 和 Asn 组成的组，且X8 是 Lys 或 Arg。在一个实施方案中X4包含序列SGK。在另一个实施方案中X4包含序列GSGK(SEQID NO :131)。在另一个实施方案中X4包含序列SSSGK (SEQ ID NO :132)。在一个实施方案中在位置BI, B3, BIO, B22, B27, B28, B29, A8，A15，A18 和 A21 的
天然氨基酸残基中的至少一个被另一个氨基酸残基替代。在另一个实施方案中单链胰岛素是desBl，desB25, desB27, desB28或desB29胰岛素类似物。在另一个实施方案中X4包含序列TRXXXGR(SEQ ID NO :112)，其中X是任何氨基酸。在另一个方面本发明涉及单链胰岛素，其中A链和B链通过含有6-11个氨基酸的肽序列相连，前提是该肽序列不是Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Lys-Arg(SEQ ID NO 1), Arg-Arg-Gly-Pro-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO 2), Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Lys-Arg(SEQ IDNO 3),Arg-Arg-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly(SEQ ID NO 4),Gly-Gly-Ala-Pro-Gly-Asp-Val-Lys-Arg (SEQ ID NO 5),Arg-Arg-Ala-Pro-Gly-Asp-Val-Gly-Gly(SEQ ID NO :6)，Gly-Gly-Tyr-Pro-Gly-Asp-Val-Lys-Arg(SEQ ID NO 7), Arg-Arg-Tyr-Pro-Gly-Asp-Val-Gly-Gly (SEQ ID NO 8), Gly-Gly-His-Pro-Gly-Asp-Val-Lys-Arg (SEQ ID NO :9),或者 Arg-Arg-His-Pro-Gly-Asp-Val-Gly-Gly(SEQ ID NO :10)。在另一个实施方案中连接肽不是SANNTK (SEQ ID NO : 136)，SPNTTK (SEQ ID NO:137)，SSNTTK (SEQ ID NO :138)或者 SRNTTK (SEQ ID NO :139)。本发明还涉及编码所要求的单链胰岛素的多核苷酸序列。另一方面本发明涉及含有这种多核苷酸序列的载体以及含有这种多聚核苷酸序列或者载体的宿主细胞。另一方面本发明涉及在宿主细胞中产生单链胰岛素的方法，所述方法包括(i)在适宜所述单链胰岛素表达的条件下培养包含编码单链胰岛素的多核苷酸序列的宿主细胞； 以及(ii)从培养基中分离单链胰岛素。在本发明的一个实施方案中宿主细胞是酵母宿主细胞且在另一个实施方案中宿主细胞选自糖酵母属(Saccharomyces)。在另一个实施方案中宿主细胞选自啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)种。在另一个实施方案中本发明涉及在单链胰岛素分子中至少一个赖氨酸残基被酰化的方法。在另一个实施方案中本发明涉及单链胰岛素作为药物用于糖尿病的治疗的用途。另一方面本发明涉及包含本发明单链胰岛素以及适宜佐剂和添加剂例如适于稳定、保存或者维持等渗的一种或多种物质(例如锌离子、苯酚、甲苯酚、对羟基苯甲酸酯、氯化钠、甘油或者甘露醇)的药物制剂。本发明制剂的锌含量可以是每个胰岛素六聚体O到大约6个锌原子。药物制剂的pH可以在大约4到大约8. 5之间,在大约4到大约5之间，在大约6. 5到大约7. 5之间。另一方面本发明涉及包含单链胰岛素以及至少一种其他药物例如迅速作用或者延长作用的胰岛素类似物以及GLP-1，GLP-2和exendin及其类似物和衍生物的药物组合物。根据本发明的单链胰岛素还可以与迅速作用或者延长作用的胰岛素类似物以及GLP-1，GLP-2和exendin及其类似物和衍生物或者口服抗糖尿病药例如噻唑烷二酮、二甲双胍(metformin)以及其他用于口服治疗的其他II型糖尿病药物制剂一起在组合治疗中使用。在另一个方面中本发明涉及单链胰岛素在制备用于降低哺乳动物中血糖水平特别用于治疗糖尿病的药物制剂中的用途。在另一个实施方案中本发明涉及通过向需要进行以下治疗的患者施用治疗活性剂量的根据本发明的单链胰岛素，在哺乳动物中降低血糖水平的方法。附图
简述图I显示根据本发明的单链胰岛素在正常Wistar大鼠中的血糖降低与人胰岛素的效果进行比较。HI是人胰岛素，SCI是单链胰岛素，图2显示在猪中s. c.给药后单链胰岛素的消失以及图3显示在猪中s. c.给药后另一个单链胰岛素的消失。发明详述根据本发明的单链胰岛素具有胰岛素生物活性。如果单链胰岛素分子没有被酰化化学修饰，它们还与胰岛素受体具有人胰岛素的至少20%的亲和性。而且它们具有IGF-I受体亲和性，与人胰岛素的该亲和性相似或者更低。没有被酰化化学修饰的单链胰岛素与胰岛素受体具有人胰岛素该亲和性的至少20%。根据本发明的单链胰岛素的特征还在于具有高度的物理稳定性。与人胰岛素相比具有一个额外正电荷且pi低于大约6. 5的单链胰岛素在中性pH下可溶且具有如人胰岛素的作用特征但是具有提高的物理稳定性。如果向胰岛素分子引入与人胰岛素相比额外的正电荷则Pl会随着每加入的一个正电荷升高一。与人胰岛素相比具有两个额外正电荷则单链胰岛素会获得延长的特征。也可以通过在一个或者更多Lys残基中或者在N末端的BI氨基酸残基中引入酰基基团使单链胰岛素延长作用。酰化的单链胰岛素在中性PH下可溶并且可以与迅速作用的双链胰岛素例如NovoRapid混合。单链胰岛素可以选择性地在例如B29上酰化。或者在B链的C末端、连接肽序列或者A链的N末端的一个或者更多天然氨基酸残基可以被Lys残基替代，然后可以用如美国专利No. 6500645中公开的众所周知的方法将Lys残基酰化。本发明的具有提高稳定性的单链胰岛素还可以与美国专利No. 6500645和5，750，497中描述的可溶的长效胰岛素相混合。产生的组合保持了两相性药物动力学特征。而且单链胰岛素可以在位置BlO和/或B28上具有氨基酸替代，降低胰岛素自身聚合。本发明单链胰岛素中的连接肽最长可以是14个氨基酸长。但是连接肽通常的长度是 6-10 或 7-10，7-9 或 7-8。在一个实施方案中连接肽具有基序VGSSSGX(SEQ ID NO 122) VGSSSXK(SEQ IDNO :123) ； VGSSXGK (SEQ ID NO :124) VGSXSGK(SEQ ID NO :125) ；VGXSSGK(SEQ ID NO:126) ；VXSSSGK (SEQ ID NO :1127)和 XGSSSGK(SEQ ID NO : 128)，其中 X 是任何可编码的氨
基酸残基。下表表示了 X的选择含义。
权利要求
1.具有生物胰岛素活性并且包含由连接肽连接的人胰岛素B和A链或者其类似物或衍生物的单链胰岛素，其中的连接肽具有5-11个氨基酸残基并且不含有两个相邻的碱性氨基酸残基，并且如果单链胰岛素分子没有被酰化化学修饰则其中单链胰岛素对人胰岛素受体的亲和性是人胰岛素对人胰岛素受体的亲和性的至少大约20%。
2.具有生物胰岛素活性并且包含由连接肽连接的人胰岛素的B和A链或者其类似物或衍生物的单链胰岛素，其中的连接肽具有5-11个氨基酸残基，前提是如果连接肽含有两个相邻的碱性氨基酸残基则B和/或A链中的至少一个天然氨基酸残基被另一个可编码的氨基酸残基替代，或者A链、B链或者连接肽中的至少一个赖氨酸残基已经被酰化化学修饰，或者连接肽不是以下序列之一 Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Lys-Arg(SEQ ID NO 1),Arg-Arg-Gly-Pro-Gly-Gly-Gly(SEQ ID NO 2), Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Lys-Arg(SEQ IDNO 3),Arg-Arg-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly(SEQ ID NO 4),Gly-Gly-Ala-Pro-Gly-Asp-Val-Lys-Arg(SEQ ID NO 5),Arg-Arg-Ala-Pro-Gly-Asp-Val-Gly-Gly(SEQ ID NO 6),Gly-Gly-Tyr-Pro-Gly-Asp-Val-Lys-Arg(SEQ ID NO 7), Arg-Arg-Tyr-Pro-Gly-A sp-Val-Gly-Gly (SEQ ID NO :8)，Gly-Gly-His-Pro-Gly-Asp-Val-Lys-Arg(SEQ ID NO :9),或Arg-Arg-His_Pro-Gly-Asp-Val-Gly-Gly(SEQ ID NO :10)。
3.具有生物胰岛素活性并且包含由连接肽连接的人胰岛素B和A链或者其类似物或衍生物的单链胰岛素，其中的连接肽具有5-11个氨基酸残基，前提是P I在大约6. 5以上的单链胰岛素与人胰岛素的A和B链相比在A和/或B链中包含至少一个氨基酸残基替代和/或缺失，或者A链、B链或者连接肽中至少一个赖氨酸残基已经被酰化化学修饰。
4.具有生物胰岛素活性并且包含由连接肽连接的人胰岛素B和A链或者其类似物或衍生物的单链胰岛素，其中的连接肽具有5-14，5-11，6-10，6-8，6-7，7-9或者7_8个氨基酸残基，且其中A链、B链或者连接肽中至少一个赖氨酸残基已经被酰化化学修饰。
5.根据权利要求1-3中任何一项的单链胰岛素，该单链胰岛素分子中至少一个赖氨酸基团被酰化。
6.根据权利要求5的单链胰岛素，其在B29被酰化。
7.根据权利要求6的单链胰岛素，其被具有6到24，6-20，6-18或6_14个碳原子的脂肪酸酰化。
8.根据权利要求I的单链胰岛素，其在中性PH下可溶并且pi低于大约6.5。
9.根据权利要求8的单链胰岛素，其pi为大约4.5到低于大约6. 5。
10.根据权利要求I的单链胰岛素，其与人胰岛素受体的亲和性是人胰岛素对人胰岛素受体亲和性的至少30%。
11.根据权利要求1-10任何一项的单链胰岛素，其中的连接肽具有7-10，7-9或7-8个氣基酸残基。
12.根据权利要求1-10中任何一项的单链胰岛素，其中的连接肽包含选自下列的序列AGRGSGK(SEQ ID NO :15) ；AGLGSGK(SEQ ID NO :33) ；AGMGSGK(SEQ ID NO :45)；ASffGSGK(SEQ ID NO :48) ；TGLGSGQ(SEQ ID NO :22) ；TGLGRGK(SEQ ID NO :23) ；TGLGSGK(SEQID NO 21) ；HGLYSGK(SEQ ID NO :50) ；KGLGSGQ(SEQ ID NO :51) ；VGLMSGK(SEQ ID NO :56)；VGLSSGQ(SEQ ID NO :27) ；VGLYSGK(SEQ ID NO :28) ；VGLSSGK(SEQ ID NO :30) ；VGMSSGK(SEQID NO 65) ； VffSSSGK(SEQ ID NO :76) ；VGSSSGK(SEQ ID NO : 16)和 VGMSSGK(SEQ ID NO:106)。
13.根据权利要求I的单链胰岛素，其具有式 B(HG)-XfX2-X3-X4-A(Hl)，其中 X1 是 Thr> Lys 或 Ar g, X2 是 Pro> Lys 或 Asp, X3 是 Lys、Pro 或 Glu, X4 是 6-11 个氨基酸残基的肽序列，B (1-26)是由人胰岛素B链的从B链N末端数起的前26个氨基酸残基组成的肽链或者其类似物或衍生物，A(l-21)是天然胰岛素的A链或者其类似物或者衍生物，其中X4不含有两个相邻的碱性氨基酸残基，且如果单链胰岛素分子没有被酰化化学修饰，其中的单链胰岛素对人胰岛素受体的亲和性是人胰岛素对人胰岛素受体的亲和性的至少大约20%。
14.根据权利要求2的单链胰岛素，其具有式 B (1-26) -X1-X2-X3-X4-A (1-21)的单链胰岛素， 其中 X1 是 Thr、Lys 或 Arg, X2 是 Pro、Lys 或 Asp, X3 是 Lys、Pro 或 Glu, X4 是6-11个氨基酸残基的肽序列，B(1-26)是由人胰岛素B链的从B链的N末端数起的前26个氨基酸残基组成的肽链或者其类似物或衍生物，A(l-21)是天然胰岛素的A链或者其类似物或者衍生物，前提是如果X4含有两个相邻的碱性氨基酸残基则B和/或A链中的至少一个天然氨基酸残基被另一个可编码氨基酸残基替代，或者A链、B链或者连接肽中至少一个赖氨酸残基已经通过酰化被化学修饰，或者 X4 不是下列序列中的一个Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Lys-Arg(SEQ ID NO 1),Arg-Arg-Gly-Pro-Gly-Gly-Gly(SEQ ID NO 2), Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Lys-Arg(SEQ IDNO 3),Arg-Arg-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly(SEQ ID NO 4),Gly-Gly-Ala-Pro-Gly-Asp-Val-Lys-Arg(SEQ ID NO 5),Arg-Arg-Ala-Pro-Gly-Asp-Val-Gly-Gly(SEQ ID NO 6),Gly-Gly-Tyr-Pro-Gly-Asp-Val-Lys-Arg(SEQ ID NO 7), Arg-Arg-Tyr-Pro-Gly-Asp-Val-Gly-Gly (SEQ ID NO 8), Gly-Gly-His-Pro-Gly-Asp-Val-Lys-Arg(SEQ IDNO :9)，或Arg-Arg-His_Pro-Gly-Asp-Val-Gly-Gly(SEQ ID NO :10)。
15.根据权利要求3的单链胰岛素，其具有式 B(HG)-XfX2-X3-X4-A(Hl)，其中 X1 是 Thr> Lys 或 Arg, X2 是 Pro> Lys 或 Asp, X3 是 Lys> Pro 或 Glu, X4 是 6-11 个氨基酸残基的肽序列，B (1-26)是由人胰岛素B链的从B链N末端数起的前26个氨基酸残基组成的肽链或者其类似物或衍生物，A(l-21)是天然胰岛素的A链或者其类似物或者衍生物，前提是Pl在大约6. 5以上的单链胰岛素与人胰岛素的A和B链相比在A和/或B链中包含至少一个氨基酸残基替代和/或缺失，或者A链、B链或者连接肽中至少一个赖氨酸残基已经被酰化化学修饰。
16.根据权利要求4的单链胰岛素，其具有式 B(HG)-XfX2-X3-X4-A(Hl)，其中 X1 是 Thr> Lys 或 Arg, X2 是 Pro> Lys 或 Asp, X3 是 Lys> Pro 或 Glu, X4 是 5-14,5-11，6-10，6-8，6-7，7-9或7_8个氨基酸残基的肽序列，B (1-26)是由人胰岛素B链的从B链N末端数起的前26个氨基酸残基组成的肽链或者其类似物或衍生物，A(l-21)是天然胰岛素的A链或者其类似物或者衍生物，其中A链、B链或者连接肽中至少一个赖氨酸残基已经通过酰化被化学修饰。
17.根据权利要求1-16中任何一项的单链胰岛素，其中位置A21的氨基酸残基被除Cys外的另一个氨基酸残基替代。
18.根据权利要求13-16的单链胰岛素，其中X4是具有下式Xa-Xb-Xe-Xd-Xe-Xf-Xg(SEQID NO :129)的肽序列，其中 Xa选自由L，R，T，A，H，Q，G，S和V组成的组； Xb选自由W，G，S，A，H，R和T组成的组； Xc 选自由 L，Y，M，H，R，T，Q，K，V, S，A，G 和 P 组成的组； Xd选自由R，A，Y，M，S，N，H和G组成的组； Xe选自由S，R，A，T，K，P，N M，H，Q，V和G组成的组； Xf选自由G和A组成的组；且 Xg选自由K，R，P，H，F，T，I，Q，W和A组成的组。
19.根据权利要求13-18中任何一项的单链胰岛素，其中X4包含序列SGK。
20.根据权利要求13-18中任何一项的单链胰岛素，其中X4包含序列GSGK(SEQID NO:131)。
21.根据权利要求13-18中任何一项的单链胰岛素，其中X4包含序列SSSGK(SEQIDNO :132)。
22.根据权利要求1-21中任何一项的单链胰岛素，其中位置B1、B3、B10、B22、B28、B29、A8、A15、A18和A21中的至少一个天然氨基酸残基被另一个氨基酸残基替代。
23.根据权利要求1-21中任何一项的单链胰岛素，其是desBl，desB27,desB28或desB29胰岛素类似物。
24.编码根据权利要求1-23的任何单链胰岛素的多核苷酸序列。
25.含有根据权利要求24的多核苷酸序列的表达载体。
26.含有根据权利要求25的表达载体的转化的宿主细胞。
27.包含生物活性量的根据权利要求1-23中任何一项的单链胰岛素的药物制剂。
28.药物制剂，它包含生物活性量的根据权利要求1-23中任何一项的单链胰岛素以及另外的生物活性化合物。
29.根据权利要求28的药物制剂，其中另外的生物活性化合物选自由迅速作用胰岛素类似物、延长作用胰岛素类似物、GLP-U GLP-2以及exendin或其类似物或衍生物组成的组。
30.根据权利要求29的药物制剂，其pH为4-10.5。
31.根据权利要求30的药物制剂，pH为4-8.5。
32.降低哺乳动物中血糖水平的方法，其通过向需要进行该治疗的患者施用治疗活性剂量的根据权利要求27-31任何一项的药物制剂。
33.根据权利要求1-23的任何一项的单链胰岛素作为药物的用途。
34.根据权利要求1-23的任何一项的单链胰岛素在制备用于治疗糖尿病的药物制剂中的用途。
全文摘要
本发明涉及具有胰岛素活性的单链胰岛素，其包含由5-11个氨基酸的连接肽连接的B和A链或修饰的B和A链。该单链胰岛素具有生物胰岛素活性和与人胰岛素的IGF-1相比类似或者更低的IGF-1受体亲和性以及高的物理稳定性。单链胰岛素在连接肽中可以含有至少一个碱性氨基酸残基。单链胰岛素还可以在一个或者多个Lys残基中被酰化。
文档编号A61K38/00GK102816228SQ20121030424
公开日2012年12月12日 申请日期2004年12月3日 优先权日2003年12月3日
发明者T·B·克耶尔德森, A·S·安德森, M·施雷恩, A·R·索伦森, P·马德森 申请人:诺和诺德公司