一种治疗腰椎间盘突出的注射剂的制备方法及检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种治疗腰椎间盘突出的注射剂的制备方法及检测方法，所述的药物制剂，按重量份计算，它由牛膝10～25份、杜仲5～10份、地龙10～15份、桑寄生20～35份和秦艽10～25份或相应重量份它们的提取物制作而成。在本发明中，本 申请人:拟将牛膝提取物、杜仲提取物、桑寄生提取物、秦艽提取物、地龙提取物组合成新制剂进行开发研究，通过配伍发挥该五味药在腰椎间盘突出疾病上的协同互补效应，为腰椎间盘突出的治疗增加一个新的用药剂型选择。同时，本发明还提供了该药物制剂的制备工艺，该制备工艺先进，简单易行，制得的制剂无毒副作用，可供病人长期使用。本发明提供的检测方法能有效的控制产品质量。
【专利说明】一种治疗腰椎间盘突出的注射剂的制备方法及检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种治疗腰椎间盘突出的注射剂的制备方法及检测方法，属于中药的【技术领域】。
【背景技术】
[0002]腰椎间盘突出症(LDH)是骨科常见病，可导致腰痛、下肢疼痛、麻木、肌力减退和大小便障碍等症状。其病因病机，一为受风寒，或坐卧湿地，风寒水湿之邪浸溃经络，经络之气阻滞而发病；二为跌扑闪挫，积累陈伤，经筋、络脉受损，瘀血凝滞所致；三为后期伴有正气虚亏，肝肾不足。腰椎间盘突出分为3型:单纯突出型，核未穿破纤维环；后纵韧带下型，髓核未穿破后纵韧带；游离块型 ，后纵韧带破裂，髓核游离于椎管内。LDH属于中医“腰腿痛”、“痹症”的范畴。
[0003]传统疗法采取服用西药、理疗等方式，但是均不能修复破裂的纤维环，而且西药具有一定的毒副作用，依赖性强，不能从根本上起到治疗作用；理疗则使多数患者不能长期坚持而中断治疗。因此，中医药疗法逐渐显示出了它的重要性。为了达到防治目的，许多 申请人:及药品企业做了大量的研究，也提供了一些治疗的产品，如专利号为:200810080262.8名称为“一种治疗腰间盘突出症的药酒”及申请号为200910272688.8名称为“一种治疗腰椎间盘突出症的外敷药面”等，但是这些药物剂型单一，大多为敷贴制剂，应用面较窄，而且敷贴制剂的提取工艺和检测方法过于简单粗糙，不能最大限度的富集有效成分，因而见效慢，治疗时间长。鉴于此，寻找更理想的药物剂型、制备工艺和更稳定的检测方法仍然是我们目如急需解决的问题。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于，提供一种治疗腰椎间盘突出的注射剂的制备方法及检测方法，用于对腰椎间盘突出的治疗，本发明提供的工艺合理可行，检测方法能有效的控制产品质量。
[0005]本发明是这样构成的:一种治疗腰椎间盘突出的注射剂的制备方法，按重量份计算，取牛膝10~25份、杜仲5~10份、桑寄生20~35份和秦艽10~25份，加入60%~90%乙醇溶液，乙醇溶液的用量为6~8倍，渗漉提取，过滤，合并醇液，减压回收乙醇并浓缩成相对密度为1.1~1.5的浸膏；加2~3倍水加热到40~60°C搅拌溶解，加入有机溶剂进行萃取，回收溶剂，浓缩干燥得牛膝提取物、杜仲提取物、桑寄生提取物和秦艽提取物；按重量份计算，取地龙10~15份，加水煎煮两次，每次加水6~9倍量，煎煮2~3.5小时，合并两次煎煮液浓缩成1.1~1.5的浸膏；将浸膏加90%~95%的乙醇，搅拌、沉淀回收乙醇并浓缩，在45~50°C下干澡、粉碎成粉，得地龙提取物；将牛膝提取物、杜仲提取物、桑寄生提取物、秦艽提取物和地龙提取物混合并加入适当的辅料制备成冻干粉针剂或输液剂。
[0006]优选的，按重量份计算，取牛膝18份、杜仲8份、桑寄生25份和秦艽18份，加入60%~90%乙醇溶液，乙醇溶液的用量为6~8倍，渗漉提取，过滤，合并醇液，减压回收乙醇并浓缩成相对密度为1.1~1.5的浸膏；加2~3倍水加热到40~60°C搅拌溶解，加入有机溶剂进行萃取，回收溶剂，浓缩干燥得牛膝提取物、杜仲提取物、桑寄生提取物和秦艽提取物；按重量份计算，取地龙12份，加水煎煮两次，每次加水6~9倍量，煎煮2~3.5小时，合并两次煎煮液浓缩成1.1~1.5的浸膏；将浸膏加90%~95%的乙醇，搅拌、沉淀回收乙醇并浓缩，在45~50°C下干澡、粉碎成粉，得地龙提取物；将牛膝提取物、杜仲提取物、桑寄生提取物、秦艽提取物和地龙提取物混合并加入适当的辅料制备成冻干粉针剂或输液剂。
[0007]牛膝提取物中的紫茎牛膝甾酮的含量为50%~100%。
[0008]牛膝提取物、杜仲提取物、桑寄生提取物和秦艽提取物还可以采用以下方法制备:
[0009]取牛膝、杜仲、桑寄生和秦艽，加水煎煮2~5次，每次I~4小时，合并煎煮液，滤过，滤液浓缩成60°C相对密度为1.15~1.20的清膏，加入等体积正丁醇或仲丁醇萃取，分离萃取液，减压浓缩溶剂至相对密度60°C为1.15~1.20的清膏，减压干燥，得牛膝提取物、杜仲提取物、桑寄生提取物和秦艽提取物。
[0010]或者取牛膝、杜仲、桑寄生和秦艽，加水煎煮2~5次，每次I~4小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩成相对密度60°C为1.15~1.20的清膏，加入乙醇进行沉淀纯化，过滤，收集滤液，减压回收乙醇至60°C相对密度为1.15~1.20的清膏，减压干燥，得牛膝提取物、杜仲提取物、桑寄生提取物和秦艽提取物。
[0011]或者取牛膝、杜仲、桑寄生和秦艽，加水煎煮2~5次，每次I~4小时，合并煎液，滤过，滤液过大孔吸附树脂柱，先用适量水洗脱，再用乙醇解吸，收集解吸液，减压回收乙醇，减压干燥，得牛膝提取物、杜仲提取物、桑寄生提取物和秦艽提取物。
[0012]或者取牛膝、杜仲、桑寄生和秦艽，加入30%~80%乙醇回流提取I~3次，每次0.5~3小时，合并提取液，滤过，滤液回收乙醇至60°C相对密度为1.15~1.20的清膏，在80°C以下减压干燥，得牛膝提取物、杜仲提取物、桑寄生提取物和秦艽提取物。
[0013]或者取牛膝、杜仲、桑寄生和秦艽，加入30%~80%乙醇回流提取I~3次，每次0.5~3小时，合并提取液，滤过，滤液回收乙醇至60°C相对密度为1.15~1.20的清膏，加入等体积正丁醇或仲丁醇萃取，分离萃取液，减压浓缩至相对密度60°C为1.15~1.20的清膏，减压干燥得牛膝提取物、杜仲提取物、桑寄生提取物和秦艽提取物。
[0014]或者取牛膝、杜仲、桑寄生和秦艽，加入30%~80%乙醇回流提取I~3次，每次0.5~3小时，合并提取液，滤过，滤液回收乙醇至60°C相对密度为1.15~1.20的清膏，加水搅拌均匀，滤过，滤液过大孔吸附树脂柱，先用水洗脱，再用乙醇解吸，收集解吸液，减压回收乙醇，减压干燥，得牛膝提取物、杜仲提取物、桑寄生提取物和秦艽提取物。
[0015]或者取牛膝、杜仲、桑寄生和秦艽，加水煎煮两次，第一次2小时，第二次I小时，合并煎煮液，滤过，滤液浓缩成60°C的相对密度为1.15~1.20的清膏，减压干燥得牛膝提取物、杜仲提取物、桑寄生提取物和秦艽提取物。
[0016]可以取牛膝提取物、杜仲提取物、桑寄生提取物、秦艽提取物和地龙提取物各5g加入2000ml注射用水中搅拌均匀，加入适量10%柠檬酸钠溶液，搅拌至溶液完全溶解，调节pH值4.3~5，搅拌使之完全溶解，加入30ml聚乙二醇600、140g甘露醇，搅拌使之完全溶解，按照质量体积百分比加入0.05%的活性炭，65°C静止吸附20分钟后，过滤除碳，补加注射用水至全量，调节pH值4.3~5，精滤，中间体取样，检测合格后，取3ml灌装于西林瓶中，半压胶塞，装入冻干机，冷冻干燥，箱内压胶塞，出箱锁铝盖，包装即得冻干粉针剂。
[0017]也可以取牛膝提取物、杜仲提取物、桑寄生提取物和秦艽提取物各500mg加入600ml注射用水中搅拌均匀，再加入1.2g柠檬酸钠和50ml丙二醇，搅匀，使之形成澄明溶液，再取300ml注射用水置配液器中，加入800mg酒石酸，再加入地龙提取物400mg，搅拌至形成澄明溶液，加入牛膝提取物、杜仲提取物、桑寄生提取物和秦艽提取物溶液，再加注射用水至1000ml,测定pH值,用1%酒石酸或0.1MNaOH溶液调pH至4.5~5.3,加入45g葡萄糖，搅拌溶解，加入0.05%的活性炭煮沸，搅拌保温20分钟，过滤，三级微孔滤膜:按先后次序为:0.8um-0.45um-0.22um，过滤，加入注射用水稀释，灌封，110°C灭菌I小时，即得葡萄糖输液剂。
[0018]还可以取牛膝提取物、杜仲提取物、桑寄生提取物和秦艽提取物各500mg加入600ml注射用水中搅拌均匀，再加入1.2g柠檬酸钠和50ml丙二醇，搅匀，使之形成澄明溶液，再取300ml注射用水置配液器中，加入800mg酒石酸，再加入地龙提取物400mg，搅拌至形成澄明溶液，加入牛膝提取物、杜仲提取物、桑寄生提取物和秦艽提取物溶液，再加注射用水至1000ml，测定pH值，用1%酒石酸或0.1MNaOH溶液调pH至4.5~5.3，加入70g氯化钠，搅拌溶解，加入0.05%的活性炭煮沸，搅拌保温20分钟，过滤，三级微孔滤膜:按先后次序为:0.8um-0.45um-0.22um,过滤,加入注射用水稀释，灌封，110°C灭菌I小时，即得氯化钠输液剂。
[0019]前述的治疗腰椎间盘突出的药物制剂的检测方法，包括:
[0020]( I)鉴别
[0021](A)取本品或内容物适量研成细粉，取4g，加乙醇30ml，超声处理20分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加0.01mol / L的氢氧化钠溶液20ml，微热使溶解，置分液漏斗中，加乙醚10ml，振摇提取，弃去乙醚液，水层再用醋酸乙酯10ml，振摇提取，醋酸乙酯提取液浓缩至约Iml ;作为供试品溶液，水层备用；或者直接取输液剂Iml作为供试品溶液。另取紫茎牛膝甾酮对照品制成对照品溶液；照薄层色`谱法，附录VI B试验，吸取上述两种溶液各10~15ul，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿:甲酸=5:1为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，于105°C加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
[0022](B)取备用的水层，加水饱和的正丁醇15ml，振摇提取，分取正丁醇提取液，用正丁醇饱和的水5ml洗涤，弃去水层液，正丁醇提取液置水浴上蒸干，残渣加甲醇Iml使溶解，作为供试品溶液；另取蚯蚓解热碱对照品适量，加甲醇制成每Iml含Img的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法，附录VI B试验，吸取上述两种溶液各10ul，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿:甲酸:水=7:3:0.5为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，于105°C加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
[0023](C)取本品适量研成细粉，取IOgJP 75%乙醇100ml，摇匀，加盐酸10ml，置水浴中加热回流3小时，取出，放冷，用60~90°C的石油醚振摇提取4次，每次需要的溶剂量为30ml，20ml，15ml, 15ml，合并石油醚提取液，挥干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液；另取秦艽对照药材，同样的方法制成对照药材溶液；照薄层色谱法，附录VI B试验，吸取上述两种溶液各lOul，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷:醋酸乙酯=4:1为展开剂，二次展开，每次展距18cm，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，于105°C加热使斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照品色谱相应位置上，显相同颜色的斑点。
[0024](2)含量测定
[0025]照高效液相色谱法，《中国药典》2000 一部附录VID测定，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇:水=55:45为流动相，用蒸发光散射检测器检测，理论塔板数按紫茎牛膝甾酮计算不低于2000 ;精密称取经105°C干燥至恒重的紫茎牛膝留酮对照品适量，加甲醇制成每Iml含0.8mg的溶液，作为对照品溶液；取本品或内容物适量研成细粉，取2.0g，精密称定，精密加入甲醇25ml，称定重量，超声处理45分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，用甲醇20ml分次洗涤残渣和容器，洗液并入滤液中；将提取液回收甲醇至干，残渣加水20ml使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次15ml，合并正丁醇提取液，用氨试液洗涤2次，每次15ml ;取正丁醇液，水浴蒸干，残渣用甲醇溶解并转移至5ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，离心，即得供试品溶液；分别精密吸取上述对照品溶液5ul、10ul，供试品溶液5~10ul，注入液相色谱仪，测定，用外标两点法对数方程计算含量。
[0026]本方中，牛膝、杜仲补肝肾、强筋骨、活血通经为君药；桑寄生、秦艽祛风湿、风湿痹痛、筋脉拘挛、骨节酸痛之症为佐药；地龙通行经络为使药，诸药相合，共奏补肝肾、祛风湿、通经络之效。与现有技术相比，本 申请人:拟将牛膝提取物、杜仲提取物、桑寄生提取物、秦艽提取物、地龙提取物组合成新制剂进行开发研究，通过配伍发挥该五味药在腰椎间盘突出疾病上的协同互补效应，为腰椎间盘突出的治疗增加一个新的用药选择。同时，本发明还提供了该药物制剂的制备工艺，该制备工艺先进，简单易行，制得的制剂无毒副作用，可供病人长期使用。本发明提供的 检测方法能有效的控制产品质量。
[0027]本发明的关键在于，本 申请人:进行了一系列实验来选择本发明提供的药物制剂的制备工艺；保证科学、合理、可行；保证得到的制剂具有有效的治疗效果，生产企业可以根据本发明直接生产、制备效果显著的药物制剂，而不再需要进行新的摸索、研究；实际上对于制剂技术来讲，其关键就在于生产工艺条件的选择；如果选择不当，要么制备不出有效的产品、有时甚至危害健康，要么制剂品种的成本高昂、又不符合市场要求；本发明的选择解决了这些问题；同时，向市场又提供了新的品种制剂，使医患双方有更多的选择余地。
[0028]实验例1:冻干粉针剂工艺条件研究
[0029](I)溶解性试验
[0030]本品为牛膝提取物、杜仲提取物、桑寄生提取物、秦艽提取物和地龙提取物的冷冻干燥制品，供静脉注射使用。因此首先需要了解牛膝提取物、杜仲提取物、桑寄生提取物和秦艽提取物的溶解性能。为此，我们进行了溶解性试验。
[0031]方法:称取牛膝提取物、杜仲提取物、桑寄生提取物和秦艽提取物各50mg分别置于烧杯中，加入注射用水，随后将药液稀释至30ml，药液的澄明度作为考察依据。结果见表
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[0032]表1原料的溶解性试验
[0033]
【权利要求】
1.一种治疗腰椎间盘突出的注射剂的制备方法，其特征在于，按重量份计算，取牛膝10~25份、杜仲5~10份、桑寄生20~35份和秦艽10~25份，加入60%~90%乙醇溶液，乙醇溶液的用量为6~8倍，渗漉提取，过滤，合并醇液，减压回收乙醇并浓缩成相对密度为1.1~1.5的浸膏；加2~3倍水加热到40~60°C搅拌溶解，加入有机溶剂进行萃取，回收溶剂，浓缩干燥得牛膝提取物、杜仲提取物、桑寄生提取物和秦艽提取物；按重量份计算，取地龙10~15份，加水煎煮两次，每次加水6~9倍量，煎煮2~3.5小时，合并两次煎煮液浓缩成1.1~1.5的浸膏；将浸膏加90%~95%的乙醇，搅拌、沉淀回收乙醇并浓缩，在45~50°C下干澡、粉碎成粉，得地龙提取物；将牛膝提取物、杜仲提取物、桑寄生提取物、秦艽提取物和地龙提取物混合并加入适当的辅料制备成冻干粉针剂或输液剂。
2.根据权利要求1所述的治疗腰椎间盘突出的注射剂的制备方法，其特征在于，按重量份计算，取牛膝18份、杜仲8份、桑寄生25份和秦艽18份，加入60%~90%乙醇溶液，乙醇溶液的用量为6~8倍，渗漉提取，过滤，合并醇液，减压回收乙醇并浓缩成相对密度为1.1~1.5的浸膏；加2~3倍水加热到40~60°C搅拌溶解，加入有机溶剂进行萃取，回收溶剂，浓缩干燥得牛膝提取物、杜仲提取物、桑寄生提取物和秦艽提取物；按重量份计算，取地龙12份，加水煎煮两次，每次加水6~9倍量，煎煮2~3.5小时，合并两次煎煮液浓缩成1.1~1.5的浸膏；将浸膏加90%~95%的乙醇，搅拌、沉淀回收乙醇并浓缩，在45~50°C下干澡、粉碎成粉，得地龙提取物；将牛膝提取物、杜仲提取物、桑寄生提取物、秦艽提取物和地龙提取物混合并加入适当的辅料制备成冻干粉针剂或输液剂。
3.根据权利要求1或2所述的治疗腰椎间盘突出的注射剂的制备方法，其特征在于，取牛膝提取物、杜仲提取物、桑寄生提取物、秦艽提取物和地龙提取物各5g加入2000ml注射用水中搅拌均匀，加入适量10%柠檬酸钠溶液，搅拌至溶液完全溶解，调节pH值4.3~5，搅拌使之完全溶解，加入30ml聚乙二醇600、140g甘露醇，搅拌使之完全溶解，按照质量体积百分比加入0.05%的活性炭，65°C静止吸附20分钟后，过滤除碳，补加注射用水至全量，调节pH值4.3~5，精滤，中间体取样，检测合格后，取3ml灌装于西林瓶中，半压胶塞，装入冻干机，冷冻干燥，箱内压胶塞，出箱锁铝盖，包装即得冻干粉针剂。
4.根据权利要求1或2所述的治疗腰椎间盘突出的注射剂的制备方法，其特征在于，取牛膝提取物、杜仲提取物、桑寄生提取物和秦艽提取物各500mg加入600ml注射用水中搅拌均匀，再加入1.2g柠檬酸钠和50ml丙二醇，搅匀，使之形成澄明溶液，再取300ml注射用水置配液器中，加入SOOmg酒石酸，再加入地龙提取物400mg，搅拌至形成澄明溶液，加入牛膝提取物、杜仲提取物、桑寄生提取物和秦艽提取物溶液，再加注射用水至1000ml，测定PH值，用1%酒石酸或0.1MNaOH溶液调pH至4.5~5.3，加入45g葡萄糖，搅拌溶解，加入0.05%的活性炭煮沸，搅拌保温20分钟，过滤，三级微孔滤膜:按先后次序为:0.8um-0.45um-0.22um，过滤，加入注射用水稀释，灌封，110°C灭菌I小时，即得葡萄糖输液剂。
5.根据权利要求1或2所述的治疗腰椎间盘突出的注射剂的制备方法，其特征在于，取牛膝提取物、杜仲提取物、桑寄生提取物和秦艽提取物各500mg加入600ml注射用水中搅拌均匀，再加入1.2g柠檬酸钠和50ml丙二醇，搅匀，使之形成澄明溶液，再取300ml注射用水置配液器中，加入SOOmg酒石酸，再加入地龙提取物400mg，搅拌至形成澄明溶液，加入牛膝提取物、杜仲提取物、桑寄生提取物和秦艽提取物溶液，再加注射用水至1000ml，测定pH值，用1%酒石酸或0.1MNaOH溶液调pH至4.5~5.3，加入70g氯化钠，搅拌溶解，加入0.05%的活性炭煮沸，搅拌保温20分钟，过滤，三级微孔滤膜:按先后次序为:`0.8um-0.45um-0.22um,过滤,加入注射用水稀释,灌封，110°C灭菌I小时，即得氯化钠输液剂。
6.权利要求1~5任一所述的治疗腰椎间盘突出的药物制剂的检测方法，其特征在于，包括: (1)鉴别 (A)取本品或内容物适量研成细粉，取4g，加乙醇30ml，超声处理20分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加0.01mol / L的氢氧化钠溶液20ml，微热使溶解，置分液漏斗中，加乙醚10ml，振摇提取，弃去乙醚液，水层再用醋酸乙酯10ml，振摇提取，醋酸乙酯提取液浓缩至约Iml ；作为供试品溶液，水层备用；或者直接取输液剂Iml作为供试品溶液。另取紫茎牛膝甾酮对照品制成对照品溶液；照薄层色谱法，附录VI B试验，吸取上述两种溶液各10~15ul，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿:甲酸=5:1为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，于105°C加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点； (B)取备用的水层，加水饱和的正丁醇15ml，振摇提取，分取正丁醇提取液，用正丁醇饱和的水5ml洗涤，弃去水层液，正丁醇提取液置水浴上蒸干，残渣加甲醇Iml使溶解，作为供试品溶液；另取蚯蚓解热碱对照品适量，加甲醇制成每Iml含Img的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法，附录VI B试验，吸取上述两种溶液各10ul，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿:甲酸冰=7:3:0.5为展开剂,展开,取出，晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液，于105°C加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点； (C)取本品适量研成细粉，`取10g，加75%乙醇100ml，摇匀，加盐酸10ml，置水浴中加热回流3小时，取出，放冷，用60~90°C的石油醚振摇提取4次，每次需要的溶剂量为30ml，20ml，15ml，15ml，合并石油醚提取液，挥干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液；另取秦艽对照药材，同样的方法制成对照药材溶液；照薄层色谱法，附录VI B试验，吸取上述两种溶液各10ul，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷:醋酸乙酯=4:1为展开剂，二次展开，每次展距18cm，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，于105°C加热使斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照品色谱相应位置上，显相同颜色的斑点。 (2)含量测定 照高效液相色谱法，《中国药典》2000 一部附录VID测定，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇:水=55:45为流动相，用蒸发光散射检测器检测，理论塔板数按紫茎牛膝甾酮计算不低于2000 ;精密称取经105°C干燥至恒重的紫茎牛膝留酮对照品适量，加甲醇制成每Iml含0.8mg的溶液，作为对照品溶液；取本品或内容物适量研成细粉，取2.0g,精密称定，精密加入甲醇25ml，称定重量，超声处理45分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，用甲醇20ml分次洗涤残渣和容器，洗液并入滤液中；将提取液回收甲醇至干，残渣加水20ml使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次15ml，合并正丁醇提取液，用氨试液洗涤2次，每次15ml ;取正丁醇液，水浴蒸干，残渣用甲醇溶解并转移至5ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，离心，即得供试品溶液；分别精密吸取上述对照品溶液5ul、10ul， 供试品溶液5~lOul，注入液相色谱仪，测定，用外标两点法对数方程计算含量。
【文档编号】A61K35/56GK103655687SQ201210362256
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2012年9月25日 优先权日:2012年9月25日
【发明者】董根荣 申请人:董根荣