一种转移因子的制备方法及其注射剂的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物制药领域，具体地指一种转移因子的制备方法及其注射剂的制备 方法。
【背景技术】
[0002] 转移因子Transfer Factor (TF)，又称传输因子，由具有细胞性免疫功能的淋巴细 胞产生，通过从冻融致敏的T细胞获得的一种可透析的因子。能加强动物的免疫力，可以将 延迟过敏反应能力从一个个体（包括人和动物）转移到另一个体，它们运送父淋巴细胞的 抗原特异细胞性免疫（迟发性过敏反应）到未暴露或原生的淋巴细胞。转移因子携带有致 敏淋巴细胞的特异性免疫信息，能够将特异性免疫信息递呈给受体淋巴细胞，使受体无活 性的淋巴细胞转变为特异性致敏淋巴细胞，从而激发受体细胞介导的免疫反应。转移因子 具有广泛的免疫学调节活性，一方面可诱导免疫细胞活化，增强机体非特异性免疫能力。另 一方面能够将特异性免疫能力传递到其他动物，激发动物产生特异性免疫。
[0003] 由于其特定的作用，转移因子临床用于治疗某些抗生素难以控制的病毒性或霉菌 性细胞内感染（如带状疱瘆，流行性乙型脑炎，白色念珠菌感染，病毒性心肌炎等）；对恶 性肿瘤可作为辅助治疗剂（主要用于肺癌，鼻咽癌，乳腺癌，骨肉瘤等）；免疫缺陷病（如湿 瘆，血小板减少，多次感染综合症及慢性皮肤粘膜真菌病有较好的疗效）。目前，已公开的 关于转移因子注射剂的制备工艺中，通常包括以下方法：（1)用绞肉机或匀浆器将猪脾（牛 脾）匀浆，冻融，或超声以破碎细胞；（2)离心；（3)离心液经10000分子量左右的超滤膜超 滤的转移因子；(4)根据转移因子的含量加注射用水配制注射制剂。
[0004] 中国专利申请"一种从牛脾脏中提取转移因子的方法"（专利【申请号】 200810154335. 3)公开生产方法：将冷冻牛脾脏破碎、絮凝、透析、过滤除菌，制成含有转移 因子的原液；"一种猪脾转移因子注射液的制备方法"（专利【申请号】201310136476. 3)公 开猪脾转移因子注射液的制备方法：将检验合格后的猪脾脏进行清洗、匀浆、甲醛灭活、冻 融破碎，经过滤、超滤后获得原液，加入注射用水得到注射液；"一种猪脾转移因子注射液 的生产方法"（专利【申请号】201110126248.9)中使用匀浆、低温超声破碎、离心、超滤工艺 提取转移因子；"一种转移因子溶液及其制备方法"（专利【申请号】201410306339.4)中将 猪脾进行清洗、匀浆、反复冻融、调节PH、过滤、超滤后得到转移因子溶液；"一种转移因子 的制备方法"（专利【申请号】201310640313.9)将新鲜鸡脾进行清洗、匀浆、冻融破碎，经 离心加压抽滤、超滤后获得转移因子溶液；"一种猪脾转移因子制备方法"（专利【申请号】 201310755932. 2)包括组织绞碎、均质破碎、微滤、超滤等步骤，采用高压均质机快速破碎细 胞。
[0005] 上述的工艺方法仅用冻融后离心，一方面不能充分有效的去除各类杂蛋白，这样 使得产品容易引起过敏反应，不能有效去除各类动物源性病毒，使制剂存在病毒污染和异 常毒性不合格的风险；另一方面就是现有的制备方法均使用微滤膜、超滤膜进行过滤，滤膜 负荷大，寿命短，成本高，限制了医学上的进一步使用。灭活过程中采用加入甲醛或进行升 温处理，甲醛为致癌物，残留的游离甲醛注入人体后产生制激性反应；升温则易使转移因子 的活性降低而影响使用效果。注射液中氨基酸、小肽类物质易发生聚合为大分子物质而析 出致使制剂不稳定，也易引起相关的副作用。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的就是要解决上述【背景技术】的不足，提供一种转移因子的制备方法及 其注射剂的制备方法，来减少转移因子中的杂蛋白过敏源，有效去除各类动物源性病毒及 延长超滤膜的使用寿命。
[0007] 本发明的技术方案为：一种转移因子的制备方法：
[0008] (1)预处理：将动物脾脏剥离其附着脂肪，用水洗净；
[0009] (2)匀浆：加入动物脾脏重量1. 5~2倍的注射用水混合后，置于胶体磨内反复绞 磨4~6次，制成匀浆，移入-16°C下存放3天以上；
[0010] (3)反复冻融：将匀浆反复冻融3~5次；
[0011] (4)离心：将匀浆化冻后离心，取匀浆上清液；
[0012] (5)乙醇沉淀：在不断搅拌下将匀浆上清液按1 : 2的体积比加入无水乙醇，在 〇~5°C静置12小时以上，离心取上清液减压真空浓缩至原体积的1/5~1/10,回收乙醇；
[0013] (6) -次超滤：调节浓缩液pH值至6.0~7.0,分别经50K分子量和IOk超滤膜超 滤后得转移因子一次溶液；
[0014] (7)病毒灭活：在转移因子一次溶液中加入白蛋白至每毫升溶液中白蛋白质量分 数为1~2%。，经60°C保温10小时后，迅速将温度降至20°C以下；
[0015] (8)二次超滤：经3K~5K分子量的超滤膜超滤后得转移因子溶液。
[0016] 优选的，所述反复冻融步骤中将已凝固的匀浆取出置于33~37°C水浴，不断搅拌 使其快速融化，待匀浆全部融为液态时，再放入低温冷冻，如此反复3~5次。
[0017] 优选的，所述离心步骤中，将匀浆化冻后在4°C、转速3000r/min下离心30分钟，取 匀浆上清液。
[0018] 优选的，所述乙醇沉淀步骤中无水乙醇与匀浆混合物在4°C、转速3000r/min下离 心30分钟。
[0019] 优选的，所述乙醇沉淀步骤中减压真空浓缩的真空度为-0. 03~-0. 08MPa。
[0020] 优选的，所述动物脾脏为猪脾或牛脾。
[0021] 本发明还提供一种转移因子注射剂的制备方法，步骤为：测定所述转移因子溶液 内多肽和核酸的含量，加入注射用水调节至每2ml溶液中含多肽3mg和核糖100 μ g，加入氯 化钠使溶液中氯化钠的浓度为〇. 9g/ml，加入稳定剂吐温-80至溶液中的吐温-80质量浓度 为1~2%。，除菌过滤后无菌分装即得转移因子注射剂。
[0022] 本发明的优点为：
[0023] 1.采用传统工艺中均未使用的乙醇沉淀法去除各类杂蛋白，能有效保证产品的安 全性，减少过敏源，提高安全性；同时经乙醇沉淀去除杂蛋白后可减少后续超滤膜超滤的负 荷，延长超滤膜的使用寿命，降低成本，使其在生物上有进一步的应用。
[0024] 2.采用乙醇沉淀法去除杂蛋白，以及先后通过50KD、10KD，3~5KD超滤膜多级超 滤，既能保证杂蛋白的彻底去除，又能有效地控制高分子量物质，制得产品高分子物质少于 I. 0%，远远低于国家标准规定的少于5. 0%，能更有效地保证产品质量，保证临床安全性。
[0025] 3.制备方法中加入白蛋白保护剂后采用60°C，10小时能有效灭活病毒，再加上后 续的超滤工艺，能充分保证动物源性病毒的灭活，保证制剂产品的安全性。同时白蛋白作为 保护剂，能保证在较高温条件下转移因子的活性不会降低。制得产品活力按T细胞活性测 定法一脱E受体法测定均不低于30 %，远远高于国家标准规定的不低于10 %。
[0026] 4.将牛脾（或猪脾）匀浆液采用低温反复冻融，能使细胞内外的有效物质充分释 放，保证有效成分的充分提取。
[0027] 5.注射剂配料过程中加入吐温-80作稳定剂，能有效得避免制剂在储存过程中有 机物类氨基酸、小肽、核苷酸、嘌呤等聚合为大分子物质析出，影响制剂的澄明度，保证产品 长时间储存过程的稳定，同时降低过敏反应发生率。
【具体实施方式】
[0028] 下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
[0029] 实施例1
[0030] 转移因子的制备方法，包括如下步骤，
[0031] (1)预处理：将猪脾剥离其附着脂肪，用饮用水清洗2次，再用纯化水清洗3次；
[0032] (2)匀浆：加入猪脾重量1. 5倍的注射用水混合后，置于胶体磨内反复绞磨4次， 制成匀浆，移入-16°C下存放3天以上；
[0033] (3)反复冻融：将已凝固的匀浆取出放入33°C的水浴中，不断搅拌使其快速融化， 待匀浆全部融为液态时，再放入低温冷库内冷冻，如此反复3次；
[0034] (4)离心：将匀浆化冻后在4°C、转速3000r/min下离心30分钟，取匀浆上清液；
[0035] (5)乙醇沉淀：在不断搅拌下将匀浆上清液按1 : 2的体积比加入无水乙醇，在 5°C静置12小时以上，4°C、转速3000r/min下离心30分钟，取上清液在-0. 03MPa真空度下 减压真空浓缩至原体积的1/5,回收乙醇；
[0036] (6) -次超滤：调节浓缩液pH值至6. 0,分别经50K分子量和IOk超滤膜超滤后得 转移因子一次溶液；
[0037] (7)病毒灭活：在转移因子一次溶液中加入白蛋白至每毫升溶液中白蛋白质量分 数为1%。，经60°C保温10小时后，迅速将温度降至20°C以下；
[0038] (8)二次超滤：经3K分子量的超滤膜超滤后得转移因子溶液；
[0039] 将所得转移因子溶液制备成转移因子注射液。
[0040] 制备注射剂：测定转移因子溶液中多肽和核酸的含量，加入注射用水调节至每 2ml溶液中含多肽3mg和核糖100 μ g，加入氯化钠使溶液中氯化钠的浓度为0. 9g/ml，加入 稳定剂吐温-80至溶液中的吐温-80质量浓度为1%。，除菌过滤后无菌分装即得转移因子注 射剂。
[0041] 实施例2
[0042] 转移因子的制