备方法，包括如下步骤，
[0043] (1)预处理：将猪脾剥离其附着脂肪，用饮用水清洗2次，再用纯化水清洗3次；
[0044] (2)匀浆：加入猪脾重量2倍的注射用水混合后，置于胶体磨内反复绞磨6次，制 成匀浆，移入-16°C下存放3天以上；
[0045] (3)反复冻融：将已凝固的匀浆取出放入35°C的水浴中，不断搅拌使其快速融化， 待匀浆全部融为液态时，再放入低温冷库内冷冻，如此反复3次；
[0046] (4)离心：将匀浆化冻后在4°C、转速3000r/min下离心30分钟，取匀浆上清液；
[0047] (5)乙醇沉淀：在不断搅拌下将匀浆上清液按1 : 2的体积比加入无水乙醇，在 0°C静置12小时以上，4°C、转速3000r/min下离心30分钟，取上清液-0. 05MPa真空度下减 压真空浓缩至原体积的1/10,回收乙醇；
[0048] (6) -次超滤：调节浓缩液pH值至7. 0,分别经50K分子量和IOk超滤膜超滤后得 转移因子一次溶液；
[0049] (7)病毒灭活：在转移因子一次溶液中加入白蛋白至每毫升溶液中白蛋白质量分 数为2%。，经60°C保温10小时后，迅速将温度降至20°C以下；
[0050] (8)二次超滤：经5K分子量的超滤膜超滤后得转移因子溶液。
[0051] 将所得转移因子溶液制备成转移因子注射液。
[0052] 制备注射剂：测定转移因子溶液中多肽和核酸的含量，加入注射用水调节至每 2ml溶液中含多肽3mg和核糖100 μ g，加入氯化钠使溶液中氯化钠的浓度为0. 9g/ml，加入 稳定剂吐温-80至溶液中的吐温-80质量浓度为2%。，除菌过滤后无菌分装即得转移因子注 射剂。
[0053] 实施例3
[0054] 转移因子的制备方法，包括如下步骤，
[0055] (1)预处理：将猪脾剥离其附着脂肪，用饮用水清洗2次，再用纯化水清洗3次；
[0056] (2)匀浆：加入猪脾重量1. 8倍的注射用水混合后，置于胶体磨内反复绞磨5次， 制成匀浆，移入-16°C下存放3天以上；
[0057] (3)反复冻融：将已凝固的匀浆取出放入33°C的水浴中，不断搅拌使其快速融化， 待匀浆全部融为液态时，再放入低温冷库内冷冻，如此反复3次；
[0058] (4)离心：将匀浆化冻后在4°C、转速3000r/min下离心30分钟，取匀浆上清液；
[0059] (5)乙醇沉淀：在不断搅拌下将匀浆上清液按1 : 2的体积比加入无水乙醇，在 5°C静置12小时以上，4°C、转速3000r/min下离心30分钟，取上清液-0. 08MPa真空度下减 压真空浓缩至原体积的1/5,回收乙醇；
[0060] (6) -次超滤：调节浓缩液pH值至6. 5,分别经50K分子量和IOk超滤膜超滤后得 转移因子一次溶液；
[0061] (7)病毒灭活：在转移因子一次溶液中加入白蛋白至每毫升溶液中白蛋白质量分 数为1. 5%。，经60°C保温10小时后，迅速将温度降至20°C以下；
[0062] (8)二次超滤：经4K分子量的超滤膜超滤后得转移因子溶液。
[0063] 将所得转移因子溶液制备成转移因子注射液。
[0064] 制备注射剂：测定转移因子溶液中多肽和核酸的含量，加入注射用水调节至每 2ml溶液中含多肽3mg和核糖100 μ g，加入氯化钠使溶液中氯化钠的浓度为0. 9g/ml，加入 稳定剂吐温-80至溶液中的吐温-80质量浓度为1.5%。，除菌过滤后无菌分装即得转移因子 注射剂。
[0065] 实施例4
[0066] 转移因子的制备方法，包括如下步骤，
[0067] (1)预处理：将牛脾剥离其附着脂肪，用饮用水清洗2次，再用纯化水清洗3次；
[0068] (2)匀浆：加入牛脾重量1. 5倍的注射用水混合后，置于胶体磨内反复绞磨4次， 制成匀浆，移入-16°C下存放3天以上；
[0069] (3)反复冻融：将已凝固的匀浆取出放入37°C的水浴中，不断搅拌使其快速融化， 待匀浆全部融为液态时，再放入低温冷库内冷冻，如此反复3次；
[0070] (4)离心：将匀浆化冻后在4°C、转速3000r/min下离心30分钟，取匀浆上清液；
[0071] (5)乙醇沉淀：在不断搅拌下将匀浆上清液按1 : 2的体积比加入无水乙醇，在 3°C静置12小时以上，4°C、转速3000r/min下离心30分钟，取上清液-0. 06MPa真空度下减 压真空浓缩至原体积的1/8,回收乙醇；
[0072] (6) -次超滤：调节浓缩液pH值至6. 0,分别经50K分子量和IOk超滤膜超滤后得 转移因子一次溶液；
[0073] (7)病毒灭活：在转移因子一次溶液中加入白蛋白至每毫升溶液中白蛋白质量分 数为1%。，经60°C保温10小时后，迅速将温度降至20°C以下；
[0074] (8)二次超滤：经3K分子量的超滤膜超滤后得转移因子溶液。
[0075] 将所得转移因子溶液制备成转移因子注射液。
[0076] 制备注射剂：测定转移因子溶液中多肽和核酸的含量，加入注射用水调节至每 2ml溶液中含多肽3mg和核糖100 μ g，加入氯化钠使溶液中氯化钠的浓度为0. 9g/ml，加入 稳定剂吐温-80至溶液中的吐温-80质量浓度为1%。，除菌过滤后无菌分装即得转移因子注 射剂。
[0077] 病毒灭活效果检测：
[0078] 按实施例中制得的转移因子一次溶液中加入伪狂犬病毒（Pseudorabies virus， PRV)为指示病毒，加入白蛋白保护剂后经过60°C X 10小时的热处理后，以IBRS-2细胞作 为培养用细胞，采用96孔细胞病变法检测病毒的滴度，以细胞病变（CPE)作为判别病毒存 在的指标，对未出现细胞病变的样品用细胞进行盲传三代。通过病毒对照培养结果显示，采 用上述热处理方法，如表1所示，可以使伪狂犬病毒滴度下降PRV7. 4个log TCID50/0.1 ml，如 表2所示，样本经盲传一代、二代、三代，均未见特异致细胞病变作用（CPE)。
[0079] 表1加热法（60°C，10小时）灭活处理转移因子加入PRV验证结果
【主权项】
1. 一种转移因子的制备方法，其特征在于，包括如下步骤， (1) 预处理：将动物脾脏剥离其附着脂肪，用水洗净； (2) 匀浆：加入动物脾脏重量1. 5~2倍的注射用水混合后，置于胶体磨内反复绞磨 4~6次，制成匀衆，移入-16°C下存放3天以上； (3) 反复冻融：将匀浆反复冻融3~5次； (4) 离心：将匀浆化冻后离心，取匀浆上清液； (5) 乙醇沉淀：在不断搅拌下将匀浆上清液按1 : 2的体积比加入无水乙醇，在O~5°C 静置12小时以上，离心取上清液减压真空浓缩至原体积的1/5~1/10,回收乙醇； (6) -次超滤：调节浓缩液pH值至6. 0~7. 0,分别经50K分子量和IOk超滤膜超滤后 得转移因子一次溶液； (7) 病毒灭活：在转移因子一次溶液中加入白蛋白至每毫升溶液中白蛋白质量分数为 1~2%。，经60°C保温10小时后，迅速将温度降至20°C以下； (8) 二次超滤：经3K~5K分子量的超滤膜超滤后得转移因子溶液。
2. 如权利要求1所述转移因子的制备方法，其特征在于，所述反复冻融步骤中将已凝 固的匀浆取出置于33~37°C水浴，不断搅拌使其快速融化，待匀浆全部融为液态时，再放 入低温-16°C下冷冻，如此反复3~5次。
3. 如权利要求1所述转移因子的制备方法，其特征在于，所述离心步骤中，将匀浆化冻 后在4°C、转速3000r/min下离心30分钟，取匀浆上清液。
4. 如权利要求1所述转移因子的制备方法，其特征在于，所述乙醇沉淀步骤中无水乙 醇与勾衆混合物在4°C、转速3000r/min下离心30分钟。
5. 如权利要求1所述转移因子的制备方法，其特征在于，所述乙醇沉淀步骤中减压真 空浓缩的真空度为-〇. 03~-0. 08MPa。
6. 如权利要求1所述转移因子的制备方法，其特征在于，所述动物脾脏为猪脾或牛脾。
7. -种如权利要求1-6任一所述的转移因子注射剂的制备方法，其特征在于，测定转 移因子溶液内多肽和核酸的含量，加入注射用水调节至每2ml溶液中含多肽3mg和核糖 100 μ g，加入氯化钠使溶液中氯化钠的浓度为0. 9g/ml，加入稳定剂吐温-80至溶液中的吐 温-80质量浓度为1~2%。，除菌过滤后无菌分装即得转移因子注射剂。
【专利摘要】本发明公开了一种转移因子的制备方法，其特征在于，包括预处理、匀浆、反复冻融、离心、乙醇沉淀、一次超滤、病毒灭活、二次超滤、本发明还公开了一种转移因子注射剂的制备方法。本发明采用传统工艺中均未使用的乙醇沉淀法去除各类杂蛋白及病毒灭活法有效去除各种动物源性病毒，能有效保证产品的安全性，减少过敏源，提高安全性；同时经乙醇沉淀去除杂蛋白后可减少后续超滤膜超滤的负荷，延长超滤膜的使用寿命。
【IPC分类】A61K38-00, A61K35-26, A61P37-04, A61K9-08
【公开号】CN104644673
【申请号】CN201510080677
【发明人】黄楚华, 王世民, 戴军宝
【申请人】武汉华龙生物制药有限公司
【公开日】2015年5月27日
【申请日】2015年2月15日