专利名称：一种小核酸分子快递技术的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，特别是指ー种小核酸分子快递技木。
背景技术：
基因治疗是ー种近年来发展起来的新型治疗技木。由于基因治疗的靶点明确，该技术在治疗重大疾病(如恶性肿瘤，糖尿病，病毒性肝炎等)方面显示出专一、高效的优势，近年来发展起来的小RNA干扰技术为基因治疗又提供了ー种新的技术方法，基因治疗技术从实验室研究走向临床应用的技术瓶颈之ー是核酸的导入技术，核酸的转移效率对于矫正在许多疾病中涉及的核酸表达的缺乏和过量是必要的，核酸转移还可以用于研究基因的表达调控和功能评估和鉴定，以及干细胞的自我更新和定向分化的分子基础的解析和应用，如今，人们提出了许多方法来进行此类遗传信息的细胞内释放，大体上可以分为病毒载体介导的和非病毒介导的核酸导入技术这两大类，尽管病毒载体在外源核酸的导入效率方面有着显著的成效，但是由于它们常常具有免疫源性，细胞毒性和生物危险性，尤其是临床研究中出现的腺病毒载体导致的癌症，病毒载体的这种长期毒性对通过病毒载体转导核酸药物的临床治疗产生了相当大的负面影响。另外ー类的核酸转染技术是使用化学的或生化的载体。这些合成的载体具有两个主要功能与要转染的核酸复合和促进其稳定性增加以及促进它穿过原生质膜。在开发的合成载体中聚赖氨酸类的阳离子聚合物和DEAE葡聚糖或脂转染剂，聚こ烯亚胺转染剂都是被广泛使用的。不同的合成多聚体导入核酸药物的作用机制细节各不相同，但它们也存在着ー些共同特点，这些特点是基于核酸分子本身带负电，而细胞膜本身也带负电，核酸分子被导入到细胞内的过程中必须克服核酸分子与细胞表面的负电荷产生的静电斥力，所以目前已经广泛用于实验室研究的各种核酸转染剂都富含阳离子基团以中和核酸以及细胞表面的负电荷，最简单的转染剂就是磷酸I丐，其它的如阳离子脂质体，阳离子聚合-L-赖氨酸以及聚こ烯亚胺等，然而由于上述有机聚合物的细胞毒性，转染剂造成的核酸药物的脱靶效应，限制了它们在基因治疗中的广泛应用，同时上述转染剂的转染效率不够高也限制了它们在基因治疗中的广泛使用，基因治疗的药物导入技术仍然是当前的技术瓶颈，寻找新的高效低毒以及组织专ー的核酸转染方法仍然是当前的ー个非常重要的课题。
发明内容
本发明提出小核酸分子快递技术，解决了现有技术中基因治疗的药物导入技术瓶颈的问题。本发明的技术方案是这样实现的ー种小核酸分子快递技术，利用多肽类转染剂将碱基数为10 100的小分子核酸/脱氧核酸或经过化学修饰的小分子核酸转染进入细胞。作为优选的技术方案，所述多肽类转染剂与碱基数为10 100的单链或双链的小RNA/DNA或经过化学修饰的单链或双链的小RNA/DNA的质量比只为0. 02 200g多肽/g核酸。作为优选的技术方案，所述多肽类转染剂包括10 50个氨基酸残基；所述多肽类转染剂的转染多肽含有带正电荷的氨基酸，所述正电荷氨基酸数目占多肽氨基酸数目的20% 80% ;所述连续分布的数目为4 20 ;所述正电荷氨基酸如赖氨酸、精氨酸；这些带阳性电荷的氨酸序列的作用被认为是和核酸分子通过静电作用形成复合物的结构单元，如多肽-核酸复合物在精氨酸的正电荷作用下与细胞表面的负电荷作用，指导多肽/核酸复合物在细胞的表面结合形成复合物；所述多肽类转染剂的转染多肽为如下的9组多肽的序列中的ー种或任意几种多肽1:R2GSTDR1KRRRRRR3RRRR ；多肽2 AR3QAIR1 IR2FQNKKRKKRKKK ；多肽3 RRRRRRRSPLMVR1GGR2GGLK ；多肽4 :R2⑶Y1KRRRRRRRR ；多肽5 :ACSRlSPSR2HCGRRRRRRR ；多肽6 AWGSR2GWSPKYIRRRRRR ；
多肽7 PPLSSSTTGGGY2GGGY1HRRRKRKRRRK ；多肽8 :RRRRRRRGAR2⑶Y1KRRRRRRRR ；多肽9 AGY2LMSTLY1RRRRRKRKR ;其中Rl，R2，R3为20个天然氨基酸或其D-型氨
基酸中的任何ー个，D-型氨基酸取代天然氨基酸的好处是所得多肽对蛋白水解酶的耐受能力更强。作为优选的技术方案，所述氨基酸残基为D型氨基酸和经过化学修饰的氨基酸；其中，所述化学修饰包括N-端修饰、C-端修饰以及侧链修饰。作为优选的技术方案，所述修饰剂为胆固醇、胆固烷醇、植物固醇、植物固烷醇、荧光分子标记、PEG或PEI。多肽的其它部分主要由非电荷氨基酸组成，提高多肽对细胞膜的穿透能力。疏水区域中増加疏水性氨基酸，尤其是色氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸有助于提高多肽对核酸分子的转染能力。多个连续的非电荷氨基酸区域，如多个丝氨酸的存在也有助于提高多肽对核酸的转染能力；一些多肽中具有细胞膜受体的配体序列如；RGS序列有助于多肽和细胞膜上的整合素V III结合，有助于提高核酸复合物在富含整合素V III的细胞，如HeLa细胞中的转染效率，在一段连续的带阳性电荷的氨基酸(如精氨酸和赖氨酸)序列的第2或/和第3位将带阳性电荷的氨基酸置換为丝氨酸可使复合物进入细胞浆后易于释放核酸分子，从而使得核酸分子能够寻找其作用位点，发挥其生物功能，此外，由于细胞内含有蛋白酶，蛋白酶对多肽的水解作用能够进ー步帮助核酸分子从多肽-核酸分子复合物中的释放，为了保证合成的多肽具有良好的水溶性，在多肽的非正电荷氨基酸区域内也适当设计少量的带电荷氨基酸。多肽的修饰还包括PEG修饰，类固醇类修饰，硬脂酸基，月桂酸基，聚こ烯亚胺修饰，甜菜碱修饰。修饰的位置包括除赖氨酸/精氨酸簇之外的任何部位，包括N-端修饰，C-端修饰,巯基修饰等。这种多肽类转染剂可用于小RNA/DNA的细胞导入，从而可于临床的基因治疗和细胞治疗。
表I列出了符合本发明保护权项的具有核酸转染功能的小肽的序列。这些序列仅仅是为了便于说明本发明的具有高效转染核酸分子的多肽转染剂的结构特点，而不仅仅局限于表I所列举的多肽，如改变阳性氨基酸的数目和排列組合可形成数千计的序列
权利要求
1.一种小核酸分子快递技术，其特征在于利用多肽类转染剂将碱基数为10 100的小分子核酸/脱氧核酸或经过化学修饰的小分子核酸转染进入细胞。
2.如权利要求1所述的一种小核酸分子快递技术，其特征在于所述多肽类转染剂与碱基数为10 100的单链或双链小分子RNA/DNA或经过化学修饰的单链或双链小分子RNA/DNA的质量比只为O. 02 200g多肽/g核酸。
3.如权利要求1所述的一种小核酸分子快递技术，其特征在于所述多肽类转染剂包括10 50个氨基酸残基；所述多肽类转染剂的转染多肽含有带正电荷的氨基酸，所述正电荷氨基酸数目占多肽氨基酸数目的20 % 80 %;所述正电荷氨基酸连续分布的数目为4 20 ；所述多肽类转染剂的转染多肽为如下的9组多肽的序列中的一种或任意几种多肽1:R2GSTDR1KRRRRRR3RRRR ；多肽 2 AR3QAIR1 IR2FQNKKRKKRKKK ；多肽 3 RRRRRRRSPLMVR1GGR2GGLK ；多肽 4 :R2⑶Y1KRRRRRRRR ；多肽 5 :ACSRlSPSR2HCGRRRRRRR ；多肽 6 AWGSR2GWSPKYIRRRRRR ；多肽 7 PPLSSSTTGGGY2GGGY1HRRRKRKRRRK ；多肽 8 :RRRRRRRGAR2⑶Y1KRRRRRRRR ；多肽9 AGY2LMSTLY1RRRRRKRKR ;其中Rl，R2，R3为20个天然氨基酸或其D-型氨基酸中的任何一个。
4.如权利要求3所述的一种小核酸分子快递技术，其特征在于所述氨基酸残基为D型氨基酸和经过化学修饰的氨基酸；其中，所述化学修饰包括N-端修饰、C-端修饰以及侧链修饰。
5.如权利要求4所述的一种小核酸分子快递技术，其特征在于所述修饰剂为胆固醇、胆固烷醇、植物固醇、植物固烷醇、荧光分子标记、PEG或PEI。
全文摘要
本发明提出了一种小核酸分子快递技术，利用多肽类转染剂将碱基数为10～100的单链或双链小分子核酸或脱氧核酸转染进入细胞，可以有效将小分子核酸或经过化学修饰的小分子核酸转染进入悬浮的和贴壁的细胞，解决了现有技术中基因治疗药物导入技术瓶颈的问题。
文档编号A61K48/00GK103031337SQ20121036744
公开日2013年4月10日 申请日期2012年9月28日 优先权日2012年9月28日
发明者殷勤伟, 黄兵 申请人:北京吉利奥生物科技发展有限公司