专利名称：壳聚糖-5’ppp-NS1shRNA纳米复合物的制备方法
技术领域：
本发明属于纳米分子的合成及基因工程技术，具体涉及到壳聚糖-5’ PPP-NSlshRNA纳米复合物的制备方法。
背景技术：
维甲酸诱导基因I (retinoic acid inducible gene I，RIG-I)为我国学者于 1997年从人急性早幼粒白血病(acute promyelocytic leukemia,APL)NB4细胞株中首次克隆。RIG-I作为胞质shRNA受体，通过其helicase结合shRNA和ATP，ATP水解致RIG_I_shRNA 构象改变，暴露其CARD，与下游接头蛋白质干扰素启动子刺激因子-I (IPS-I)的CARD相互作用，下传信号，激活NF-KB和IRF等转录因子，诱导I型干扰素的表达和分泌，引发抗病毒天然免疫应答。但裸露的shRNA进人组织后迅速被组织内的RNase水解，因此需要构建一个能有效保护RNA并能被组织更好吸收的RNA运载体系。本专利采用分步法制备的RNA壳聚糖纳米粒，制备方法简单、可行，制剂稳定性，对包裹的RNA具有较好的保护作用。其实验结果显示壳聚糖与RNA形成表面带正电荷的纳米颗粒，使RNA被保护不受RNase的降解；壳聚糖_5’ppp-NS I shRNA纳米复合物能激活RIG-I，诱导I型干扰素的表达和分泌。5’ppp-NSlshRNA是流感病毒的RNA，壳聚糖-5’ ppp -NSlshRNA纳米复合物的研制为进一步研究通用流感病毒疫苗奠定了基础。
发明内容
本发明的目的是提供一种壳聚糖_5’ ppp -NSlshRNA纳米复合物的制备方法。并公开壳聚糖-5’ppp -NSshRNA纳米复合物作为制备基因药物载体方面的应用。本发明使用壳聚糖作为基因药物载体生物体内给药系统，取得了很好的效果。壳聚糖及其衍生物具有良好结黏附性，广泛用于祀向给药。壳聚糖及其衍生物和病毒外膜蛋白NSl shRNA通过静电作用形成复合物，保护shRNA免于核酶降解、提高细胞摄取及胞内shRNA释放，已成功应用于shRNA的体内转染。本发明利用壳聚糖作为载体，把流感病毒的NSlshRNA转染细胞中，进入细胞中的NSlshRNA被RIG-I所识别后，诱导RIG-I发生构象改变，暴露出原来隐蔽在蛋白质内部的CARD,以便与下游信号衔接蛋白VISA(又称为IPS1、MAVS或Cardif)的CARD结构域相互作用。VISA位于线粒体外膜，可通过细胞质内的TRAF3将RIG-I的激活信号传递给下游的TBKl和IKK蛋白激酶，导致IRF3/7和NF_kB的激活和干扰素基因的表达，引发抗病毒天然免疫应答。壳聚糖-NSlshRNA纳米复合物的制备方法包括以下步骤
第一步壳聚糖纳米颗粒的制备方法
壳聚糖，脱乙酰度>85%，粘度< 100。本发明使用的药品全部是分析级试剂，所制备的纳米颗粒形态大多成球形，平均粒径约为480nm，多分散度〈O. 25，zeta电位约为25 mV。第二步病毒外膜蛋白NSl基因的获得和5’ ppp- shRNA的合成病毒的NS基因(890 bp)编码非结蛋白NS1、NS2。每个节段的两端具有末端重复序列，所有节段的3端核苷酸序列相同。5端有与3端核苷酸序列互补的保守区段和重复序列。根据NCBI登录的流感病毒A/PR/8/1934 (HlNl)株的NSl基因，我们进行了设计，选取了其中21个碱基序列用于本实验的研究，碱基序列为TGAGGATGTCAAAAATGCAGT。委托鼎国生物公司合成了 21个核苷酸的NSlshRNAj^WT 5’ ppp的帽状结构。第三步壳聚糖_5’ ppp-NSlshRNA纳米复合物的合成
把壳聚糖纳米颗粒、5’ ppp-NS I shRNA按质量比为1:5的比例混合,壳聚糖纳米颗粒带有正电荷，5’ppp-NSl shRNA带有负电荷，通过静电的作用形成壳聚糖-5’ppp-NSlshRNA纳米复合物；用5%琼脂糖凝胶电泳检测壳聚糖与5’ ppp- NSlshRNA的结合情况。本发明使用的天然阳离子聚合物壳聚糖，具有生物可降解、无免疫原性及低毒等特性，其分子结构中具有活泼氨基，可连接不同功能基团，如质子化基团(季铵基团)、PH敏感基团、巯基和各种细胞表面受体特异性配体等，形成壳聚糖衍生物。壳聚糖及其衍生物具 有良好的黏附性，广泛用于靶向给药。壳聚糖及其衍生物和病毒NSlshRNA通过静电作用形成复合物，保护shRNA免于核酶降解、提高细胞摄取及胞内shRNA释放，并能成功将shRNA转染细胞内。转染细胞内的shRNA能靶定RIG-I基因，诱导RIG-I发生构象改变，以便与下游信号衔接蛋白VISA相互作用，导致IRF3/7和NF_kB转录因子的激活和诱导干扰素基因的表达，引发抗病毒天然免疫应答。具体实施方案
本发明的具体实施包括以下内容
实施例I:
第一步壳聚糖纳米颗粒的制备
I、微乳液A的合成22 mL环己烷；8 mL己醇；200 μ L壳聚糖；400 μ L壳聚糖-Rh ；2.6 mL Triton XlOO，将上述溶液混合，搅拌30分钟，直到得到溶液清晰，得到微乳液A。2、微乳液B的合成
在尚心管中放入分子质量为150. 09的NHS 100 μ L ;分子质量为115. 09的酒石酸200μ L ;分子质量为190的EDC 300 μ L，将上述溶液混合，终浓度为O. 2Μ。溶液静止20分钟后，把全部溶液放到微乳液A中去，搅拌过夜(至少16小时)，得到微乳液B。3、在上述微乳液B中溶液中加入I mL的乙醇溶液，8，000 rpm，离心20 min，去上清。添加ImL的乙醇，8000 rpm，再离心10分钟，再重复以上步骤两次。获得的壳聚糖纳米颗粒在I - 2 mL HPLC级水中再溶解；在去离子水中透析的I-2天(每天换水)。第二步病毒外膜蛋白NSl基因的获得和5’ ppp- NSlshRNA的合成
病毒的NS基因(890 bp)编码非结蛋白NS1、NS2。每个节段的两端具有末端重复序列，所有节段的3端核苷酸序列相同。根据NCBI登录的流感病毒A/PR/8/1934(HlNl)株的NSl基因，选取其中21个碱基，委托鼎国生物公司合成21个核苷酸的NSlshRNA，加了5’ ppp 的帽状结构，碱基序列为5’ ppp-TGAGGATGTCAAAAATGCAGT。第三步壳聚糖_5’ ppp - NSlshRNA纳米复合物的合成
把壳聚糖纳米颗粒、5’ ppp -NSl shRNA的水溶液按质量比的I :5比例混合，形成壳聚糖-5’ppp - NSlshRNA纳米复合物。用5%琼脂糖凝胶电泳检测壳聚糖与5’ppp - NSlshRNA的结合情况。实施例2:
壳聚糖-5’ ppp - NSlshRNA纳米复合物的应用
I.细胞转染实验取对数生长期的B16-BlueINF_a/i3细胞，使消化后细胞的浓度在4. 2X105cell/ml，取180ul/孔细胞液接种于96孔板培养板上，每孔加20 ul的壳聚糖-5’ppp - NSlshRNA纳米复合物，壳聚糖纳米颗粒、5’ppp -NSl shRNA的水溶液按质量比的I :5混合，将细胞培养板置于CO2培养箱中，37°C培养，培养24h。2.细胞培养24h后，每孔取细胞上清液20 ul添加在新的96孔的酶标板里，再取180ul的QUANTI-Blue检测溶液放在每个小孔中，将酶标板置于CO2培养箱中，37°C培养，培养24h后。24h后，将酶标板置于酶标仪上，在655nm上检测细胞中分泌型碱性磷酸酶活性。3.如果壳聚糖纳米颗粒把NSl shRNA转染到B16_Blue INF- a / β细胞中去，NSl·shRNA就会激活RIG-I基因及其下游基因IRF3/5和ISRE ；IRF3/5基因激活干扰素基因，产生的干扰素和细胞受体结合，激活IRF9基因，最后产生ISG54基因。产生的ISRE和ISG54相互作用，细胞产生分泌型碱性磷酸酶，上清液呈现蓝色，在655nm上就可以检测到它的活性，说明有干扰素的产生及干扰素量的变化。
权利要求
1.壳聚糖-5’PPP-NSshRNA纳米复合物的制备方法,其特征是 第一步壳聚糖纳米颗粒的制备 1)、微乳液A的合成22mL环己烷；8 mL己醇；200 μ L壳聚糖；400 yL壳聚糖-Rh;2.6 mL Triton XlOO混合，搅拌，直到得到溶液清晰，得到微乳液A ; 2)、微乳液B的合成 在离心管中放入MW为150. 09的100 μ L NHS O ;MW为115. 09的200 μ L酒石酸；■为190的300 μ L EDC离心使溶液应该达到O. 2Μ，静止20分钟，然后把全部溶液放到微乳液A中去，搅拌过夜，至少16小时，得到微乳液B ; 3)、在上述微乳液B中溶液中加入ImL的乙醇溶液，8，000 rpm离心，去上清然后添加ImL的乙醇，8000 rpm，再离心，再重复以上步骤两次，获得的壳聚糖纳米颗粒在I - 2 mLHPLC级水中再溶解，在去离子水中透析的I - 2天，每天换水； 第二步病毒外膜蛋白NSl基因的获得和5’ PPP- NSlshRNA的合成 病毒的NS基因890 bp编码非结蛋白NS1、NS2，每个节段的两端具有末端重复序列，所有节段的3端核苷酸序列相同，根据NCBI登录的流感病毒A/PR/8/1934(HlNl)株的NSl基因，选取其中19个碱基，委托鼎国生物公司合成19个核苷酸的NSlshRNA，加了 5’ppp的帽状结构，碱基序列为5’ ppp-TGAGGATGTCAAAAATGCA ； 第三步壳聚糖_5’ ppp - NSlshRNA纳米复合物的合成 把壳聚糖纳米颗粒、5’ ppp NSl shRNA的水溶液按质量比的I :5比例混合，形成壳聚糖-5’ppp - NSlshRNA纳米复合物，用5%凝胶电泳检测壳聚糖与5’ppp NSlshRNA的结合情况。
2.壳聚糖_5’ppp-NSshRNA纳米复合物作为制备基因药物方面的应用。
全文摘要
本发明属于纳米分子的合成及基因工程技术领域，具体涉及到壳聚糖-NS1shRNA纳米复合物的制备方法。把壳聚糖纳米颗粒、NS1shRNA按一定的比例混合，通过静电的作用形成壳聚糖-NS1shRNA纳米复合物，利用壳聚糖作为载体把病毒的NS1基因、shRNA导入哺乳动物细胞中，和宿主细胞的模式识别受体RIG-I样受体(RIG-I likereceptors,RLRs)结合，能结合shRNA并激活下游的信号级联反应,激活天然免疫系统和乳细胞内抗病毒的干扰素通路，诱导I型干扰素的产生，最终清除感染体内的病毒。本发明使用壳聚糖作为基因药物的生物体外及生物体内给药系统，取得了很好的效果，能应用于shRNA的体内外转染。
文档编号A61K39/145GK102895674SQ201210384100
公开日2013年1月30日 申请日期2012年10月12日 优先权日2012年10月12日
发明者赵丽辉, 赵赫楠, 韩德明, 贾凯莉, 王丽丽 申请人:长春理工大学