专利名称：桦褐孔菌液体发酵产物氯仿提取物在制备治疗糖尿病药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种药食用真菌提取物，特别具体涉及桦褐孔菌液体发酵产物氯仿提取物在制备治疗糖尿病药物中的应用。
背景技术：
桦褐孔菌o/WiijTOAS」属于真菌门、担子菌亚门、层菌纲、非褐菌目、多孔菌科、褐卧孔菌属，是一种寄生在多种树木(白桦、银 桦、榆树、赤杨等)树皮上的白腐菌，主要分布于俄罗斯西伯利亚和远东地区、北欧、波兰、我国大小兴安岭以及长白山地区、日本北海道及北美北部等北纬45° 50°的寒冷地区。桦褐孔菌是一种珍稀的药食用真菌，具有多种药用价值，早在16世纪，北欧多个国家的民间就开始食用桦褐孔菌子实体，用来防治胃癌、肠癌、心脏病、糖尿病等多种疾病。由于桦褐孔菌野生资源匮乏，深层发酵技术逐渐被应用于桦褐孔菌的生产。近几年的研究表明，桦褐孔菌提取物表现出多种生物活性，主要有抗癌、抗氧化、降血糖、抗病毒、抗真菌、保肝作用等。越来越多的活性物质被发现，其中主要包括多糖、桦褐孔菌素、桦褐孔菌醇、多种氧化三萜类化合物、羊毛留醇型三萜类化合物、木质素以及黑色素类等。二肽基肽酶IV(dipeptidyl peptidaseIV, DPP-1V)是一种跨膜的丝氨酸蛋白酶，属于脯氨酰寡肽酶(prolyloligopeptidase, POP)家族,其广泛分布于肾脏、胃肠道、结缔组织、淋巴结等组织中，具有多种活性。DPP-1V是由两个亚基组成的一种II型跨膜糖基化蛋白，分子质量为240kD，由766个氨基酸组成。DPP-1V的活性中心细胞膜外部分C末端区域，凡是N末端第二位上存在脯氨酸(Pro)残基或丙氨酸(Ala)残基的多肽多是其底物，胰高血糖素样肽-1 (GLP-1)就是其中之一。GLP-1是由小肠中L细胞分泌的一种内源性激素，主要是通过促进胰岛素分泌、抑制胰高血糖素的释放、延缓胃排空以及胰岛β细胞保护作用来实现控制血糖的目的。GLP-1是由36个氨基酸组成的多肽，其N段第二位为Ala，能够被DPP-1V识别，故其在分泌后很快便被DPP-1V剪切而失去降血糖的活性。因此，抑制DPP-1V的活性，可以减少GLP-1的降解，延长其半衰期，增加其在血液中的浓度，进而起到降血糖的作用。默克公司的sitagliptin于2006年8月获FDA批准在墨西哥上市，是第一个获准上市的DPP-1V抑制剂类药物，该药也是目前唯一在我国上市的此类药物。诺华公司的vildagliptin与百时美施贵宝公司的saxagliptin分别在欧盟及欧美上市，日本武田公司的alogliptin已在日本获准，目前正在申请在美国上市，目前还有很多正处于待批和临床阶段。利用此类药物降糖无低血糖风险、避免了体重增加等副作用，与其他药物(如二甲双胍)联用效果更佳稳定。
发明内容
本发明的目的在于提供桦褐孔菌液体发酵产物的氯仿提取物在制备DPP-1V抑制剂和制备治疗糖尿病药物中的应用。
本发明研究了桦褐孔菌的发酵特性，并采用深层发酵技术制备了桦褐孔菌的发酵产物，50 L发酵罐对桦褐孔菌进行规模化发酵，第9 d生物量达到最大(8. 6 g/L);得到桦褐孔菌菌粉201. 96 g，得率6. 73 g/L。采用不同溶剂对桦褐孔菌发酵产物进行提取，得到10种提取物，对各提取物抑制活性进行评价，其中菌粉氯仿提取物活性较高，200 mg/L浓度下对DPP-4的抑制率分别为38. 1%和31. 2%。本发明采用娃胶柱层析、Sephadex LH-20柱层析、大孔树脂柱层析、制备型HPLC等多种现代分离纯化技术对菌粉氯仿提取物及发酵液甲醇提取物进行分离纯化，200 mg/L浓度下活性组分抑制率分别升高至47. 1%和51. 7%，分离得到了活性部位。本发明利用UPLC-Q-T0F-MS对活性部位的化合物结构进行推断，推断出19个化合物的化学结构，其中生物碱类物质10个，留类、三萜类及其他物质9个。本发明利用分子对接技术对化合物与酶分子的相互作用进行模拟，通过与已上市药物Sitagliptin比较，结果显示化合物5、8、9、14、15与DPP-1V分子亲和力较强，是活性 物质。以下通过实例形式的具体实施方式
，对本发明的上述内容再做进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
图1以DPP-4抑制活性为导向从桦褐孔菌菌粉中分离活性部位。黑色柱状为阳性对照IIe-Pro-1Ie ;灰色柱状为活性最高部位； water :水提物；Hexane :正己烧提取物；Chlf :氯仿提取物；
EthOAc :乙酸乙酯提取物；Methanol :甲醇提取物。图2、图3UPLC-MS和化合物1-19结构图。
具体实施例方式实施例1桦褐孔菌液体发酵工艺。1.菌种以桦褐孔菌(中国林业微生物菌种保藏管理中心保藏号cfcc 60260)的菌株作为出发菌种。2.斜面培养将樟芝菌丝体转接至斜面培养基中，28°C培养288小时。斜面培养基(g/L):马铃薯200，葡萄糖20，琼脂20，pH自然。3.种子摇瓶培养斜面菌种转接入装有100 mL摇瓶培养基的500 mL摇瓶中，26°C培养，转速150 rpm,培养5天。摇瓶培养基(g/L):葡萄糖20，蛋白胨3，硫酸镁O. 5，磷酸二氢钾1，pH自然。4.发酵摇瓶培养桦褐孔菌发酵液按10%的接种量转接入装有100 mL发酵培养基的500 mL发酵摇瓶中，25°C培养，转速150 rpm，培养10天。发酵培养基(g/L):葡萄糖25，蛋白胨3，硫酸镁1. 5，磷酸二氢钾3，pH4。5. 5 L发酵罐发酵发酵摇瓶发酵完成后取出10%发酵液转接入另一装有新鲜发酵培养基的5L发酵罐中，转速150 rpm，通气量控制在L 67 vvm，25°C条件下培养10天。实施例2桦褐孔菌发酵产物制备。
发酵结束后，将发酵产物自发酵罐中取出，6层纱布过滤，将发酵液与菌丝体进行初步分离，发酵液6000 rpm/min离心10 min,取上清,利用旋转蒸发仪45 °C下减压浓缩，于冷冻干燥机上冻干，研磨成粉，过100目筛，即得桦褐孔菌发酵液冻干粉；将过滤得到的菌丝体及离心后沉淀合并，用去离子水清洗3次，然后于冷冻干燥机上冻干，研磨成粉，过100目筛，即得桦褐孔菌菌粉。分别称取150 g菌粉及90 g发酵液冻干粉置于3 L烧杯中(内置磁力搅拌转子)，加入I L正己烷，室温下搅拌提取12 h，过滤，将滤渣转移回烧杯中，再加入I L正己烷，继续提取12 h，如此连续提取3次，收集3次的正己烷提取液；待菌粉中的正己烷挥发干净，往烧杯中加入I L氯仿，按照上述正己烷提取的方法，连续提取3次，得到氯仿提取液；如此依次得到乙酸乙酯提取液及甲醇提取液；待甲醇挥发尽以后，往烧杯中加入I L蒸馏水，90 °C下搅拌提取30 min, 6000 rpm/min离心10 min，取上清，连续提取3次，收集3次上清液即得菌粉/发酵液冻干粉的水提液。正己烷、氯仿、乙酸乙酯、甲醇提取液分别用旋转蒸发仪减压浓缩至干，称重，计算得率。水提液旋蒸浓缩，再用冷冻干燥机冻干，磨粉，称重。五种提取物总质量为46. 26 g，提取总得率为30. 84% ;菌粉正己烷提取物·10. 29g，得率6. 86% ;菌粉氯仿提取物2. 75g，得率1. 83% ;菌粉乙酸乙酯提取物1. 70g，得率1.13% ;菌粉甲醇提取物15. 22g，得率 10. 15% ;菌粉水提物16. 30g，得率10. 87%。实施例3发酵产物提取物DPP-1V抑制活性评价的方法。酶促反应体系(见表I)共分为4组(阴性对照组、空白对照组、阳性对照组以及阳性空白组)，阴性对照组由酶、缓冲液以及底物组成；空白对照组只有酶和缓冲液；阳性对照组由酶、阳性对照物、缓冲液和底物组成；阳性空白组由阳性对照物、缓冲液和底物组成。加样将底物、酶、缓冲液于37 °C下预热30 min，然后按照酶、缓冲液、底物的顺序依次加入96孔板，每个孔内样品的总体积均为100 μ L,震荡，37 °C反应2h，于405 nm波长下检测。表I酶促反应体系组成
权利要求
1.桦褐孔菌粉氯仿提取物在二肽基肽酶IV抑制剂和治疗糖尿病药物中的应用，其特征为，所述氯仿提取物由以下19种化合物中的I种或多种构成化合物I.3，3 - 二甲基-9 -(丙氨基)_3，4 - 二氢-1 (2H)-吖啶酮(I) (3，3-Dimethyl_9-(propylamino)-3, 4-dihydro-l(2H)-acridinone)；化合物2.2 - 丁基-3 - (3 -甲基苯基)-4 (3H)-喹唑啉酮(2_Butyl_3-(3-methylphenyl)-4(3H)-quinazolinone)；化合物3.1-(4-甲基-1 -哌嗪基)-2 - {[3 - (2 -甲基-1 -哌啶基)丙基]氨基} 乙 SM (1-(4-Methyl-l-piperazinyl)~2~{[3-(2-methyl-l-piperidinyl)propyl]amino} ethanone)；化合物41- {[2 - (二乙氨基)乙基]氨基} -3-(4-甲基-1 -哌嗪基)_2 -丙醇 (1-((2-(Diethylamino) ethyl)amino)-3-(4-methyl-l-piperazinyl)-2-propanol)； 化合物5N-{ (1S，2S)-1 -苄基-3 - [1-1 -(环己基甲基)肼基]-2 -羟基丙基}_N 2 -[(2-甲氧基乙氧基)羰基]-L-缴氨酰胺(N-{(IS, 2S) -l-benzyl-3-[1-1-(cyclohexyImet hyl)hydrazino]-2-hydroxypropyl}_N2_[(2-methoxyethoxy)carbonyl]_L_valinamide)； 化合物6I,1-乙基-3，3 -双(2，2，6，6 -四甲基-1 -丙-2 -烯-1 -基哌啶_4 -基) 服(I, l-dim-ethyl-3, 3-bis(2, 2, 6, 6-tetramethyl-l-prop-2-en-l-ylpiperidin-4-yl) urea)；化合物71- (3, 6 - 二氧批P定-1 (2H)-基)-3 - [3 - (二甲基氛基)丙基]服(l-(3，6_dih ydropyridin-1(2H)-yl)-3-[3-(dimethylamino)propyl]urea)；化合物8(2R，4S，5S，7S)-5-氨基-丁基 _7_ {4 - [4 - (二甲基氨基)丁氧基]-3-(3-甲氧基丙氧基)苄基}-4 -羟基-2，8-二甲基戊酰胺((21 ，45，55，75)-5-&1^110-^131^71-7-{4-[4-(dimethylamino)-but-oxy]_3_(3-meth-oxypropoxy)benzyl}-4-hydroxy-2, 8-dim -ethylnonanamide)；化合物9.2，2-双[2，2, 6, 6 -四甲基-1 -(羊氧基)哌唳-4 -基]己烧-二酸盐(2，2-bis [ 2, 2, 6, 6-tetramethyl-l-(octyloxy)piperidin-4-yl]hexane-dioate)；化合物10.3-(4-环己基丁基)-6，ll - 二甲基-1，2，3，4，5，6 -六氢 _2，6 -亚甲基-3 -苯并吖辛因(3-(4_cyclohexylbutyl)-6, 11-dimethyl-l, 2, 3, 4, 5, 6-hexahydro-2, 6-methano-.3_benzazocine)；化合物11[(3R，5S，8R，9S，10S，`13S，14S，17S)-17 - (1-羟基丙 _`2 -炔基)-10，13 - 二甲基-2，3, 4，5，6，7，8，9，`11，12，14，15，16，17-tetradecahydro-lH-环戍 _ a]菲 _3- 醇([(3R, 5S, 8R, 9S, 10S, 13S, 14S, 17S) -17- (l-hydroxyprop-2-ynyl) -10，13-dimethyl-2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, `11, 12, 14, 15, 16, 17-tetradecahydro-lH-cyclopent-a[a]phenanthren-3-oI ])； 化合物12(2S，4aR, 10bR)-l, I`, 4a, IOb-四甲基-1，2，3，4，4a, 4b, 5，6，10b, 11，12，12a_ 十二氢chrysen-2-醇((2S, 4aR, IObR) -1, I, 4a, 10b-tetra-methyl-l, 2, 3, 4, 4a, 4b, `5`, 6, 10b, 11,`12,12a-dodecahydrochrysen-2-ol)； 化合物13 (3β，5α，9β，16α，205)-3，20_ 双(二甲基氨基)_4_ (羟甲基)_4，14 -二甲基-9, 19-cyclopreg -正 _6 _ 稀-16-醇((3 β，5 α，9 β，16 a，20S) -3，20-bis (dimethylamino)~4~(hydroxymethyl)-4, 14-dimethyl_9，19-cyclopreg-n-6-en-16_ol)； 化合物14 (22E)-stigmasta_7, 22，`25 -三烯_3 -基乙酸酯((22E)-stigmasta-7，22，25_trien-3-yl acetate)； 化合物15 (3 β ) - olean -12 -烯-3 -基-(4-轻基苯基)丙酸乙酯 ((3 β)-olean-12-en-3-yl-(4-hydroxyphenyl)propanoate)； 化合物16 (2S)-2 - [ (IS)-1 -苯乙基]-`3，6-1 - 二氢-2H-吡喃((2S)-2-[(lS)-l-phenylethyl]-3, 6-l-dihydro-2H-pyran)； 化合物17` 齿叶棄吾醇(Ligudentatol)； 化合物18 ` 1,6- 二脱氧-3，4-0- (1，`5，9_trime-thyldecylidene)-D 甘露糖醇(1，6_dideoxy-3,4-0-(1, 5, 9-trime-thyldecylidene)-Dmannitol)； 化合物19 (15，4&1 ，51 ，8&5)-5-氢-父￥-1-2，5- 二甲基己基]_4a_ 甲基十氢萘-1 -醇((lS，4aR,5R, 8aS)-5-[(IR)-5-hydro-xy-l, 5-dimethylhexyl]-4a-methyldecahydronaphthalen-l_ol )0
2.权利要求1中所述的19种化合物中的I种或多种，在制备二肽基肽酶IV抑制剂和治疗糖尿病药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及桦褐孔菌发酵菌粉氯仿提取物及其中化合物在治疗糖尿病药物中的应用，该提取物包含19种化合物，19中化合物中的1种或几种组合，可用于制备二肽基肽酶IV抑制剂和治疗糖尿病药物。
文档编号A61K31/496GK103006655SQ20121053034
公开日2013年4月3日 申请日期2012年12月11日 优先权日2012年12月11日
发明者许正宏, 史劲松, 陆震鸣, 耿燕, 李恒, 许泓瑜, 徐国华, 王英燕, 钱建瑛 申请人:江南大学, 江苏神华药业有限公司