一种疫苗组合物及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种疫苗组合物，该疫苗组合物包含免疫量的猪圆环病毒抗原、免疫量的猪细小病毒抗原以及兽医学上可接受的一种或多种类型佐剂，该疫苗组合物可达到一剂即可预防猪圆环病毒病、猪细小病毒病两种疾病的目的，与多打几针现有的单疫苗或二联疫苗才能预防这两种疾病的情况相比，该疫苗组合物更加经济实用，并具有一定的社会效益。
【专利说明】一种疫苗组合物及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种疫苗组合物，具体地说，涉及一种治疗猪多系统衰弱综合征的疫苗组合物。
【背景技术】
[0002]1974年，德国学者Tischer等从连续传代的猪肾细胞系PK15细胞中检出一种细胞污染物，是一种不能引起细胞病变的病毒样粒子。1982年，该学者进一步研究证实:该病毒的基因组由单股环状的DNA组成，因而将其命名为猪圆环病毒(Porcine Circovirus,PCV)ο PCV属于圆环病毒科圆环病毒属，是迄今发现的一种最小的动物病毒,有两种血清型:PCV-1和PCV-2，研究表明PCV-1不具有致病性，而PCV-2具有致病性，主要引起猪多系统衰弱综合征(Pig Multisystemic Wasting Syndrome, PMWS),还会引起猪皮炎肾病综合征(Porcine Dermatitis and Nephropathy Syndrome, FONS)、猪呼吸道疾病综合征(Porcine Respiratory Disease Complex, PRDC)、增生性坏死性肺炎(Proliferative andNecrotizing Pneumonia, PNP)、先天性震颤(Congenital Tremors, CT)等疾病，总称为猪圆环病毒病(Procine Circovirus Disease，PCVD)。在临床上，PCV-2主要侵害猪的肺泡巨噬细胞和淋巴细胞，主要感染5-12周龄的仔猪，病猪的临床症状为:渐进性消瘦或生长迟缓、营养不良、咳嗽、呼吸困难、黄疸、腹泻、皮肤苍白、淋巴结肿大、肾脏灰白水肿等，可成为僵猪，严重者可导致死亡。
[0003]1966年，Mary和Mahnel进行猪瘟病毒组织培养时发现了一种潜伏于细胞内并可以引起感染的病毒；1967年，Cartwright等分离出猪细小病毒(Porcine Parvovirus,PPV)，并对其进行血清学鉴定。PPV属于细小病毒科细小病毒属的自主型细小病毒，所引起的猪细小病毒病又称为猪繁殖障碍病，以怀孕母猪发生流产、死产、产木乃伊胎为主要特征，造成传染性不孕；母猪怀孕前期感染该病毒，便可通过胎盘使胎儿受到侵袭，以引起PMWS ;PPV还可引起仔猪的皮炎和腹泻，但其他类型的猪感染后无明显临床症状。PPV在猪群中检出率甚高，在猪群中的血清抗体阳性率达50%-80%，是困扰养猪业发展的主要病毒性繁殖障碍性疾病之一。
[0004]PCV_2、PPV不仅可分别在不同程度上导致PMWS症状发生，还常常引发多种疾病混合感染和继发感染，造成猪体免疫抑制，导致机体抵抗力下降，从而给养猪业造成巨大的经济损失。目前，尚没有较好的药物可以治疗PCV-2、PPV等病毒性疾病的感染，疫苗免疫是预防和/或治疗猪多系统衰弱综合征的有效手段和措施。
[0005]生产中，有湖北中博生化有限公司生产的猪细小病毒油乳剂灭活疫苗(CP-99株)用于预防猪细小病毒病感染，其推荐的免疫程序为:后备种母猪及公猪在6-7月龄或配种前3-4周注射2次，间隔期为21天，每次深部肌肉注射2mL。即需进行多次注射，容易造成机体应激反应。其免疫之后所诱导产生的抗体效价相对较低，持续时间相对比较短。
[0006]专利ZL99809131.6公开了一种猪环状病毒和细小病毒疫苗，该猪圆环病毒和细小病毒疫苗主要是指含有矿物油佐剂的猪圆环病毒、细小病毒二联灭活疫苗，并具体公开了:病毒抗原的灭活、制备基于矿物油的乳剂形式的疫苗、以及制备基于可代谢油的乳剂形式的疫苗。其中，基于矿物油的乳剂形式的疫苗及基于可代谢油的乳剂形式的疫苗一个疫苗剂量均含有约IO7 5TCID5tlt5 —个疫苗剂量的体积对于通过肌内途径给药为2mL。该疫苗可与PamwaxR疫苗联合用于抵抗多系统萎缩综合症的疫苗接种计划。
[0007]然而，由于该疫苗免疫保护期较短，需要多次免疫才能达到理想的效果，但多次免疫容易造成成本升高、免疫机体应激反应增强。现有技术未公开过一种只免疫一次便可降低成本、减轻免疫应激反应的猪圆环病毒、细小病毒二联疫苗。
【发明内容】
[0008]为解决现有技术的不足，本发明提供了对抗PCV-2、PPV病毒的疫苗组合物，该疫苗通过单剂给予便可引发保护性免疫，预防或治疗PCV、PPV所引发的疾病。
[0009]本发明的主要目的在于提供一种疫苗组合物，所述疫苗组合物包含:
[0010]免疫量的猪圆环病毒抗原；
[0011]免疫量的猪细小病毒抗原；以及
[0012]兽医学上可接受的一种或多种类型佐剂。
[0013]本发明中所述“猪圆环病毒抗原”、“PCV抗原”是指当所述抗原对免疫动物，特别地，所述免疫动物为猪，给药时，可诱导、刺激或增强免疫动物抵抗PCV-2感染的免疫应答。
[0014]本发明中所述 “猪细小病毒抗原”、“PPV抗原”是指当所述抗原对免疫动物，特别地，所述免疫动物为猪，给药时，可诱导、刺激或增强免疫动物抵抗PPV感染的免疫应答。
[0015]优选地，所述佐剂包括丙烯酸聚合物佐剂、蜂胶、矿物油佐剂中的一种或几种。
[0016]更优选地，所述丙烯酸聚合物佐剂与蜂胶佐剂混合物为至少含有丙烯酸聚合物佐剂、蜂胶成分的混合物；所述丙烯酸聚合物佐剂为至少含有丙烯酸聚合物的佐剂。
[0017]更优选地，所述丙烯酸聚合物佐剂为丙烯酸聚合物、可代谢油的混合物。
[0018]进一步优选地，所述的丙烯酸聚合物为均聚物或共聚物；优选地，所述丙烯酸聚合物为 Carbopol。
[0019]最优地，所述的兽医学上可接受的一种和/或多种不同类型佐剂的混合物为疫苗组合物的5%-30%V/V，优选为15%-25%V/V ;所述丙烯酸聚合物Carbopol优选在疫苗组合物中的终含量为0.2%W/V。
[0020]优选地，所述猪圆环病毒抗原为灭活形式、改良的活的形式或减毒形式的猪圆环病毒2型抗原，所述猪细小病毒抗原为灭活形式、改良的活的形式或减毒形式的猪细小病毒抗原。
[0021]更优选地，所述猪圆环病毒抗原为PCV-2灭活全病毒抗原，所述猪细小病毒抗原为PPV灭活全病毒抗原。
[0022]可用于本发明的PCV-2抗原还可以包含以下组合物中的任一种抗原，如:梅里亚动物保健公司研发的pcv-2全病毒灭活疫苗(Circovace* ),勃林格殷格翰动物保健公司的pcv-2亚单位疫苗(CircoFlexg),先灵葆雅动物保健公司的pcv-2亚单位疫苗(Porcilis? PCV),英特威国际有限公司的pcv-2亚单位疫苗(Circumvent?)，富道动物保健公司研制的PCV-1-PCV-2嵌合病毒灭活疫苗，哈尔滨维科生物技术有限公司的猪圆环病毒2型灭活疫苗(DBN-SX07株)。[0023]可用于本发明的PPV抗原还可以包含以下组合物中的任一种抗原，如:辉瑞公司生产的PPV灭活疫苗，武汉中博生物股份有限公司的PPV灭活疫苗CP-99株，中牧实业股份有限公司的PPV灭活疫苗WH-1株，上海科立特农科(集团)有限公司的猪细小病毒油乳剂灭
活疫苗。
[0024]优选地，所述猪圆环病毒抗原为灭活SH株全病毒抗原，所述猪细小病毒抗原为灭活HN-2011株全病毒抗原；优选地，所述猪圆环病毒抗原为5X 106.0TCID5tl/头份，所述猪细小病毒抗原为5X 106_tlTCID5tl/头份。
[0025]猪圆环病毒PCV-2型SH株，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏(简称为CGMCC)，保藏日期为2008年3月4日，保藏号为CGMCC N0.2389。该菌株已经在专利申请CN200810024423.1中公开。
[0026]猪细小病毒HN-2011株，已在中国典型培养物保藏中心进行保藏(简称为CCTCC)，保藏日期为2011年6月9日，保藏号为CCTCC N0.V201118。
[0027]优选地，所述疫苗组合物进一步包括载体，所述载体优选为水性媒介，所述水性媒介包括盐水、磷酸盐缓冲液、基本必需培养基(MEM)、用HEPES缓冲剂配制的MEM中的一种或几种。
[0028]优选地,所述疫苗组合物还包括其他抗原,所述其他抗原包括猪生殖与呼吸综合征病毒抗原、猪肺炎支原体病毒抗原、大叶性肺炎放线杆菌抗原、大肠杆菌抗原、萎缩性鼻炎抗原、伪狂犬病毒抗原、猪霍乱病毒抗原、猪流感病毒抗原中的一种或多种。
[0029]本发明的另一目的在于提供一种制备所述疫苗组合物的方法，所述制备方法包括分别培养增殖所述猪圆环病毒、所述猪细小病毒，分别用甲醛灭活所述培养的猪圆环病毒、猪细小病毒，按比例混合所述猪圆环病毒抗原和所述猪细小病毒抗原，并加入一定量佐剂。
[0030]本发明的再一目的在于提供所述疫苗组合物在制备预防和/或治疗猪圆环病毒病、猪细小病毒病的药物中的应用。
[0031]本发明所述的疫苗组合物在制备用于保护动物免患PCV-2、PPV所引起的疾病的疫苗中的应用时，所用疫苗组合物的免疫量为2mL/头份。所述疫苗组合物在给予免疫动物时，可以通过肌内注射、皮下注射、口服途径或鼻内途径，优选地通过肌内注射或皮下注射。
[0032]本发明所制备的疫苗组合物，可达到一剂即可预防猪圆环病毒病、猪细小病毒病两种疾病的目的，与多打几针现有的单疫苗或二联疫苗才能预防这两种疾病的情况相比，本发明所提供的技术方案更加经济实用，并具有一定的社会效益。
【具体实施方式】
[0033]下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0034]本实施例中所用的“免疫量”是指提供针对PCV_2、PPV的免疫剂量，主要取决于以下因素:被免疫动物的物种、品种、年龄、重量大小、健康状态以及动物之前是否接受过对抗同样病毒的疫苗。
[0035]本发明实施例中所述的“疫苗组合物”指具有预防和/或治疗猪圆环病毒2型(PCV-2)、猪细小病毒效果的疫苗组合物，即至少包含免疫量的猪圆环病毒2型抗原、免疫量的猪细小病毒抗原两种抗原的疫苗组合物。
[0036]本发明实施例中所述的“单苗”是指仅含有免疫量的猪圆环病毒2型抗原或免疫量的猪细小病毒抗原中的一种疫苗，用于评价本发明中疫苗组合物的免疫效力。
[0037]本发明实施例中，以猪圆环病毒2型PCV-2SH株和猪细小病毒PPVHN-2011株为例，对疫苗组合物中不同佐剂对疫苗免疫效力的影响进行解释说明。
[0038]在本发明的实施方式中使用的猪圆环病毒PCV-2型SH株，该实施方式无论在何种情况下均不构成对本发明的限定。
[0039]在本发明的实施方式中使用的猪细小病毒HN-2011株，该实施方式无论在何种情况下均不构成对本发明的限定。
[0040]在本发明的实施方式中，猪圆环病毒抗原优选为5 X IO6 0TCID50/头份，猪细小病毒抗原优选为5X IO6 tlTCID5ci/头份，本领域技术人员知晓，灭活疫苗的抗原量不构成对本发明的进一步限定，免疫量取决于被免疫动物的物种、品种、年龄、重量大小、健康状态以及动物之前是否接受过对抗同样病毒的疫苗。
[0041]本发明实施例中的疫苗组合物中的佐剂为兽医学上可接受的一种和/或多种不同类型佐剂，为丙烯酸聚合物佐剂、蜂胶、矿物油佐剂中的一种和/或几种的混合物。优选地，丙烯酸聚合物佐剂与蜂胶佐剂混合物为至少含有丙烯酸聚合物佐剂、蜂胶两种成分的混合物，丙烯酸聚合物佐剂为至少含有丙烯酸聚合物的佐剂。更优选地，丙烯酸聚合物佐剂为丙烯酸聚合物、可代谢油的混合物。 [0042]本发明实施例中兽医学上可接受的一种和/或多种不同类型佐剂的混合物为疫苗组合物的5%-30%V/V，更优选为15%-25%V/V ;优选地，丙烯酸聚合物Carbopol在疫苗组合物中的终含量为0.2%ff/V,蜂胶佐剂在疫苗组合物中的终含量为0.1%-2%W/V。
[0043]在本发明的实施方式中丙烯酸聚合物Carbopol为The Lubrizol Corporation的Carbopol934> Carbopol940和Carbopol941,它们是丙烯酸和聚烯丙基鹿糖的交联聚合物，化学式为(CH2CH000H) n，该实施方式无论在何种情况下均不构成对本发明的限定。
[0044]实施例1不同类型佐剂的配制
[0045]丙烯酸聚合物佐剂的配制:将丙烯酸聚合物Carbopol934佐剂(购自TheLubrizol Corporation)10g溶解于500mL生理盐水中，并定容至1000mL,高压蒸汽灭菌后，得到10mg/mL的丙烯酸聚合物佐剂，于4°C以下低温贮存备用。
[0046]蜂胶佐剂的配制:将蜂胶佐剂(购自绿都生物科技有限公司)置于4°C以下低温贮存，用前在4-8°C下粉碎，过筛，按1:4W/V加入95%乙醇，室温浸泡24_48h，冷却，过滤或离心取上清，即得含蜂胶量为40mg/mL的佐剂，于4°C以下低温贮存备用。
[0047]实施例2疫苗组合物中PCV-2、PPV两种抗原的制备
[0048]2.1病毒液的培养与制备
[0049]猪圆环病毒2型PCV-2 (SH株)病毒液的制备:用转瓶细胞培养法培养。将长满单层的PK15细胞(购自美国ATCC，保藏号为CCL-33)，倒去细胞培养液(美国Invitrogen公司的MEM培养基+10%胎牛血清)，将PCV-2毒株按0.1-0.2TCID50/个细胞的接种量接种于PK15细胞上，37°C吸附30min，加入细胞维持液(美国Invitrogen公司的MEM培养基+3%胎牛血清)，置36-37°C旋转培养。每日观察1-2次，细胞生长良好，36-37°C培养4-7日后收获细胞培养物，冻融1-3次后置_20°C以下保存。
[0050]猪细小病毒PPV (HN-2011株)病毒液的制备:米用同步接种法培养。将病毒液与生长液(美国Invitrogen公司的MEM培养基+5%胎牛血清)按体积比1:10的比例将HA为21°种毒接种于IBRS-2细胞(购自美国ATCC)，置37°C旋转培养，24-36h后细胞出现网状病变、肿胀，融合等现象。当细胞病变达到80%以上时，终止培养，反复冻融三次后收取病毒液，-20°C以下保存。
[0051]2.2病毒液的处理
[0052]猪圆环病毒2型PCV-2 (SH株)病毒液的处理:将步骤2.1所制得的PCV-2病毒液用中空纤维滤柱(0.5-2 μ m，美国Mi 11 ipore公司)过滤，除去细胞碎片。
[0053]猪细小病毒PPV (HN-2011株)病毒液的处理:将步骤2.1所制得的PPV病毒液用中空纤维滤柱(0.5-2 μ m,美国Millipore公司)过滤,除去细胞碎片。
[0054]2.3病毒含量的测定
[0055]PCV-2抗原含量的测定:步骤2.1收获的PCV-2病毒液使用MEM基础培养液将病毒做10倍比稀释，取10' 10' 10' 10' 10-2五个梯度，每个稀释梯度均重复4孔，分别接种于96孔细胞培养板中单层的ΡΚ15细胞中，100 μ L/孔，同时分别设阴性和阳性细胞对照，37°C孵育1.2h，加入维持液200 μ L继续培养48h，中间换维持液一次。弃去维持液(同步骤 2.1所述)，用PBS洗3次，每次5min,加100 μ L含5%BSA的PBS, 37°C封闭30min,弃去封闭液，加入IOOyL的1:500倍稀释的？(^-2阳性血清，37°C孵育45min，弃去一抗，PBS洗涤3次，5min/次，加入FITC-羊抗猪-1gG 二抗，孵育45min，弃去二抗，PBS洗3次，5min/次，每孔加50 μ L的50%PBS-甘油缓冲液封底，荧光显微镜下镜检，按照Reed-Muench计算PCV-2抗原的病毒效价为108TCID5Q/mL。
[0056]PPV抗原含量的测定:PPV病毒液使用DMEM基础培养液将病毒做10倍比稀释，同步接种IBRS-2细胞，100 μ L/孔，设阴性和阳性细胞对照，37°C培养24h，换维持液(美国Invitrogen公司的MEM培养基+2%胎牛血清)，培养12h后，弃去维持液，PBS洗3次，每次5min，加100 μ L含5%BSA的PBS，37°C封闭30min，弃去封闭液，加入100 μ L的1:400倍稀释的PPV阳性血清，37°C孵育45min，弃去一抗，PBS洗涤3次，5min/次，加入FITC-羊抗猪-1gG 二抗，孵育45min,弃去二抗，PBS洗3次，5min/次，每孔加50 μ L的50%PBS-甘油缓冲液封底，荧光显微镜下镜检，按照Reed-Muenh计算PPV的病毒效价为108TCID5(l/mL。
[0057]2.4病毒液的灭活
[0058]PCV-2、PPV抗原病毒液的灭活:向培养增殖的病毒液中，分别无菌加入甲醛溶液至终浓度为0.1% (V/V)，振摇5min，置37°C下灭活48h。期间每6h振摇I次，每次5min。取灭活后的病毒液，分别接种PK15细胞和IBRS-2细胞，37°C培养观察5d，对无病变者再盲传2代，将灭活病毒液置于冰箱中2-8°C保存。
[0059]2.5抗原灭活结果
[0060]依据《中华人民共和国兽药典》所述的检验方法进行灭活检验:将猪圆环病毒2型SH株、猪细小病毒HN-2011株灭活抗原分别接种PK15和IBRS-2细胞，培养3_5d后观察，无细胞病变，证明抗原灭活彻底。
[0061]实施例3不同类型佐剂的猪圆环病毒2型抗原、猪细小病毒抗原疫苗组合物的制备[0062]为了比较不同抗原含量疫苗组合物的免疫效果，选择3种佐剂制备不同佐剂的疫苗组合物，分别为丙烯酸聚合物佐剂与蜂胶佐剂混合物、丙烯酸聚合物佐剂、蜂胶佐剂，每种佐剂分别制备猪圆环病毒与猪细小病毒二联疫苗组合物、猪圆环病毒单苗、猪细小病毒单苗，其中，一种单苗的抗原含量与猪圆环病毒、细小病毒二联疫苗组合物中的相应抗原含量相同。同时，制备矿物油佐剂疫苗组合物，以作比对。具体情况如下:
[0063]3.1丙烯酸聚合物佐剂与蜂胶佐剂混合物疫苗
[0064]取实施例1制备的丙烯酸聚合物佐剂与蜂胶佐剂，将其配制成混合物；和实施例2制备的PCV-2、PPV两种病毒抗原，根据表1中单苗、联苗的最终抗原含量分别制备成丙烯酸聚合物佐剂与蜂胶佐剂混合物的单苗、二联疫苗，并确保:所制备的各佐剂二联疫苗与单苗中的PCV-2、PPV两种抗原含量均相同，且丙烯酸聚合物Carbopol在疫苗组合物中的终含量为0.2%W/V，蜂胶佐剂在疫苗组合物中的终含量为0.1%-2%W/V。将抗原、丙烯酸聚合物佐剂与蜂胶佐剂混合物按照表1配方混合，并用生理盐水补充体积至2mL，搅拌均匀。
[0065]表1丙烯酸聚合物佐剂与蜂胶佐剂混合物疫苗的配方及含量(以2mL/头份疫苗
计)
[0066]
【权利要求】
1.一种疫苗组合物，所述疫苗组合物包含: 免疫量的猪圆环病毒抗原； 免疫量的猪细小病毒抗原；以及 兽医学上可接受的一种或多种类型佐剂。
2.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中，所述佐剂包括丙烯酸聚合物佐剂、蜂胶、矿物油佐剂中的一种或几种。
3.根据权利要求2所述的疫苗组合物，其中，所述丙烯酸聚合物佐剂与蜂胶佐剂混合物为至少含有丙烯酸聚合物佐剂、蜂胶成分的混合物，所述的丙烯酸聚合物佐剂为至少含有丙烯酸聚合物的佐剂；优选地，所述丙烯酸聚合物佐剂为丙烯酸聚合物、可代谢油的混合物。
4.根据权利要求3所述的丙烯酸聚合物，其中，所述的丙烯酸聚合物为均聚物或共聚物；优选地，所述丙烯酸聚合物为Carbopol。
5.根据权利要求4所述的疫苗组合物，所述的兽医学上可接受的一种和/或多种不同类型佐剂的混合物为疫苗组合物的5%-30%V/V，优选为15%-25%V/V ;优选地，所述丙烯酸聚合物Carbopol在疫苗组合物中的终含量为0.2%W/V。
6.根据权利 要求1飞任一项所述的疫苗组合物，其中，所述猪圆环病毒抗原为灭活形式、改良的活的形式或减毒形式的猪圆环病毒2型抗原，所述猪细小病毒抗原为灭活形式、改良的活的形式或减毒形式的猪细小病毒抗原；优选地，所述猪圆环病毒抗原为PCV-2灭活全病毒抗原，所述猪细小病毒抗原为PPV灭活全病毒抗原。
7.根据权利要求6所述的疫苗组合物，其中，所述猪圆环病毒抗原为灭活SH株全病毒抗原，所述猪细小病毒抗原为灭活HN-2011株全病毒抗原；优选地，所述猪圆环病毒抗原为5 X IO6 0TCID50/头份，所述猪细小病毒抗原为5 X 106_tlTCID5tl/头份。
8.根据权利要求1飞任一项所述的疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物还包括其他抗原，所述其他抗原包括猪生殖与呼吸综合征病毒抗原、猪肺炎支原体病毒抗原、大叶性肺炎放线杆菌抗原、大肠杆菌抗原、萎缩性鼻炎抗原、伪狂犬病毒抗原、猪霍乱病毒抗原、猪流感病毒抗原中的一种或多种。
9.一种制备权利要求f 5任一项所述的疫苗组合物的方法，所述制备方法包括分别培养增殖所述猪圆环病毒、所述猪细小病毒，分别用甲醛灭活所述培养的猪圆环病毒、猪细小病毒,按比例混合所述猪圆环病毒抗原和所述猪细小病毒抗原,并加入一定量佐剂。
10.根据权利要求1飞任一项所述的疫苗组合物在制备预防和/或治疗猪圆环病毒病、猪细小病毒病的药物中的应用。
【文档编号】A61K39/12GK103893749SQ201210590315
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2012年12月29日 优先权日:2012年12月29日
【发明者】张许科, 孙进忠, 白朝勇 申请人:普莱柯生物工程股份有限公司