可溶性整联蛋白α4突变体的制作方法
【专利摘要】本发明的课题在于：提供能够抑制整联蛋白α4的各种功能的新型物质、和／或提供能够抑制整联蛋白α4和整联蛋白α9这两者的新型物质。本发明提供一种具有人整联蛋白α4的一部分胞外区的整联蛋白α4突变体肽等，具体而言，本发明涉及具有序列号4～9的氨基酸序列的肽等、以及含有这些肽作为有效成分的药物组合物。
【专利说明】可溶性整联蛋白Ct 4突变体
【技术领域】
[0001]本发明涉及整联蛋白α 4和整联蛋白α 9所参与的疾病的治疗或预防的领域。更具体而言，本发明涉及通过可溶性整联蛋白α 4突变体、对整联蛋白α 4和整联蛋白α9所参与的疾病进行治疗或预防的方法。
【背景技术】
[0002]整联蛋白(以下称作“ITG”)是形成α链:β链为1:1的异源二聚体的跨膜受体蛋白。已知整联蛋白α4(以下称作“ITG-CI4”)主要在淋巴细胞或肿瘤细胞上表达，其与血管细胞粘附分子I (VCAMl)、纤连蛋白(Fn)、连接粘附分子2 (JAM2)、粘膜地址素细胞粘附分子I (MAdCAMl)、人淋巴细胞表达金属蛋白酶样解联蛋白样富含半胱氨酸的蛋白家族成员(MDC-L;解联蛋白和金属蛋白酶28(ADAM28))、血管性血友病因子(pp-vWF)或骨桥蛋白(OPN)等配体结合(非专利文献1、非专利文献2)。人们认为ITG-α 4与这些配体结合，可发挥细胞粘附、迁移(例如向淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞的炎症部位迁移等)、淋巴细胞的归巢等丰富多彩的功能。迄今为止，已知ITG-α 4与癌转移(非专利文献3)、多发性骨髓瘤(专利文献I)或类风湿性关节炎、支气管炎、炎症性肠道疾病、克罗恩病、多发性硬化症等炎症性疾病(非专利文献4)、急性中枢神经系统损伤(专利文献2)、HIV (专利文献
3)有关，有报道称:抗ITG-α 4抗体在实验性变应性脑脊髓炎、过敏症、I型糖尿病等T细胞依赖性自身免疫疾病模型中能发挥一定的效果。同样，还已知抗ITG-α 4抗体对抑制过敏性肺炎、免疫复合体介导的肺部疾病、急性肾毒性肾炎、延迟性过敏症中的皮肤硬化和纤维蛋白的沉积有效，该抗ITG-a 4抗体还抑制带血管蒂的心脏的同种移植的排斥反应(非专利文献I)。
[0003]如上所述，由于ITG-α 4与疾病有关，所以人们期望将ITG-α 4的抑制剂用作药物。实际上，作为抑制ITG-α 4的功能的物质，人们研究了抗ITG-α 4抗体、ITG_a4拮抗剂(专利文献4等)、ITG-a 4受体拮抗剂(专利文献5等)，作为抗ITG-a 4抗体的Tysabri (那他珠单抗)，已经作为多发性硬化症或克罗恩病的治疗药得到了承认。另外，还报道了以ITG-CI4的胞内区中的功能模体为靶的的治疗方法(专利文献6)。
[0004]在使用抗体作为药品时，其效果由表位来决定。已知a4i31ITG经由与ITG- a 5 β I所结合的RGD序列(序列号I)不同的序列(LDV序列(序列号2)或QIDSPL序列(序列号3))，与其配体强力结合(非专利文献1、非专利文献2)。但是，已知例如在ITG- a 4中的与Fn结合的位点和与VCAMl结合的位点相互重叠，可是在ITG- a 4与VCAMl的结合中必须有钙离子的帮助，相对于此，在ITG- a 4与Fn的结合中不需要钙离子，一部分抗体仅抑制ITG-a 4与Fn的结合等，ITG-a 4与其配体的结合具有不同的特性。另外，已知作为抗ITG-a 4抗体的主要表位，存在三种不重叠的表位(非专利文献I)。
[0005]另一方面，作为与ITG-a 4具有共通的配体的ITG，存在整联蛋白a9(以下称作“ ITG-a 9”)。有报道称:ITG_a 9也与作为多发性硬化症的小鼠模型的实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)恶化有关(非专利文献5)。本发明人等迄今为止制备了抗ITG-a 9抗体，并发现了它的治疗类风湿性关节炎的疗效(非专利文献6、专利文献7)。
[0006]由于ITG-a 9与ITG-a 4具有共通的配体，所以认为ITG-a 9具有与ITG_a 4类似的功能。另外，已知ITG-a 9的氨基酸序列与ITG-a 4的氨基酸序列具有39%的同源性，在ITG中同源性最高(非专利文献7)。
[0007]迄今为止，本申请的发明人发现:仅由ITG-a 9的一部分胞外区和新的C末端氨基酸构成的可变剪接变体即a 9突变体(SFa 9)存在于生物体内，对SF a 9的结构和功能进行了分析，并作了报道(非专利文献8)。关于ITG- a 4的突变体，虽然有关于ITG- a 4的多形性的报道(专利文献8)，但却没有关于可变剪接变体的报道。
[0008]现有技术文献
[0009]专利文献
[0010]专利文献1:国际公开公报W000 / 15247
[0011]专利文献2:国际公开公报TOOl / 43774
[0012]专利文献3:国际公开公报W02008 / 140602
[0013]专利文献4:国际公开公报2010 / 126914
[0014]专利文献5:国际公开公报2006 / 0969807
[0015]专利文献6:国际公开公报W02006 / 112738
[0016]专利文献7:国际公开公报W02008 / 007804
[0017]专利文献8:国际公开公报TOOO / 17394
[0018]非专利文献
[0019]非专利文献I:Roy R.Lobb 等人.(1994) J.Clin.1nvest.,94:1722-1728
[0020]非专利文献2:Roberto Gonzalez-Amaro 等人.(2005) Immunology, 116:289-296
[0021]非专利文献3:HoIzmann, B.等人.(1998) Curr.Top.Microbiol.Tmmunol., 231:125-141
[0022]非专利文献4 Jackson, D.Y.(2002) Curr.Pharm.Des.，8:1229-1253
[0023]非专利文献5:Kanayama, M.等人.(2009) J.1mmunol.，182:8015-8025
[0024]非专利文献6:Palmer，Ε.L.等人.(1993) J.Cell.Biol., 123:1289-1297
[0025]非专利文献7:1nternational Immunology Meeting, PP-038-31
[0026]非专利文献8:Kon, S.等人.(2011)Εχρ.Cell.Res.317:1774-84
【发明内容】
[0027]由于认为ITG- α 4和ITG- α 9具有共通的配体，并与EAE等相同的疾病发生有关，所以人们期望能够同时抑制ITG-a 4和ITG-a 9的物质，能够成为对ITG- a 4 ITG- a 9所参与的疾病有效的治疗药。另外，已知黑色素瘤等癌细胞，表达ITG-a 4和ITG-a 9这两者(J Cell Physiol.(2007)212:368-74.；Exp Cell Res.(2009) 315:3312-24.)。已知虽然在癌症的转移中，血管内存在滚动、粘附、血管外移动的步骤，但认为在进行该粘附时ITG承担重要的作用。人们认为:当ITG- a 4与ITG-a 9共通的配体在血管内皮细胞上表达时，仅通过抗体等抑制其中一个整联蛋白与该配体的结合，还无法阻止转移，需要有抗ITG-a 4和ITG-a 9这两者的抗体。有报道称:作为ITG_a4与ITG-a 9共通的配体即血管性血友病因子(vWF)，实际上是由血管内皮细胞产生的(J Clin Invest.1978Jun,61 (6):1498-507.)。有报道称:ITG-a 4和ITG-a 9这两者均在淋巴管内表达(Nat Rev Cancer.(2008)8:604-17.)。因此认为，能够同时抑制ITG-a 4和ITG- a 9的物质会成为有效的癌转移抑制剂。并且，还报道了通过抑制ITG-a 4或抑制ITG-a 9对淋巴管新生、功能的影响(Cancer Res.(2010)70:3042-51.，EMBO J.(2005)24:2885-95.)，人们期望通过同时抑制ITG- α 4和ITG- α 9，从而提供前所未有的有效的淋巴管新生抑制剂。
[0028]本发明人等为了探索ITG-a 4的有效的抑制剂，尝试了鉴定ITG-a 4的新型可变剪接变体。其结果是，成功鉴定了六种新的可变剪接变体(图1~3和序列号4~9)。本发明人等分析了所得的ITG-a 4的可变剪接变体的结构，其结果令人惊奇，在六种可变剪接变体中，有五种可变剪接变体在C末端侧具有新的来自固有的内含子而不是来自人ITG- a 4 (序列号10)的氨基酸序列(图3表示各ITG- a 4可变剪接变体的C末端侧的新的氨基酸序列)。
[0029]本发明人等分析了所得的ITG-a 4可变剪接变体的功能，结果发现:这些可变剪接变体能够抑制ITG-a 4与多个不同配体的结合。并且，本发明人等还发现:所得的ITG- a 4可变剪接变体不仅抑制ITG- a 4与其配体的结合，而且还抑制ITG- a 9与其配体的结合。[0030]即、本发明的课题在于:提供能够抑制ITG-a 4的各种功能的新型物质和/或提供能够抑制ITG-a 4和ITG-a 9这两者的新型物质。另外，本发明是基于发现了 ITG-a 4的新型可变剪接变体的发明。具体而言，本发明涉及下述(I)~(15)所述的发明。
[0031](I) 一种整联蛋白a 4突变体，其具有人整联蛋白a4(序列号10)的一部分胞外区。
[0032](2)根据⑴所述的肽，其中，人整联蛋白a4(序列号10)的胞外区包含:来自人整联蛋白α 4(序列号10)的螺旋桨结构域的氨基酸序列。
[0033](3)根据⑴所述的肽，其中，人整联蛋白α4(序列号10)的胞外区是，选自序列号9和序列号11~14中的一个序列。
[0034](4)根据⑴至(3)中任一项所述的肽，其特征在于，选自序列号15~19中的一个序列与人整联蛋白α4(序列号10)的胞外区的C末端结合。
[0035](5) 一种肽,其具有选自序列号4~9中的一个序列。
[0036](6)根据⑴至(5)中任一项所述的肽，其中，所述肽与整联蛋白a 4的配体结合、并且/或者抑制整联蛋白a4与其配体的结合。
[0037](7)根据(6)所述的肽，其中，整联蛋白a4的配体是选自VCAM1、Fn、JAM2、MAdCAMl、MDC-L (ADAM28)、pp-vWF 和 OPN 中的一种物质。
[0038](8)根据(6)所述的肽，其中，整联蛋白a 4的配体是pp-vWF或0ΡΝ。
[0039](9)根据(6)所述的肽，其中，整联蛋白a 4的配体是具有序列号20或21的氨基酸序列的肽。
[0040](10)根据(I)至(9)中任一项所述的肽，其中，所述肽进一步与整联蛋白a 9的配体结合、并且/或者抑制整联蛋白a9与其配体的结合。
[0041](11)根据(10)所述的肽，其中，整联蛋白a9的配体是选自VCAM1、Fn、JAM2、MAdCAMl、MDC-L (ADAM28)、pp-vWF 和 OPN 中的一种物质。
[0042](12)根据(10)所述的肽，其中，整联蛋白a 9的配体是pp_vWF或0ΡΝ。[0043](13)根据(10)所述的肽，其中，整联蛋白α 9的配体是具有序列号20或21的氨基酸序列的肽。
[0044](14)根据⑴至(13)中任一项所述的肽，其中，所述肽是可溶性肽。
[0045](15) 一种药物组合物，其含有(I)至(14)中任一项所述的肽作为有效成分。
[0046](16) 一种抗体，所述抗体能特异性地识别(或结合)(I)至(14)中任一项所述的肽。
[0047](17)根据(16)所述的抗体，其中，所述抗体不识别整联蛋白α 4(或者不与整联蛋白0 4结合)。
[0048]在本发明中，“整联蛋白α 4突变体”和“ITG-a 4突变体”同义，均是指来自ITG-a 4基因组且不同于ITG-a 4的、通过剪接产生的ITG-a 4的可变剪接变体肽或者实质上与该肽具有相同的氨基酸序列的肽。本说明书中的“整联蛋白a4突变体”具有人ITG- a 4的胞外区(由序列号10的第I位~第977位的氨基酸序列组成的部分)的一部分，不包括跨膜区和胞内区。关于ITG-a 4与结构域的关系，有报道称:根据整联蛋白a V的立体结构分析的结果(Science (2001)，294.339-345)，通过其与ITG- a 4氨基酸序列的同源性分析而类推得到的关系(Proc Natl Acad Sci USA.(1997) 94:65-72)。具体而言，已知在胞外区中，具有信号序列(由序列号10中的第I位~第33位的氨基酸序列组成的部分)、β -螺旋桨(由序列号10中的第34位~第465位的氨基酸序列组成的部分)、Thigh (由序列号10中的第466位~第618位的氨基酸序列组成的部分)、Genu(由序列号10中的第619位~第626位的氨基酸序列组成的部分)、Calfl (由序列号10中的第627位~第770位的氨基酸序列组成的部分)和Calf2 (由序列号10中的第771位~第977位的氨基酸序列组成的部分)的结构域。作为本发明中的人ITG-a 4的一部分胞外区，优选为β-螺旋桨结构域和/或Thigh结构域。例如，本说明书中的人ITG-a 4的一部分胞外区具有:来自人ITG- a 4的β -螺旋桨结构域的氨基酸序列。在此，来自β -螺旋桨结构域的氨基酸序列是指，只要是位于ITG- a 4的N末端的构成β -螺旋桨结构域的氨基酸序列的一部分即可，其可以是任何位点的序列。人ITG-a 4的一部分胞外区，例如可以具有50个氨基酸以上、100个氨基酸以上、150个氨基酸以上、180个氨基酸以上或者185个氨基酸以上的、来自构成螺旋桨结构域(由432个氨基酸组成)氨基酸序列的氨基酸序列。另外，来自人ITG-a 4的β -螺旋桨结构域的氨基酸序列，优选包含在序列号10中的第34位的氨基酸序列。另外，具有来自人ITG- a 4的β -螺旋桨结构域的氨基酸序列的人ITG- a 4的一部分胞外区，可以仅由来自螺旋桨结构域的氨基酸序列组成，也可以在来自螺旋桨结构域的氨基酸序列中，再加入具有除了来自β_螺旋桨结构域以外的人ITG-a 4的胞外区的氨基酸序列。更具体而言，本说明书中的人ITG-a 4的一部分胞外区，可以包含序列号11~14所记载的氨基酸序列(或者在该氨基酸序列中，缺失了由第I位~第33位的氨基酸序列组成的信号序列而得到的氨基酸序列)、或者序列号10的第I~185位、第I~384位、第I~513位、或者第I~640位(或者序列号10的第34~185位、第34~384位、第34~513位或第34~640位)的氨基酸序列。
[0049]另外，在本说明书中，“整联蛋白a 4突变体”可以包括不是来自ITG-a 4的氨基酸序列(以下称作“ ITG- a 4突变体特异性氨基酸序列”)。优选“ ITG- a 4突变体特异性氨基酸序列”是来自ITG-a 4的内含子的序列，具体而言，本说明书中的ITG-a 4突变体特异性氨基酸序列可以是序列号15~19所记载的氨基酸序列。
[0050]即、在一个方式中，本说明书中的“整联蛋白α 4突变体”包含仅由上述人ITG-a 4的一部分胞外区组成的肽、或者由上述人ITG-a 4的一部分胞外区和ITG-a 4突变体特异性氨基酸序列组成的肽(以下统称为“ITG-a 4的可变剪接变体”)。具体而言，本说明书中的ITG-a 4突变体可以是包含序列号4~9(分别依次称作“1-2-1突变体”(序列号
4)、“ 1-1-2突变体”(序列号5)、“7-3-2突变体”(序列号6)、“ 10_7_3突变体”(序列号7)、“ 10-7-2突变体”(序列号8)和“9-5-4突变体”(序列号9))所记载的氨基酸序列的肽。另外，本说明书中的ITG-a 4的可变剪接变体具有与ITG-a 4的配体结合、并且/或者抑制ITG-a 4与其配体结合的活性、以及/或者与ITG-a 9的配体结合、并且/或者抑制ITG-a 9与其配体结合的活性。
[0051]并且，在另一个方式中，本说明书中的“具有人整联蛋白a 4的一部分胞外区的整联蛋白a 4突变体”包含:与上述ITG-a 4的可变剪接变体实质上相同的肽。在此，实质上相同的肽是指，与上述ITG-a 4的可变剪接变体在氨基酸序列方面的同源性高、由与编码该肽的DNA在严格条件下杂交的DNA进行编码、和/或有少数氨基酸残基被取代、缺失、添加和/或插入而得到的肽，并且与本说明书中的ITG-a 4的可变剪接变体具有同等的生物学活性的肽。
[0052]在本说明书中，氨基酸序列的同源性高是指，具有与上述ITG-a 4的可变剪接变体有80%、85%、90%、95%、98%或99%的同源性的氨基酸序列。例如，与ITG- a 4的可变剪接变体在氨基酸序列方面的同源性高的肽，可以具有与序列号4~9的氨基酸序列中的任一个氨基酸序列有80%、85%、90%、95%、98%或99%的同源性的氨基酸序列。在此，氨基酸序列的同源性例如能够利用BLAST、FASTA等公知的程序，通过本领域技术人员通常采用的方法来确定。
[0053]在本说明书中，由与编码ITG-a 4的可变剪接变体的DNA在严格条件下杂交的DNA进行编码是指，在本领域技术人员通`常采用的杂交条件下与编码ITG-a 4的可变剪接变体的DNA进行杂交。例如，与编码ITG- a 4的可变剪接变体的DNA在严格条件下进行杂交的DNA，可以是由与编码序列号4~9的氨基酸序列中的任意一个氨基酸序列的DNA在严格条件下杂交的DNA进行编码的肽。在严格的条件下是否杂交，这能够通过MolecularCloning, ALaboratory Mannual,第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)记载的方法来确定是否进行杂交。例如，严格的杂交条件可以是在6XSSC(0.9M的NaCl、0.09M 的柠檬酸三钠)或 6XSSPE(3M 的 NaCU0.2M 的 NaH2PO4,20mM 的 EDTA.2Na、ρΗ7.4)中、在42°C下杂交，之后在42°C下用0.5 X SSC进行清洗的条件。
[0054]在本说明书中，在ITG-a 4的可变剪接变体中有少数氨基酸残基被取代、缺失、添加和/或插入而得到的肽是指，构成ITG-a 4的可变剪接变体的氨基酸序列的一部分氨基酸被其他氨基酸取代和/或缺失而得到的肽、和/或在构成ITG-a 4的可变剪接变体的氨基酸序列的C末端或N末端上添加了其他的氨基酸序列而得到的肽、和/或在构成ITG-a 4的可变剪接变体的氨基酸序列内插入了其他的氨基酸而得到的肽。例如，作为在ITG-a 4的可变剪接变体中有少数氨基酸残基被取代、缺失、添加和/或插入而得到的肽，可以列举出:在由序列号4~9的氨基酸序列中的任一个氨基酸序列组成的肽中有少数氨基酸残基被取代、缺失、添加和/或插入而得到的肽。被取代、缺失、添加和/或插入的氨基酸的数量，只要是不影响ITG-a 4的可变剪接变体的生物学活性的数量即可，并没有特别限定，例如可以是I~10个、I~5个、I~4个或I~3个。
[0055]如上所述，与上述ITG-a 4的可变剪接变体实质上相同的肽，具有与ITG_a4的可变剪接变体同等的生物学活性。在此，“与ITG-a 4的可变剪接变体同等的生物学活性”是指，与ITG-CI4的配体结合、并且/或者抑制整联蛋白a4与其配体结合的活性。在此，ITG-a 4的配体，只要是作为ITG-CI4的配体为已知的蛋白或肽即可，并没有特别限定，优选为 VCAM1、Fn(特别是纤连蛋白 EIIIA(Fn-EIIIA))、JAM2、MAdCAMU MDC-L(ADAM28)、pp-vWF或0ΡΝ，更优选为Fn-EIIIA、pp-vWF或0ΡΝ，进一步优选为具有序列号20或21的氨基酸序列的肽。在与ITG-a 4的配体结合、并且/或者抑制整联蛋白a 4与其配体的结合的情况下，配体的种类不必是所有的这些配体，例如，可以与上述配体中的一部分配体结合、并且/或者抑制整联蛋白a4与上述配体中的一部分配体的结合。优选与两个或两个以上的配体结合、并且/或者抑制整联蛋白a 4与其配体的结合，该两个或两个以上的配体优选包含Fn-EIIIA、pp-vWF和0ΡΝ，更优选包含具有序列号20的氨基酸序列的肽和具有序列号21的氨基酸序列的肽。
[0056]优选“与ITG-a 4的可变剪接变体同等的生物学活性”是指，与ITG-a 4的配体结合、并且/或者抑制ITG-a 4与其配体结合的活性，而且还指与ITG-a 9的配体结合、并且/或者抑制ITG-a 9与其配体结合的活性。在这里，ITG-a 9的配体，只要是作为ITG-a 9的配体为已知的蛋白或肽即可，并没有特别限定，优选为VCAMl、Fn(特别是纤连蛋白 EIIIA(Fn-EIIIA))、JAM2、MDC-L(ADAM28)、pp-vWF 或 0ΡΝ，更优选为 Fn-EIIIA、pp-vWF或0ΡΝ，进一步优选为具有序列号20或21的氨基酸序列的肽。在与ITG-a 9的配体结合、并且/或者抑制整联蛋白a 4与其配体的结合的情况下，配体的种类不必是所有的这些配体，例如，可以与上述配体中的一部分配体结合、并且/或者抑制整联蛋白a 9与上述配体中的一部分配体的结合。优选与两个或两个以上的配体结合、并且/或者抑制整联蛋白a 9与其配体的结合，该两个或 两个以上的配体优选包含Fn-EIIIA、pp-vWF和0ΡΝ，更优选包含具有序列号20的氨基酸序列的肽和具有序列号21的氨基酸序列的肽。
[0057]在本说明书中，抑制ITG-a 4与其配体的结合活性和抑制ITG-a 9与其配体的结合活性，可以分别换成对表达ITG-a 4的细胞与ITG-a 4配体的结合(表达ITG-a 4的细胞与ITG- a 4配体的细胞粘附)进行抑制的活性、以及对表达ITG- a 9的细胞与HG- a 9配体的结合(表达ITG-a 9的细胞与ITG-a 9配体的细胞粘附)进行抑制的活性。
[0058]如上所述，本发明的ITG-a 4突变体具有:与ITG-a 4的配体结合、并且/或者抑制ITG-a 4与其配体的结合的活性、以及/或者与ITG-a 9的配体结合、并且/或者抑制ITG-a 9与其配体的结合的活性。优选为，本发明的ITG-a 4突变体具有--与ITG-a 4的配体结合、并且/或者抑制ITG-a 4与其配体结合的活性、以及与ITG-a 9的配体结合、并且/或者抑制ITG-a 9与其配体结合的活性。更优选为，本发明的ITG-a 4突变体与ITG- a 4和ITG- a 9这两者所结合的共通配体相结合，或者抑制ITG- a 4和ITG- a 9这两者所结合的共通配体与ITG- a 4的结合、以及抑制ITG- a 4和ITG- a 9这两者所结合的共通配体与ITG-a 9的结合。作为ITG-a 4和ITG-a 9这两者所结合的共通配体，可以列举出Fn-EIIIA、pp-vWF 和 OPN。
[0059]进一步优选为，“与ITG-a 4的可变剪接变体同等的生物学活性”除了包含上述活性，还可以包含可溶性。关于作为对象的肽是否是可溶性，例如，可以将利用FLAG等修饰后的编码该肽的DNA重组到宿主细胞中，之后培养该细胞，然后使用抗FLAG抗体等来确认培养上清中的该肽的存在，由此进行研究。在该肽被释放到培养上清中的情况下，能够判定出该肽是可溶性。在本说明书中，“可溶性”是指，所产生的肽中有大部分(过半数)被释放到培养液中而不是停留在细胞内或细胞表面，而并不要求所产生的全部的肽都被释放到培养液中。
[0060]在本说明书中，“与ITG-a 4的可变剪接变体同等的生物学活性”原则上是指定性的性质，只要具有上述活性则不问其大小，但优选为，与ITG-a 4的可变剪接变体(优选包含序列号4~9所记载的氨基酸序列的肽)的程度相同(例如，活性值在±25%、±20%、土 15%或土 10%的范围内)。
[0061]另外，本说明书中的“整联蛋白a 4突变体”，根据需要，构成的氨基酸可以接受适当的化学修饰。另外，本说明书中的“整联蛋白a 4突变体”可以是不与RGD序列(序列号I)结合的肽和/或不抑制RDG序列(序列号I)与ITG (特别是ITG- a 4和/或ITG- a 9)结合的肽。
[0062]另外，在另一个方式中，本发明涉及特异性地识别ITG-CI4突变体的抗体。本发明的抗体既可以是多克隆抗体，也可以是单克隆抗体，但优选为单克隆抗体。在本发明中，“单克隆抗体”是指对抗原有高度的特异性、且识别单一抗原的抗体。并且，本发明的抗体包含非人动物的抗体、具有非人动物的抗体的氨基酸序列和来自人的抗体的氨基酸序列的抗体、以及人抗体。作为非人动物的抗体，例如可以列举出:小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、兔、狗、猴、绵羊、山羊、鸡、鸭等的抗体，优选为能够制备杂交瘤的动物的抗体，更优选为小鼠的抗体。作为具有非人动物的抗体的氨基酸序列和来自人的抗体的氨基酸序列的抗体，可以列举出人型嵌合抗体、人源化抗体。上述的“嵌合抗体”是指，对来自非人动物且与ITG-a 4突变体特异性结合的抗体的恒定区进行了基因工程改造而使其具有与人的抗体相同的恒定区的抗体，优选为人 -小鼠嵌合抗体(参照欧州专利公开公报EP0125023)。“人源化抗体”是指，利用基因工程将来自非人动物且除了与ITG- a 4突变体特异性结合的抗体的H链和L链的互补识别区(CDR)以外的一级结构改造成与人的抗体相对应的一级结构而得到的抗体。在此，CDR 可以是由 Kabat 等人(“Sequences of Proteins of Immunological Interest，，、Kabat, E.等人(U.S.Department of Health and Human Services, 1983)或 Chothia 等人(Chothia & Lesk (1987) J.Mol.Biol.，196:901-917)进行定义中的任一个 CDR。“人抗体”是指，作为完全来自人的抗体基因的表达产物的人抗体，例如可以列举出:使用导入了与人的抗体产生有关的基因的转基因动物而制备的单克隆抗体(参照欧州专利公开公报EP0546073)等。
[0063]发明效果
[0064]由于本发明的ITG- α 4突变体能够抑制ITG- α 4的各种功能，所以能够对ITG- α 4参与的发病或病情恶化的各种疾病进行治疗或预防。特别是，由于本发明的ITG-a 4突变体除了能够抑制ITG-a 4与其配体的结合，还能够抑制ITG-a 9与其配体的结合，所以能够对ITG- a 4和ITG- a 9参与的发病或病情恶化的各种疾病进行治疗或预防。
【专利附图】
【附图说明】[0065]图1是表示作为ITG-a 4的可变剪接变体的1_2_1突变体、1_1_2突变体、7_3_2突变体和10-7-3突变体的氨基酸序列的图。
[0066]图2是表示作为ITG- a 4的可变剪接变体的10_7_2突变体和9_5_4突变体的氨基酸序列的图。
[0067]图3是ITG-a 4的可变剪接变体的序列的示意图。
[0068]图4是表示在ITG-a 4的可变剪接变体的染色体2中的基因结构的图。
[0069]图5是表示通过蛋白质印迹对强制表达了六种ITG-a 4的可变剪接变体(1_1_2突变体、1-2-1突变体、7-3-2突变体、10-7-3突变体、10-7-2突变体、9_5_4突变体)的COS细胞的培养上清中各突变体的表达进行确认后的结果图。
[0070]图6表示:通过配体固相ELISA对培养上清中的ITG-a 4的可变剪接变体与作为整联蛋白 a 4 的配体即人 OPN RAA Nhalf 蛋白(Kon，S.等人，(2002) J.Cell.Biochem.，84:420-432)或阴性对照(牛血清白蛋白:BSA)的结合进行研究后的结果。纵轴表示:作为与配体结合的整联蛋白α 4突变体的量的指标即标记抗体在450nm处的吸光度；横轴表示:所使用的各ITG- α 4的可变剪接变体。黑色图形表示:各ITG- α 4的可变剪接变体与人OPNRAA Nhalf蛋白的结合；灰色图形表示:各ITG-a 4的可变剪接变体与BSA的结合。[0071]图7表示通过蛋白质印迹对内源性1-2-1突变体的表达进行分析后的结果。左边的数值表示蛋白的分子量(kDa)。照片上部的“1-2-1 / COS pos1-con”表示强制表达了 1-2-1突变体的COSl细胞的培养上清；“Jurkat sup”表示Jurkat细胞的培养上清；“Rec-lsup”表示Rec-1细胞的培养上清。
[0072]图8表示:测定1-2-1突变体的对整联蛋白α 4、整联蛋白α 9介导的细胞粘附抑制功能的结果。纵轴表示:作为与配体结合的细胞数量的指标即595nm处的吸光度，横轴表示:所使用的各配体。“ma4 / CH0”是指使用了表达小鼠整联蛋白α 4整联蛋白的CHO细胞，“ma9 / CH0”是指使用了表达小鼠整联蛋白a9的CHO细胞。图中的白色表示未添加1-2-1突变体(-);黑色表示添加6.25 yg / mL的1-2-1突变体；点表示添加12.5yg /mL的1-2-1突变体；斜线表示添加25 μ g / mL的1_2_1突变体。
[0073]图9是表示研究1-2-1突变体/ GST蛋白对EAE的影响的日程图。
[0074]图10是表示对利用1-2-1突变体蛋白的EAE抑制效果进行研究后的结果图。纵轴表示EAE分数；横轴表示给予1-2-1突变体后经过的天数。
【具体实施方式】
[0075](ITG- a 4 突变体)
[0076]本发明的ITG-a 4突变体可以通过参照ITG-a 4的结构(图3)和序列(序列号10)，同时采用本领域技术人员公知的方法并参考本说明书的记载而得到。例如，通过使用已知的表达ITG- a 4的细胞(例如Jurkat细胞等T细胞、Rec-1细胞等)的cDNA进行3’_race法，能够得到ITG-α 4突变体。例如，有报道称:ITG_ α 4在肠、T细胞、产生IgA的B细胞、(单核)白细胞等中表达。具体而言，使用QIAGEN RNeasy试剂盒(QIAGEN)，提取出来自已知的表达ITG-a 4的细胞的总RNA。可以使用第一链cDNA合成试剂盒(Roche)，来进行从总RNA合成3’ -race用cDNA。具体而言，使用3’ -race用的引物QT引物(例如序列号22)作为逆转录中使用的引物，来合成3’-race用的cDNA。以得到的cDNA为模板，使用QO引物(例如序列号23)和接下来表示的ITG-a 4的各种区的引物(例如在人ITG-a 4的情况下，有序列号24、序列号25、序列号26等)，进行第一次PCR。将所得的PCR产物稀释20倍，使用其中的IyL作为模板，并使用Ql引物(例如序列号27)和ITG_a4引物((例如在人ITG-a 4的情况下，有序列号25、序列号26、序列号28等)，进行第二次PCR。通过凝胶提取，来纯化所得的谱带，并通过进行克隆，从而能够得到ITG- a 4突变体。 [0077]或者，本发明的ITG-a 4突变体，能够直接由1_2_1突变体、1_1_2突变体、7_3_2突变体、10-7-3突变体、10-7-2突变体和9-5-4突变体而得到或者通过适当地改造上述突变体而得到。当直接使用1-2-1突变体、1-1-2突变体、7-3-2突变体、10-7-3突变体、10-7-2突变体和9-5-4突变体作为ITG- a 4突变体时，能够按照本说明书的实施例2的方法来制备。另外，关于改造，通过利用蛋白质工程领域通常采用的技术，能够进行氨基酸的取代、缺失、添加和/或插入，此外还能够对氨基酸进行适当修饰，由此即可进行改造。
[0078]具体而言，本发明的ITG-CI4突变体能够通过以下的方法而得到。使用得到了突变体的细胞cDNA作为模板，并适当设计用于使编码目标突变体的DNA扩增的引物，进行PCR。将PCR产物经适当设定的限制酶消化后插入到表达载体中，使用脂质体(Lipofectamine) 2000 (Invitrogen)等,将所制备的表达载体导入到宿主细胞中，根据需要而纯化培养上清。或者，利用本领域技术人员公知的方法，由氨基酸序列来设计DNA序列，通过合成并制备该DNA，可以将其插入到表达载体中进行使用。或者，通过肽合成，可以直接制备如1-2-1突变体那样的较短的突变体。
[0079](结合活性的测定方法)
[0080]ITG-a 4突变体是否与ITG-a 4或ITG-a 9的配体具有结合力，可以通过采用本领域技术人员公知的方法，同时参考本说明书的记载来确定。具体而言，可以使用配体固相ELISA，并通过以下的方法来进行。将ITG-a 4或ITG-a 9的配体进行固相，用BSA / PBS封闭，之后添加含有用FLAG标记的受检ITG- a 4突变体的溶液。在4°C下反应I小时之后，添加抗FLAG抗体和抗小鼠IgG混合物，然后在4°C下使其反应30分钟，清洗之后用TMB液使其显色，就能够分析出结合力。
[0081](抑制结合活性的测定方法)
[0082]ITG-a 4突变体是否具有抑制ITG-a 4与其配体或ITG-a 9与其配体的结合活性，可以通过ITG- a 4突变体是否抑制了表达ITG- a 4或ITG- a 9的细胞与它们的配体的结合(细胞粘附)来确定。具体而言，使BSA与ITG- a 4的配体或ITG- a 9的配体进行偶联，在4°C下放置一夜进行固相。利用含有BSA的DMEM培养基封闭I小时，之后添加了表达整联蛋白a 4或整联蛋白a 9的细胞(例如CHO细胞)和GST融合受检ITG- a 4突变体的混合物，在CO2培养箱内、于37°C下培养I小时。用PBS去除非粘附细胞，再利用含有0.5%结晶紫的20%甲醇来固定粘附细胞，并使其染色。利用20%的乙酸进行转溶，根据595nm处的吸光度，能够对抑制细胞粘附的效果进行测定、定量。
[0083](药物组合物)
[0084]在蛋白质药物的领域，根据本领域技术人员通常应用的知识，能够将本发明的ITG-a 4突变体用作药物组合物。因此，在一个方式中，本发明涉及含有本发明的ITG-a 4突变体作为有效成分的药物组合物。具体而言，本发明的药物组合物能够作为癌症、癌转移、多发性骨髓瘤或类风湿性关节炎、支气管炎、炎症性肠道疾病、克罗恩病、多发性硬化症等炎症性疾病或自身免疫疾病、急性中枢神经系统损伤、HIV等免疫功能不全、变应性脑脊髓炎、过敏症、I型糖尿病等T细胞依赖性自身免疫疾病、过敏性肺炎、免疫复合体介导的肺部疾病、急性肾毒性肾炎、延迟性过敏症(皮肤硬化和纤维蛋白的沉积等)、动脉硬化、心肌梗塞的治疗药或预防药、或者带血管蒂的心脏的同种移植的排斥反应抑制等移植时的排斥反应的抑制剂。
[0085]在将本发明的ITG- α 4突变体用作药物组合物的情况下，作为给药部位，例如可以列举出:口服给药、口腔内给药、呼吸道内给药、皮下给药、肌肉内给药、血管内(静脉内)给药、经皮给药等。另外，药物组合物例如能够制成注射剂、胶囊剂、片剂、糖浆剂、颗粒剂、软膏等搽剂的制剂。本发明的抗体可以单独给药，也可以与药理学上允许的单体一同给药。
[0086](抗体)
[0087]本发明的抗体能够通过以下的方法得到。首先，本发明的用于抗体制备的免疫原能够通过如下方式得到:将表达载体(例如PGEX (大肠杆菌用)、pcDNA3.1 (动物细胞表达用)等)转化成大肠杆菌、酵母、昆虫细胞、动物细胞等，所述表达载体包含对具有ITG-a 4突变体的全部或其一部分的多肽(优选在ITG- a 4中不存在的ITG- a 4突变体特异性氨基酸序列、例如序列号15~19)进行编码的DNA，再将已转化的大肠杆菌等宿主微生物、培养细胞在适当的培养基(例如LB培养基等)中培养，并使其表达，从而能够得到免疫原。另外，还能够使用对具有该序列的肽进行化学合成而得到的免疫原。
[0088]使用上述抗原的动物的免疫是通过如下方式进行的:将上述抗原溶解在磷酸钠缓冲液(PBS)中，根据需要将其与免疫赋活剂(例如，矿物油或铝沉淀物和加热死菌或脂多糖、弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂等)一起对非人哺乳动物或鸟类进行免疫。对动物给予免疫原，例如是能够通过皮下注射、腹腔内注射、静脉内注射、肌肉内注射或足跖注射进行的。所使用的免疫原的量只要是能够产生抗体的量即可，并没有特别限定，但优选为0.1~1000 μ g，更优选为I~500 μ g，更进一步优选为10~100 μ go免疫能够进行I次或者以适当的间隔进行数次。优选I~5周进行I次免疫，并能够进行数次(优选总计为2~5次)。多克隆抗体能够通过由表现出足够的抗体效价的动物血清进行纯化而得到。
`[0089]在制备单克隆抗体的情况下，将由利用上述方法进行了免疫的免疫致敏动物的脾脏等得到的抗体生成细胞、与骨髓瘤系细胞(骨髓瘤细胞)融合而得到杂交瘤，通过培养该杂交瘤，能够得到单克隆抗体。作为该融合方法，例如可以列举出Milstein等人的方法(Galfre,G.& Milstein,C.,Methods Enzymol.73:3_46，1981)。通过在体外培养杂交瘤，并纯化培养液，能够得到抗体。
[0090](人型嵌合抗体的制备)
[0091]在本发明的抗体为人型嵌合抗体的情况下，通过制备对与ITG-a 4突变体结合的非人动物单克隆抗体的VH和VL进行编码的DNA，使其与人免疫球蛋白的恒定区cDNA结合，并插入到表达载体中，将该载体导入到适当的宿主细胞中使其进行表达，从而能够得到人型嵌合抗体(Morrison, S.L 等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA，81，6851-6855，1984)。
[0092](人源化抗体的制备)
[0093]在本发明的抗体为人源化抗体的情况下，通过构建编码V区的DNA，所述V区是在人抗体的VH和VL的FR中移植了对与ITG- α 4突变体结合的非人动物单克隆抗体的VH和VL的CDR进行编码的氨基酸序列，将所构建的DNA与来自人的免疫球蛋白的恒定区cDNA结合，并插入到表达载体中，将该载体导入到适当的宿主细胞中使其进行表达，从而能够得到人源化抗体(参照 L.Rieohmann 等人，Nature, 332, 323,1988:Kettleborough, C.A 等人，Protein Eng., 4, 773-783,1991 ；Clark M., Tmmunol.Today., 21, 397-402, 2000)。关于非人动物单克隆抗体的CDR，能够对由DNA序列预测的氨基酸序列与已知抗体的VH和VL的全氨基酸序列进行比较而得到，所述DNA序列用于编码通过上述方法得到的非人动物单克隆抗体的VH和VL。已知抗体的氨基酸序列例如能够由注册在蛋白质数据库等数据库中的抗体的氨基酸序列而得到。另外，作为人源化抗体的FR，只要是移植后的抗体能发挥本发明效果的FR即可，并没有特别限定，但优选人源化抗体的可变区(以下称作“V区”)是形成与CDR所来源的非人动物单克隆抗体的V区类似的立体结构的人抗体的FR、或者与使用的非人动物单克隆抗体的FR的氨基酸序列的同源性高的人抗体FR。将所使用的人源化抗体的V区进行编码的DNA序列，作为与氨基酸序列相对应的DNA序列进行设计，所述氨基酸序列是结合了非人动物单克隆抗体的CDR的氨基酸序列和人抗体的FR的氨基酸序列而成的。关于编码人源化抗体V区的DNA，能够根据所设计的DNA序列，并利用本领域技术人员公知的方法来制备。
[0094](人抗体)
[0095]人抗体例如能够通过利用人抗体噬菌体文库、或产生人抗体的转基因小鼠而得到(富塚等人，Nature Genet., 15,146-156 (1997))。在利用人抗体卩遼菌体文库的情况下,例如，将具有ITG-a 4突变体或者本发明的抗体所识别的表位序列的肽固定在固相上，使噬菌体抗体文库反应，清洗并去除了未结合的噬菌体，之后回收已结合的噬菌体，从而能够得到所期望的克隆(筛选)。另外，使得到的噬菌体扩增，对所扩增的文库进一步反复进行筛选，从而能够提高所得的克隆的精度。通过分析所得的克隆的VH基因和VL基因，还能够制备具有这些基因序列的完全的人抗体。
[0096]产生人抗体的转基因小鼠是指，向敲除了内源性免疫球蛋白(Ig)基因的小鼠导入了人抗体的Ig 基因而得到的小鼠。产生人抗体的转基因小鼠例如能够通过以下的方法得到。通过对人-小鼠杂交细胞进行48小时的秋水仙酰胺(纺锤丝形成的抑制剂)处理，从而形成一条至数条染色体被包在核膜内的结构体即微细胞。在细胞松弛素B的存在下将分离后的微细胞与染色体受容细胞(小鼠ES细胞)通过聚乙二醇进行融合，制备微细胞杂交ES细胞，将其注入到小鼠胚胎中。以产生人抗体的转基因小鼠作为免疫动物，根据上述的抗ITG- a 4突变体抗体制备方法，对抗原(优选具有本发明的抗体所识别的表位序列的肽)进行免疫，从而能够得到抗ITG- a 4突变体人抗体。
[0097](抗体片段的制备)
[0098]关于F(ab’)2片段(分子量大约为10万的具有抗原结合活性的抗体片段)，能够通过用胃蛋白酶处理本发明的IgG抗体，并在H链的第234位氨基酸残基处切断而得到。Fab’片段能够通过对利用上述方法得到的F(ab’)2进行二硫苏糖醇处理而得到。另外，本发明的Fab’片段能够由编码本发明抗体的Fab’的DNA而得到。关于Fab片段(H链N末端侧的大约二分之一的区与L链的整个区通过二硫键进行结合而成的、分子量大约为5万且具有抗原结合活性的抗体片段)，能够通过用木瓜蛋白酶处理本发明的抗体，并在H链的第224位氨基酸残基处切断而得到。另外，本发明的Fab片段能够由编码本发明抗体的Fab的DNA而得到。scFv能够通过如下方法得到:在对本发明抗体的VH和VL进行编码的cDNA之间，插入编码接头序列的DNA，并构建编码scFv的DNA。接头的长度只要是能够使VH和VL缔合的长度即可，并没有特别限定，但优选为10~20个残基，更优选为15个残基。另外，接头的序列只要是不阻碍VH和VL的两个结构域的多肽链的折叠即可，并没有特别限定，但优选为由甘氨酸和/或丝氨酸构成的接头，更优选为GGGGS (G:甘氨酸、S:丝氨酸)或其重复序列。dsFv能够通过如下方法得到:将VH和VL中的各I个氨基酸残基取代成半胱氨酸残基，并通过二硫键使该半胱氨酸残基之间进行结合。双抗体(diabody)能够通过如下方法得到:在编码上述scFv的DNA中，构建成接头的氨基酸序列为8个残基以下(优选为5个残基)。双特异性双抗体能够通过组合两种不同的scFv的VH和VL的DNA来制备scFv而得到。本发明的包含CDR的肽能够通过设计成如下的肽而得到，所述肽具有本发明抗体的VH或VL的⑶R的氨基酸序列。
[0099] 以下，为了更详细地说明本发明而给出了实施例，但本发明并不局限于此。此外，本申请通篇引用的所有文献均通过参照而直接被组合在本申请中。
[0100](实施例1)整联蛋白α4突变体的鉴定
[0101]采用使用了 Jurkat细胞、Rec-1细胞cDNA的3’ -race法,进行了新型人α4整联蛋白突变体的鉴定。使用QIAGEN RNeasy试剂盒(QIAGEN)，提取了来自人T细胞细胞株Jurkat细胞(ATCC、TIB-152)和人套细胞淋巴瘤细胞株Rec-1细胞(ATCC、CRL-3004)的总 RNA。具体而言，利用 3’ -race 用的引物 QT 引物(5’ -CCAGTGAGCAGAGTGACGAGGACTCGAGCTCAAGCTTTTTTTTTTTTTT TTT-3’:序列号22)，对逆转录中所使用的引物进行了 3’ -race用cDNA合成。以得到的cDNA为模板，使用QO引物(5 ’ -CCAGTGAGCAGAGTGACG-3 ’:序列号23)和接下来表示的人整联蛋白α 4的各种区的三种引物(a4-N:5’ -TGTCTCGAGTGGCCGTTTAGTGTTGAATGT-3，:序列号 24 ; α 4-1246:5，-ACTGGTGGTTGCTATGGAGTA-3，:序列号 25 ； α 4-2118:5，-CTTTTCGGTCTGATTCTGCTG-3’:序列号 26)，进行了第一次 PCR。将所得的PCR产物稀释20倍，使用其中的IyL作为模板，进行了第二次PCR。作为第二次PCR用的引物组，使用了 Ql引物(5’ -GAGGACTCGAGCTCAAGC-3’:序列号27)和三种人整联蛋白 α4 引物(α 4-1246:5，-ACTGGTGGTTGCTAT GGAGTA-3，:序列号 25 ； α 4-2118:5，-CTTTTCGGTCTGATTCTGCTG-3，:序列号 26 ； α 4-2556:5，-CACTTCAGCCAATTCTTCAGC-3，:序列号28)。所得到的多个谱带通过凝胶提取进行纯化,使用TOPO克隆试剂盒(Invitrogen)进行克隆，通过测序确定了喊基序列。
[0102]其结果为，成功鉴定了六种新型整联蛋白α 4突变体。将鉴定出的新型突变体分别命名为1-1-2突变体、1-2-1突变体、7-3-2突变体、10_7_3突变体、10_7_2突变体、9_5_4突变体。图1和图2表示:鉴定出的六种整联蛋白α 4突变体即1-2-1突变体、1_1_2突变体、7-3-2突变体、10-7-3突变体、10-7-2突变体和9_5_4突变体的氨基酸序列。另外，图3表示:这些突变体的序列的示意图，图4表示:在染色体2中的各整联蛋白α 4突变体的基因结构。
[0103](实施例2)整联蛋白α4突变体的表达
[0104]由于得到的全部的整联蛋白α 4突变体仅由整联蛋白α 4胞外区构成，所以推测它们是分泌性蛋白。因此，为了使各突变体在培养细胞中表达，而构建了在C末端侧添加FLAG标签的质粒。以如下方式，进行了六种整联蛋白α 4突变体(1-1-2突变体、1-2-1突变体、7-3-2突变体、10-7-3突变体、10-7-2突变体、9_5_4突变体)的表达载体的构建。使用Jurkat 细胞(ATCC、TIB-152)和 Rec-1 细胞(ATCC、CRL_3004) cDNA 作为模板，并使用 α 4-N引物和各突变体的特异性3’端引物进行了 PCR。以下表示:所使用的3’端引物。在各引物中，添加了用于表达分析的FLAG标签序列。
[0105]ha4-l-l-2-FLAG-RV 引物:5，-TTACTCTAGACTATTTATCGTCATCATCTTTGTAGTCATTACCTTCAAAGCCATCATT-3’(序列号 29)；
[0106]ha4-l-2-l-FLAG-RV 引物:5，-TCGTTCTAGACTATTTATCGTCATCATCTTTGTAGTCTGTCCTAGCTCTGTACTTGCT-3’(序列号 3O)；
[0107]ha4-7-3-2-FLAG-RV 引物:5，-CCACTCTAGACTATTTATCGTCATCATCTTTGTAGTCATATTGTAGGGCATACCCACC-3’(序列号 31)；
[0108]ha4-10-6-3-FLAG-RV 引物:5，-TTGATCTAGACTATTTATCGTCATCATCTTTGTAGTCTGAGGAAAAGCTGAGAGAGTT-3’(序列号 32)；
[0109]ha4-10-7-2-FLAG-RV 引物:5， -CCCATCTAGACTATTTATCGTCATCATCTTTGTAGTCGAGACAACACTTCAAAAACCC-3’(序列号 33)；
[0110]ha4-9-5-4-FLAG-RV 引物:5，-CGTTTCTAGACTATTTATCGTCATCATCTTTGTAGTCCTTCAAAAACCCAATCTTTGC-3’ (序列号 34)。用限制酶 Xho1、XbaI 消化 PCR 产物之后，将其插入到pcDNA3.1表达载体(Invitrogen)中，通过测序确认了序列。
[0111]使用脂质体2000 (Invitrogen)，将所制备的表达载体导入到COSl细胞(ATCC、CRL-1650)中，利用Vivaspin(GE)将两天后的培养上清浓缩10倍，使用该浓缩后的样品，通过抗FLAG抗体(和光)，进行了蛋白质印迹。
[0112]图5表示:蛋白质印 迹的结果。如图所示，可知各整联蛋白α 4突变体被分泌到培养上清中。
[0113](实施例3)整联蛋白α4突变体与整联蛋白α 4配体的结合力
[0114]通过配体固相ELISA，研究了上清中的整联蛋白α 4突变体与整联蛋白α 4的配体是否具有结合力。将作为整联蛋白α 4的配体即人OPN RAA Nhalf蛋白(Kon，S.等人，(2002) J.Cell.Biochem.,84:420-432)或作为对照的 BSA，以 10 μ g / mL 的浓度在 4°C下固相一夜，利用1%的BSA / PBS封闭之后,添加了与实施例2中使用的样品相同的10倍浓缩后的培养上清。在4°C下反应I小时后，添加抗FLAG抗体(和光)和抗小鼠IgG(株式会社免疫生物研究所)的混合物之后，在4°C下使其反应30分钟。清洗后，使用TMB液(DAKO)使其显色，并分析了结合力。
[0115]结果如图6所示。除了 9-5-4以外的所有的突变体均与作为整联蛋白α 4的配体即人OPN RAA Nhalf蛋白具有结合力。由蛋白质印迹的结果，推测出其原因如下:9_5_4突变体并不是没有结合力，而是由于其在培养上清中的分泌量少。
[0116](实施例4)内源性1-2-1突变体的表达分析
[0117](I)抗1-2-1突变体抗体的制备
[0118]以1-2-1突变体特异性氨基酸序列即GSISKYRART(序列号15)作为抗原，制备兔多克隆抗体，并进行了内源性1-2-1突变体的表达分析。具体而言，对1-2-1突变体特异性氨基酸序列即GSISKYRART序列(序列号15)进行牛甲状腺球蛋白的载体导入，对兔进行了免疫。使用结合了 GSISKYRART肽(序列号15)的巯基琼脂糖珠粒(GE)来纯化抗血清，并得到了抗1-2-1突变体抗体。[0119](2)培养上清的制备
[0120]在COSl细胞(ATCC、CRL-1650)中的一过性的α 4整联蛋白突变体(1_2_1突变体)的过表达是通过如下方式进行的:使用脂质体2000 (InvitiOgen)，将实施例2中制备的1-2-1突变体的表达载体导入到COSl细胞(ATCC、CRL-1650)中。用DMEM(无血清)继续培养两天，回收了培养上清和细胞。将培养上清用Vivaspin(GE)进行10倍浓缩，并在蛋白质印迹中使用。另外，将Jurkat细胞(ATCC、TIB-152)和Rec-1细胞(ATCC、CRL-3004)在TIL培养基(株式会社免疫生物研究所)中进行无血清培养，将三天后的培养上清用Vivaspin浓缩20倍,并在蛋白质印迹中使用。
[0121](3)通过蛋白质印迹法进行的表达确认
[0122]在SDS-PAGE后，将蛋白质印迹转移到immobilon-P膜(Millipore)上。由于所有的α 4突变体中都带有FLAG标签，所以在COS细胞中的整联蛋白α 4突变体(1_2_1突变体)的表达，用抗FLAG抗体(和光)进行了印迹。另外，内源性整联蛋白α4突变体(1_2_1突变体)的表达，使用通过上述方法制备的抗1-2-1突变体抗体进行了印迹。发光、检测使用了 ECL-pIus (PERKIN ELMER)。
[0123]根据蛋白质印迹法的结果，在Rec-1细胞(ATCC、CRL_3004)中，在与导入了 1-2-1突变体的COS细胞的培养上清相同的位置上确认出谱带(图7)。即、这表示在Rec-1细胞中，内源性1-2-1突变体以蛋白水平进行表达和分泌。
[0124](实施例5)1-2-1突变体的由整联蛋白α 4、整联蛋白α 9介导的细胞粘附抑制功倉泛
[0125](I)GST融合1-2-1突变体蛋白的制备
[0126]为了分析1-2-1突变体的功能，使其以GST融合蛋白的方式在大肠杆菌中表达，通过使用谷胱甘肽琼脂糖的常规方法进行了`纯化。为了用大肠杆菌制备整联蛋白α4突变体(1-2-1突变体)蛋白，将1-2-1突变体重组到pGEX6P-l (GE)中。使用设计成使1_2_1的N末端的信号序列缺失的5’端引物(5’ -GAGGAATTCTACAACGTGGACACTGAGAG-3’:序列号35)和 3’ 端引物(5，-CGTCTCGAGTTATGTCCTAGCTCTGTACTTGC-3’:序列号 36)，以 1_2_1 突变体表达载体为模板，进行了 PCR。用EcoRI和XhoI限制酶消化PCR产物之后，将其插入到PGEX6P-1载体中，以使结构与GST部一致。利用测序确认了序列。将本质粒转化成大肠杆菌，使其在含有氨苄西林的LB培养基中、在37°C下增殖，在对数增殖期于20°C下培养I小时后，添加异丙基_β -硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)，使其最终浓度达到0.3mM，在20°C下进行一夜的后培养。回收大肠杆菌，将其悬浮在NETN150(20mM的Tris-HCl (pH8.0)、150mM的NaClUmM的EDTA、0.5%(v / v)NP-40)之后，使用超声波破碎机对大肠杆菌进行了超声处理。向离心后的上清中添加谷胱甘肽珠粒(GE)，在4°C下旋转一夜。通过离心回收珠粒，用 NETN100(20mM 的 Tris-HCl(pH8.0)、IOOmM 的 NaCl、ImM 的 EDTA、0.5%(v / v)NP-40)清洗三次后，利用洗脱液(20mM的还原型谷胱甘肽(Sigma)、IOOmM的Tris-HCl (pH8.8))进行洗脱。所得到的GST融合1-2-1突变体蛋白用PBS进行透析后，利用蛋白浓度测定试剂盒(BioRad)进行了定量。
[0127](2)表达整联蛋白α 4或整联蛋白α 9的CHO细胞(分别称作“ma4 / CHO”或“ma9 / CH0")的制备方法
[0128]小鼠a 4整联蛋白(在本说明书中称作“ma 4”)表达载体以如下方式进行制备:使用 ma 4-Fw 引物(5，-CGAGGATCCTGAATGTTCTCCACCAAGAGC-3’:序列号 37)和 ma 4-RV引物(5 ’ -TTACTCGAGACGGGTCTTCTGAACAGGATT-3 ’:序列号38)，以小鼠黑色素瘤细胞株B16-F10(ATCC、CRL-6475)为模板，进行PCR，用限制酶BamHI和XhoI切断了 PCR产物之后，将其克隆到pcDNA3.1载体(Invitrogen)中，从而制备了小鼠α 4整联蛋白表达载体。
[0129]小鼠α 9整联蛋白(在本说明书中称作“ma 9”)表达载体，通过以下的方法来构建。使用 ma 9-Fw 引物(5，-GCTAAGCTTCTCTCGACTGTAGCCCATCG-3’:序列号 39)和 ma 9-RV弓丨物(5’-CCATCTAGAGCAACTGCTGAGAGGAAA CC-3’:序列号40)，以由小鼠胎盘制备的cDNA为模板，进行PCR，使用TOPO克隆试剂盒(Invitrogen)，首先进行了克隆(m a 9/T0P0)。通过测序确认小鼠a 9整联蛋白序列之后，为了制备附加了 FLAG标签的m a 9整联蛋白表达载体，使用 ma 9-Fw 引物和 ma 9-FLAG-RV 引物(5，-CTGTCTAGATTACTTGTCATCGTC ATCCTTGTAGTCCTGGTTTTTCTGGACCCAGTC-3’:序列号 41)，以 ma 9/T0P0 为模板，进行了 PCR。用限制酶HindIII和XbaI切断所得的PCR产物之后，将其插入到pcDNA3.1载体(Invitrogen)中，从而制备了小鼠α9整联蛋白表达载体。
[0130]针对小鼠α 4整联蛋白和α 9整联蛋白分别构建的载体，通过测序法进行了序列的确认。使用脂质体2000 (Invitrogen)，对CHO-Kl细胞(ATCC，CCL-61)进行各基因导入，利用含有作为抗生素的lmg/mL的G418 (PAA)的DMEM、10%的FCS进行选择后，再进行有限稀释，并进行了单菌落中的小鼠α4整联蛋白、小鼠α9整联蛋白的表达确认。小鼠α4整联蛋白的表达，通过抗小鼠α4整联蛋白抗体(Rl-2) (Biolegend)并通过流式细胞仪进行分析，而小鼠α 9整联蛋白的表达，通过使用抗FLAG抗体(和光)的蛋白质印迹来进行确认，将表达最高的克隆用于细胞粘附抑制活性试验。
[0131](3)细胞粘附抑制活性试验
[0132] 使用所得到的纯化GST融合1-2-1突变体蛋白(1_2_1 / GST)，进行了细胞粘附抑制试验。当进行细胞粘附试验时，作为各种整联蛋白配体，使用了使各种细胞外基质蛋白的功能位点的肽、具体地说是以下的肽与BSA结合而得到的产物:所述肽是5μ g / mL的GRGDS(序列号42)肽(αν整联蛋白等RGD依赖性整联蛋白介导的细胞粘附用肽:阴性对照)、10yg / mL的SVVYGLR (序列号20)肽(0ΡΝ的功能肽，通过与整联蛋白α 4、整联蛋白α 9结合而表现出细胞粘附力)、10 μ g / mL的QDHSFSIVIETVQ(序列号21)肽(pp-vWF的功能肽，通过与整联蛋白α 4、整联蛋白α 9结合而表现出细胞粘附力)。
[0133]将偶联有BSA的细胞外基质蛋白的功能位点的肽在4°C下放置一夜进行固相。利用含有0.5%BSA的DMEM培养基封闭I小时之后，添加表达α 4整联蛋白、α 9整联蛋白的CHO细胞和1-2-1 / GST蛋白(最终浓度分别为6.25 μ g / mL、12.5 μ g / mL和25 μ g /mL)的混合物，在CO2培养箱内、于37°C下培养I小时。用PBS去除非粘附细胞，并利用含有0.5%结晶紫的20%甲醇固定了粘附细胞，并使其染色。通过用20%的乙酸进行转溶，使用免疫读数仪测定595nm处的吸光度，由此研究了细胞粘附抑制效果。
[0134](4)结果
[0135]虽然1-2-1 / GST蛋白对RGD依赖性细胞粘附完全不具有抑制能力，但其浓度依赖性地抑制与整联蛋白α4、整联蛋白α9具有结合力的SVVYGLR(序列号20)肽或QDHSFSIVIETVQ (序列号21)肽依赖性的细胞粘附(图8)。即、可知1_2_1 / GST蛋白具有同时抑制整联蛋白α 4、整联蛋白α 9介导的细胞粘附的功能。另外，还同样测定了纤连蛋白EIIIA的粘附抑制活性，其结果为，1-2-1 / GST蛋白具有同时抑制整联蛋白α 4、整联蛋白α 9介导的细胞粘附的功能(未图示)。已知OPN与动脉硬化、心肌梗塞、癌转移和炎症性疾病有关。由于本发明的ITG-a 4突变体能够抑制OPN和整联蛋白a 4及整联蛋白a 9两者介导的粘附，所以表现出其能够成为这些疾病的更有效的治疗药。另外，已知PP-vWF与血栓、血小板功能、炎症等有关。由于本发明的ITG a 4突变体能够抑制pp-vWF和整联蛋白a 4及整联蛋白a 9两者介导的粘附，所以表现出其能够成为炎症性疾病(特开2005-298336)等的更有效的治疗药。并且，已知纤连蛋白EIIIA(别名为EDA)与癌症(Clin.Chim.Acta.(2006)372:83-93)有关。由于本发明的ITG α 4突变体能够抑制纤连蛋白EIIIA和整联蛋白α 4及整联蛋白α 9两者介导的粘附，所以表现出其能够成为更有效的癌症的治疗药或癌转移抑制剂。
[0136](实施例6)整联蛋白α4突变体1_2_1蛋白的EAE抑制效果
[0137]使用EAE模型，对1-2-1 / GST蛋白的抑制病情恶化的效果进行了研究。EAE模型为，在SJL / J小鼠(日本Charles River)的尾根部皮下给予200 μ g的PLP139-151肽(序列:HSLGKWLGHPDKF:序列号43)和CFA的乳剂，同一天静脉内注射400ng百日咳毒素(ListBiological Laboratories),并且两天后再静脉内注射400ng百日咳毒素,从而使其发病。在给予PLP139-151肽的前一天，腹腔内给予50yg的1-2-1 / GST蛋白或GST蛋白(阴性对照)。以如下方式，对EAE的临床分数进行打分。0.无症状；1.尾部麻痹；2.运动失调；3.后肢轻度麻痹；4.后肢麻痹；5.四肢麻痹且尿失禁；6.频临死亡；7.死亡。1-2-1 /GST蛋白对EAE影响的研究的日程如图9所示。
[0138]进行本研究的结果为，发现1-2-1 / GST蛋白表现出发病日(开始发病)的延迟、以及戏剧性地抑制EAE分数(图9)。由于EAE模型是多发性硬化症的模型，所以由本实验的结果显示:本发明的ITG- a 4突变体可以作为多发性硬化症的治疗药或预防药。
【权利要求】
1.一种整联蛋白α 4突变体，其具有人整联蛋白α 4的一部分胞外区。
2.根据权利要求1所述的肽，其中，人整联蛋白α4的胞外区包含:来自人整联蛋白α 4的β-螺旋桨结构域的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的肽，其中，人整联蛋白α4的胞外区是选自序列号9和序列号11~14中的一个序列。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的肽,其特征在于,选自序列号15~19中的一个序列与人整联蛋白α 4的胞外区的C末端结合,所述人整联蛋白ct4具有序列号10的序列。
5.一种肽，所述钛具有选自序列号4~9中的一个序列。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的肽，其中，所述肽与整联蛋白α4的配体结合、并且/或者抑制整联蛋白α4与其配体的结合。
7.根据权利要求6所述的肽，其中，整联蛋白α4的配体是选自血管细胞粘附分子1、纤连蛋白、连接粘附分子2、粘膜地址素细胞粘附分子1、人淋巴细胞表达金属蛋白酶样解联蛋白样富含半胱氨酸的蛋白家族成员L、血管性血友病因子和骨桥蛋白中的一种物质。
8.根据权利要求6所述的肽，其中，整联蛋白α4的配体是血管性血友病因子或ΟΡΝ。
9.根据权利要求6所述的肽，其中，整联蛋白α4的配体是具有序列号20或21的氨基酸序列的肽。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的肽，其中，所述肽进一步与整联蛋白α9的配体结合、并且/或者抑制整联 蛋白α9与其配体的结合。
11.根据权利要求10所述的肽，其中，整联蛋白α9的配体是选自血管细胞粘附分子1、纤连蛋白、连接粘附分子2、粘膜地址素细胞粘附分子1、人淋巴细胞表达金属蛋白酶样解联蛋白样富含半胱氨酸的蛋白家族成员L、血管性血友病因子和骨桥蛋白中的一种物质。
12.根据权利要求10所述的肽，其中，整联蛋白α9的配体是血管性血友病因子或OPN。
13.根据权利要求10所述的肽，其中，整联蛋白α9的配体是具有序列号20或21的氨基酸序列的肽。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的肽，其中，所述肽是可溶性肽。
15.一种药物组合物，其含有权利要求1至14中任一项所述的肽作为有效成分。
16.一种抗体，所述抗体能特异性地识别权利要求1至14中任一项所述的肽。
17.根据权利要求16所述的抗体，其中，所述抗体不识别整联蛋白α4。
【文档编号】A61P13/12GK103619874SQ201280032210
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2012年6月28日 优先权日:2011年6月30日
【发明者】清藤勉, 今重之 申请人:株式会社免疫生物研究所, 株式会社遗传科技