用于增加胰岛素敏感性和治疗糖尿病的方法
【专利摘要】本文描述了用于增加胰岛素敏感性和用于治疗糖尿病(I型和II型)的方法。本文还描述了用于增加受试者中褐色脂肪的量和用于治疗代谢性病症包括肥胖的方法。
【专利说明】用于增加胰岛素敏感性和治疗糖尿病的方法
[0001]相关申请的交叉引用
本申请要求于2011年6月17日提交的美国临时申请号61/498，202和于2011年9月30日提交的美国临时申请号61/541，686的权益；所述申请各自的内容通过引用以其整体特别地结合到本文中。
_2] 发明背景
糖尿病(“糖尿病”)是一种慢性代谢性疾病，其特征在于胰岛素产生不足(I型糖尿病)或对所产生胰岛素的反应缺陷(II型糖尿病)所导致的高血糖水平。糖尿病影响着数百万的个体，是一个遍及全世界的主要公共健康问题。
[0003]I型糖尿病特征在于产胰岛素细胞的丧失，这导致胰岛素缺乏。I型糖尿病通常是T细胞介导的对胰腺β细胞的自身免疫攻击的结果，代表了大多数儿童糖尿病病例。目前尚不知I型糖尿病的治愈方法，而I型糖尿病患者通常通过饮食和胰岛素注射控制其症状。[0004]在美国，大多数糖尿病患者患有II型糖尿病。II型糖尿病特征在于胰岛素抵抗，并且伴随肥胖。II型糖尿病患者显示一系列的代谢性病症，其常常促成心血管疾病、中风、视网膜病变、神经病、肾病和肝病的发展。与I型糖尿病一样，尚不知II型糖尿病的治愈方法，而II型糖尿病患者必须通过饮食和运动控制其症状。
[0005]因此，存在对可增加糖尿病个体中胰岛素敏感性的方法的极大需求。这类方法可用于恢复II型糖尿病个体的胰岛素敏感性和增加许多I型糖尿病患者中保留的少量胰岛素的活性。因此这类方法可用于治疗I型和II型糖尿病两者。
[0006]发明概沭
在一些实施方案中，本文描述了在受试者中增加胰岛素敏感性、预防或治疗糖尿病(例如，I型或II型糖尿病)、增加褐色脂肪水平、预防或治疗代谢性病症(例如，肥胖)、促进体重减轻、治疗高脂血症和/或治疗心血管和血管疾病的方法。在一些实施方案中，受试者患有或易患糖尿病、代谢性病症和/或肥胖。
[0007]在一些实施方案中，所述方法包括给予受试者激肽释放酶家族肽酶或其生物学活性片段。在某些实施方案中，激肽释放酶家族肽酶或其生物学活性片段具有与选自SEQ IDNO: 1-41的序列(例如，SEQ ID NO: 1、12或38)至少70%同一性的氨基酸序列。
[0008]在一些实施方案中，激肽释放酶家族肽酶或其生物学活性片段通过给予受试者包含治疗量的分离的激肽释放酶家族肽酶或其生物学活性片段的药物组合物而给予。
[0009]在一些实施方案中，激肽释放酶家族肽酶或其生物学活性片段通过给予受试者表达激肽释放酶家族肽酶或其生物学活性片段的重组细胞群而给予。在某些实施方案中，重组细胞群包括T细胞、T细胞前体、B细胞、B细胞前体、骨髓干细胞、胚胎干细胞、诱导胚胎干细胞、外周血干细胞或其组合。在一些实施方案中，所述细胞群最初从受试者中衍生。
[0010]在某些实施方案中，所述方法包括以下步骤:给予受试者增加受试者中激肽释放酶家族肽酶(例如，Klkl、Klk2、Klk3、Klk4、Klk5、Klk6、Klk7、Klk8、Klk9、KlklO、Klkll、Klkl2、Klkl3、Klkl4或Klkl5)表达的药剂。在一些实施方案中，所述药剂为小分子、多肽、抗体或抑制性RNA分子(例如，Rheb特异性抑制性RNA分子)。在某些实施方案中，给予受试者已经用核酸分子转染的细胞，所述核酸分子增加细胞激肽释放酶家族肽酶的表达。在一些实施方案中，所述方法包括转染细胞的步骤。
[0011]在一些实施方案中，所述方法包括给予受试者Rheb表达或活性降低的一种或多种重组细胞(例如，与同一类型和/或来自同一物种的非重组细胞相比，该一种或多种细胞的Rheb表达或活性降低)。在某些实施方案中，将所述一种或多种重组细胞中的Rheb基因或Rheb启动子突变或敲除。在一些实施方案中，一种或多种重组细胞中的Rheb基因或Rheb启动子二者均被突变或敲除。在一些实施方案中，该一种或多种重组细胞表达Rheb特异性抑制性RNA分子(例如，siRNA分子、shRNA分子或微RNA分子)。
[0012]在一些实施方案中，所述一种或多种重组细胞包括T细胞、T细胞前体、B细胞、B细胞前体、骨髓干细胞、胚胎干细胞、诱导胚胎干细胞、外周血干细胞或其组合。在某些实施方案中，所述一种或多种重组细胞与受试者同源。在一些实施方案中，所述一种或多种重组细胞从受试者的一种或多种非重组细胞产生。
[0013]在某些实施方案中，所述方法还包括从受试者获取一种或多种非重组细胞的步骤和/或将一种或多种非重组细胞转化为一种或多种重组细胞的步骤。在一些实施方案中转化通过(例如,使用本领域已知的标准重组技术)突变一种或多种非重组细胞中的Rheb基因或Rheb启动子进行，从而产生Rheb表达降低的一种或多种重组细胞。在一些实施方案中，转化步骤通过向一种或多种非重组细胞中引入Rheb特异性抑制性RNA分子表达载体进行。
[0014]在一些实施方案中，本文描述了用于确定测试化合物是否为可能的用于增加胰岛素敏感性、治疗糖尿病(例如，I型糖尿病或II型糖尿病)、增加褐色脂肪水平和/或治疗代谢性病症(例如肥胖)的治疗剂的方法。
[0015]在一些实施方案中，所述方法包括以下步骤:(a)使细胞(例如小鼠细胞或人细胞，例如T细胞)与测试化合物接触和(b)检测细胞的激肽释放酶家族肽酶(例如，Klklb22、Klkl或Klkl2)表达，其中导致激肽释放酶家族肽酶表达增加的测试化合物为可能的治疗剂。在某些实施方案中，通过检测激肽释放酶家族肽酶mRNA而检测激肽释放酶家族肽酶的表达。在一些实施方案中，通过检测激肽释放酶家族肽酶蛋白而检测激肽释放酶家族肽酶的表达。在一些实施方案中，将激肽释放酶家族肽酶与可检测部分连接，并且通过检测可检测部分而检测激肽释放酶家族肽酶的表达。
[0016]在一些实施方案中，所述方法包括以下步骤:(a)使细胞(例如，人细胞或小鼠细胞，例如T细胞)与测试化合物接触，其中该细胞包含与激肽释放酶家族肽酶基因的启动子(例如，Klklb22、Klkl或Klkl2启动子)操作性连接的编码可检测部分的核酸序列，和(b)检测细胞的可检测部分的表达，其中导致可检测部分的表达增加的测试化合物为可能的治疗剂。
[0017]附图简沭
图1显示Rhebfim⑶4cre小鼠和野生型(WT)小鼠的中值体重。
[0018]图2显示Rhebfim CD4cre小鼠和野生型小鼠的体脂分析。
[0019]图3显示Rhebfim⑶4cre小鼠和野生型小鼠的葡萄糖摄取和胰岛素敏感性。
[0020]图4显示Rhebfim⑶4cre小鼠和野生型小鼠的血清甘油三酯和血清高密度脂蛋白水平。[0021]图5显示Rhebfim CD4cre小鼠和野生型小鼠的食物消耗。
[0022]图6显示使用18-F-FDG质子发射断层扫描成像测定的Rhebfl/fCD4cre小鼠和野生型小鼠中葡萄糖的组织摄取。
[0023]图7显示Rhebfim CD4cre小鼠和野生型小鼠肝中BMP7、成纤维细胞生长因子_21和乙酰-CoA硫酯酶的表达。
[0024]图8显示从RhebfimCD4cre小鼠或野生型小鼠分离的T细胞中L-乳酸的产生。
[0025]图9显示RhebfimCD4cre小鼠和野生型小鼠的呼吸交换率。
[0026]图10显示经受从Rhebfim OTkre小鼠或野生型小鼠分离的骨髓的骨髓移植的受辐照野生型小鼠的体重变化。
[0027]图11显示接受RhebfimCD4cre小鼠或野生型小鼠的T细胞移植的RAGV〃小鼠的葡萄糖摄取。
[0028]图12显示糖尿病小鼠在接受来自RhebfimCD4cre小鼠或野生型小鼠的T细胞之前和之后的胰岛素敏感性。
[0029]图13显示给予取自RhebfimCD4cre小鼠或野生型小鼠的血清后野生型小鼠的葡萄糖摄取。
[0030]图14显示人激肽释放酶家族肽酶的氨基酸序列。
[0031]图15显示小鼠激肽释放酶家族肽酶的氨基酸序列。
[0032]图16显示人激肽释放酶家族肽酶的核酸序列。
[0033]图17显示小鼠激肽释放酶家族肽酶的核酸序列。
[0034]图18A-18B显示Klklb22对响应胰岛素剂量反应的胰岛素受体磷酸化(图18A)和延长的胰岛素受体磷酸化(图18B) 二者的增强作用。
[0035]发明详沭 1.总述
本文描述了用于在受试者中增加胰岛素敏感性和/或褐色脂肪水平和用于治疗和预防多种疾病和病症(包括糖尿病、代谢性病症和肥胖)的组合物和方法。本文还描述了用于鉴定另外的可用于本文所述方法的治疗剂的组合物和方法。
[0036]糖尿病是遍及全世界的一个重要的健康问题。由于胰岛素产生减少(I型糖尿病)或由于胰岛素敏感性降低(II型糖尿病)，糖尿病患者不能调节其血糖水平。严重的糖尿病相关长期并发症包括心血管疾病、慢性肾衰竭和视网膜损伤。
[0037]在某些实施方案中，本文提供了用于增加胰岛素敏感性的方法和组合物。这些方法和组合物可用于治疗I型糖尿病和II型糖尿病两者。例如，使用本文所述组合物和方法对I型糖尿病患者的治疗增加了该糖尿病受试者产生的低水平胰岛素的效能，而对II型糖尿病患者的治疗恢复了其细胞的胰岛素敏感性。此外，本文所述组合物和方法可与胰岛素或胰岛素类似物的给予结合，以便增加胰岛素功效并降低达到治疗效果所需的剂量。
[0038]在一些实施方案中，通过给予激肽释放酶家族肽酶或其生物学活性片段在受试者中达到治疗效果(例如增加胰岛素敏感性、预防和/或治疗糖尿病、增加褐色脂肪水平、预防和/或治疗代谢性病症、预防和/或治疗肥胖、增加体重减轻、预防和/或治疗高脂血症、治疗和/或预防心血管和血管疾病)。在其它实施方案中，通过给予增强激肽释放酶家族肽酶表达或活性的治疗剂达到治疗效果。[0039]肽酶的激肽释放酶家族是高度保守的丝氨酸蛋白酶的多基因家族。SEQ ID NO:1-15和图14中提供了人激肽释放酶家族肽酶的氨基酸序列。SEQ ID NO: 16-41和图15中提供了小鼠激肽释放酶家族肽酶的氨基酸序列。SEQ ID NO: 42-56和图16中提供了人激肽释放酶家族肽酶的核酸序列。SEQ ID NO: 57-82和图17中提供了小鼠激肽释放酶家族肽酶的核酸序列。如本文所述，受试者中激肽释放酶家族肽酶水平的增加导致胰岛素敏感性增加、葡萄糖摄取增加和褐色脂肪水平增加。因此，给予激肽释放酶家族肽酶或增加激肽释放酶家族肽酶表达或活性的药剂可用于治疗糖尿病和代谢性病症，包括肥胖。
[0040]在一些实施方案中，通过给予Rheb表达或活性降低的一种或多种重组细胞(例如，淋巴细胞,例如T细胞或淋巴细胞前体,例如造血干细胞)在受试者中达到治疗效果(例如增加胰岛素敏感性、预防和/或治疗糖尿病、增加褐色脂肪水平、预防和/或治疗代谢性病症、预防和/或治疗肥胖、增加体重减轻、预防和/或治疗高脂血症、治疗和/或预防心血管和血管疾病)。Rheb是mTOR信号传导通路的小GTP酶成员，在调节细胞增殖和存活中发挥关键作用。G1:100913214提供了人Rheb mRNA序列，G1:5032041提供了人Rheb蛋白序列，其各自通过引用结合。G1: 133893211提供了小鼠Rheb mRNA序列，而G1: 28626508提供了小鼠Rheb蛋白序列，其各自通过引用结合。
[0041]I1.定义
为了使本发明可被更容易地理解，首先定义某些术语。另外的定义贯穿整个详述说明。
[0042]本文使用冠词“一个”和“一种”是指一个或多于一个(即至少一个)该冠词语法上的对象。例如，“一种要素”意指一种要素或多于一种的要素。
[0043]如本文所使用的，术语“给予”意指向受试者提供药剂(例如激肽释放酶家族肽酶或增加激肽释放酶家族肽酶表达或活性的药剂)或组合物，包括，但不限于，由医学专业人员给予和自己给予。
[0044]本文使用的术语“药剂”指化合物、小分子、化合物的混合物、生物大分子(例如核酸、抗体、蛋白或其部分)或由生物学材料例如细菌、植物、真菌或动物(特别是哺乳动物)细胞或组织制备的提取物。药剂可通过下文所述筛选测定法鉴定为具有特定活性(例如，增加胰岛素敏感性)。这些药剂的活性可使其适于作为“治疗剂”，即在受试者局部或全身发挥作用的一种或多种生物学、生理学或药理学活性物质。
[0045]术语“氨基酸”意在包括所有分子，不论天然的或合成的，其包含氨基官能性和酸官能性两者，并且能包含在天然存在氨基酸的聚合物中。示例性氨基酸包括天然存在的氨基酸及其类似物、衍生物和同源物、具有不同侧链的氨基酸类似物和上述任一的所有立体异构体。
[0046]术语“生物学活性片段”指保留完整激肽释放酶家族肽酶的生物学活性(例如增加胰岛素敏感性的能力)至少一部分的激肽释放酶家族肽酶片段。
[0047]如本文所使用的， 术语“糖尿病”是指多种众所周知的病况。定义胰岛素抵抗为这样的状态，其中需要超过对葡萄糖负荷的正常反应的循环胰岛素水平来维持血糖正常状态(Ford E S，等JAMA.(2002) 287:356-9，通过引用明确地结合)。胰岛素抵抗，以及具有胰岛素抵抗的受试者对治疗的反应可通过评估胰岛素抵抗的稳态模型评估(HOMA-1R)得分而定量化，该得分为胰岛素抵抗的可靠指标(Katsuki A,等Diabetes Care 2001;24:362-5,通过引用明确地结合)。通过稳态评估模型(HOMA) -1R评分对胰岛素抵抗进行估测用下式计算(Galvin P,等Diabet Med 1992;9:921-8):HOMA_IR=[空腹血清胰岛素(yU/mL)]X[空腹血浆葡萄糖(mmol/L)/22.5]。具有发展葡萄糖耐量降低(IGT)或2型糖尿病倾向的受试者为血糖正常且伴随高胰岛素血症的那些，其在定义上是胰岛素抵抗的。具有胰岛素抵抗的典型受试者常常超重或肥胖。术语“糖尿病前期(pre-diabetes) ”为其中个体易发展2型糖尿病的情况。糖尿病前期将葡萄糖耐量降低的定义延伸至包括空腹血糖在高的正常范围 100 mg/dL 内(J.B.Meigs,等 Diabetes 2003; 52:1475-1484，通过引用明确地结合)和具有空腹高胰岛素血症(血浆胰岛素浓度提高)的个体。将糖尿病前期鉴定为严重健康威胁的科学和医学依据在由美国糖尿病协会和国家糖尿病、消化和肾脏疾病研究所联合发布的名为“2型糖尿病的预防或延误”(Diabetes Care 2002; 25:742-749,通过引用明确地结合)的立场声明(position statement)中展示。可能具有胰岛素抵抗的个体为具有两种或更多种以下属性的那些:1)超重或肥胖，2)高血压，3)高脂血症，4) 一个或多个一级亲属诊断有IGT或2型糖尿病。可通过计算HOMA-1R得分确认这些个体的胰岛素抵抗。可将胰岛素抵抗定义为这样的临床情况，其中个体的HOMA-1R得分>4.0或HOMA-1R得分超过实验室进行葡萄糖和胰岛素测定所定义的上限。定义2型糖尿病为这样的情况，其中受试者的空腹血糖或血清葡萄糖浓度大于125 mg/dl (6.94 mmol/L)。此外,在本发明一些实施方案中可根据对胰岛素受体磷酸化调节(例如，胰岛素受体磷酸化增加)和/或延长的胰岛素受体磷酸化的测量结果测量或实现糖尿病的治疗、预防或诊断。
[0048]术语“分离的多肽”是指在某些实施方案中从重组DNA或RNA制备的多肽、或合成来源的多肽，或其某些组合，其(I)与自然界中通常与其一起存在的蛋白不相关，(2)从其通常存在的细胞中分离，⑶不含同一细胞来源的其它蛋白而分离，⑷由来自不同物种的细胞表达，或(5)在自然界中不存在。
[0049]术语“代谢性病症”包括受试者中异常代谢(即，为生命过程和活动提供能量的活细胞的化学变化)所导致的或以所述异常代谢为特征的病症、疾病或病况。代谢性病症包括产热异常或脂肪细胞(例如，褐色或白色脂肪细胞)内含物或功能异常相关的疾病、病症或病况。代谢性病症可有害地影响细胞功能(例如细胞增殖、生长、分化或迁移、稳态的细胞调节、细胞间或细胞内通讯)、组织功能(例如肝功能、肌肉功能或`脂肪细胞功能)、生物的全身反应例如激素反应(例如胰岛素反应)。
[0050]代谢性病症的实例包括肥胖(包括胰岛素抵抗性肥胖)、非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM或II型糖尿病)、胰岛素依赖型糖尿病(IDDM或I型糖尿病)、II型糖尿病、胰岛素抵抗例如葡萄糖耐量降低、葡萄糖耐受不良、动脉粥样硬化、动脉粥样化疾病、心脏病、高血压、中风、X综合征、饮食过多、内分泌异常、甘油三酯贮积病、Bardet-Biedl综合征、Lawrence-Moon 综合征、Prader-Labhart-ffi 11 i 综合征、维尔纳氏综合征(Werner’ ssyndrome)、脂质生物合成、脂质转运、甘油三酯水平、血浆水平和血浆胆固醇相关的功能障碍、闻脂血症、游尚脂肪酸提闻、闻胆固醇血症、闻甘油二酷血症、低密度脂蛋白_ (LDL)-胆固醇提高、极低密度脂蛋白-(VLDL)-胆固醇提高、中间密度脂蛋白-(IDL)-胆固醇提高或高密度脂蛋白-(HDL)-胆固醇减少相关的血脂障碍。如果代谢性病症(例如，糖尿病和/或肥胖)的至少一种症状被缓和、终止、减缓或防止，则代谢性病症(例如，糖尿病和/或肥胖)被“治疗”。如本文所使用的，如果代谢性病症(例如，糖尿病和/或肥胖)的复发或转移被减轻、减缓、延迟或防止，则代谢性病症(例如，糖尿病和/或肥胖)也被“治疗”。[0051]此外，代谢性病症与一种或多种离散表型相关。例如，定义受试者的身体质量指数(BMI)为体重(千克)除以身高(米)的平方，使得BMI单位为kg/m2。在一些实施方案中，定义肥胖为其中个体的BMI等于或大于30 kg/m2的情况。在另一个方面，术语肥胖用于指内脏肥胖，在一些实施方案中其可被定义为男性腰臀比1.0或女性腰臀比0.8，这在另一方面定义了胰岛素抵抗和发展糖尿病前期的风险。在一个实施方案中，定义血糖正常为其中受试者的空腹血糖浓度在大于70 mg/dl (3.89 mmol/L)并小于110 mg/dl (6.11 mmol/L)的正常范围内的情况。词语空腹具有作为医学术语的通常含义。在一个实施方案中，定义葡萄糖耐量降低(IGT)为其中受试者的空腹血糖浓度或空腹血清葡萄糖浓度大于110 mg/dl并小于126 mg/dl (7.00 mmol/L)或餐后2小时血糖或血清葡萄糖浓度大于140 mg/dl(7.78 mmol/L)并小于200 mg/dl (11.11 mmol/L)的情况。术语葡萄糖耐量降低还意在适用于空腹葡萄糖降低的情况。在一个实施方案中，定义高胰岛素血症为这样的情况，其中具有胰岛素抵抗、血糖正常或不正常的受试者的空腹或餐后血清或血浆胰岛素浓度高于无胰岛素抵抗、腰臀比〈1.0 (男性)或〈0.8 (女性)的正常、瘦个体。
[0052]在一些实施方案中，“肥胖”是指身体质量指数(BMI)为30 kg/2m或更高(NationalInstitute of Health,Clinical Guidelines on the Identification, Evaluation, andTreatment of Overweight and Obesity in Adults (国立卫生研究所，鉴定、评估和治疗成年人超重和肥胖的临床指南)(1998)，通过引用明确地结合)。然而，在本发明一些实施方案中，至少部分上，还意在包括特征为身体质量指数(BMI)是25 kg/m2或更大、是26kg/m2或更大、是27 kg/m2或更大、是28 kg/m2或更大、是29 kg/m2或更大、是29.5 kg/m2或更大、是29.9 kg/m2或更大的疾病、病症或病况，通常这些均被称为超重(NationalInstitute of Health,Clinical Guidelines on the Identification, Evaluation, andTreatment of Overweight and Obesity in Adults (国立卫生研究所，鉴定、评估和治疗成年人超重和肥胖的临床指南)(1998)，通过引用明确地结合)。本文所描述的肥胖可由任何原因造成，无论是遗传还是环境的。在一个实施方案中，“预防肥胖”是指若在肥胖情况开始前给予治疗，则可预防肥胖或肥胖相关病症的发生。此外，如果治疗在已经患有或具有肥胖或肥胖相关病症症状的受试者中开始，期望这样的治疗防止肥胖或肥胖相关病症或防止肥胖或肥胖相关病症的进展。
[0053]术语“肥胖相关病症”包括所有与肥胖相关或至少部分由肥胖引起的病症。肥胖相关病症包括，例如，糖尿病、心血管疾病、高血压、深静脉血栓形成、骨关节炎、阻塞性睡眠呼吸暂停、癌症和非酒精性脂肪肝病。
[0054]术语“同一性百分比”是指两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的序列同一性。同一性可各自通过比较各个序列(其经比对以用于比较目的)的位置确定。当所比较序列的对应位置被相同的碱基或氨基酸占据时，那么这些分子在该位置是同一的；当对应位置被相同或相似的氨基酸残基(例如，立体和/或电子性质相似)占据时，那么这些分子可称为在该位置同源的(相似的)。表述为同源性、相似性或同一性的百分比是指在所比较序列共享的位置同一或相似氨基酸数目的函数。可使用各种比对算法和/或程序，包括 FASTA、BLAST 或 ENTREZ。FASTA 和 BLAST 可作为 GCG 序列分析包(University ofWisconsin, Madison, ffis. )的一部分得到，并可以以例如默认设置使用。ENTREZ可通过国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)、国家医学图书馆、国立卫生研究所、Bethesda, Md得到。在一个实施方案中，两个序列的同一'丨生百分比可通过空位权重为I (例如，将每个氨基酸空位加权，就好像其为两序列之间单个氨基酸或核苷酸错配)的GCG程序确定。
[0055]Methods in Enzymology (酶学方法)，第 2册卷:Computer Methods forMacromolecular Sequence Analysis (用于大分子序列分析的计算机方法)(1996)，ed.Doolittle, Academic Press, Inc., a division of Harcourt Brace & C0., San Diego,California, USA中描述了其它用于比对的技术。优选利用允许序列中空位的比对程序来比对序列。Smith-Waterman是一类在序列比对中允许空位的算法。见Meth.Mol.Biol.70: 173-187 (1997)，通过引用结合到本文中。同样，可利用使用Needleman和Wunsch比对方法的GAP程序来比对序列。一个替代的搜索策略使用MPSRCH软件，该软件在MASPAR计算机上运行。MPSRCH在大规模并行计算机上使用Smith-Waterman算法对序列评分。该方法提高了找出远缘相关匹配的能力，并且对小空位和核苷酸序列错误尤其宽容。核酸编码的氨基酸序列可用于搜索蛋白和DNA数据库。
[0056]术语“药学上可接受的载体”为本领域所公认的，指药学上可接受的物质、组合物或溶媒，例如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或包封材料，涉及将任何本发明组合物或其组分从一个器官或身体的一部分运送或转运至另一器官或身体的另一部分。从与本发明组合物及其组分相容且对患者无害的意义上说，每个载体都必须是“可接受的”。可用作药学上可接受载体的物质的一些实例包括:(I)糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，例如玉米淀粉和土豆淀粉； (3)纤维素，及其衍生物，例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；⑷西黄蓍胶粉；(5)麦芽；(6)明胶；(7)滑石；⑶赋形剂，例如可可脂和栓剂蜡；(9)油,例如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；(10) 二醇，例如丙二醇；(11)多元醇，例如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；(12)酯，例如油酸乙酯和十二烷酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，例如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)海藻酸；(16)无热原水;(17)等渗盐水；(18)林格溶液；(19)乙醇；(20)磷酸盐缓冲液；和(21)药物制剂中使用的其它无毒相容性物质。
[0057]术语“多肽片段”或“片段”，当参照参考多肽而使用时，指这样的多肽，其中与参考多肽本身相比氨基酸残基缺失，但剩余的氨基酸序列通常与参考多肽中的相应位置同一。这样的缺失可发生在参考多肽的氨基末端或羧基末端，或者备选地，两个末端。片段通常至少5、6、7、8、9或10个氨基酸长、至少14个氨基酸长、至少20、21、22、23、24、25、26、27、
28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49 或 50 个氨基酸长、至少 75 个氨基酸长或至少 100、115、125、135、150、160、175、180、190、200、215、230、250、275、290、300、250、400、425、450、475、500或更多个氨基酸长。片段可保留参考多肽的一种或多种生物活性。在某些实施方案中，片段可包含成药区(druggable region),和任选成药区一侧或两侧的额外氨基酸，额外的氨基酸数目可为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、
15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50，或多达 100 或更多残基。此外，片段可包括特定区域的亚片段，所述亚片段保留其所来源区域的功能。在另一个实施方案中，片段可具有免疫原性。片段可在野生型蛋白的N-或C-末端缺乏约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100 或更多个氨基酸。
[0058]术语“小分子”为本领域公认的，指分子量小于约2000 amu、或小于约1000 amu以及甚至小于约500 amu的组合物。小分子可为，例如，核酸、肽、多肽、肽核酸、模拟肽、碳水化合物、脂质或其它有机(含碳)或无机分子。许多制药公司具有扩充的化学和/或生物混合物(通常为真菌、细菌或藻类提取物)文库，可用本文所述任何测定法进行筛选。术语“有机小分子”是指通常被确定为有机或药用化合物的小分子，并且不包括仅仅为核酸、肽或多肽的分子。
[0059]如本文所使用的，术语“受试者”和“多个受试者”指动物，例如哺乳动物，包括非灵长类(例如，奶牛、猪、马、驴、山羊、骆骑、猫、狗、豚鼠、大鼠、小鼠、绵羊)和灵长类(例如猴，例如食蟹猴、大猩猩、黑猩猩和人)。在一些实施方案中，受试者或患者患有代谢性病症例如肥胖。
[0060]如本文所使用的，短语“治疗有效量”和“有效量”意指包含本发明化合物的化合物、物质或组合物的量，其至少在动物的细胞亚群中以适用于任何医学治疗的合理的效益/风险比有效产生一些期需的治疗效果。
[0061]“治疗”受试者的疾病或“治疗”具有疾病的受试者是指对受试者进行药物治疗，例如给予药物，使得至少一种疾病症状减退或防止其恶化。
[0062]II1.激肽释放酶家族肽酶
如本文所使用的，术语“激肽释放酶家族肽酶”或“激肽释放酶家族成员蛋白”指氨基酸序列在SEQ ID NO: 1-41中提供的丝氨酸蛋白酶家族，及其生物学活性片段(例如至少50、
60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、225、230、235 或240个氨基酸的片段)，和其生物学活性同源变体(例如与SEQ ID NO: 1_41中所提供序列具有至少 50%、60%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的蛋白)。激肽释放酶家族成员的示例性生物学活性片段和/或同源变体可，例如，具有丝氨酸蛋白酶活性和/或增强胰岛素敏感性的能力。激肽释放酶家族成员蛋白的变体可通过标准`方法，包括定点和随机诱变产生。在一些实施方案中激肽释放酶相关肽酶为Klklb22 (SEQ ID NO: 38)或其片段或同源变体。在一些实施方案中，激肽释放酶相关肽酶为Klkl (SEQ ID NO:1)或Klkl2 (SEQ ID NO: 12)或其片段或同源变体。
[0063]激肽释放酶家族成员蛋白通常以无活性的前蛋白形式翻译，然后经蛋白水解剪切为活性蛋白(见例如，Schmaier, International Immunopharmacology 8:161—165(2008),通过引用明确地结合到本文中)。如本文使用的，术语“激肽释放酶家族肽酶”和“激肽释放酶家族成员蛋白”包括无活性的前蛋白和蛋白的活性形式两者。
[0064]激肽释放酶家族成员蛋白增强胰岛素敏感性的能力可使用本领域已知的任何方法体内或体外测定。例如，为了体外测定激肽释放酶家族成员蛋白增强胰岛素敏感性的能力，可将该蛋白添加到在培养物中生长的细胞系中，并且测量胰岛素受体响应胰岛素而随时间的磷酸化。为了体内测量激肽释放酶家族成员蛋白增强胰岛素敏感性的能力，可将该蛋白注射入动物(例如，小鼠)或在动物中表达，并且在给予葡萄糖推注或注射胰岛素后测定血液中的葡萄糖清除率。测量胰岛素敏感性的方法的非限制性实例也在下文的实施例中提供。
[0065]在某些实施方案中，本文所述蛋白进一步与异源多肽(例如，包含增加其溶解度和/或促进其纯化、鉴定、检测和/或结构表征的结构域的多肽)连接。本文所述蛋白可与至少2、3、4、5或更多个异源多肽连接。多肽可与同种异源多肽的多个拷贝连接，或可与两种或更多种异源多肽连接。融合可发生在多肽的N-末端、多肽的C-末端或多肽的N-和C-两个末端。在一些实施方案中本文所述蛋白与融合结构域之间包含接头序列以促进融合蛋白的构建或优化蛋白表达或融合蛋白的结构约束。
[0066]在另一个实施方案中,可对蛋白进行修饰使其穿过细胞膜的速率增加。例如,多肽可与促进“胞吞转运作用”(例如细胞对肽的摄取)的另一肽融合。所述肽可为HIV反式激活子(TAT)蛋白的一部分，例如与TAT残基37-62或48-60相应的片段、已经观察到在体外迅速被细胞摄取的部分(Green和Loewenstein, (1989) Cell 55:1179-1188)。或者，内化肽可来源于果蝇触角足iProsophila antennapedia)蛋白或其同源物。已经证实同源异型蛋白触角足的60个氨基酸长的同源异型结构域移位通过生物膜，并且可促进其偶联的异源多肽的移位。因此，可将多肽与由果蝇触角足的约42-58个氨基酸组成的肽或用于胞吞转运作用的更短片段融合(Derossi 等(1996) J Biol Chem 271:18188-18193; Derossi 等(1994) J Biol Chem 269:10444-10450;和Perez等(1992) J Cell Sci 102:717-722)，所有这些均通过引用结合。胞吞转运作用多肽还可为非天然存在的膜移位序列(MTS)，例如美国专利号6，248，558中公开的肽序列，所述专利通过引用结合。
[0067]IV.激肽释放酶家族肽酶表达的诱导物
本文所述某些方法涉及给予增加或降低激肽释放酶家族肽酶活性和/或表达的药剂。可用于增加激肽释放酶家族肽酶表达或活性的药剂包括抗体(例如缀合抗体)、蛋白、肽、小分子和抑制性RNA分子，例如siRNA分子、shRNA、核酶和反义寡核苷酸。这些药剂可为本文所描述的那些、本领域所已知的那些或通过常规筛选测定法(例如本文所述筛选测定法)鉴定的那些。例如，在一些实施方案中所述药剂为RheB GTP酶特异性抑制性RNA分子(例如，siRNA或shRNA分子)。
[0068]在一些实施方案中，测定法用于鉴定可用于本文所述方法的药剂。例如，本文提供了用于确定测试化合物是否为可能的用于增加胰岛素敏感性、增加褐色脂肪水平、治疗糖尿病、治疗代谢性病症或治疗肥胖的治疗剂的方法。一般而言，这些方法包括以下步骤:(a)使细胞与测试化合物接触；和(b)检测细胞的激肽释放酶家族肽酶(例如，Klklb22、Klkl或Klkl2)的表达。引起激肽释放酶家族肽酶表达增加(例如，与用安慰剂处理的细胞或未处理的细胞相比)的测试化合物为可能的治疗剂。
[0069]任何细胞均可用于上述筛选方法。例如，在一些实施方案中细胞为小鼠细胞或人细胞。在某些实施方案中细胞为T细胞或T细胞系。用于筛选的细胞可为原代细胞或细胞系。可用于本文所述筛选测定法的其它细胞系的实例包括，但不限于，293-T细胞、3T3细胞、721细胞、9L细胞、A2780细胞、A172细胞、A253细胞、A431细胞、CHO细胞、C0S-7细胞、HCA2细胞、HeLa细胞、Jurkat细胞、NIH-3T3细胞和Vero细胞。
[0070]激肽释放酶家族肽酶的表达可使用本领域已知的任何方法检测。例如，激肽释放酶家族肽酶的表达可通过使用例如可检测的标记核酸探针、RT-PCR和/或微阵列技术检测激肽释放酶家族肽酶mRNA而检测。激肽释放酶家族肽酶的表达还可通过使用例如可检测的具有激肽释放酶家族蛋白酶结合特异性的标记抗体检测激肽释放酶家族肽酶蛋白检测。 [0071]在一些实施方案中，在筛选测定法中使用已经基因工程改造的细胞以便于进行该测定。例如，在一些实施方案中，对细胞进行工程改造使得激肽释放酶家族肽酶作为与可检测部分(例如荧光部分例如GFP或发光部分例如萤光素酶)连接的异源蛋白表达。在其它实施方案中，细胞包含编码与激肽释放酶家族成员启动子操作性连接的可检测部分的核酸序列。在这样的实施方案中，直接检测可检测部分的表达，而不是检测激肽释放酶家族肽酶的表达。这样的细胞可使用本领域所熟知的标准重组技术产生。
[0072]可用于本发明方法的药剂可获自任何可用的来源，包括天然和/或合成化合物的系统文库。药剂还可通过本领域已知的组合文库方法中许多方法的任一获得，所述组合文库方法包括:生物文库、类肽文库(具有肽的功能性，但含有新的非肽主链的分子文库，其抗酶降解但仍保留生物活性，见，例如，Zuckermann等，1994，J.Med.Chem.37:2678-85,通过引用结合)、空间可寻址的平行固相或溶液相文库、需要解卷积的合成文库方法、’ 一珠一化合物’文库方法和使用亲和色谱法选择的合成文库方法。生物文库和类肽文库方法仅限于肽文库，而其它四种方法适用于肽、非肽寡聚体或化合物的小分子文库(Lam, 1997, Anticancer Drug Des.12:145,通过引用结合)。
[0073]用于合成分子文库的方法的实例可参见本领域，例如在:DeWitt等(1993) Proc.Natl.Acad.ScL U.S.A.90:6909; Erb 等(1994)/*roc.Natl.Acad.ScL USA91:11422; Zuckermann 等(1994).J.Med.Chem.37:2678; Cho 等(1993) Science261:1303; Carrell 等(1994) Angew.Chem.1nt.Ed.Engl.33:2059; Carell 等(1994) Angew.Chem.1nt.Ed.Engl.33:2061; and in Gallop 等(1994) J.Med.Chem.37:1233，所有这些均通过引用结合到本文中。
[0074]V.Rheb活性或表达降低的重组细胞
本文所述某些实施方案涉及给予Rheb表达或活性降低的一种或多种重组细胞。在某些实施方案中，Rheb表达或活性的降低水平与以下非重组细胞进行比较:与重组细胞同一类型和种类的非重组细胞。例如，重组细胞可为与非重组人T细胞相比Rheb表达降低的重组人T细胞。在某些实施方案中，自同一生物体(例如，同一个人)制备重组细胞和与其进行比较的非重组细胞。在某些实施方案中，重组细胞的Rheb表达或活性为非重组细胞Rheb表达的 75%、50%、40%、35%、50%、25%、20%、15%、10%、5%、4%、3%、2% 或 1%。可例如使用本领域已知方法(例如定量RT-PCR或 蛋白质印迹)测定Rheb的表达水平。在一些实施方案中，重组细胞无Rheb表达或活性。
[0075]可使用本领域已知的重组DNA技术降低重组细胞中的Rheb表达水平。例如，在某些实施方案中细胞内Rheb基因和/或Rheb启动子中的一个或两个被突变或敲除以产生重组细胞。在一些实施方案中，向重组细胞中引入Rheb特异性抑制性RNA表达载体，使其表达Rheb特异性抑制性RNA分子。
[0076]在一些实施方案中，重组细胞为免疫细胞或免疫细胞前体，例如淋巴细胞或淋巴细胞前体。例如，在一些实施方案中重组细胞为T细胞、T细胞前体、B细胞、B细胞前体、骨髓干细胞、胚胎干细胞、诱导胚胎干细胞、外周血干细胞或其组合。
[0077]在一些实施方案中，重组细胞与其所给予的受试者同源。与受试者同源的重组细胞可，例如，通过使用重组基因技术将获自受试者的非重组细胞转化为Rheb表达或活性减低的重组细胞而产生。
[0078]V1.药物组合物
可将本文所述药剂(例如激肽释 放酶家族肽酶、Rheb活性或表达降低的细胞和/或增加激肽释放酶家族肽酶表达或活性的药剂)掺入适合给予受试者的药物组合物中。所述组合物可包含单一的这些药剂或本文所述调节剂和药学上可接受载体的任何组合。药物组合物可进一步包含可用于治疗糖尿病或代谢性病症例如肥胖的额外药剂。
[0079]如本文所使用的，术语“药学上可接受的载体”意在包括任何和所有与药物给予相容的溶剂、分散介质、包衣剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。这类介质和剂用于药物活性物质的用途在本领域众所周知。除非到任何常规介质或剂与活性化合物均不相容的程度，否则即考虑其在组合物中的应用。还可将补充的活性化合物掺入组合物中。
[0080]本发明药物组合物配制为与其预期给药途径相容。给药途径的实例包括胃肠外例如静脉内、皮内、皮下、口服、透皮(局部)、透粘膜和直肠给药。
[0081]可通过细胞培养或实验动物中例如用于测定LD50 (50%群体致死的剂量)和ED50(50%群体中治疗有效的剂量)的标准药学程序测定本文所述药剂的毒性和治疗功效。毒性和疗效之间的剂量比为治疗指数，其可表述为LD50/ED50比率。尽管可使用显示毒性副作用的化合物，但应小心设计将这些化合物靶向至受影响组织位点的递送系统，以将对未感染细胞的潜在损伤最小化，从而减少副作用。
[0082]自细胞培养测定法和动物研究获得的数据可用于配制一系列人用剂量。这类化合物的剂量优选处于包含较小或无毒性ED50的循环浓度范围内。剂量可根据使用的剂型和利用的给药途径在此范围内变化。对于本发明的本文所述方法中使用的任何化合物，治疗有效剂量可最初从细胞培养测定法估测。可在动物模型中配制剂量以达到包含如细胞培养中所测定IC50 (即，达到症状的半最大抑制的测试化合物浓度)的循环血浆浓度范围。这些信息可用于更精确地测定人中的有用剂量。血浆中的水平可例如通过高效液相色谱法测量。
[0083]药剂的适当剂量取决于普通技术医师、兽医或研究者知识范围内的多种因素。小分子的剂量将例如根据以下而变化:根据待治疗受试者或样品的身份、大小和状况，进一步根据该组合物的给药途径(若适用)和从业医生希望该小分子对本发明核酸或多肽所具有的作用。
[0084]VI1.治疗方法
在一些实施方案中，本发明涉及用于通过给予受试者(例如，需要其的受试者)本文所述药剂(例如激肽释放酶家族肽酶、Rheb表达或活性降低的重组细胞或增加激肽释放酶家族肽酶表达的药剂)而增加胰岛素敏感性、预防或治疗糖尿病(例如，I型或II型糖尿病)、增加褐色脂肪水平、预防或治疗代谢性病症(例如肥胖)、促进体重减轻、治疗高脂血症和/或治疗心血管和血管疾病的方法。
[0085]需要其的受试者可包括，例如，已经诊断有糖尿病的受试者、已经诊断有代谢性疾病的受试者、肥胖的受试者、或已经针对代谢性疾病或糖尿病而治疗的受试者(包括难以用先前治疗而治疗的受试者)。需要其的受试者还可包括，例如，易患代谢性疾病或糖尿病的受试者(包括易患肥胖的受试者)、超重的受试者和具有代谢性疾病或糖尿病家族史的受试者。
[0086]在某些实施方案中，本文所述方法涉及糖尿病的治疗。本文所述方法可用于治疗任何形式的糖尿病,包括I型糖尿病、II型糖尿病和妊娠糖尿病。
[0087]在某些实施方案中，本文所述方法包括任何代谢性病症的治疗。在某些实施方案中，治疗的代谢性病症为肥胖、胰岛素抵抗、高胰岛素血症、低胰岛素血症(hypoinsulinemia) > II型糖尿病、高血压、高肝脂肪变性(hyperhepatosteatosis)、高尿酸血症、脂肪肝、非酒精性脂肪肝病、多囊性卵巢综合征、黑棘皮病、饮食过多、内分泌异常、甘油三酯忙积病、Bardet-Biedl 综合征、Lawrence-Moon 综合征、Prader-Labhart-Willi 综合征或肌肉发育不全。在某些实施方案中，代谢性病症为肥胖相关病症，例如糖尿病、心血管疾病、高血压、深静脉血栓形成、骨关节炎、阻塞性睡眠呼吸暂停、癌症或非酒精性脂肪肝病。
[0088]在一些实施方案中，本文所述药物组合物将掺入以足以为患者递送治疗有效量的所掺入治疗剂的量递送的治疗剂或其它物质作为预防性或治疗性治疗的一部分。活性剂的期需浓度将取决于药物的吸收、失活和排泄速率以及该化合物的递送速率。需指出的是剂量值还可随着待缓解病况的严重性而变化。应进一步理解的是对于任何特定的受试者，应根据个体需要和给予或监督给予组合物的人的专业判断随时间调整具体的剂量方案。一般地，将使用本领域技术人员已知的技术确定剂量。
[0089]本发明药剂的剂量可通过参照该药剂的血浆浓度确定。例如，可使用最大血浆浓度(Cmax)和从时间O到无穷的血浆浓度-时间曲线下面积(AUC (0_4))。用于本发明的剂量包括产生Cmax和AUC (0-4)上述值的那些和使这些参数值更大或更小的其它剂量。
[0090]可改变本发明药物组合物中活性成分的实际剂量水平，以获得对于特定患者、组合物和给药方式有效达到期需治疗反应而对患者无毒性的活性成分的量。
[0091]所选剂量水平将取决于多种因素，包括所使用特定药剂的活性、给药途径、给药时间、所使用特定化合物的排泄或代谢率、治疗持续时间、与所用特定化合物组合使用的其它药物、化合物和/或物质、待治疗患者的年龄、性别、体重、状况、一般健康和以前的病史以及医学领域众所周知的类似因素。
[0092]本领域普通技术医师或兽医可容易地确定并开出所需的药物组合物的有效量。例如，医师或兽医可开出和/或给予低于达到期需的治疗效果所需水平的组合物中所用本发明药剂的剂量，并逐步增加剂量直到`达到期需的效果。
[0093]一般而言，本文所述药剂的合适日剂量将为有效产生治疗效果的最低剂量的药剂的量。这一有效剂量将通常取决于上述因素。
[0094]在某些实施方案中，通过给予受试者表达激肽释放酶家族肽酶的细胞群而给予受试者激肽释放酶家族肽酶。在某些实施方案中，这些细胞经工程改造以表达提高水平的激肽释放酶家族肽酶。例如，可使用标准重组技术向细胞中插入转基因，所述转基因包含与组成型或有条件的启动子操作性连接的激肽释放酶家族肽酶编码核酸。或者，细胞可通过敲除内源性Rheb GTP酶基因或通过插入包含与组成型或有条件的启动子操作性连接的RhebGTP酶抑制性RNA分子编码核酸的转基因进行工程改造，使得其表达降低水平的Rheb GTP酶。
[0095]在某些实施方案中，给予受试者的表达激肽释放酶家族肽酶的细胞群包含T细胞、T细胞前体、B细胞、B细胞前体、骨髓干细胞、胚胎干细胞、诱导胚胎干细胞、外周血干细胞或其组合。在某些实施方案中，使用受试者自身的细胞产生表达激肽释放酶的细胞群。例如，在一些实施方案中从受试者中分离骨髓或外周血干细胞，如上文所述经工程改造以表达提高水平的激肽释放酶家族肽酶，然后给回受试者。在这样的实施方案中，细胞排斥的可能性较小。
[0096]本发明通过下列实施例进一步阐述，这些实施例不应理解为限制性的。贯穿本申请所引用的所有参考文献、专利和出版的专利申请的内容，以及图形，通过引用结合到本文中。
[0097]实施例1
mTOR信号传导通路为营养物敏感的级联，其在调节细胞增殖和存活中发挥关键作用。使用LoxP-cre技术开发了仅在T细胞中缺乏该信号传导级联成员Rheb的小鼠系(由此称为 Rhebfl/fl CD4cre)。
[0098]Rhebfim⑶4cre小鼠以比其对应WT快的速率增加体重(图1)。这些小鼠显示体脂沉积量的显著增加，其中与其对应WT相比，7周龄Rhebfim⑶4cre小鼠呈现3_6倍的体脂质量(图2a、2b)。Rhebfl7fl CD4cre小鼠的瘦体重未增加(图2c)。
[0099]当研究Rhebfim⑶4cre小鼠摄取葡萄糖的能力时，观察到其显示腹膜内D-葡萄糖挑战(D-Glucose challenge)后从其血流中摄取葡萄糖的能力增加(图3a),和胰岛素敏感性增加(图3b)。还观察到Rhebfim⑶4cre小鼠具有比WT对照低的血清甘油三酯水平(图4a)，但血清高密度脂蛋白(HDL)水平并无不同(图4b)。这是一个传统上与“拟合(fit) ”情况相关的表型，并且不是通常在严重肥胖个体中发现的。
[0100]Rhebfim CD4cre小鼠在24小时期间吃的食物比年龄一致的WT对照多(图5a)，而每30g体重每小时所吃的食物量并无不同(图5b)，这提示体重的增加并不是因为神经病症，而是因为营养代谢的一些不同。
[0101]为了确定哪个组织造成了 Rhebfim⑶4cre小鼠葡萄糖摄取增强和胰岛素敏感性增加，使用18F-FDG质子发射断层扫描(PET)成像将放射性葡萄糖的组织摄取可视化。在WT小鼠中，大部分的可检测 信号位于膀胱、脑、心脏和肠(图6a)。然而，在Rhebfim CD4cre小鼠中，肩胛骨之间的背上的组织中存在高水平的葡萄糖摄取(图6b)。这一解剖学位置和代谢概况提示与WT对照相比Rhebfim⑶4cre小鼠具有明显的褐色脂肪组织(BAT)沉积。已知BAT富含血管并具有高葡萄糖代谢率。
[0102]进行肝和脂肪组织的实时PCR分析检测基因表达概况，这将解释在Rhebfl/fl⑶4cre小鼠中观察到的表型。在Rhebfim⑶4cre小鼠肝中观察到骨形态发生蛋白7(BMP-7，TGF-β家族成员，其增强褐色脂肪组织的发展)的表达增加(图7a)。在Rhebfl/fl⑶4cre小鼠中还观察到成纤维细胞生长因子21 (FGF-21)的表达增加(图7b)。FGF-21为脂肪组织中刺激葡萄糖摄取的因子。最后，在Rhebfim⑶4cre小鼠肝中观察到乙酰-CoA硫酯酶I的表达减少(图7c)。
[0103]检查了 Rhebfim⑶4cre小鼠的T细胞利用葡糖糖的能力。如通过乳酸产生所测量的，从Rhebfim⑶4cre小鼠分离的⑶4 T细胞具有比其对应WT低的糖酵解率(图8)。
[0104]使用Oxymax间接测热法测量WT和Rhebfim CD4cre小鼠的呼吸交换率(RER)。该技术确定了小鼠使用的代谢底物性质，得分在I附近指示碳水化合物利用，得分在0.7附近指示脂肪利用。在光/暗周期期间Rhebfim⑶4cre小鼠显示RER得分的急剧变化(图9)。这些结果提示在暗周期期间，当食物被消耗时，Rhebfl7fl CD4cre小鼠主要利用其食物中消耗的碳水化合物产生能量。然而，在光周期期间，很少的食物被消耗，其依靠脂肪储存。这些结果与Rhebfim⑶4cre小鼠的高 胰岛素敏感性一致。[0105]为了确保Rhebfim⑶4cre小鼠中观察到的表型不是因为T细胞以外组织中Rheb的异位缺失所致，使用从WT和Rhebfim CD4cre小鼠分离的骨髓进行骨髓移植(BMT)，并注射入经辐照WT受者。正如亲代品系，接受Rhebfim⑶4cre小鼠骨髓的小鼠比接受WT骨髓的小鼠体重增加快(图10)。
[0106]接着，将CD4 T细胞从WT和Rhebfim CD4cre小鼠转移至Rag-/-受者。2.5周后，小鼠禁食6小时，并检验其从血流中清除葡萄糖的能力。如图11所示，接受Rhebfim CD4cre小鼠的CD4 T细胞的小鼠显示其从血流中清除葡萄糖的能力增强。这证明仅通过提供缺乏Rheb活性的CD4 T细胞群而调节宿主的总体葡萄糖敏感性是可能的。
[0107]对从WT和Rhebfim⑶4cre小鼠分离的⑶4和⑶8 T细胞进行了微阵列分析。基因Klklb22 (激肽释放酶蛋白酶家族成员)在从Rhebfim⑶4cre小鼠分离的⑶4和⑶8细胞两者中均非常高地表达。通过RT-PCR确认了这一结果。
[0108]接下来检验了 Rheb缺陷的T细胞的过继转移是否可逆转长时间高脂肪饮食诱导的胰岛素不敏感性。为此，WT小鼠用60%脂肪饮食维持25周，此时间点后约40%的小鼠显示明显的胰岛素不敏感性。此时，对糖尿病小鼠进行轻微辐照(700rad)，并静脉注射4xl06个从Rhebfim⑶4cre小鼠分离的⑶4 T细胞。I周后，对糖尿病小鼠取血以测定过继转移的T细胞扩增的水平，并测定其对胰岛素的敏感性。约50%接受Rhebfim⑶4cre T细胞转移的小鼠显示对胰岛素的敏感性增加(图12a)。此外，胰岛素敏感性增长最强劲的小鼠为被供体T细胞最高程度重构的那些(图12b)。因此将Rhebfim⑶4cre T细胞转移至II型糖尿病小鼠能够治愈其糖尿病。
[0109]检验了 Rhebfim CD4cre小鼠的血清传送增强的葡萄糖摄取的能力。将WT和Rhebfl/fl⑶4cre小鼠禁食2小时，然后心脏穿刺取血并分离其血清。静脉注射100 μ I血清至已经禁食4小时的WT小鼠中。30分钟后，受体小鼠经腹膜内注射1.5g/kg D-葡萄糖。使用OneTouch Ultra系统测量血糖水平。如图13中所示，与给予WT小鼠血清的小鼠相比，给予Rhebfl7fl⑶4cre小鼠血清的小鼠的葡萄糖摄取水平显著提高。
`[0110]实施例2
本文已经进一步确定Klklb22增强响应胰岛素剂量反应的胰岛素受体磷酸化和延长的胰岛素受体磷酸化两者。具体而言，用不同剂量的胰岛素在重组(Flag标签分离的)Klklb22存在或不存在的情况下孵育HEK293T细胞。收集裂解物，并通过蛋白质印迹分析评估胰岛素受体磷酸化(图18A)。类似地，在重组(Flag标签分离的)Klklb22存在或不存在的情况下孵育HEK293T细胞。在不同时间点收集裂解物，并通过蛋白质印迹分析评估胰岛素受体磷酸化(图18B)。图18A-18B中所显示的数据证明Klklb22增强响应胰岛素剂量反应的胰岛素受体磷酸化和延长的胰岛素受体磷酸化两者。
[0111]等价实施方案
本领域技术人员将认识到，或仅仅使用常规实验能够确定，本文所述本发明具体实施方案的许多等价实施方案。这些等价实施方案意在被所述权利要求书包括。
【权利要求】
1.用于在受试者中预防或治疗糖尿病的方法，包括给予受试者激肽释放酶家族肽酶或其生物学活性片段。
2.权利要求1的方法，其中所述激肽释放酶家族肽酶或其生物学活性片段具有与选自SEQ ID NO: 1-41的序列至少70%同一性的氨基酸序列。
3.权利要求1的方法，其中所述激肽释放酶家族肽酶或其生物学活性片段具有与SEQID NO: 38至少70%同一性的氨基酸序列。
4.权利要求1的方法，其中所述激肽释放酶家族肽酶或其生物学活性片段具有与SEQID NO: 12至少70%同一性的氨基酸序列。
5.权利要求1的方法，其中所述激肽释放酶家族肽酶或其生物学活性片段具有与SEQID NO:1至少70%同一性的氨基酸序列。
6.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述糖尿病为I型糖尿病。
7.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述糖尿病为II型糖尿病。
8.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述激肽释放酶家族肽酶或其生物学活性片段通过给予受试者包含分离的激肽释放酶家族肽酶或其生物学活性片段的药物组合物而给予。
9.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述激肽释放酶家族肽酶或其生物学活性片段通过给予受试者表达激肽释放酶家族肽酶或其生物学活性片段的重组细胞群而给予。
10.权利要求9的方法，其中所述重组细胞群包括T细胞、T细胞前体、B细胞、B细胞前体、骨髓干细胞、胚胎干细胞、诱导胚胎干细胞、外周血干细胞或其组合。
11.用于在受试者中增加胰 岛素敏感性的方法，包括给予受试者激肽释放酶家族肽酶或其生物学活性片段。
12.权利要求11的方法，其中所述激肽释放酶家族肽酶或其生物学活性片段具有与选自SEQ ID NO: 1-41的序列至少70%同一性的氨基酸序列。
13.权利要求11的方法，其中所述激肽释放酶家族肽酶或其生物学活性片段具有与SEQ ID NO: 38至少70%同一性的氨基酸序列。
14.权利要求11的方法，其中所述激肽释放酶家族肽酶或其生物学活性片段具有与SEQ ID NO: 12至少70%同一性的氨基酸序列。
15.权利要求11的方法，其中所述激肽释放酶家族肽酶或其生物学活性片段具有与SEQ ID NO:1至少70%同一性的氨基酸序列。
16.权利要求11-15中任一项的方法,其中所述受试者具有I型糖尿病。
17.权利要求11-15中任一项的方法，其中所述受试者具有II型糖尿病。
18.权利要求11-15中任一项的方法，其中所述激肽释放酶家族肽酶或其生物学活性片段通过给予受试者包含分离的激肽释放酶家族肽酶或其生物学活性片段的药物组合物而给予。
19.权利要求11-15中任一项的方法，其中所述激肽释放酶家族肽酶或其生物学活性片段通过给予受试者表达激肽释放酶家族肽酶或其生物学活性片段的重组细胞群而给予。
20.权利要求19的方法，其中所述重组细胞群包括T细胞、T细胞前体、B细胞、B细胞前体、骨髓干细胞、胚胎干细胞、诱导胚胎干细胞、外周血干细胞或其组合。
21.用于在受试者中预防或治疗代谢性病症的方法，包括给予受试者激肽释放酶家族肽酶或其生物学活性片段。
22.权利要求21的方法，其中所述激肽释放酶家族肽酶或其生物学活性片段具有与选自SEQ ID NO: 1-41的序列至少70%同一性的氨基酸序列。
23.权利要求21的方法，其中所述激肽释放酶家族肽酶或其生物学活性片段具有与SEQ ID NO: 38至少70%同一性的氨基酸序列。
24.权利要求21的方法，其中所述激肽释放酶家族肽酶或其生物学活性片段具有与SEQ ID NO: 12至少70%同一性的氨基酸序列。
25.权利要求21的方法，其中所述激肽释放酶家族肽酶或其生物学活性片段具有与SEQ ID NO:1至少70%同一性的氨基酸序列。
26.权利要求21-25中任一项的方法，其中所述代谢性病症为肥胖。
27.权利要求21-25中任一项的方法，其中所述激肽释放酶家族肽酶或其生物学活性片段通过给予受试者包含分离的激肽释放酶家族肽酶或其生物学活性片段的药物组合物而给予。
28.权利要求21-25中任一项的方法，其中所述激肽释放酶家族肽酶或其生物学活性片段通过给予受试者表达激肽释放酶家族肽酶或其生物学活性片段的重组细胞群而给予。
29.权利要求28的方法，其中所述重组细胞群包括T细胞、T细胞前体、B细胞、B细胞前体、骨髓干细胞、胚胎干细胞、诱导胚胎干细胞、外周血干细胞或其组合。
30.用于在受试者中预防或治疗糖尿病的方法，包括给予受试者增加受试者中激肽释放酶家族肽酶表达的药剂。
31.权利要求30的方法，其中所述激肽释放酶家族肽酶选自Klkl、Klk2、Klk3、Klk4、Klk5、Klk6、Klk7、Klk8、Klk9、KlklO、Klkll、Klkl2、Klkl3、Klkl4 和 Klkl5。
32.权利要求31的方法，其中所述激肽释放酶家族肽酶为Klkl2。
33.权利要求31的方法，其中所述激肽释放酶家族肽酶为Klkl。
34.权利要求30的方法，其中所述药剂为小分子、多肽、抗体或抑制性RNA分子。
35.权利要求34的方法，其中所述药剂为Rheb的小分子抑制剂或Rheb特异性抑制性RNA分子。
36.权利要求30-35中任一项的方法，其中所述糖尿病为I型糖尿病。
37.权利要求30-35中任一项的方法，其中所述糖尿病为II型糖尿病。
38.用于在受试者中增加胰岛素敏感性的方法，包括给予受试者增加受试者中激肽释放酶家族肽酶表达的药剂。
39.权利要求38的方法， 其中所述激肽释放酶家族肽酶选自Klkl、Klk2、Klk3、Klk4、Klk5、Klk6、Klk7、Klk8、Klk9、KlklO、Klkll、Klkl2、Klkl3、Klkl4 和 Klkl5。
40.权利要求39的方法，其中所述激肽释放酶家族肽酶为Klkl2。
41.权利要求39的方法，其中所述激肽释放酶家族肽酶为Klkl。
42.权利要求38的方法，其中所述药剂为小分子、多肽、抗体或抑制性RNA分子。
43.权利要求42的方法，其中所述药剂为Rheb的小分子抑制剂或Rheb特异性抑制性RNA分子。
44.权利要求38-42中任一项的方法，其中所述受试者具有I型糖尿病。
45.权利要求38-42中任一项的方法，其中所述受试者具有II型糖尿病。
46.用于在受试者中预防或治疗代谢性病症的方法，包括给予受试者增加受试者中激肽释放酶家族肽酶表达的药剂。
47.权利要求46的方法，其中所述激肽释放酶家族肽酶选自Klkl、Klk2、Klk3、Klk4、Klk5、Klk6、Klk7、Klk8、Klk9、KlklO、Klkll、Klkl2、Klkl3、Klkl4 和 Klkl5。
48.权利要求47的方法，其中所述激肽释放酶家族肽酶为Klkl2。
49.权利要求47的方法，其中所述激肽释放酶家族肽酶为Klkl。
50.权利要求46的方法，其中所述药剂为小分子、多肽、抗体或抑制性RNA分子。
51.权利要求50的方法，其中所述药剂为Rheb的小分子抑制剂或Rheb特异性抑制性RNA分子。
52.权利要求46-51中任一项的方法，其中所述代谢性病症为肥胖。
53.用于在受试者中预防或治疗糖尿病的方法，包括给予受试者一种或多种重组细胞，其中所述一种或多种重组细胞的Rheb表达或活性降低。
54.权利要求53的方法，其中所述一种或多种重组细胞中的Rheb基因或Rheb启动子被突变或敲除。
55.权利要求53的方法，其中所述一种或多种重组细胞表达Rheb特异性抑制性RNA分子。
56.权利要求53-55中任一项的方法，其中所述一种或多种重组细胞包括T细胞、T细胞前体、B细胞、B细胞前体、骨髓干细胞、胚胎干细胞、诱导胚胎干细胞、外周血干细胞或其 组合。
57.权利要求56的方法，其中所述一种或多种重组细胞与受试者同源。
58.权利要求57的方法，其中使用受试者的一种或多种非重组细胞产生所述一种或多种重组细胞。
59.权利要求58的方法，其中所述方法进一步包括从受试者中获取一种或多种非重组细胞的步骤。
60.权利要求59的方法，其中所述方法进一步包括将一种或多种非重组细胞转化为一种或多种重组细胞的步骤。
61.权利要求60的方法，其中所述转化步骤通过突变一种或多种非重组细胞中的Rheb基因或Rheb启动子进行。
62.权利要求60的方法，其中所述转化步骤通过向一种或多种非重组细胞中引入Rheb特异性抑制性RNA分子表达载体进行。
63.用于在受试者中增加胰岛素敏感性的方法，包括给予受试者一种或多种重组细胞，其中所述一种或多种重组细胞的Rheb表达或活性降低。
64.权利要求63的方法，其中所述一种或多种重组细胞中的Rheb基因或Rheb启动子被突变或敲除。
65.权利要求63的方法，其中所述一种或多种重组细胞表达Rheb特异性抑制性RNA分子。
66.权利要求63-65中任一项的方法,其中所述一种或多种重组细胞包括T细胞、T细胞前体、B细胞、B细胞前体、骨髓干细胞、胚胎干细胞、诱导胚胎干细胞、外周血干细胞或其组合。
67.权利要求66的方法，其中所述一种或多种重组细胞与受试者同源。
68.权利要求67的方法,其中使用受试者的一种或多种非重组细胞产生所述一种或多种重组细胞。
69.权利要求68的方法，其中所述方法进一步包括从受试者中获取一种或多种非重组细胞的步骤。
70.权利要求69的方法，其中所述方法进一步包括将一种或多种非重组细胞转化为一种或多种重组细胞的步骤。
71.权利要求70的方法，其中所述转化步骤通过突变一种或多种非重组细胞中的Rheb基因或Rheb启动子进行。
72.权利要求70的方法，其中所述转化步骤通过向一种或多种非重组细胞中引入Rheb特异性抑制性RNA分子表达载体进行。
73.用于在受试者中预防或治疗代谢性病症的方法，包括给予受试者一种或多种重组细胞，其中所述一种或多种重组细胞的Rheb表达或活性降低。
74.权利要求73的方法，其中所述一种或多种重组细胞中的Rheb基因或Rheb启动子被突变或敲除。
75.权利要求73的方法，其中所述一种或多种重组细胞表达Rheb特异性抑制性RNA分子。
76.权利要求73-75中任一项的方法，其中所述一种或多种重组细胞包括T细胞、T细胞前体、B细胞、B细胞前体、骨髓干 细胞、胚胎干细胞、诱导胚胎干细胞、外周血干细胞或其组合。
77.权利要求76的方法，其中所述一种或多种重组细胞与受试者同源。
78.权利要求77的方法，其中使用受试者的一种或多种非重组细胞产生所述一种或多种重组细胞。
79.权利要求78的方法，其中所述方法进一步包括从受试者中收获一种或多种非重组细胞的步骤。
80.权利要求79的方法，其中所述方法进一步包括将一种或多种非重组细胞转化为一种或多种重组细胞的步骤。
81.权利要求80的方法，其中所述转化步骤通过突变一种或多种非重组细胞中的Rheb基因或Rheb启动子进行。
82.权利要求80的方法，其中所述转化步骤通过向一种或多种非重组细胞中引入Rheb特异性抑制性RNA分子表达载体进行。
83.用于确定测试化合物是否为可能的用于治疗糖尿病的治疗剂的方法，包括下列步骤: (a)使细胞与测试化合物接触；和 (b)检测细胞的激肽释放酶家族肽酶的表达； 其中导致激肽释放酶家族肽酶表达增加的测试化合物为可能的用于治疗糖尿病的治疗剂。
84.权利要求83的方法，其中所述细胞为小鼠细胞，并且所述激肽释放酶家族肽酶为Klklb22。
85.权利要求83的方法，其中所述细胞为人细胞，并且所述激肽释放酶家族肽酶为Klkl 或 Klkl2。
86.权利要求83-85中任一项的方法，其中所述细胞为T细胞。
87.权利要求83-85中任一项的方法，其中通过检测激肽释放酶家族肽酶mRNA而检测激肽释放酶家族肽酶的表达。
88.权利要求83-85中任一项的方法，其中通过检测激肽释放酶家族肽酶蛋白而检测激肽释放酶家族肽酶的表达。
89.权利要求83-85中任一项的方法，其中所述激肽释放酶家族肽酶与可检测部分连接。
90.权利要求89的方法，其中通过检测可检测部分而检测激肽释放酶家族肽酶的表达。
91.用于确定测试化合物是否为可能的用于治疗糖尿病的治疗剂的方法，包括下列步骤: (a)使细胞与测试化合物接触，其中所述细胞包含与激肽释放酶家族肽酶基因启动子操作性连接的编码可检测部分的核酸序列；和 (b)检测细胞的可检测部分的表达； 其中导致可检测部分的表达增加的测试化合物为可能的用于治疗糖尿病的治疗剂。
92.权利要求91的方法，其中所述启动子为Klklb22启动子。
93.权利要求91的方法，其中所述启动子为Klkl启动子或Klkl2启动子。
94.权利要求90-93中任一项的方法，其中所述细胞为T细胞。
【文档编号】A61K38/00GK103889435SQ201280040043
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2012年6月15日 优先权日:2011年6月17日
【发明者】J.D.鲍威尔, B.肖, P.F.沃尔利, G.M.德尔戈夫, A.维克曼 申请人:约翰斯·霍普金斯大学