从山药分离出的新颖生物活性蛋白及其用途
【专利摘要】本发明公开了分离自山药薯蓣的蛋白，其在体外和在体内刺激雌激素和孕酮释放，但是不会刺激乳腺癌和卵巢癌细胞的增殖。所述蛋白在体内表现出抗骨质疏松活性。也公开了用于分离和纯化所述蛋白的程序和所述蛋白的N端氨基酸序列，以及所述多肽化合物和包含所述多肽化合物的提取物用于在体内和/或在体外增加雌二醇、雌激素和/或孕酮的水平的治疗用途，用于增加芳香酶和/或促卵泡激素受体(FSHR)的表达水平的治疗用途，和用于治疗绝经期综合征的治疗用途。
【专利说明】从山药分离出的新颖生物活性蛋白及其用途
[0001]对相关申请的交叉引用
本申请要求2011年8月17日提交的美国临时申请系列号61/524,477的权益，其特此通过引用整体并入。
【技术领域】
[0002]本发明涉及源自山药的生物活性蛋白及其用于增加血清雌激素和孕酮水平以及用于治疗骨质疏松症、绝经期综合征和伴随的认知减退的用途。
【背景技术】
[0003]绝经是衰老过程的正常部分，绝经期间由卵巢分泌的雌激素和孕酮的水平逐渐下降。大约80%的妇女经历轻微的或很少的症状。但是，有些妇女具有严重症状，包括:热潮红、严重出汗、焦虑、恐慌或抑郁、皮肤干燥和起皱、阴道干燥和不适、压迫性尿失禁、膀胱炎、失眠、易怒(irritability )和骨质疏松症。世界卫生组织在1990年公布的报告估计，全世界绝经后妇女的总人数为4.76亿。在2030年前，预测的人数将达到12亿。
[0004]当前的减轻绝经期综合征的治疗是激素替代疗法(HRT)，其由施用补充性的外源雌激素或雌激素加上孕酮组成，最经常通过使用丸剂、皮下植入物或皮肤贴剂进行。尽管HRT通过给绝经妇女提供外源雌激素来增加循环雌激素水平，但是由于绝经妇女之间的生理条件的个体差异，难以确定适当的剂量和治疗持续时间。结果，HRT有时是无效的，且易于造成副作用，包括子宫内膜瘤、？L腺和卵巢癌、冠心病和中风。
[0005]骨质疏松症起因于增加的骨吸收速率和相对地降低的骨形成速率，导致减少的骨量和骨架的微结构衰退，以及增加的骨折风险。骨改建在绝经后岁月大幅增加，并在较老的骨质疏松症患者中保持升高，这表示在绝经期中卵巢激素的丧失是骨质疏松症的主要危险因素之一。这样的骨状态导致妇女中年龄相关的骨胳脆性增加。已经证实，小梁骨矿物质密度、小梁骨体积分数、小梁厚度和小梁数目都随着年龄增长而下降。并且，较低的骨量主要特征在于较小的板/杆比(plate-to-rod ratio )。所有这些变化减弱骨强度和增加骨质疏松性骨折的风险。
[0006]承重锻炼在绝经后妇女中具有成骨作用。但是，在老年人中需要剧烈锻炼来产生成骨作用。已经证实，HRT与承重锻炼的联合应用具有协同效应。这表明，施用的雌激素可以增强成骨应答。
[0007]选择性雌激素受体调节剂(SERM)是一种补救手段，尤其是用于减轻绝经后骨质疏松症。但是，没有证据表明SERM会增加绝经妇女的内源雌激素水平，并因此可能不会减轻除了骨质疏松症以外的绝经期综合征。
[0008]多项研究已经证实，从不同种的山药块茎分离出的蛋白或其它化合物具有抗氧化活性、壳多糖酶活性和免疫调节活性，包括活化雌激素受体。[0009]渴望开发针对绝经期综合征症状的有成本效益的治疗，以便减轻或预防由低血清雌激素水平和孕酮水平引起的骨质疏松症和/或认知减退。
【发明内容】
[0010]本发明提供了源自山药(薯葡，Dioscorea opposita)块莖的新颖多肽。所述多肽增加循环雌激素水平、增量调节卵巢促卵泡激素受体(FSHR)的表达、升高卵巢芳香酶(卵巢CYP-19)，并表现出抗骨质疏松活性。
[0011]在一个实施方案中，本发明提供了源自薯蓣根茎的分离的或基本上纯的多肽，其中所述多肽具有约32.5 kDA的分子量(通过在SUPERDEX 75 10/300 GL柱上的色谱法确定)和 N 端序列 Gly—lie—Gly—Lys—lie—Thr—Thr—Tyr—Trp—Gly—Gin—Tyr—Ser—Asp—Glu—Pro-Ser-Leu-Thr-Glu-Ala (SEQ ID NO:l)0在一个实施方案中，当将所述肽施用给雌性主
体时，血清雌激素和孕酮水平增加。
[0012]本发明的另一个方面提供了所述多肽化合物和包含所述多肽化合物的提取物用于在体内和/或在体外增加雌二醇、雌激素和/或孕酮的水平的治疗用途、用于增加芳香酶和/或促卵泡激素受体(FSHR)的表达水平的治疗用途，和用于治疗绝经期综合征的治疗用途。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]通过不同实施方案的附图和下面给出的详细描述解释本发明。所述附图不应当用于将本发明限定至具体实施方案，而是用于解释和理解。详细描述和附图仅仅是本发明的示例，而不是限制性的，本发明的范围由所附权利要求书及其等同方案限定。附图不是按比例绘制。通过结合附图阅读详细描述会更容易地理解本发明的前述方面和其它伴随的优 点。
[0014]图1是山药薯蓣的照片。
[0015]图2的色谱图显示了在HiPrep 16/10 DEAE FF柱上对薯蓣提取物的纯化。
[0016]图3的色谱图显示了在HiPrep 16/10 Phenyl FF (high sub)柱上对DO蛋白级分的进一步纯化。
[0017]图4的色谱图显示了在Superdex 75 10/300 GL柱上对DO蛋白级分的纯化。
[0018]图5是DO提取物的15%非变性PAGE (左)和15% SDS PAGE (右)的照片，显
示了通过银染色显影的从DO提取物回收的蛋白。
[0019]图6A的色谱图显不了蛋白标准品葡聚糖蓝和卵白蛋白在Superdex 75 10/300 GL柱上的洗脱。
[0020]图6B的色谱图显示了蛋白标准品牛血清白蛋白和抑肽酶在Superdex 75 10/300GL柱上的洗脱。
[0021]图6C的色谱图显示了根据本发明的DO肽在Superdex 75 10/300 GL柱上的洗脱。
[0022]图6D的图表显示了校正曲线，从该曲线确定DO肽的分子量。
[0023]图7显示了分离的DO蛋白的N端序列。
[0024]图8的图表显示了根据本发明的DO蛋白对粒层细胞的雌激素活性；
图9的图表显示了 NaOH处理过的DO肽对粒层细胞的雌激素活性。
[0025]图10的图表显示了 HCl处理过的DO肽对粒层细胞的雌激素活性。
[0026]图11的图表显示了热处理过的DO肽对粒层细胞的雌激素活性。[0027]图GA是用DO肽治疗2周以后，Sprague-Dawley大鼠的血清雌激素(雌二醇)水平的图表。
[0028]图1ZB是使用DO肽的4周治疗期以后，Sprague-Dawley大鼠的血清雌激素(雌
二醇)水平的图表。
[0029]图12C是使用DO肽的6周治疗期以后，Sprague-Dawley大鼠的血清雌激素(雌
二醇)水平的图表。
[0030]图12D是根据本发明使用DO肽的2周治疗期以后，Sprague-Dawley大鼠的血清孕酮水平的图表。 [0031 ] 图12E是使用DO肽的4周治疗期以后，Sprague-Dawley大鼠的血清孕酮水平的图表。
[0032]图12F是使用DO肽的6周治疗期以后，Sprague-Dawley大鼠的血清孕酮水平的图表。
[0033]图13的图表显示了粒层细胞中的卵巢CYP-19芳香酶的蛋白表达。
[0034]图14的图表显示了粒层细胞中的FSHR的蛋白表达。
[0035]图15的图表显示了用DO肽治疗以后，得自大鼠的卵巢中的卵巢CYP-19芳香酶的mRNA表达。
[0036]图16的图表显不了用DO治疗以后，得自大鼠的卵巢中的FSHR的mRNA表达。
[0037]图17的图表显示了用DO肽治疗以后，得自大鼠的卵巢中的卵巢CYP-19芳香酶的蛋白表达水平。
[0038]图18的图表显示了用DO肽治疗以后，得自大鼠的卵巢中的FSHR的蛋白表达水平。
[0039]图19的图表显示了 DO对BT-483乳腺癌细胞增殖的影响。
[0040]图20的图表显示了 DO对OVCA-429卵巢癌细胞增殖的影响。
[0041]图21的图表显示了用DO肽治疗以后，大鼠的体重。
[0042]图22的图表显示了用DO肽治疗6周以后，大鼠的椎骨L2的表观小梁骨矿物质密度。
[0043]图23的图表显示了用DO肽治疗6周以后，大鼠的椎骨L2的骨体积分数。
[0044]图24是根据本发明使用DO肽的6周治疗期以后，大鼠的椎骨L2的小梁数目的图表；
图25是使用DO肽的6周治疗期以后，大鼠的椎骨L2的小梁厚度的图表。
[0045]图26是使用DO肽的6周治疗期以后，大鼠的椎骨L2的结构模型指数的图表。
[0046]图27是使用DO肽的6周治疗期以后，大鼠的椎骨L2的小梁分离的图表。
[0047]图28是用DO肽治疗以后，大鼠海马中的脑衍生的神经营养因子(BDNF)蛋白的蛋白水平的图表。
[0048]图29的图表显示了用DO肽治疗以后，大鼠前额皮质中的脑衍生的神经营养因子(BDNF)蛋白的蛋白水平。
[0049]图30的图表显示了用DO肽治疗以后，大鼠前额皮质中的TrkBgpl45受体蛋白
的蛋白水平。
[0050]图31的图表显示了 DO肽对小鼠脾细胞的促有丝分裂活性的测定结果。[0051 ] 图32是15% SDS PAGE的照片，显示了通过银染色显影的通过抗体亲和柱分离的DO蛋白。左泳道是蛋白分子量标准品，右泳道显示了洗脱的被亲和柱保留的DO蛋白。与分子量标准品的大小34kDA和26 kDA相比，洗脱的DO蛋白的大小为大约30 kDA。DO肽的表观分子量与使用常规柱纯化技术得到的值一致。
[0052]图33显示了DO蛋白对卵巢粒层细胞的雌激素活性。使用抗体亲和柱，从薯蓣分离出DO蛋白。将结果表示为平均值± SEM,n=30 **通过不成对t-检验，与对照组相比，
P < ().()1 ο
[0053]图34显示了 DO蛋白对乳腺中的芳香酶表达的影响。
[0054]序列简述
S EQ ID ΝΟ:1是从山药块莖薯蓣纯化的新颖蛋白(DO)的N端序列。
[0055]S EQ ID ΝΟ:2是根据本发明有用的引物序列。
[0056]S EQ ID ΝΟ:3是根据本发明有用的引物序列。
[0057]S EQ ID ΝΟ:4是根据本发明有用的引物序列。
[0058]S EQ ID ΝΟ:5是根据本发明有用的引物序列 详细描述
在本说明书由始至终，相同的附图标记表示相同的要素。
[0059]本发明涉及分离自山药块茎薯蓣的新颖蛋白(DO蛋白或肽)。在一个实施方案中，所述纯化的DO肽通过增量调节卵巢促卵泡激素受体(FSHR)和卵巢芳香酶(卵巢CYP-19)的表达而升高循环雌激素水平。在另一个实施方案中，所述DO肽减少或预防骨脱钙和骨质疏松症。在另一个实施方案中，所述DO肽增加海马中的脑衍生的神经营养因子(BDNF)的水平，并增加前额皮质中的BDNF和TrkB gpl45受体蛋白的水平。
[0060]蛋白
在一个实施方案中，本发明提供了分离的或基本上纯的、具有约32.5 kDa的表观分子量的多肽，其中在所述多肽N端处的前21个连续氨基酸由SEQ ID NO:1组成。在一个实施方案中，所述多肽源自薯葡属种(Htwcorea sp.)。在一个具体实施方案中，所述多肽源自薯蓣。
[0061]在一个实施方案中，本发明的多肽具有如表1所示的DO肽的特征。
[0062]在一个实施方案中，本发明的多肽在体内和/或在体外增加雌二醇、雌激素和/或孕酮水平。在一个具体实施方案中，本发明的多肽增加卵巢组织和/或血液(例如血清、血浆、全血)中的雌二醇、雌激素和/或孕酮的水平。在一个实施方案中，本发明的多肽增加芳香酶和/或促卵泡激素受体(FSHR)的表达。在一个具体实施方案中，本发明的多肽增加芳香酶:GAPDH和/或FSHR:GAPDH的表达水平比率。
[0063]在一个实施方案中，与在pH O或在pH 2温育以后相比，本发明的多肽在pH约I温育以后具有更高的活性(诸如增加雌二醇、雌激素和/或孕酮的水平)。在一个实施方案中，与在60°C或在100°C温育以后相比，本发明的多肽在80°C温育以后具有更高的活性(诸如增加雌二醇、雌激素和/或孕酮的水平)。 [0064]在一个实施方案中，本发明的多肽在pHO温育以后具有活性(诸如增加雌二醇、雌激素和/或孕酮的水平)。在一个实施方案中，本发明的多肽在100°C温育以后具有活性(诸如增加雌二醇、雌激素和/或孕酮的水平)。[0065]在一个实施方案中，本发明的多肽不会增加乳腺癌细胞的增殖。在一个实施方案中，本发明的多肽不会增加主体的体重。在一个实施方案中，本发明的多肽增加主体(包括具有低雌激素和/或孕酮水平的主体)中的骨矿物质密度、骨体积分数、小梁数目和/或小梁厚度。在一个实施方案中，本发明的多肽降低主体(包括具有低雌激素和/或孕酮水平的主体)中的结构模型指数和/或小梁分离。
[0066]在一个实施方案中，本发明的多肽增加主体(包括具有低雌激素和/或孕酮水平的主体)的脑中的脑衍生的神经营养因子(BDNF)和/或TrkB gpl45受体的水平。
[0067]在一个实施方案中，本发明提供了分离的或基本上纯的、具有约32.5kDa的表观分子量的多肽，其中所述多肽的N端序列与SEQ ID ΝΟ:1具有至少85%同一性，其中所述多肽在体内和/或在体外增加雌二醇、雌激素和/或孕酮的水平。
[0068]在一个实施方案中，本发明的多肽具有27kDa至34kDa的表观分子量或二者之间的分子量，诸如28 kDa.29 kDa、30 kDa、31 kDa、31.5 kDa、32 kDa、32.5 kDa、33 kDa、33.5 kDa或 34 kDao
[0069]在一个实施方案中，本发明提供了分离的或基本上纯的多肽，其中所述多肽与特定肽具有至少85%序列同一性，所述特定肽具有约32.5 kDa的表观分子量，且所述特定肽的N端的前21个连续氨基酸由SEQ ID ΝΟ:1组成，其中所述多肽在体内和/或在体外增加雌二醇、雌激素和/或孕酮的水平。
[0070]在一个实施方案中，本发明提供了分离的或基本上纯的多肽片段，其中所述多肽具有约32.5 kDa的表观分子量，且所述多肽的N端的前21个连续氨基酸由SEQ ID ΝΟ:1组成，其中所述片段在体内和/或在体外增加雌二醇、雌激素和/或孕酮的水平。在一个实施方案中，所述片段与本 发明的多肽具有至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或97%序列同一性，且所述片段在体内和/或在体外增加雌二醇、雌激素和/或孕酮的水平。
[0071]在一个实施方案中，本发明提供了包含本发明的多肽的蛋白和融合构建体。
[0072]本发明的多肽可以是天然存在的，或者可以重组地生产。
[0073]在一个实施方案中，本发明提供了得自薯蓣属种(例如薯蓣)的分离的水性提取物，其中所述提取物包含本发明的多肽。
[0074]在某些实施方案中，本发明涉及分离的或基本上纯的蛋白和多肽。本文中使用的术语“基本上纯的”表示超过99%纯。
[0075]本文中使用的“分离的”表示这样的提取物和化合物(例如，蛋白和多肽):其已经从它们在自然界中可能存在于其中的任何环境中取出。例如，分离的提取物或化合物不表示这样的化合物或提取物:存在于可以从其中分离出所述化合物的植物中的化合物或提取物。在优选的实施方案中，本发明的化合物和提取物是至少75%纯，优选至少90%纯，更优选地是超过95%纯，且最优选地超过99%纯(基本上纯的)。
[0076]绝经期综合征和其它疾病的治疗
主题发明的另一个方面提供了所述多肽化合物和包含所述多肽化合物的提取物的下述治疗用途:用于在体内和/或在体外增加雌二醇、雌激素和/或孕酮的水平，用于增加芳香酶和/或促卵泡激素受体(FSHR)的表达水平，和用于治疗绝经期综合征。
[0077]在一个实施方案中，本发明提供了增加细胞中的雌性生殖激素(诸如雌二醇、雌激素和/或孕酮)的水平的方法，所述方法包括:给细胞施用有效量的包含本发明的多肽化合物或其盐的组合物。
[0078]在一个实施方案中，所述细胞是在需要增加雌性生殖激素(例如，雌二醇、雌激素和/或孕酮)的水平的主体中。在一个实施方案中，所述细胞是卵巢细胞。在一个实施方案中，与具有正常生殖功能的正常雌性群体的水平相比，所述主体具有低血清雌性生殖激素(例如，雌二醇、雌激素和/或孕酮)水平。在一个实施方案中，所述主体是女性人主体，且所述正常雌性群体由具有正常生殖功能的14-40岁的女性组成。在一个实施方案中，所述主体是处于绝经期、围绝经期或绝经后时期的女性。
[0079]在一个实施方案中，本发明不会增加乳腺癌细胞的增殖。在一个实施方案中，本发明不会增加主体的体重。
[0080]在一个实施方案中，本发明可以用于治疗主体的骨质疏松症。在一个实施方案中，所述主体是这样的雌性:其雌二醇、雌激素和/或孕酮水平低于具有生殖功能的正常雌性群体的水平。在一个实施方案中，本发明可以用于改善主体的认知功能。在一个实施方案中，所述主体是这样的雌性:其雌二醇、雌激素和/或孕酮水平低于具有正常生殖功能的正常雌性群体的水平。在一个实施方案中，本发明可以用于增加主体脑中的脑衍生的神经营养因子(BDNF)和/或TrkB gpl45受体的水平。
[0081 ]本文中使用的术语“主体”或“患者”描述了可以给其提供使用根据本发明的组合物的治疗的生物体，包括哺乳动物诸如灵长类动物。可以从公开的治疗方法受益的生物体包括但不限于:猿、黑猩猩、猩猩、人类、猴；驯化的动物诸如狗、猫、马、牛、猪、绵羊、山羊、鸡；和其它动物诸如小鼠、大鼠、豚鼠和仓鼠。在一个实施方案中，所述主体或患者是雌性。
[0082]本文中使用的术语“治疗(treatment )”或其任意语法变体(例如，treat、treating和treatment等)包括但不限于:改善或减轻疾病或病症的症状，减轻、遏制、抑制、减少，或影响病症的进展、严重程度和/或范围。
[0083]本文中使用的术语“有效量”表示这样的量:其能够治疗或改善疾病或病症，或者以其它方式能够产生预期的治疗效果。
[0084]在一个实施方案中，本发明提供了治疗骨质疏松症的方法，所述方法包括:将薯蓣植物根茎的水性提取物施用给患者，和由此刺激雌激素和孕酮分泌。
[0085]在一个实施方案中，本发明提供了治疗绝经期综合征的方法，所述方法包括:将薯蓣植物根茎的水性提取物施用给患者，和刺激雌激素和孕酮分泌。
[0086]在一个实施方案中，本发明提供了治疗患者的骨质疏松症的方法，所述方法包括:将薯蓣植物根茎的水性提取物施用给患者，和增量调节促卵泡激素受体和卵巢芳香酶CYP-19 O
[0087]在一个实施方案中，本发明提供了治疗绝经期综合征的方法，所述方法包括:将薯蓣植物根茎的水性提取物施用给患者，和响应于所述治疗而刺激雌激素和孕酮分泌。
[0088]在一个实施方案中，本发明提供了治疗具有低血清雌激素和孕酮水平的患者的认知功能减退的方法，所述方法包括:将薯蓣植物根茎的水性提取物施用给患者，和由此升高血清雌激素和孕酮水平，并响应于所述升高的血清雌激素和孕酮水平而提高认知功能。[0089]在一个实施方案中，本发明提供了改进患者的认知功能的方法，所述方法包括:给所述患者施用薯蓣植物根茎的水性提取物，和响应于所述提取物而升高患者脑部的海马和皮质中的脑衍生的神经营养因子表达。
[0090]在一个实施方案中，本发明提供了改进患者的认知功能的方法，所述方法包括:给所述患者施用薯蓣植物根茎的水性提取物，和响应于所述提取物而升高患者脑部的前额皮质中的TRKB受体。
[0091]从薯#揋取蛋白
将薯蓣的根茎102 (图1)剥皮，并以1:2 (w/v)的比例在水性提取缓冲液(5%乙酸+0.1% β -琉基乙醇)中在4°C均质化3小时。将匀浆物在17,700g在4°C离心30分钟。收集上清液，并加入硫酸铵至80%饱和。将混合物在4°C搅拌过夜，并在17,700g在4°C离心I小时。收集上清液，并加入硫酸铵至80%饱和。将混合物在4°C搅拌过夜，并在17,700g在4°C离心I小时。保留沉淀物(蛋白提取物)，并再悬浮于净化水中。将蛋白提取物混合物在重蒸溜H2O中透析过夜，然后在40,OOOg在4°C超速闻心2小时。收集上清液，并进行快速蛋白液相色谱法(FPLC)。
[0092]梓绌化
将上述提取物的样品调节至IOOmM Tris (pH 8.0)的终浓度，并应用于HiPrep 16/10DEAE FF柱(GE Healthcare, Inc., Princeton, NJ)，并通过FPLC进行色谱分离。洗脱缓冲液由缓冲液A和缓冲液B组成，所述缓冲液A为IOOmM Tris (pH 8.0)，缓冲液B为含有IMNaCl的100 niM Tris (pH 8.0)。使用O - 45%缓冲液B的梯度。洗脱曲线显示为图2中的色谱图200。收集级分D3 (20 2)，并在重蒸馏H2O中透析过夜。
[0093]然后将级分D3 (202)调节至50%缓冲液B，并应用于HiPrep 16/10 Phenyl FF (highsub)柱(GE Healthcare, Inc., Princeton, NJ)，并通过FPLC进行色谱分闻。使用由 mill1-Q H2O和含有IM (NH4)2SO4的IOmM磷酸钠缓冲液(pH 7.0)组成的洗脱缓冲液(缓冲液B( bufferB ))。用30 - 0%缓冲液B ( buffer B )的梯度，洗脱柱。洗脱曲线300显示在图3中。收集级分Pl (302)，并在重蒸馏H2O中透析过夜，然后冻干以得到粉末状残余物。
[0094]将得自302的冻干粉末溶解在含有I5O niM NaCl的50mM磷酸钠缓冲液(pH 7.2)中，应用于 Superdex 75 10/300 GL 柱(GE Healthcare, Inc., Princeton, NJ)，并通过 FPLC 进行色谱分离。以0.6 ml/min的流速，用50 mM磷酸钠缓冲液(pH 7.2)洗脱柱。色谱图400显示在图4中。收集级分S2 (402)，并在重蒸馏H2O中透析过夜并冻干至干燥。回收冻干的残余物，并在-20°C储存。该粉末状残余物被称作DO肽，并将其进一步表征以评价它的物理、化学和生物学特性。
[0095]对粉末状残余物DO的一部分进行在15%非变性PAGE系统上和在15%十二烷基硫酸钠(SDS) PAGE系统上的聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，分别如图5A和图5B所示。发现DO肽在2个系统中作为单个带502泳动，从而指示DO残余物是相对纯的肽。将DO肽级分的泳动与分子量标准品504 (其具有26 kDA的分子量)和506 (其具有34 kDA的分子量)的泳动进行对比。从其在SDS PAGE上的泳动确定，发现DO肽的分子量为大约30kDA。
[0096]使用抑肽酶(6500 Da)、卵白蛋白(44287 Da)和牛血清白蛋白(66000 Da)作为校准大小标准品，通过DO肽在Superdex 75 10/300柱上的保留时间，确定DO肽(级分S2)的
天然大小。在图6A中显示了色谱图，其显示了卵白蛋白602的洗脱时间以及由葡聚糖蓝604指示的柱前(column front )洗脱体积。在图6B中显示了色谱图，其显示了牛血清白蛋白606和抑肽酶608的洗脱时间。通过将洗脱体积相对于3种标准品的分子量绘图，构建图6D中显示的标准曲线。最后，对纯化的级分S2 (DO肽)610进行色谱分离，并将色谱图显示在图6C中。从标准曲线计算的DO肽的大小为32.5 kDa。
[0097]表1显示了 DO肽的分子量确定的总结，所述分子量从DO肽的色谱洗脱体积来确定。
[0098]表1 计算DO的分子量:
【权利要求】
1.在体外或在体内增加雌激素水平的肽，其中该肽选自: `a)分离的或基本上纯的可得自薯葡属种{Dioscoreasp.)的多肽，其中通过色谱法确定，该多肽具有约32.5 kDA的表观分子量，其中在该多肽N端处的首21个连续氨基酸由SEQ`ID NO:1 组成； ` b)所述多肽的片段，其中所述片段表现出增加雌激素的活性;和 `c)与所述多肽具有至少85%序列同一性的变体，其中所述变体表现出增加雌激素的活性。
2.根据权利要求1所述的肽，其中该肽在体外或在体内增加孕酮的水平。
3.根据权利要求1所述的肽，其是分离的或基本上纯的可得自薯蓣属种的多肽，其中通过色谱法确定，该多肽具有约32.5 kDA的表观分子量，且其中在该多肽N端处的首21个连续氨基酸由SEQ ID ΝΟ:1组成。
4.根据权利要求1所述的肽，其中该多肽源自薯葡{DiscoreaOpposita) Q
5.根据权利要求1所述的肽，其是重组地生产的。
6.根据权利要求1所述的肽，其中与在pHO或在pH 2温育以后相比，该肽在pH I温育以后具有更高的活性，其中该活性是增加卵巢细胞中或雌性主体中的雌激素和/或孕酮的水平。
7.根据权利要求6所述的肽，其中该肽在pH O温育以后具有活性，其中该活性是增加卵巢细胞中或雌性主体中的雌激素和/或孕酮的水平。
8.根据权利要求1所述的肽，其中与在60°C或在100°C温育以后相比，该肽在80°C温育以后具有更高的活性，其中该活性是增加卵巢细胞中或雌性主体中的雌激素和/或孕酮的水平。
9.根据权利要求8所述的肽，其中该肽在100°C温育以后具有活性，其中该活性是增加卵巢细胞中或雌性主体中的雌激素和/或孕酮的水平。
10.一种抗体，其特异性地结合根据权利要求1所述的肽。
11.一种用于增加雌性主体中的雌二醇、雌激素和/或孕酮的水平的方法，该方法包括:给雌性主体施用有效量的包含权利要求1的肽的组合物，该雌性主体的雌激素水平低于具有正常生殖功能的正常雌性群体的雌激素水平。
12.根据权利要求11所述的方法，其中该主体是处于绝经期、围绝经期或绝经后时期的人。
13.根据权利要求11所述的方法，其中该主体的孕酮水平低于具有正常生殖功能的正常雌性群体的孕酮水平。
14.根据权利要求11所述的方法，其中该主体具有绝经期综合征。
15.根据权利要求11所述的方法，其中该主体具有骨质疏松症，且该组合物的施用治疗骨质疏松症。
16.根据权利要求11所述的方法，其中该组合物是薯蓣的分离的水性提取物。
17.根据权利要求11所述的方法，其中该组合物包含分离的或基本上纯的可得自薯蓣属种的多肽，其中通过色谱法确定，该多肽具有约32.5 kDA的表观分子量，其中在该多肽N端处的首21个连续氨基酸由SEQ ID NO:1组成。
18.一种用于治疗雌性主体的方法，该雌性主体具有与低雌激素水平有关的病症，该方法包括:给雌性主体施用有效量的包含权利要求1的肽的组合物，该雌性主体的雌激素水平低于具有正常生殖功能的正常雌性群体的雌激素水平，其中该施用会实现至少一种选自以下的治疗效果: a)增加雌二醇、雌激素和/或孕酮的血清水平； b)增加芳香酶CYP-19和/或促卵泡激素受体(FSHR)的表达水平； c)增加海马和前额皮质中的脑衍生的神经营养因子(BDNF)和/或TrkB受体的水平； d)治疗骨质疏松症； e)提高认知功能；和 f)刺激脾有丝分裂应答。
19.根据权利要求18所述的方法，其中该主体是处于绝经期、围绝经期或绝经后时期的人。
20.根据权利要求18所述的方法，其中该主体具有绝经期综合征。
21.有效量的包含权利要求1的肽的组合物在制备药物中的用途，该药物用于增加雌性主体中的雌二醇、雌激素和/或孕酮的水平，该雌性主体的雌激素水平低于具有正常生殖功能的正常雌性群体的雌激素水平。
22.根据权利要求21所述的用途，其中该主体是处于绝经期、围绝经期或绝经后时期的人。
23.根据权利要求21所述的用途，其中该主体的孕酮水平低于具有正常生殖功能的正常雌性群体的孕酮水平。
24.根据权利要求21所述的用途，其中该主体具有绝经期综合征。
25.根据权利要求21所述的用途，其中该主体具有骨质疏松症，且该药物治疗骨质疏松症。
26.根据权利要求21所述的用途，其中该组合物是薯蓣的分离的水性提取物。
27.根据权利要求21所述的用途，其中该组合物包含分离的或基本上纯的可得自薯蓣属种的多肽，其中通过色谱法确定，该多肽具有约32.5 kDA的表观分子量，其中在该多肽N端处的首21个连续氨基酸由SEQ ID NO:1组成。
28.有效量的包含权利要求1的肽的组合物在药物制备中的用途，该药物用于治疗具有与低雌激素水平有关的病症的雌性主体。
29.根据权利要求28所述的用途，其中该主体是处于绝经期、围绝经期或绝经后时期的人。
30.根据权利要求28所述的用途，其中该主体具有绝经期综合征。
【文档编号】A61P5/30GK103945854SQ201280039980
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2012年8月17日 优先权日:2011年8月17日
【发明者】施祖荣, 黄金乐, 童瑶, 张艳波, 张浩斌 申请人:香港大学