口腔用组合物的制作方法
【专利摘要】本发明提供具有生物膜形成抑制作用的口腔用组合物。包含植物提取物的口腔用组合物，所述植物提取物为小松菜、日本芜菁、壬生菜、辣味萝卜、水芹、荚果蕨、辽东楤木或冰叶日中花的热水提取物。
【专利说明】口腔用组合物
【技术领域】
[0001]本发明涉及具有基于植物提取物的内氏放线菌(Actinomyces naeslundii)生物膜的形成抑制作用的口腔用组合物。
【背景技术】
[0002]附着于物体表面的微生物并不是单独存在，在具有特征的结构中与其它微生物一起形成生物膜。欲通过研究探讨该生物膜是否如可用于固定化微生物所示的那样对人类有益，结果却发现反而是引发龋齿和食品污染的原因，近年来进行了大量研究。
[0003]口腔生物膜由700种以上的细菌构成，Img中存在IO8个以上的菌。其中，内氏放线菌作为从初期菌斑(龋齿菌斑)发展为后期菌斑(牙周病菌斑)方面的关键性微生物在近年来受到瞩目。
[0004]以往的牙周病预防中,通过杀灭牙銀卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)等牙周病病原菌来抑制牙周病是主流的想法，但实际的牙周病病灶与生物膜一起存在于牙周袋的深处，阻碍了抗菌物质的渗透，所以大多无法获得预期的效果，而且经常伴随出现耐药菌的危险。因此，希望有更安全且有效的预防方法。
[0005]此外，生物膜的抑制方法中，刷牙和洗牙等机械除去被认为是最有效的，但对于需要看护的高龄老人等难以进行这样的机械方式的口腔生物膜控制的人们，通过目前的方法，很难实施适当的口腔护理，需要开发基于与以往不同的切入口的生物膜去除方法。
[0006]已知丁酸等短链脂肪酸(SCFA)在牙周袋和牙周病患者的牙菌斑中以高浓度存在，显示参与到牙周病的发病和发展。近年来，确认牙龈卟啉单胞菌等牙周病病原菌产生的SCFA等酸具有内氏放线菌的生物膜形成促进效果，进行着以该现象为目标的机理的阐明和病原性的表现控制研究(日本大学齿学部，国立传染病研究所)。
[0007]本发明中，着眼于内氏放线菌的生物膜形成中酸的影响，探询通过抑制丁酸等酸依赖性的生物膜形成来实现牙周病生物膜形成抑制的物质，尝试了作为新的牙周病生物膜抑制原材料的开发。
[0008]作为涉及显示口腔生物膜的抗菌效果和牙龈炎改善效果的口腔用组合物的发明，可例举专利文献I。专利文献I揭示了以包含(A)N-酰基肌氨酸或其盐和(B)异硫氰酸苄酯且(A)/(B)的质量比为0.5~20为特征的口腔用组合物，揭示了该口腔用组合物对作为口腔疾病原因的口腔生物膜的抗菌效果和牙龈炎改善效果良好。然而，未揭示或提示对于牙周病的效果。
[0009]现有技术文献
[0010]专利文献
[0011]专利文献1:日本专利特开2008 - 174542号公报
[0012]发明的概要
[0013]发明所要解决的技术问题
[0014]一直以来，使用某种抗菌剂的牙周病抑制法中，口腔生物膜阻碍抗菌剂的渗透，难以发挥所设想的牙周病抑制效果。此外，出现抗药菌的危险性高，抗菌剂的使用不理想。因此，与控制牙周病的病原菌相比，进行初期牙周病病原菌的生物膜控制被认为是更安全且有效的牙周病预防法。
[0015]解决技术问题所采用的技术方案
[0016]进行了认真研究后发现，作为十字花科植物的日本芜菁(Brassica rapa var.nipposinica)、小松菜(Brassica rapa var.perviridis)、辣味萝卜、水芳:和作为五加科植物的辽东惚木、番杏科的冰叶日中花的提取物分别具有由酸诱导的内氏放线菌的生物膜形成抑制效果，从而完成了本发明。
[0017]内氏放线菌的生物膜形成因酸刺激而增加，但发现如果在培养体系中添加1000ppm上述植物，则生物膜形成降低至约30%左右。这时，各植物提取物对内氏放线菌的生长繁殖不产生影响，因此该生物膜形成抑制效果被认为机理与抗菌作用不同。
[0018]内氏放线菌是从牙龈炎和根面龋部位被发现的革兰氏阳性杆菌，被认为是初期牙周病的病原细菌。由于与链球菌和牙周病病原菌共凝集，因此认为是向牙周病菌斑的菌群迁移的关键细菌，被认为可实现有效控制内氏放线菌的牙周病预防。
[0019]本发明人确认生物膜形成因口腔细菌产生的酸而增加。
[0020]发明的效果
[0021]本发明是基于新着眼点的牙周病预防剂，与已有的抗菌剂等相比，可具有耐药菌出现危险低等优点。
[0022]附图的简单说明
[0023]图1是表示基于酸添加的内氏放线菌的生物膜形成的图表。
[0024]图2是表示辣味萝卜的基于不同提取溶剂的生物膜形成抑制活性的差异的图表。
[0025]实施发明的方式
[0026]本发明是通过抑制初期牙周病病原菌内氏放线菌形成的牙周病生物膜来预防牙周病的发明，在日本芜菁、小松菜、辣味萝卜等部分十字花科植物和辽东惚木、冰叶日中花的提取物中发现了该牙周病生物膜抑制剂。
[0027]与以往的牙周病病原菌的抗菌剂不同，抑制作为牙周病病原菌的聚集场所的生物膜的形成，认为有效且安全。
[0028]作为新的口腔用组合物，还可应用于口香糖和糖果。
[0029]即，本发明涉及包含植物提取物的口腔用组合物，该植物提取物为小松菜、日本芜菁、壬生菜(Brassica campestris var laciniifolia)、辣味萝卜、水芳:(夕^义)、荚果蕨(Matteuccia struthiopteris)、辽东惚木或冰叶日中花的热水提取物。
[0030]另外，本发明还涉及包含植物提取物的酸诱导生物膜形成抑制剂，该植物提取物为小松菜、日本芜菁、壬生菜、辣味萝卜、水芹、荚果蕨、辽东惚木或冰叶日中花的热水提取物。
[0031]此外，本发明还涉及由包含植物提取物的口腔用组合物形成的漱口剂、牙膏剂、吸入剂、含片剂和包括口香糖、糖果、压片糖等的食品，所述植物提取物为小松菜、日本芜菁、壬生菜、辣味萝卜、水芹、荚果蕨、辽东惚木或冰叶日中花的热水提取物。
实施例[0032][实施例1]
[0033](提取物制备)
[0034]各植物样品在购入后冷冻干燥，再用粉碎机将Ig粉碎，用50ml水在70°C提取2小时。所得的提取液以3000rpm、10分钟进行离心分离，过滤上清后冷冻干燥，将所得的样品作为各植物热水提取物供于试验。
[0035][实施例2]
[0036](生物膜形成抑制活性评价)
[0037]1.生物膜形成
[0038]将内氏放线菌ATCC19039株在5ml的脑心浸液(Brain Heart Infusion, BHI)液体培养基中于37°C进行10小时的厌氧培养，以3000rpm、10分钟进行离心分离，将所收集的细菌用PBS配制为OD55tol=0.5，将其作为供试菌悬浮液。
[0039]用96孔板进行生物膜形成试验。向各孔中添加60μ I生物膜形成抑制样品、20μ I丁酸、20 μ I内氏放线菌供试菌悬浮液、100 μ I加有0.5%蔗糖的胰蛋白胨大豆肉汤培养基，在37°C、5% C02的条件下进行16小时的培养。
[0040]2.生物膜定量
[0041]去除上述的培养后的上清，用PBS进行2次各孔的清洗。清洗后，向各孔中添加
0.25%番红溶液，静置15分钟后去除剩余番红溶液，用PBS进行2次各孔的清洗。清洗后，向各孔中添加乙醇，振荡30分钟而使染色了的番红溶出，用微孔板阅读仪测定492nm的吸光度，对生物膜形成量进行定量。
[0042]生物膜形成量以将未添加样品的情况下的形成量设为100时的比例表示。
[0043](结果)
[0044]1.天然提取物的生物膜形成抑制效果
[0045]在丁酸添加体系中，研究各种天然物的提取物是否可见生物膜形成抑制活性。制备各种植物的热水提取物，对生物膜形成抑制活性进行了测定，结果确认如果向试验体系中添加小松菜、日本芜菁、壬生菜、辣味萝卜、水芳\荚果蕨、辽东惚木、冰叶日中花的热水提取物，则在未添加丁酸的体系中生物膜形成量未见大的变化，但添加了丁酸的体系中生物膜形成量下降50~90%。该效果在十字花科植物的热水提取物中特别显著(表1)。
[0046]接着，考察了在添加丁酸以外的酸的情况下内氏放线菌的生物膜形成是否增加以及日本芜菁提取物是否抑制酸诱导生物膜形成。其结果是，确认即使是丁酸以外的酸(乙酸、乳酸、盐酸)，内氏放线菌的生物膜形成也增加，日本芜菁提取物也抑制这些生物膜。
[0047]将确认具有活性的辣味萝卜用不同的提取溶剂(热水、50%乙醇、100%乙醇)进行提取，确认了各提取物的生物膜形成抑制活性，结果确认提取物均具有依赖于浓度的生物膜形成抑制活性(图2)。由此提示，辣味萝卜中同时含有水溶性的活性物质和脂溶性的活性物质的可能性高。
[0048]为了开发以与以往的原材料不同的机理发挥作用的牙周病预防原材料，着眼于内氏放线菌的生物膜形成因丁酸而增加的现象，进行了丁酸诱导生物膜形成抑制物质的开发。
[0049]考虑到在食品中的使用，以平时经常食用的植物为中心进行了探索，结果在数种植物提取物中发现较强的活性。这 些提取物在未添加丁酸的体系中没有使生物膜形成量有大的变化，但在添加了丁酸的体系中使生物膜形成量大幅下降，因此认为可能仅在与丁酸相关的体系中产生影响。此次的试验中，确认十字花科植物具有活性，但同样是十字花科植物，也存在不具有生物膜形成抑制活性的植物，不是所有十字花科植物共通的效果。
[0050]此外，称为冰叶日中花的番杏科植物的提取物中也发现显著的生物膜形成抑制活性。冰叶日中花(学名:Mesembryanthemum crystalIinum)是原产于欧洲、西亚、非洲的耐盐性高的盐生植物之一，是在与海水同等程度的氯化钠水溶液中也可水耕栽培的植物。近年来，在百货商店和超市的蔬菜柜台有售，是受到瞩目的植物，但如果能够发掘牙周病生物膜预防效果等附加值，今后应该会更加受关注。
[0051]使用抗菌剂、杀菌剂等的微生物控制和传染病的克服是与耐药菌出现之间的战争，处于新抗生素开发与其耐药菌的出现僵持不下的状态。但是，此次获得的植物的热水提取物的生物膜形成抑制活性仅在添加酸时得到确认，因此从出现耐药菌的角度来看，可以说安全性高。
[0052]希望能够以此次获得的结果为基础，进行作用机理的阐明和活性成分的鉴定、人体药效试验，进而实现新的牙周病生物膜形成抑制原材料的开发和对于口腔护理产品的应用。
[0053]对通过添加丁酸诱导的内氏放线菌的生物膜形成抑制物质进行了探索，结果发现小松菜、日本芜菁等5种十字花科植物和冰叶日中花的热水提取物具有使生物膜量下降50~90%的活性。此外，还提示了十字花科植物的活性成分同时包含水溶性物质和脂溶性物质的可能性。
[0054]【表1-1】
[0055]表1.天然物热水提取物的生物膜形成抑制效果
[0056]`
【权利要求】
1.口腔用组合物，其特征在于，包含植物提取物。
2.如权利要求1所述的口腔用组合物，其特征在于，所述植物提取物为小松菜、日本芜菁、壬生菜、辣味萝卜、水芹、荚果蕨、辽东惚木或冰叶日中花的热水提取物。
3.酸诱导生物膜形成抑制剂，其特征在于，包含植物提取物。
4.如权利要求3所述的酸诱导生物膜形成抑制剂，其特征在于，所述植物提取物为小松菜、日本芜菁、壬生菜、辣味萝卜、水芹、荚果蕨、辽东惚木或冰叶日中花的热水提取物。
5.漱口剂，其特征在于，含有权利要求1或2所述的口腔用组合物。
6.牙膏剂，其特征在于，含有权利要求1或2所述的口腔用组合物。
7.吸入剂，其特征在于，含有权利要求1或2所述的口腔用组合物。
8.含片剂，其特征在于，含有权利要求1或2所述的口腔用组合物。
9.食品，其特征在于，包含权利`要求1或2所述的口腔用组合物。
【文档编号】A61K36/18GK103781466SQ201280043403
【公开日】2014年5月7日 申请日期:2012年9月6日 优先权日:2011年9月8日
【发明者】津金贵则, 毛利彰太, 佐伯洋二 申请人:罗蒂株式会社