用于治疗过度增生性障碍、优选具有受损的p53功能的过度增生性障碍的包含CIP2A沉默 ...的制作方法
【专利摘要】本发明是基于以下发现：沉默CIP2A(KIAA1524)基因会使癌细胞对某些小分子化学治疗剂的细胞凋亡诱导活性敏化。因而，本发明涉及各种联合治疗、致敏方法和药物组合物。本发明另外涉及基于得自所述对象的样品中的CIP2A和p53表达和/或蛋白活性为对象选择癌症治疗的方法。
【专利说明】用于治疗过度增生性障碍、优选具有受损的P53功能的过度增生性障碍的包含ClP2A沉默剂的药物组合
【技术领域】
[0001]本发明涉及联合癌症治疗剂的领域。
【背景技术】
[0002]癌症是影响全世界所有社会群体的破坏性疾病。据估计2个男性中的I个和3个女性中的1个将在其一生中发展某种形式的癌症。
[0003]令人感兴趣的是，最近已经确定，不论不同癌症类型之间的表型变异性如何，有限数目的遗传元件的微扰足以在许多不同的人细胞类型中诱发细胞转化(综述见(Zhao等人，2004))。通过实验证实，Ras和端粒末端转移酶(TERT)的活化，与肿瘤抑制蛋白p53和视网膜母细胞瘤蛋白(Rb)的失活一起，可以永生化多种人细胞类型，所述人细胞类型可以随后响应于蛋白磷酸酶2A (PP2A)的抑制而转化为致瘤状态。因此，这些普通的遗传元件可以被视作癌症发展的主要调节剂(Zhao等人，2004)。
[0004]PP2A是在很大程度上保守的蛋白丝氨酸/苏氨酸磷酸酶(PSP)，其作为由一个催化亚基(PP2Ac或C)、一个支架亚基(PR65或A)和替代性的调节B亚基之一组成的三聚体蛋白复合物而起作用。如上所述，最近的实验证据已经肯定地确认，PP2A活性的抑制是人细胞转化的先决条件(综述见(Westermarck和Hahn, 2008))。尽管如此,关于在体内调节PP2A复合物组成和/或活性的机制知之甚少。PP2A抑制机制的鉴别可提供开发新类型的再活化PP2A肿瘤抑制物活性的癌症治疗剂的机会。该想法类似于以用小分子(诸如Nutlin-3)再活化P53的肿瘤抑制物活性为目的的癌症治疗方案(Vassilev等人，2004)。
[0005]在2007年，鉴别出了一种新颖的PP2A抑制剂蛋白，其被命名为PP2A的癌性抑制剂(CIP2A) (Junttila等人，2007)。CIP2A会与PP2A和与最重要的致癌转录因子之一MYC相互作用。此外，siRNA介导的CIP2A的消除显著增加MYC-PP2A复合物中的PP2A活性，并导致MYC丝氨酸62去磷酸化和MYC蛋白降解。还已经证实，CIP2A是恶性细胞生长和体内肿瘤形成所需的(Junttila 等人，2007; Khanna 等人，2009; Westermarck 和 Hahn,2008)。此外，最近的工作已经证实了 CIP2A在几种常见的人恶性肿瘤中的过表达，并且验证了它作为临床上有关的人癌蛋白的作用(Khanna等人，2009; Westermarck和Hahn,
2008)。因而，这些结果证实，CIP2A是一种新颖的在人恶性肿瘤中抑制PP2A的人癌蛋白。
[0006]细胞杀死和/或细胞凋亡是癌症治疗方案的优选终点。另一方面，固有的或获得性的抗性是与当前使用的化学疗法有关的主要问题。因而，尽管已经揭示了恶性肿瘤的至少一些基础机制，本领域需要开发用于过度增生性疾病和尤其是癌症的药物。肿瘤抑制蛋白P53的活化会响应于多种临床使用的化疗剂而介导细胞的细胞凋亡诱导(Chari等人，
2009)。但是，由于p53功能在大约50-70%的人癌症中是受损的，这是化学疗法抗性的一个重要原因(Chari等人，2009)。在大多数情况下，癌症中的p53通过基因突变或通过p53的负调节剂(诸如MDM2)或病毒蛋白(诸如人乳头瘤病毒(HPV) 16 E6蛋白)的过表达而失活。因而，为了克服抗药性，显然需要这样的方案:其使携带在功能上受损的P53的那些癌细胞对化学疗法敏化(Chari等人，2009)。
【发明内容】
[0007]在一个方面，本发明提供了用作药物的至少一类CIP2A沉默剂和化学治疗剂的组合，所述药物用于治疗包含具有受损的P53功能的细胞的过度增殖障碍，所述化学治疗剂选自小分子酪氨酸激酶抑制剂、PARP抑制剂、CHKl抑制剂、硫代葡萄糖苷、烷化剂、植物生物碱、PI3K/mT0R抑制剂、组蛋白脱乙酰基酶、DNA-PK抑制剂、STAT抑制剂、抗代谢药和存活抑制剂。在权利要求1中阐述了每类药剂的合适药剂。
[0008]在另一个方面，本发明提供了药物组合物，其包含根据本发明的CIP2A沉默剂和化学治疗剂的组合以及至少一种药学上可接受的载体。
[0009]在另一个方面，本发明提供了一种使过度增生性细胞对化学治疗剂敏化的方法，所述方法包括:在需要这种致敏的人或动物对象中使CIP2A基因沉默。
[0010]在另一个方面，本发明提供了一种在需要这种治疗的人或动物对象中治疗过度增生性疾病的方法，所述方法包括:给所述对象伴随地、同时地或相继地施用至少一类CIP2A沉默剂和选自小分子酪氨酸激酶抑制剂、PARP抑制剂、CHKl抑制剂、硫代葡萄糖苷、烷化剂、植物生物碱、PI3K/mT0R抑制剂、组蛋白脱乙酰基酶、DNA-PK抑制剂、STAT抑制剂、抗代谢药和存活抑制剂的化合物。在权利要求8中阐述了每个类别的合适化合物。
[0011]此外，本发明的一个方面提供了一种为需要这种治疗的对象选择癌症治疗的方法，其中所述方法包括:评价得自所述对象的样品中的CIP2A和P53表达和/或蛋白活性，和对于其样品为CIP2A表达和/或活性阴性的和p53活性受损的对象，选择至少一种化学治疗剂的单一疗法，且对于其样品为CIP2A表达阳性的和p53活性受损的对象，选择根据本发明实施方案的联合治疗。
[0012]在上述方面的某些实施方案中，所述CIP2A沉默剂选自:siRNA分子、DsiRNA分子、人工miRNA前体、shRNA分子、反义寡核苷酸、核酶和阻止CIP2A向PP2Ac起作用的药剂。在其它实施方案中，所述CIP2A沉默剂包含选自以下的核酸序列:SEQ ID N0:l_25，和与所述SEQ ID NO: 1-25具有至少80%序列同一性且保留它们的CIP2A沉默活性的序列。
[0013]在上述方面的某些实施方案中，要治疗的过度增生性障碍选自:银屑病、心肌肥大、良性肿瘤、实体癌症和血液学癌症。所述实体癌症的非限制性例子包括:头和颈的鳞状细胞癌、结肠癌、胃癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、宫颈癌、食管癌、肺癌、肝癌、脑癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤和胶质母细胞瘤，而血液学癌症的非限制性例子包括急性和慢性T-细胞和B-细胞白血病以及淋巴瘤。
[0014]在从属权利要求、下面的附图、详细描述和实施例中阐述了本发明的其它具体实施方案、目的、细节和优点。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]在下面，将借助于优选的实施方案参考附图更详细地描述本发明，其中
图1显示了当与单独SCR SiRNA转染的细胞相比时，在用与标准化学治疗剂组合的siRNA抑制CIP2A以后，在人衍生的神经胶质瘤细胞系T98G中诱导的细胞凋亡水平(即天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3/7活性)。[0016]图2显示了当与单独的SCR siRNA相比时，使用CTG测定在人衍生的宫颈癌细胞系HeLa中确定的、与不同化疗药物组合的CIP2A siRNA的降低细胞生存力的效力。
[0017]图3证实了使用天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3/7测定所确定的各种化疗药物在原代小鼠淋巴瘤细胞中诱导细胞凋亡的效力，所述原代小鼠淋巴瘤细胞源自CIP2A缺陷型(CIP2A+)小鼠或表达CIP2A的小鼠(CIP2A+/+)小鼠。
[0018]图4证实，在用各种的化疗药物处理细胞以后，当与表达CIP2A的细胞相比时，使用CTG测定确定的细胞生存力在源自CIP2A缺陷型(CIP2A+)小鼠的原代淋巴瘤细胞中显著降低。
[0019]图5是天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3/7测定，其测量当与单独的SCR siRNA转染的细胞相比时，在用与标准化学治疗剂组合的siRNA抑制CIP2A以后，在人衍生的胃癌细胞系MKN28中诱导的细胞凋亡水平(即天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3/7活性)。
[0020]图6证实，当与单独的SCR siRNA转染的细胞相比时，在用与标准化学治疗剂组合的siRNA抑制CIP2A以后，在人衍生的乳腺癌细胞系MCF-7中没有诱导细胞凋亡(即天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3/7活性)。
【具体实施方式】
[0021]本发明是基于以下惊人发现:沉默CIP2A基因会使p53肿瘤抑制蛋白功能受损的癌细胞对某些小分子化学治疗剂的细胞凋亡诱导活性敏化。伴随地沉默CIP2A基因和施用所述化学治疗剂会导致其中已经抑制P53功能的细胞中的细胞凋亡和/或其它类型的细胞死亡的水平的累加性或协同性增加。另一方面，本发明表明，表达突变的P53的CIP2A阴性的淋巴瘤细胞对使用所述化学治疗剂的单一疗法更敏感。因而，在一个方面，本发明提供了CIP2A缺失和所述化学治疗剂的联合治疗，而在另一个方面，本发明提供了通过检测患者样品的CIP2A和p53状态而将癌症患者分级进行化疗的方法。
[0022]本发明的患者分级方法包括，确定得自所述患者的癌症组织样品的CIP2A和p53状态。应当选择具有CIP2A阴性的和p53灭活的癌细胞的患者进行使用化学治疗剂的单一疗法治疗，而具有CIP2A阳性的和p53灭活的癌细胞的患者应当用本发明的联合治疗(即CIP2A抑制与某些化学治疗剂的施用一起)来治疗。
[0023]通过多种方式可以确定癌症组织样品或体液中的CIP2A水平。例如，可以如下定量组织或体液中的CIP2A蛋白水平:i)通过RT-PCR或通过杂交技术，确定得自所述组织或体液的CIP2A mRNA表达，或ii)对预期含有蛋白CIP2A的组织或体液实施识别所述CIP2A的抗体，并检测和/或定量所述抗体，或通过蛋白组学技术对所述组织或体液实施分析。合适的杂交技术包括例如DNA杂交和RNA印迹。根据标准免疫测定方案，例如标记连接的免疫吸附测定、蛋白质印迹和免疫组织化学方法，可以进行抗体的检测或定量。
[0024]通过本领域技术人员已知的标准方法，可以确定癌症组织或体液样品中受损的p53功能。选择的方法至少部分地取决于受损的p53功能的基础机制。例如,如本领域技术人员众所周知的，通过杂交技术、或通过DNA或RNA测序、或通过RNA或DNA的RT-PCR分析，可以进行P53失活突变的检测。通过与CIP2A水平相同的方式，可以确定p53的负调节剂(诸如MDM2或病毒蛋白诸如人乳头瘤病毒(HPV) 16 E6蛋白)的过表达。
[0025]通过确定单独的CIP2A和p53或者它们与其它蛋白或基因的组合的状态，可以进行所述患者分级方法。
[0026]通过本领域已知的任意合适的方法，包括、但不限于RNA干扰(RNAi)，可以得到CIP2A基因沉默。最常见的基于RNAi的基因沉默方案是使用小干扰RNA (siRNA)。
[0027]siRNA的原理在文献中得到广泛呈现。作为例子可以提及美国专利公开2003/0143732,2003/0148507,2003/0175950,2003/0190635,2004/0019001,2005/0008617和2005/0043266。siRNA双链体分子包含反义区和有义链，其中所述反义链包含与编码某一蛋白质的mRNA序列中的靶区互补的序列，且所述有义链包含与所述反义链互补的序列。因此，siRNA双链体分子由2个核酸片段装配成，其中I个片段包含反义链，且第2个片段包含所述siRNA分子的有义链。换而言之，siRNA是小双链RNA (dsRNA)。所述有义链和反义链可以经由接头分子共价连接，所述接头分子可以是多核苷酸接头或非核苷酸接头。所述反义链和有义链的长度可以变化，且通常是各自约19-21个核苷酸。在某些情况下，siRNA可以包含22、23或24个核苷酸。
[0028]另一个基于RNAi的CIP2A沉默方案是，使用更长的、通常25-35个核苷酸的Dicer底物siRNA (DsiRNA)，已经报道其在某些情况下比对应的常规21-聚体siRNA更有效(Kim等人，2005)。Dicer在体内将DsiRNA加工成有活性的siRNA。
[0029]有活性的siRNA反义链在细胞中形成，并且它识别靶mRNA的靶区。这又会导致RISC内切核酸酶复合物(RISC = RNA诱导的沉默复合物)对靶RNA的切割以及RNA依赖性的RNA聚合酶(RdRP)对额外RNA的合成，这可以激活Dicer并产生额外的siRNA双链体分子，从而放大应答。
[0030]本文中使用的术语“dsRNA”表示siRNA和DsiRNA两者。
[0031]通常，但不一定，dsRNA的反义链和有义链二者包含几个、通常1-3个核苷酸的3’-端突出端。所述3’突出端可以包括一个或多个修饰的核苷酸，诸如2’-O-甲基核糖核苷酸。所述反义链的5’-端通常是磷酸酯基团(P)。具有末端磷酸酯基团(P)的dsRNA双链体比单链反义链更容易施用进细胞中。在某些情况下，有义链的5’ -端或反义链和有义链二者的5’ -端可以包含P基团。
[0032]由于其被存在于活细胞中的核糖核酸酶的降解，正常的、未修饰的RNA在生理条件下具有低稳定性。如果要外源性地施用寡核苷酸，那么非常希望根据已知方法修饰该分子，以便增强其对抗化学和酶促降解的稳定性。
[0033]在本领域中(例如在US 2005/0255487中，通过引用并入本文)广泛描述了要在体内外源性地施用的核苷酸的修饰。基本上可以修饰核苷酸的任何部分，即核糖、碱基和/或核苷酸间磷酸二酯链。例如，从核糖单位除去2’ -OH基团以产生2’ -脱氧核糖核苷酸，会导致提高的稳定性。先前也公开了在该基团处的其它修饰:用烷基、烯基、烯丙基、烷氧基烷基、卤代、氨基、叠氮基或巯基替代核糖2’-OH基团。还可以进行在核糖单位处的其它修饰:含有在核糖的2’-位和4’-位之间的亚甲基连接的锁核酸(LNA)可以用于产生更高的固有稳定性。
[0034]此外，核苷酸间磷酸二酯键可以例如这样进行修饰:使得一个或多个氧被硫、氨基、烷基或烷氧基替代。也可以修饰核苷酸中的碱基。
[0035]优选地，寡核苷酸包含在核糖处的一个或多个2’ -羟基的修饰，和/或一个或多个核苷酸间磷酸二酯键中的修饰，和/或在核糖的2’ -位和4’ -位之间的一个或多个锁核酸(LNA)修饰。
[0036]特别优选的修饰是例如用2’ -脱氧、2’ -O-甲基、2’ -卤代(例如氟代)或2’ -甲氧基乙基替代一个或多个2’-OH基团。特别优选的是这样的寡核苷酸:其中某些核苷酸间磷酸二酯键也被修饰，例如被硫代磷酸酯键替代。
[0037]在某些实施方案中，dsRNA可以含有一种或多种合成的或天然的核苷酸类似物，包括、但不限于，硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性-甲基膦酸酯和肽-核酸(PNA)，只要dsRNA保留它们的CIP2A沉默能力。
[0038]应当指出，上面提及的修饰仅是非限制性例子。
[0039]与RNAi相关的挑战之一是，鉴别对相应mRNA的有效dsRNA。应当指出，具有不完全互补性的基因会被dsRNA非故意地减量调节，从而导致数据解释和潜在毒性方面的问题。但是，这可以通过用设计算法小心地设计适当的dsRNA来部分地解决。这些计算机程序用一组规则筛选给定的靶序列，以发现具有低GC含量的序列段、内部重复序列的缺乏、富含A/U的5末端和高局部自由结合能，这些是增强dsRNA的沉默效应的特征。
[0040]为了鉴别在本发明中有用的试剂，使用商业和非商业算法设计了几种不同的CIP2A siRNA。为此目的，将CIP2A的全长cDNA序列(KIAA1524)装载到siRNA算法程序(Eurofins MWG Operon’s Online Design Tool)和由 Cui 等人(Cui 等人，2004)开发的独立程序。此外，随后通过基因组范围的DNA序列比对(BLAST)筛选算法产生的siRNA序列，以消除没有免于脱靶的siRNA。换而言之，具有与除靶基因(CIP2A)以外的其它基因匹配的更短序列区域的所有那些siRNA被认为对于进一步应用而言是无价值的。
[0041]然后将得到的siRNA转染至不同的细胞系，并通过测量用CIP2A特异性抗体进行siRNA处理以后CIP2A蛋白的量而在蛋白水平研究它们的降解mRNA和进一步缺失CIP2A翻译的能力(表1)。
[0042]表1.CIP2A 特异性的 siRNA
【权利要求】
1.用作药物的至少一类CIP2A沉默剂和选自以下的化合物的组合，所述药物用于治疗包含具有受损的P53功能的细胞的过度增殖障碍: -小分子激酶抑制剂，其选自拉帕替尼、坦度替尼、凡他尼布、达沙替尼、PKC-412、H-7和舒尼替尼； -PARP抑制剂，其选自ABT-888、AG-014699、IND-71677、奥拉帕利和PARP抑制剂III ； -CHKl 抑制剂，其选自 UCN-01、AZD7762、PF-477736、SB 218078 和 G06976 ; -硫代葡萄糖苷，其是吲哚-3-甲醇； -烷化剂，其选自顺钼和替莫唑胺； -植物生物碱，其选自紫杉醇和长春瑞滨； -PI3K/mTOR抑制剂，其选自雷帕霉素和TGX-221 ； -组蛋白脱乙酰基酶抑制剂，其是曲古抑菌素A ; -DNA-PK 抑制剂，其是 NU-7441 ； -STAT抑制剂，其是S31-201 ； -抗代谢药，其是吉西他滨；和 -存活抑制剂，其选自LY2181308、特拉罗考和YM155。
2.根据权利要求1所述的组合，其中所述CIP2A沉默剂选自:siRNA分子、DsiRNA分子、人工miRNA前体、shRNA分子、反义寡核苷酸、核酶和阻止CIP2A向PP2Ac起作用的药剂。
3.根据权利要求2所述的组合，其中所述CIP2A沉默剂包含选自以下的核酸序列:SEQID NO: 1-25，和与所述SEQ ID NO: 1_25具有至少80%序列同一性且保留它们的CIP2A沉默活性的序列。
4.根据权利要求1所述的组合,其用于治疗过度增生性疾病,所述过度增生性疾病选自银屑病、心肌肥大、良性肿瘤、实体癌症和血液学癌症。
5.根据权利要求4所述的组合，其中所述实体癌症选自:头和颈的鳞状细胞癌、结肠癌、胃癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、宫颈癌、食管癌、肺癌、肝癌、脑癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤和胶质母细胞瘤，且所述血液学癌症选自:急性和慢性T-细胞和B-细胞白血病和淋巴瘤。
6.药物组合物，其包含根据权利要求1-5中的任一项所述的组合和至少一种药学上可接受的载体。
7.使过度增生性细胞对化学治疗剂敏化的方法，其通过在需要这种致敏的人或动物对象中使CIP2A基因沉默。
8.在需要这种治疗的人或动物对象中治疗过度增生性疾病的方法，所述方法包括:给所述对象伴随地、同时地或相继地施用至少一类CIP2A沉默剂和选自以下的化合物: -小分子激酶抑制剂，其选自拉帕替尼、坦度替尼、凡他尼布、达沙替尼、PKC-412、H-7和舒尼替尼； -PARP抑制剂，其选自ABT-888、AG-014699、IND-71677、奥拉帕利和PARP抑制剂III ； -CHKl 抑制剂，其选自 UCN-01、AZD7762、PF-477736、SB 218078 和 G06976 ; -硫代葡萄糖苷，其是吲哚-3-甲醇； -烷化剂，其选自顺钼和替莫唑胺； -植物生物碱，其选自紫杉醇和长春瑞滨；-PI3K/mT0R抑制剂，其选自雷帕霉素和TGX-221 ； -组蛋白脱乙酰基酶抑制剂，其是曲古抑菌素A; -DNA-PK 抑制剂，其是 NU-7441 ； -STAT抑制剂，其是S31-201 ； -抗代谢药，其是吉西他滨；和 -存活抑制剂，其选自LY2181308、特拉罗考和YM155。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述CIP2A沉默剂选自:siRNA分子、DsiRNA分子、人工miRNA前体、shRNA分子、反义寡核苷酸、核酶和阻止CIP2A向PP2Ac起作用的药剂。
10.根据权利要求8所述的方法，其中所述CIP2A沉默剂包含选自以下的核酸序列:SEQID NO: 1-25和与所述SEQ ID NO: 1-25具有至少80%序列同一性且保留它们的CIP2A沉默活性的序列。
11.根据权利要求8所述的方法，其用于治疗过度增生性疾病，所述过度增生性疾病选自银屑病、心肌肥大、良性肿瘤、实体癌症和血液学癌症。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述实体癌症选自头和颈的鳞状细胞癌、结肠癌、胃癌、乳腺癌、 卵巢癌、前列腺癌、宫颈癌、脑癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤和胶质母细胞瘤。
13.为需要这种治疗的对象选择癌症治疗的方法，其中所述方法包括:评价得自所述对象的样品中的CIP2A和p53表达和/或蛋白活性，和对于其样品为CIP2A表达和/或活性阴性的和P53活性受损的对象，选择至少一种化学治疗剂的单一疗法，且对于其样品为CIP2A表达阳性的和p53活性受损的对象，选择根据权利要求1所述的组合作为疗法。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述对象患有在权利要求5或6中定义的疾病。
15.试剂盒，其包含用于实践根据权利要求13所述的方法的试剂。
【文档编号】A61K31/4406GK103917228SQ201280054472
【公开日】2014年7月9日 申请日期:2012年9月6日 优先权日:2011年9月6日
【发明者】J.维斯特马克, A.斯杰韦 申请人:图尔库大学