用于选择性递送治疗剂和诊断剂的endo180靶向微粒的制作方法

用于选择性递送治疗剂和诊断剂的endo180靶向微粒的制作方法
【专利摘要】本文公开了包含基于脂质的微粒和抗ENDO180抗体的组合物以及使用它们将治疗剂靶向递送至癌症和纤维化细胞以用于治疗包括纤维化、癌症的细胞增生性疾病或病症和减弱肿瘤进展的方法。
【专利说明】用于选择性递送治疗剂和诊断剂的END0180靶向微粒
[0001]相关申请
[0002]本申请要求2012年I月I日提交的标题为“END0180-Targeted Particles forSelective Delivery of Therapeutic and Diagnostic Agents” 的美国临时申请序列号61/582373的权益并且该专利全文出于所有目的以引用方式并入本文。
[0003]序列表
[0004]本申请通过引用并入存在于文件名为“230-PCTl_SEQLISTING.ST25.txt”中的核苷酸和/或氨基酸序列，所述文件大小为33千字节，并且以与MS-Windows具有操作系统兼容性的IBM-PCT机器格式创建于2012年12月31日。
发明领域
[0005]本文公开了包含载体部分(诸如基于脂质的微粒)和抗END0180靶向部分(诸如抗END0180抗体)的组合物以及使用其将治疗剂和/或诊断剂递送至表达END0180的细胞和组织的方法，所述表达END0180的细胞和组织包括肿瘤细胞、巨噬细胞、内皮细胞和纤维化细胞。所述组合物和方法可用于治疗细胞增生性疾病或病症(包括纤维化、癌症或炎症)并且用于控制(调节)肿瘤进展。
[0006]发明背景
[0007]ENDO180受体，也称为⑶280、uPARAP (尿激酶纤溶酶原激活物受体相关蛋白)和甘露糖受体C2型(MRC2)，为指导结合的配体在胞内体中降解的循环内吞受体。它为与尿激酶型纤溶酶激活物(uPA)和尿激酶型纤溶酶激活物受体(uPAR)形成的三重复合物的部分，并且参与由纤溶酶原生成纤溶酶。进而已知纤溶酶在细胞外基质(ECM)周转(turnover)和潜在的TGF-β至其活性形式的蛋白水解转化中起作用。
[0008]ENDO180与巨噬细胞甘露糖受体家族:甘露糖受体、磷脂酶A2和DEC-205/MR6共享同源性(Isacke 等，1990Mol.Cell.B1l.10:2606-2618 ；Sheikh 等，2000，J.Cell.Sc1.113:1021-1032 ；Behrendt 等，2000，J.B1l.Chem.275:1993-2002)。ENDO180 在甘露糖受体的家族中是不寻常的，因为它由质膜被靶向循环的胞内体而并不靶向晚期胞内体/溶酶体区室(Howard和Isacke, 2002.JBC 35:32320-31)并且在细胞运动和通过促进细胞迁移和摄取用于细胞内降解的胶原来重塑细胞外基质中起作用(Behrendt.2004B1lChem.385 (2): 103-36 ；Kjoller 等，2004Exp Cell Res.293 (I): 106-16 ；ffienke等，2007Cancer Res.67(21):10230-40)。
[0009]PCT专利申请公布号WO 2004/100759分别涉及诊断和治疗与END0180相关的疾病的方法。PCT专利申请公布号WO 2010/111198提供了抗END0180抗体、包含它们的组合物及其用途。
[0010]脂质复合物
[0011]US 2009/0232730公开了用于制备免疫脂质体的方法。US2010/0008937公开了白细胞选择性递送剂。
[0012]用于递送治疗剂和诊断剂的靶向系统将具有很高的价值。
[0013]发明概述
[0014]本文公开了用于将治疗剂和/或诊断剂选择性且靶向递送至异常增生细胞的组合物。所述组合物包含END0180靶向部分和载体部分，还包含治疗剂和/或诊断剂，用于将治疗剂或诊断剂靶向递送至表达END0180受体的细胞。所述组合物可用于将至少一种诊断剂和/或治疗剂靶向递送至表达END0180受体的细胞的细胞内空间，所述至少一种诊断剂和/或治疗剂包括小分子诸如寡核苷酸、抗体或其片段、多肽或肽或它们的组合。不希望受到理论的束缚，END0180受体为在纤维化组织和肿瘤中活化的成肌细胞上以及在肿瘤细胞的亚群上、在巨噬细胞上和在内皮细胞上特异性表达的内吞受体。
[0015]在一个方面，本文公开了一种组合物，其包含a)载体部分；b)END0180靶向部分；和c)有效量的治疗剂和/或诊断剂。
[0016]在一些实施方案中，所述载体部分包括基于脂质的载体，优选脂质微粒(也称为基于脂质的纳米微粒)。在一些实施方案中，所述载体部分和所述靶向部分共价结合或非共价缔合。在优选的实施方案中，所述载体部分包括共价结合至所述靶向部分的脂质微粒。在一些实施方案中，所述脂质微粒和所述靶向部分经由用合成聚合物、天然聚合物或半合成聚合物(包含天然成分和合成成分)对脂质体进行的表面修饰共价结合。在一些实施方案中，所述合成聚合物包含PEG部分。在一些实施方案中，所述PEG部分包括NHS-PEG-DSPE [3-(N-琥珀酰亚氨氧基戊二酰基)氨基丙基，聚乙二醇_氨基甲酰基二硬脂酰磷脂酰-乙醇胺]。在一些实施方案中，所述天然聚合物包括糖类，所述糖类包括多糖和/或糖胺聚糖。在一些实施方案中，所述糖胺聚糖包括透明质酸。
[0017]可以将所述聚合物从头开始掺入到脂质体组合物或可以与制备的脂质微粒组合。
[0018]在一些实施方案中，所述END0180靶向部分包含END0180结合蛋白，所述END0180结合蛋白结合存在于细胞上的END0180多肽的细胞外结构域并通过所述END0180多肽被内化至所述细胞内。在一些实施方案中，所述END0180多肽与列于SEQ ID N0:2的氨基酸序列基本相同，所述氨基酸序列由与列于SEQ ID NO:1的核酸序列基本相同的多核苷酸编码。在一些实施方案中，所述END0180结合蛋白包括END0180抗体或其能够结合END0180的功能片段。
[0019]在一些实施方案中，所述END0180靶向剂选自
[0020]a.分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其由以登记号LMBP7203CB保藏于BCCM的杂交瘤细胞系E3-8D8产生；
[0021]b.与(a)的抗体结合至相同的表位的抗体或其抗原结合片段；
[0022]c.(a)的抗体或其抗原结合片段的人源化形式，或(b)的抗体或抗原结合片段的人源化形式；
[0023]d.(a)的抗体或其抗原结合片段的嵌合形式，或(b)的抗体或抗原结合片段的嵌合形式；
[0024]e.包含(a)的抗体的抗原结合结构域的重组多肽或其抗原结合片段，其通过ENDO180受体被内化至细胞内；
[0025]f.抗体的抗原结合片段，其包含与SEQ ID NO: 6基本相似的多肽；以及
[0026]g.重组多肽，其包含具有与列于SEQ ID NO:7和8的氨基酸序列基本相似的氨基酸序列的⑶R。
[0027]在一些实施方案中，所述抗体或其片段为人源化抗体或嵌合抗体或其片段。
[0028]E3-8D8单克隆抗体也称为8D8、e3b3和8D8E3B3。在优选的实施方案中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段；所述单克隆抗体的人源化形式的抗体或其抗原结合片段；或所述单克隆抗体的嵌合形式的抗体或其抗原结合片段结合于细胞表面上的END0180并被内化至细胞内。
[0029]在一些实施方案中，所述END0180抗体选自:完整的IgG、单克隆抗体、多克隆抗体、人抗体、人源化抗体、Fab片段、Fab’片段、F(ab' ) 2片段、其重链和/或轻链的可变部分、Fab微型抗体(MB)和scFv或它们的组合。在一些实施方案中，所述END0180抗体为结合于与以登记号LMBP 7203CB保藏于BCCM的杂交瘤细胞系E3-8D8产生的单克隆抗体相同表位的抗体或其片段；在一些实施方案中，所述END0180抗体为由以登记号LMBP 7203CB保藏于BCCM的杂交瘤细胞系E3-8D8产生的单克隆抗体的人源化形式的抗体或人源化抗体或其片段。在一些实施方案中，所述END0180抗体为包含含有列于SEQ ID NO:7的氨基酸序列的抗原结合结构域的重组多肽或其保留了特异性结合END0180的能力的变体。在一些实施方案中，所述END0180抗体为包含⑶R(诸如重链⑶R3结构域)的重组多肽，所述重链⑶R3结构域具有与列于SEQ ID NO: 7的氨基酸序列基本相似的氨基酸序列或其含有一个或多个保守氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，所述变体保留了特异性结合END0180的能力。在一些实施方案中，所述抗体还包含CDR，诸如轻链CDR3结构域，所述轻链CDR3结构域具有与列于SEQ ID NO:8的氨基酸序列基本相似的氨基酸序列或其变体。在一些实施方案中，所述变体保留了特异性结合END0180的能力。
[0030]在一些实施方案中，所述END0180靶向部分包含scFv重组多肽，其包含由杂交瘤细胞系E3-8D8 (BCCM登记号LMBP 7203CB)产生的单克隆抗体的抗原结合结构域。
[0031]在一些实施方案中，所述END0180靶向部分包含scFv重组多肽，其包含列于SEQID NO: 6 (微型抗体，MB)的氨基酸序列或其变体，所述变体保留了特异性结合END0180的能力。在具体实施方案中，对END0180受体表现出结合亲和力且包含列于SEQ ID N0S:7和8的CDR3结构域的抗体在抗体与受体接触时通过所述受体被内化至表达END0180的细胞内。
[0032]在一些实施方案中，所述脂质微粒包含磷脂酰胆碱或其衍生物、磷脂酰甘油或其衍生物、或磷脂酰乙醇胺或其衍生物或它们的组合。在一些实施方案中，所述脂质微粒包含二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)、大豆磷脂酰胆碱(大豆PC)、卵磷脂酰胆碱(卵PC)、氢化卵磷脂酰胆碱(HEPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二肉豆蘧酰磷脂酰胆碱(DMPC)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二肉豆蘧酰磷脂酰甘油(DMPG)、二月桂酰磷脂酰甘油(DLPG)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)、二肉豆蘧酰磷脂酸(DMPA)、二硬脂酰磷脂酸(DSPA)、二月桂酰磷脂酸(DLPA)、二棕榈酰磷脂酸(DPPA)中的一种或多种。在一些实施方案中，所述脂质微粒包含阳离子脂质，诸如一种或多种选自DOTMA和DOTP或它们的组合的阳离子脂质。
[0033] 在一些实施方案中，所述脂质微粒包含氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)、大豆磷脂酰胆碱(大豆PC)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)中的一种或多种。在一些实施方案中，所述脂质微粒包含二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)。在一些实施方案中，所述脂质微粒包含1，2-双(二苯基膦基)乙烷(DPPE)。在一些实施方案中，所述脂质微粒还包含胆固醇。在一些实施方案中，所述脂质微粒还包含大豆PC。
[0034]在一些实施方案中，所述脂质微粒包含DOPE和胆固醇。
[0035]在一个实施方案中，所述脂质微粒包含HSPC、胆固醇和DOPE。在其它实施方案中，所述脂质微粒包含DOPE、胆固醇和D0TMA。在其它实施方案中，所述脂质微粒包含HSPCji固醇、DOPE 和 DOTMA。
[0036]在一些优选的实施方案中，脂质微粒包含摩尔比为约4:2:1 (DOPE: D0TMA:Chol)的二油酰磷脂酰乙醇胺(D0PE)、1，2-二-O-十八烯基-3-三甲基铵丙烷(DOTMA)和胆固醇(Choi)。
[0037]在其它优选的实施方案中，所述脂质微粒包含摩尔比为约4.5:20:75:0.5 (DOPE: HSPC:Cho1:NHS-PEG-DSPE)的 DOPE、氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)、胆固醇和 NHS-PEG-DSPE。在一些实施方案中，所述脂质微粒还包含DOTMA。
[0038]在其它优选的实施方案中，所述脂质微粒包含摩尔比为约3:1: 1(大豆PCiDPPE:胆固醇)的大豆PC、1，2_双(二苯基膦基)乙烷(DPPE)和胆固醇。
[0039]在一些实施方案中，所述脂质微粒的直径为约85nm至约300nm,优选小于200nm,诸如直径为约85nm至约150nm。
[0040]在一些实施方案中，所述脂质微粒包含约(-7)至约(-60)，优选约(-7)至(-40)，优选约(-7)至(-18)的ζ电势。
[0041]在一些实施方案中，所述组合物还包含包括诊断剂和/或治疗剂中至少一者的部分。在一些实施方案中，所述诊断剂包含可检测标记，诸如选自放射性同位素、荧光团、发光剂、磁性标记和酶标记的显像剂。
[0042]在一些实施方案中，所述治疗剂包括化疗剂、核酸、肽、多肽或肽模拟物及其功能性片段的抗体中的一种或多种。在一些实施方案中，所述化疗剂为小分子。在一些实施方案中，所述小分子为多柔比星(doxorubicin)或丝裂霉素(doxorubicin)。
[0043]在一些实施方案中，所述治疗剂选自核酸和非核酸。
[0044]在一些实施方案中，所述非核酸化合物选自小分子、肽、多肽、肽模拟物、糖脂和抗体或它们的组合。
[0045]在一些实施方案中，所述治疗剂为选自以下的核酸:反义化合物、化学修饰的dsRNA化合物、未修饰的dsRNA化合物、化学修饰的siRNA化合物、未修饰的siRNA化合物、化学修饰的shRNA化合物、未修饰的shRNA化合物、化学修饰的miRNA化合物和未修饰的miRNA化合物、核酶或它们的组合。在各种优选的实施方案中，所述治疗剂为化学修饰的siRNA。在一些优选的实施方案中，所述治疗剂为未修饰的siRNA化合物。
[0046]在一些优选的实施方案中，所述脂质微粒包含二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、1，2- 二 -O-十八烯基-3-三甲基铵丙烷(DOTMA)和胆固醇(Chol)、透明质酸、抗END0180抗体或人源化或嵌合抗END0180抗体的抗原结合片段以及选自多柔比星、丝裂霉素C和治疗性核酸分子的治疗剂。在一些实施方案中，所述二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、1，2- 二 -O-十八烯基-3-三甲基铵丙烷(DOTMA)和胆固醇(Chol)以约4:2:l(D0PE:D0TMA:Chol)的摩尔比存在。
[0047]在其它优选的实施方案中，所述脂质微粒包含DOPE、氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)、胆固醇和NHS-PEG-DSPE、抗END0180抗体或人源化或嵌合抗END0180抗体的抗原结合片段以及选自多柔比星、丝裂霉素C和治疗性核酸分子的治疗剂。在一些实施方案中，所述脂质微粒还包含DOTMA。在一些实施方案中，所述DOPE、氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)、胆固醇和 NHS-PEG-DSPE 以约 4.5:20:75:0.5 (DOPE:HSPC:Chol:NHS-PEG-DSPE)的摩尔比存在。
[0048]在其它优选的实施方案中，所述脂质微粒包含大豆PC、1，2-双(二苯基膦基)乙烷(DPPE)和胆固醇、透明质酸、抗END0180抗体或人源化或嵌合抗END0180抗体的抗原结合片段以及选自多柔比星、丝裂霉素C和治疗性核酸分子的治疗剂。在一些实施方案中，所述大豆PC、1，2-双(二苯基膦基)乙烷(DPPE)和胆固醇以约3:1:1(大豆PC:DPPE:胆固醇)的摩尔比存在。
[0049]在另一方面，本文提供了治疗患有增生性病症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的组合物，所述组合物包含a)载体部分；b)END0180祀向部分和c)治疗剂。
[0050]在另一方面，本文提供了用于治疗的组合物，所述组合物包含a)载体部分；b)END0180靶向部分和c)治疗剂。
[0051]在另一方面，本文提供了用于治疗增生性病症的组合物，所述组合物包含a)载体部分；b)END0180靶向部分和c)治疗剂。
[0052]在一些实施方案中，所述组合物被全身施用。
[0053]在一些实施方案中，所述增生性病症选自实体瘤、造血系统肿瘤、转移、纤维化和巨噬细胞相关的病症。在一些实施方案中，所述增生性病症为实体瘤或造血系统肿瘤。
[0054]在一些实施方案中，所述肿瘤为卵巢肿瘤、乳腺肿瘤、成骨性癌/骨细胞性癌、前列腺癌、头颈癌、白血病、肾细胞癌或移行细胞癌。
[0055]在一些实施方案中，所述纤维化为肝纤维化、骨髓纤维化、出于任何原因的肾纤维化(CKD，包括晚期肾病，ESRD);肺纤维化(包括间质性肺纤维化ILF);与所有可能类型的皮肤意外损伤和医源性损伤(操作)相关的异常疤痕(瘢痕瘤)；硬皮病；心肌纤维化、青光眼滤过术故障；肠粘附。
[0056]在一些实施方案中，所述巨噬细胞相关的病症为炎症或动脉粥样硬化。
[0057]疾病和病症的非限制性实例包括:
[0058]1.其中END0180在肿瘤和肿瘤基质细胞(活化的肌成纤维细胞、新血管系统和巨噬细胞-单核细胞系的浸润细胞)中表达的软组织肉瘤；
[0059]2.其中END0180在肿瘤基质细胞(活化的肌成纤维细胞、新血管系统和巨噬细胞-单核细胞系的浸润细胞)中表达的癌；
[0060]3.表达END0180并经历上皮-间质转换从而获得高转移潜力的癌；
[0061]4.例如由巨噬细胞-单核细胞系表达END0180的白血病；
[0062]5.例如具有活化的肌成纤维细胞的肾脏、肺和肝脏的纤维化疾病
[0063]6.与巨噬细胞相关的疾病和病症，包括动脉粥样硬化和慢性炎症。
[0064]在另一方面，本文提供了诊断受试者的增生性病症的方法，所述方法包括使来自所述受试者的生物样品与包含a)载体部分；b)END0180靶向部分和c)诊断剂的组合物接触；并将生物样品中诊断剂的水平与参考样品(诸如来自健康受试者的生物样品)中诊断剂的水平进行比较。
[0065]在一些实施方案中，用于诊断的生物样品可以取自体液或取自组织。在一些实施方案中，所述体液选自以下流体:血液、淋巴液、腹水、浆液、胸腔积液、痰液、脑脊髓液、泪液、滑液、唾液、粪便、精液、血液和尿液。
[0066]在以下附图、发明详述和权利要求书中更详细地解释本发明。
[0067]附图简述
[0068]图1提供了产生用于核酸(NA)分子递送的靶向纳米微粒的方法的示意图。
[0069]图2A和2B示出了与I μ g/ml抗END0180mAb ;克隆8D8、克隆10C12、微型抗体和第二抗体FITC山羊抗小鼠(1.5 μ g/ml)温育的NRK-ENDO180 (2A)、A549 (2B)细胞系的流式细胞术分析。为清楚起见，对示出结合于抗END0180的细胞的峰进行了标记。
[0070]图3A和3B示出了与I μ g/ml抗END0180mAb ;克隆8D8、克隆10C12和微型抗体以及第二抗体 FITC 山羊抗小鼠(1.5 μ g/ml)温育的 LLC END0180 (3A)、DU145END0180 (3B)细胞系的流式细胞术分析。为清楚起见，对示出结合于抗END0180的细胞的峰进行了标记。[0071 ]图 4A-4D 示出了与 I μ g/ml 抗 END0180mAb 温育的 DU145END0180 (4A)、DU145 初始细胞(4B)、NRK END0180(稳定转染)(4C)和A549 (4D)细胞系的流式细胞术分析；与对照未染色的细胞(红线，在所有图中最左边的峰)相比，将克隆8D8(橙线，在所有图中最右边的峰)和微型抗体(新批次,蓝线,在所有图中中间的峰)均用Alexa fluor_647标记。
[0072]图5A-5D使用共聚焦显微镜示出了将END0180mAb: 8D8mAb内化至NRK-ENDO180 (5A)将新的批次的微型抗体内化至A549细胞系(5B)和将8D8mAb内化至A549(5C和5D)的细胞。在37°C与Alexa488标记的mAb (红色，左锋)，(每个为5.0 μ g/ml)、Hoechst (天蓝色，H33342 ) 1:10，000、Cell Tracker? (绿色，Di 1C18 (5)-DS 1:5000)温育I小时。图5A和5c中的箭头示出了指示细胞中存在标记的抗体的荧光。
[0073]图6A-6D示出8D8HA-脂质微粒(用若丹明-DPPE制备，50ul)至A549的内化:将细胞用Concavalin A(l.5ug/ml)和Hoechst试剂(1:10, 000)染色分别用于膜和核标记。6A.将细胞在37°C下仅与脂质微粒温育Ih。6B，6C-在37°C下与涂覆有8D8的脂质微粒温育Ih-检测特异性内化。6D.在4°C下8D8脂质微粒的温育(X525)-未观察到进入。
[0074]图7A-7D示出8D8HA-脂质微粒至NRK细胞的内化:将细胞用ConcavalinA (1.5ug/ml)和Hoechst试剂(1:10，000)染色分别用于膜和核标记。7A.将NRK初始细胞在37°C下仅与脂质微粒温育lh。7B.将NRK初始细胞在37°C下与8D8脂质微粒温育lh。7C.将NRK END0180在37°C下与8D8脂质微粒温育lh。7D.将NRK-END0180在37°C下仅与HA-脂质微粒温育Ih (X525)。*NRK-END0180细胞用支原体污染。图8示出了当抗体经由PEG间隔基与脂质缀合时由于脂质微粒-抗体组合物(8D8-NP)与NRK-END0180细胞的结合而产生的荧光移动。IgG-Np是指缀合于IgG抗体的脂质微粒。
[0075]图9描述了多柔比星(DOX)经由8D8-NP特异性递送至NRK-END0180细胞之后表达END0180的细胞的减少的细胞存活。细胞存活使用XTT测定测量。
[0076]图 10 示出了 8D8AF 488-NP 与 NRK-END0180 的结合。
[0077]图1lA和IlB示出了 Cy3_siRNA至表达NRK-END0180的细胞的递送。
[0078]图12示出了显示Cy3_siRNA摄取进入NRK52-END0180细胞的多层光切(Z-Stack)图像。
[0079]图13示出了经由定位的8D8-NP递送至核周焦点的Cy3_siRNA(白色箭头)，其中在核周焦点也定位了 RNAi机构。
[0080]图14为示出使用包封MMC的END0180靶向的脂质纳米微粒的END0180+细胞的减少细胞存活的图。XTT测定在温育72h后进行。每个条表示16个孔/处理的平均值和数据点之间的SD。呈现的数据代表三次独立实验。
[0081]图15A和15B示出暴露于包封siRNA与RAC(siRACl)的8D8-NP的A549细胞系中RacImRNA (示出的残余mRNA的水平)的体外敲低。
[0082]图16A-16D呈现描绘鼠癌症模型中siRNA在用包封Cy5_Racl_28的涂覆有END0180的纳米微粒(NP)处理的小鼠中的各个身体器官的生物分布的图。每mg组织样品中存在的siRNA的量(埃摩尔)在用不同组合物处理的动物中呈现。
[0083]图17A-17D呈现描绘包封Racl_28的涂覆有END0180的纳米微粒(NP)在来自鼠癌症模型的肿瘤和肾脏中的生物分布的图。每mg组织样品中存在的siRNA的量(埃摩尔)在用不同组合物处理的动物中呈现。
[0084]发明详述
[0085]定义
[0086]为了方便起见，本文描述在说明书、实施例和权利要求中使用的某些术语。
[0087]应注意，如本文所用，单数形式“一种”、“一个”和“该”包括复数形式，除非内容中另外明确指不。
[0088]其中方面或实施方案按照马库什组(Markush group)或替代物的其它分组描述，本领域技术人员将认识到方面或实施方案从而也按照组中的任何单个成员或成员的亚组描述。
[0089]在本文中可互换使用的术语“靶向剂”或“靶向部分”是指优先与特定靶标缔合或结合的药剂，所述靶标可以包括特定的细胞类型或组织类型、蛋白质(包括例如受体)、感染剂或其它目标靶标。适用于所公开组合物的靶向剂必须在生理条件下对靶标具有足够的结合亲和力以通过所需的递送方法(如、体内、体外、离体)选择性地识别并结合至表达靶标的合适的细胞类型。靶向剂的实例包括但不限于寡核苷酸(包括适体)、抗原、抗体或其功能片段、配体、受体、特异结合对中的一员，聚酰胺(包括对生物受体具有亲和力的肽或肽模拟物)、寡糖、，多糖、类固醇或类固醇衍生物、激素、激素模拟物(例如，吗啡)或对靶标具有结合特异性的其它化合物。在本文公开的方法中，靶向部分促进递送系统至目标靶标(即，表达END0180受体的细胞)的递送。
[0090]本文公开的递送系统可以利用一种或多种不同的靶向剂。可使用特定递送剂上每种具有它们自己的结合靶标的多种靶向剂以有利于至较广泛的细胞类型(不止一种细胞类型)递送，或可替代地至较窄的靶细胞类型递送。
[0091]表现出所需结合活性(特异地结合所需的细胞表面抗原)的抗体及其功能片段或衍生物为有用的靶向部分。如本文所用，“抗体”或抗体的“功能片段”涵盖表现出所需的特异性结合活性的抗体或其衍生物。这包括但不限于多克隆抗体和单克隆抗体以及包含杂合抗体或嵌合抗体(诸如人源化抗体)、变异抗体(altered antibody)、抗体片段(诸如F (ab’) 2片段、F (ab)片段、包括ScFv的Fv片段)、单结构域抗体，二聚和三聚抗体片段构建体，微型抗体及其功能片段的制剂，它们表现出亲本抗体分子的免疫结合特性和/或结合细胞表面抗原，即ENDO180受体。
[0092] 如本文所公开的“脂质微粒”也可以称为“载体部分”并且是指但不限于可以包含非脂质组分的脂质微粒。本文公开了包含脂质微粒的组合物。本文公开的组合物包含脂质微粒，所述脂质微粒已经通过连接靶向部分而修饰。
[0093]如本文所公开的脂质微粒在本文也被称为基于脂质的纳米微粒。脂质体为含有包埋水体积的封闭的脂质双层膜。脂质体可以为具有单个膜双层的单层囊泡(ULV)或具有特征在于多个双层膜的洋葱状结构的多层囊泡(MLV)，其中每个双层膜与下一个双层膜通过水层分离。在一个优选的实施方案中，本文公开的脂质微粒为单层囊泡。双层由两个脂质单层组成，所述脂质单层具有疏水性“尾部”区域和亲水性“头部”区域。膜双层的结构使得脂质单层的疏水性(非极性)“尾部”朝向双层的中央定向，而亲水性“头部”朝向水相定向。
[0094]本文公开的基于脂质的纳米微粒可以由本领域熟知的且常规用于制备脂质体的脂质材料的组合制备。脂质体涵盖较坚硬的类型诸如鞘磷脂，或流体类型诸如具有不饱和酰基链的磷脂。“磷脂”指任何一种磷脂或能够形成脂质体的磷脂的组合。磷脂酰胆碱(PC)，包括获自蛋、大豆或其它植物来源的磷脂酰胆碱或部分或完全是合成的磷脂酰胆碱，或具有可变脂质链长和不饱和的磷脂酰胆碱是适用的，如本文所公开。合成的、半合成的和天然产物磷脂酰胆碱，包括但不限于二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)、大豆磷脂酰胆碱(大豆PC)、卵磷脂酰胆碱(卵PC)、氢化卵磷脂酰胆碱(HEPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)和二肉豆蘧酰磷脂酰胆碱(DMPC)，为用于本文公开的组合物的合适的磷脂酰胆碱。所有这些磷脂可商购获得。此外，磷脂酰甘油(PG)和磷脂酸(PA)、磷脂酰乙醇胺(PE)也为用于本文公开的组合物的合适的磷脂，并且包括但不限于二肉豆蘧酰磷脂酰甘油(DMPG)、二月桂酰基磷脂酰甘油(DLPG)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二肉豆蘧酰磷脂酸(DMPA)、二硬脂酰磷脂酸(DSPA)、二月桂酰磷脂酸(DLPA)和二棕榈酰磷脂酸(DPPA)。当用于组合物时，二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)为优选的带负电荷的脂质。其它合适的磷脂包括磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、 鞘磷脂和含有月桂酸链、肉豆蘧酸链、硬脂酸链、棕榈酸链的磷脂酸。为了稳定脂质膜，优选添加另外的脂质组分，诸如胆固醇(Choi)。用于制备本文公开的基于脂质的纳米微粒的某些优选的脂质包括磷脂酰乙醇胺(PE)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)和与胆固醇(CH)进一步组合的磷脂酰胆碱(PC)。其它合适的脂质包括阳离子脂质N-[1-(2，3-二油基氧基)丙基]-N，N，N-三甲基氯化铵(DOTMA)和N-[1-(2，3-二油酰基氧基)丙基]-N，N，N-三甲基氯化铵(DOTAP)及其类似物。
[0095]非阳离子脂质包括二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)、棕榈酰油酰-磷脂酰乙醇胺(POPE)和二油酰-磷脂酰乙醇胺4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(DOPE-mal)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蘧酰磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)、16-0-单甲基PE、16-0- 二甲基PE、18-1-反式PE、1-硬脂酰_2_油酰-磷脂酰乙醇胺(SOPE)、固醇(如，胆固醇)及其混合物。
[0096]在一些实施方案中，用于制备本文公开的脂质体的脂质和胆固醇的组合包含约3:1:1 或约 4:2:1 的 PE:PC:Chol 摩尔比。
[0097]本发明的基于脂质的纳米微粒可以通过本领域技术人员已知的任何方法获得。例如，本文公开的脂质微粒制剂可通过反相蒸发(REV)方法(参见美国专利号4，235，871)、注入过程或去垢剂稀释制备。用于制备脂质体的这些和其它方法的综述可见于文本Liposomes, Marc Ostro 编辑，Marcel Dekker, Inc., New York, 1983,第 I 章，也参见 SzokaJr.等,(1980, Ann.Rev.B1phys.B1eng., 9:467)。用于形成 ULV 的方法描述于 Cullis 等，1986年 I 月 16 日，标题为“Extrus1n Technique for Producing Unilamellar Vesicles，，的PCT公布号87/00238。多层脂质体(MLV)可通过脂质-膜方法制备，其中脂质被溶解在氯仿-甲醇溶液(3:1，体积/体积)中，在减压下蒸发至干燥并通过溶胀溶液水合。然后，使溶液经受充分搅拌并例如在37°C下温育2小时。在温育之后，通过挤出获得单层脂质体(ULV)。挤出步骤通过将脂质体的尺寸减小至优选的且基本均一的平均直径来修饰脂质体。或者，可以使用诸如过滤或其它尺寸选择技术等的技术来选择所需尺寸的脂质体。尽管本文公开的选择尺寸的脂质体具有小于约200nm的平均直径，但优选的是选择小于约150nm的平均直径，特别优选的是约90-150nm的平均直径。当本文公开的脂质微粒为单层脂质体时，优选的是选择小于约200nm的平均直径。本文公开的最优选的单层脂质微粒具有小于约150nm的平均直径。
[0098]可以修饰基于脂质的纳米微粒的外表面以有利于连接靶向部分。此类修饰的一个实例为用天然或合成聚合物，例如聚乙二醇(PEG)或透明质酸(HA)修饰基于脂质的纳米微粒的外表面。其它聚合物包括糖类，诸如海藻糖、蔗糖、甘露糖或葡萄糖。在一个优选的实施方案中，基于脂质的纳米微粒用HA涂覆。不希望受到理论的束缚，HA用作长循环剂(long-circulating agent)和冷冻保护剂。可以将所述聚合物从头开始掺入到脂质体组合物或可以与制备的基于脂质的纳米微粒组合。
[0099]可以将基于脂质的纳米微粒的外表面用试剂进一步修饰以增强将基于脂质的纳米微粒摄取进入目标组织并防止或减少将基于脂质的纳米微粒摄取进入细胞内皮系统。用亲水性聚合物作为长循环剂修饰基于脂质的纳米微粒延长血液中基于脂质的纳米微粒的半衰期。适合使用的亲水性聚合物的实例包括聚乙二醇(PEG)、聚甲基乙二醇、聚羟基丙二醇、聚丙二醇、聚甲基丙二醇和聚羟基环氧丙烷(polyhydroxypropylene oxide)。也可以将糖胺聚糖(例如，透明质酸)用作长循环剂。
[0100]基于脂质的纳米微粒通过连接祀向部分修饰。在一个实施方案中，将所述祀向部分共价缀合至冷冻保护剂，如HA。这可通过使用交联试剂(如戊二醛(GAD)、双功能环氧乙烷(OXR)、乙二醇二缩水甘油醚(E⑶E)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和水溶性碳二亚胺，例如1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC))来实现。如本领域技术人员所知，可使用任何化学交联剂，包括但不限于硫醚、硫酯、马来酰亚胺和硫醇、胺-羧基、胺-胺等。通过交联，建立靶向部分的胺残基和基于脂质的纳米微粒的连接。
[0101]修饰的基于脂质的纳米微粒由空微-或纳米级脂质体制备，所述脂质体由当时已知的任何脂质体材料通过本领域技术人员已知的任何方法制备。基于脂质的纳米微粒优选用第一层表面修饰通过共价结合修饰。第一层优选包含聚合物诸如PEG或糖胺聚糖诸如透明质酸。通过共价连接至第一层，可以向此添加第二层的表面修饰。第二层包含如本文描述的靶向剂或部分，如，抗体或其功能片段。可以将另外的层添加至基于脂质的纳米微粒的另外的试剂(如另外的靶向部分)。或者，第二层可以包含靶向部分的多相混合物。在添加最后层之后，可以冻干基于脂质的纳米微粒组合物。可以通过将基于脂质的纳米微粒用含有治疗剂或诊断剂的水溶液再水合由基于脂质的纳米微粒包封目标治疗剂。在制备基于脂质的纳米微粒期间，可以将难溶于水溶液的治疗剂或疏水性的药剂添加至组合物。在添加第一层之后的任何时间，任选使基于脂质的纳米微粒组合物冻干和复水。
[0102]在一个实施方案中，两种目标药剂(如，治疗剂)可通过脂质微粒递送。一种药剂可为疏水的，并且另一种为亲水的。在形成脂质微粒期间，可以将疏水性药剂添加至脂质微粒。疏水性药剂与脂质微粒的脂质部分缔合。将亲水性药剂添加至使冻干脂质微粒再水化的水溶液中。两种药剂递送的示例性实施方案描述如下:其中浓缩的siRNA被包封在基于脂质的纳米微粒中并且其中难溶于水溶液的药物与脂质微粒的脂质部分缔合。如本文所用，“难溶于水溶液”是指小于约10%溶于水的组合物。
[0103]除了脂质，所述脂质微粒还可以包含另外的药剂，所述另外的药剂包括天然或合成聚合物，包括蛋白质或非蛋白质聚合物。可以类似于本文描述的针对基于脂质的纳米微粒载体部分的修饰对此类脂质微粒进行修饰和增强。所述脂质微粒还可以包含合成聚合物诸如聚(乳酸)(PLA)和聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)。在另一个实施方案中，所述组合物还包含蛋白质(如多肽)或蛋白质的核酸结合结构域。在一个实施方案中，所述结合部分为选自以下的蛋白质的核酸结合结构域:存在于选自鱼精蛋白、60财108、扣11、了?115、FMR1、酵母蛋白HX、Vigillin, Merl、细菌多核苷酸磷酸化酶、核糖体蛋白S3和热休克蛋白的蛋白中核酸结合结构域。在一个实施方案中，所述结合部分为鱼精蛋白或鱼精蛋白的RNA干扰-诱导分子结合片段。
[0104]“抑制剂”为能够将基因的表达或这种基因的产物的活性减少(部分或完全)至足以实现所需生物或生理作用的程度的化合物。本文所用术语“抑制剂”包括核酸抑制剂，包括siRNA、shRNA、合成shRNA ；miRNA ;反义RNA和DNA以及核酶中的一种或多种。“抑制性核酸”包括反义化合物、化学修饰的siRNA化合物、未修饰的siRNA化合物、化学修饰的shRNA化合物、未修饰的shRNA化合物、化学修饰的miRNA化合物和未修饰的miRNA化合物。
[0105]“siRNA抑制剂”为能够将基因的表达或这种基因的产物的活性减少至足以实现所需生物或生理作用的程度的化合物。本文所用术语“siRNA抑制剂”是指siRNA、shRNA、合成shRNA、miRNA中的一种或多种。也可以将抑制称为下调,或者对于RNAi来说称为沉默。
[0106]本文所用术语“抑制”是指将基因的表达或这种基因的产物的活性减少至足以实现所需生物或生理作用的程度。抑制可以是完全的或部分的。如本文所用，术语“END0180基因”被定义为与SEQ ID NO:1的氨基酸编码区域或在高度严格杂交条件下结合于END0180基因的核酸序列具有优选90%同源性、更优选具有95%同源性、并且甚至更优选具有98%同源性的END0180基因的任何同源物，所述高度严格杂交条件在本领域为熟知的(例如，参见 Ausubel 等，Current Protocols in Molecular B1logy, John Wiley 和Sons, Baltimore, Maryland (1988)，在 1995 年和 1998 年更新)。
[0107]如本文所用，术语“END0180”或“END0180多肽”或“END0180受体”被定义为与SEQ ID N0:2具有优选至少90%同源性、更优选具有至少95%同源性、并且甚至更优选具有至少98%同源性或100%同一性的END0180多肽的任何同源物、定义为全长或其片段或其结构域、定义为由剪接变体核酸序列编码的突变体或多肽、定义为与其它多肽的嵌合体，条件是上述任一者具有与END0180受体相同的或基本上相同的生物学功能。END0180多肽或END0180多肽同源物可以以不同的形式存在，包括但不限于可溶性蛋白、膜-结合(在纯化的膜制备物或在细胞表面上)、珠结合或呈现END0180蛋白或其衍生的片段和多肽的任何其它形式。本文所用术语“抑制”是指将基因的表达或这种基因的产物的活性减少至足以实现所需生物或生理作用的程度。抑制是完全的或部分的。
[0108]术语“mRNA多核苷酸序列”、“mRNA序列”和“mRNA”可互换使用。
[0109]如本文所用，术语“多核苷酸”和“核酸”可以互换使用并且是指包含脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)的核苷酸序列。应当理解所述术语包括作为等同物的由核苷酸类似物制成的RNA或DNA的类似物。在整个本申请中，将mRNA序列列为表示对应的基因。
[0110]“寡核苷酸”或“寡聚物”是指约2个至约50个核苷酸的脱氧核糖核苷酸序列或核糖核苷酸序列。每个DNA或RNA核苷酸可以独立地为天然的或合成的、并且或修饰的或未修饰的。修饰包括糖部分、碱基部分和或寡核苷酸的核苷酸间的键合的改变。本文公开的核酸分子涵盖包括脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的脱氧核糖核苷酸、修饰的核糖核苷酸和它们的组合的分子。
[0111]如本文所用，术语“核酸分子”或“核酸”可互换使用并且是指寡核苷酸、核苷酸或多核苷酸。“核酸分子”的变型在本文得到更详细的描述。如本文所述，核酸分子涵盖单链(即反义)和双链分子(即dsRNA、siRNA)、修饰的核酸分子和未修饰的核酸分子。核酸分子可以包括任何组合的脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的核苷酸或核苷酸类似物。
[0112]“基本上互补”是指与另一个序列大于约84%的互补性。例如，在由19个碱基对组成的双链体区域，一次错配导致94.7%的互补性，两次错配导致约89.5%的互补性，并且3次错配导致约84.2%的互补性，从而使得双链体区域基本上互补。因此“基本上相同”是指与另一序列大于约84%的同一性。
[0113] 如本文公开的“接头”为例如将抗体连接至治疗性分子或将抗体连接至脂质或将抗体连接至GAG或将GAG连接至脂质的核苷酸或非核苷酸部分。在一些实施方案中，所述接头为可裂解部分。优选的可裂解基团包括二硫键、酰胺键、硫代酰胺键、酯键、硫酯键、邻二醇键或半缩醛。其它可裂解键包括酶可裂解的键，诸如肽键(由肽酶裂解)、磷酸键(由磷酸酶裂解)、核酸键(由内切核酸酶裂解)和糖键(由糖苷酶裂解)。
[0114]在一些实施方案中，所述接头非核苷酸接头，包括肽接头。肽序列的选择对于缀合物的成功至关重要。在一些实施方案中，所述接头对血清蛋白酶是稳定的，但由靶细胞中的溶酶体酶裂解。在非限制性实例中，所述接头为选自以下的肽:列于美国5574142的接头、鱼精蛋白、鱼精蛋白的片段、(Arg)9、生物素-亲和素、生物素-链霉亲和素和触足肽(antennapedia peptide)。例如,肽接头被用于将抗体连接至基于核酸的治疗剂。其它非核苷酸接头包括约5个原子至约100个原子的烷基或芳基链。
[0115]在一些实施方案中，所述接头为核苷酸接头。在某些实施方案中，所述核酸接头的长度范围为2-100、优选2-50或2-30个核苷酸。
[0116]寡核苷酸的化学修饰
[0117]在一些实施方案中，所述治疗剂和/或诊断剂包含寡核苷酸分子。在一些实施方案中，所述寡核苷酸为单链或双链的。在一些实施方案中，所述寡核苷酸为反义或RNAi试剂。
[0118]“核苷酸”意图涵盖脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸，其可以为天然的或合成的和/或修饰的或未修饰的。修饰包括糖部分、碱基部分和/或寡核糖核苷酸的核糖核苷酸间的键合的改变。如本文所用，术语“核糖核苷酸”涵盖天然和合成的、未修饰的和修饰的核糖核苷酸。修饰包括糖部分、碱基部分和/或寡核苷酸的核糖核苷酸间的键合的改变。
[0119]用于制备治疗剂的核苷酸(即核酸分子)包括天然存在的或合成修饰的碱基。天然存在的碱基包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶。核苷酸的修饰碱基包括肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、6-甲基、2-丙基和其它烷基腺嘌呤、5-卤代尿嘧啶、5-卤代胞嘧唳、6-氮杂胞嘧唳和6-氮杂胸腺嘧唆、假尿嘧唆、4-硫脲嘧唆、8-卤代腺嘌呤、8-氨基腺嘌呤、8-硫醇腺嘌呤、8-硫醇烷基腺嘌呤、8-羟基腺嘌呤和其它8-取代的腺嘌呤、8-卤代鸟嘌呤、8-氨基鸟嘌呤、8-硫醇鸟嘌呤、8-硫代烷基鸟嘌呤、8-羟基鸟嘌呤和其它取代的鸟嘌呤、其它氮杂和脱氮腺嘌呤、其它氮杂和脱氮鸟嘌呤、5-三氟甲基尿嘧啶和5-三氟胞嘧啶。在一些实施方案中，寡聚物中的一个或多个核苷酸被肌苷取代。
[0120]根据本文提供的一些实施方案为包含未修饰的和修饰的核苷酸和/或非常规部分的抑制性寡核苷酸化合物。在某些实施方案中，治疗剂为寡核苷酸/核酸分子。在各种优选实施方案中，治疗剂为双链寡核苷酸并且优选为siRNA。在一些实施方案中，化学修饰的siRNA分子为优选的。
[0121]已广泛报道了对应于已知基因的siRNA的选择和合成；(参见例如 U1-Tei 等，2006.J B1med B1technol.;2006:65052 ; Chalk 等，2004.BBRC.319(1):264-74 ；S1ud 和 Leirdal, 2004.Met.Mol B1l.；252:457-69 ；Levenkova等，2004，B1inform.20( 3):430-2 ;Ui_Tei 等，2004.NAR 32 (3):936-48)。
[0122]例如修饰的siRNA的用途和制备参见例如Braasch等，2003.B1chem.，42 (26):7967-75 ；Chiu 等，2003，RNA,9 (9): 1034-48 ;PCT 公布 WO2004/015107(atugen AG)和 WO 02/44321(Tuschl 等)。美国专利号 5,898,031 和6，107，094教导了化学修饰的寡聚物。美国专利号7，452，987涉及具有交替的未修饰的和2’糖修饰的核糖核苷酸的寡聚化合物。美国专利公布号2005/0042647描述了具有化学修饰的核苷间键合的dsRNA化合物。
[0123]Amarzgu1ui 等(2003, NAR, 31 (2):589-595)示出 siRNA 活性取决于 2’ -O-甲基修饰的定位。Holen等(2003，NAR，31 (9):2401-2407)报道与野生型相比具有小数目的2’ -O-甲基修饰的核苷的siRNA示出良好的活性但是随着2’-0_甲基修饰的核苷的数目增加，所述活性降低。Chiu和Rana (2003，RNA, 9:1034-1048)提出相对于未修饰的siRNA，将2’ -O-甲基修饰的核苷掺入有义或反义链(完全修饰的链)严重降低siRNA活性。据报道在反义链上5'-末端处放置2’ -O-甲基基团严重限制活性然而在反义链的3'-末端处和有义链的两端处放置为耐受的(Czauderna等，2003, NAR, 31 (11)，2705-2716)。
[0124]据此通过引用整体并入的PCT专利申请号PCT/IL2008/000248和PCT/IL2008/001197公开了用于制备化学修饰的siRNA化合物的基序。PCT专利公布号WO2008/020435公开了本文列出的靶基因的抑制剂，包括一些siRNA化合物。
[0125]所述化合物包含至少一种选自以下的修饰的核苷酸:糖修饰、碱基修饰和核苷酸间键合的修饰并且可以含有DNA和修饰的核苷酸诸如LNA (锁核酸),ENA (亚乙基-桥接的核酸)、PNA (肽核酸)、阿糖胞苷、膦酸羧酸酯(phosphonocarboxylate)或膦酸羧酸酯核苷酸(PACE核苷酸)、镜像核苷酸或具有6碳糖的核苷酸。
[0126]核苷酸/寡核苷酸的所有类似物或修饰可以与本文公开的组合物一起使用，条件是所述类似物或修饰基本上不会不利地影响核苷酸/寡核苷酸的功能。可接受的修饰包括糖部分的修饰、碱基部分的修饰、核苷酸间键合的修饰和它们的组合。
[0127]糖修饰包括糖残基的W部分上的修饰且涵盖氨基、氟、烷氧基如甲氧基、烷基、氨基、氟、氯、溴、CN、CF、咪唑、羧酸酯、硫酯、C1至Cltl低级烷基、取代的低级烷基、烷芳基或芳烷基、OCF3> 0CN、O-、S-或 N-烷基；0-、S 或 N-烯基；S0CH3 ；SO2CH3 ；0N02 ；NO2,N3 ;杂环烷基；杂环烷芳基；氨基烷基氨基；聚烷基氨基或取代的甲硅烷基等，如欧洲专利EP O 586 520BI或EP O 618 925 BI中所描述。
[0128]在一个实施方案中，所述siRNA化合物包含至少一个核糖核苷酸，所述核糖核苷酸在糖部分上包含2’修饰(“2’糖修饰”)。在某些实施方案中，所述化合物包含2’-O-烷基或2’-氟或2’-O-烯丙基或任选地在其它位置上的任何其它2’修饰。其它稳定化的修饰也是可能的(如末端修饰)。在一些实施方案中，优选的2’O-烷基为2’O-甲基(甲氧基)糖修饰。
[0129]在一些实施方案中，所述寡核苷酸的主链被修饰并且包含磷酸-D-核糖实体但是也可能含有硫代磷酸-D-核糖实体、三酯、硫酯、2’-5’桥接的主链(也可以称为5’-2’)、PACE 等。
[0130]如本文所用，术语“非配对的核苷酸类似物”意指包含非碱基配对部分的核苷酸类似物，包括但不限于:6脱氨基(des amino)腺苷(Nebularine)、4_Me_吲哚、3-硝基吡咯、5-硝基吲哚 、Ds、Pa、N3-Meribo U、N3_Me riboT、N3_Me dC、N3-Me_dT、Nl-Me-dG、Nl-Me-dA、N3-乙基-dC、N3-Me dC。在一些实施方案中，所述非碱基配对核苷酸类似物为核糖核苷酸。在其它实施方案中，其为脱氧核糖核苷酸。另外，可以制备多核苷酸的类似物，其中一个或多个核苷酸的结构根本地改变并且更适合作为治疗试剂或实验试剂。核苷酸类似物的一个实例为肽核酸(PNA)，其中DNA (或RNA)中的脱氧核糖(或核糖)磷酸主链被聚酰胺主链代替，这与肽中发现的相似。已经示出PNA类似物对酶降解具有抗性并且具有延长的体内和体外稳定性。可对寡核苷酸进行的其它修饰包括聚合物主链、环主链、无环主链、硫代磷酸-D-核糖主链、三酯主链、硫酯主链、2’ -5’桥接的主链、人工核酸、吗啉代核酸、二醇核酸(GNA)、苏糖核酸(TNA)、阿糖胞苷和镜像核苷(例如，β-L-脱氧核糖核苷代替β -D-脱氧核糖核苷)。包含LNA核苷酸的siRNA化合物的实例公开于Elmen等，(NAR2005，33(1):439-447)。
[0131]对寡核苷酸的其它修饰包括在末端的一个或多个中存在核苷酸部分和或非核苷酸部分。
[0132]本文公开的目前核酸分子的化合物可以使用一个或多个反向核苷酸，例如反向胸腺嘧啶或反向腺嘌呤合成(参见，例如，Takei等，2002，JBC, 277(26):23800-06)。
[0133]本文有时称为“脱碱基核苷酸”或“脱碱基核苷酸类似物”的物质称为假核苷酸或非常规部分更适当。核苷酸为核酸的单体单元，其由核糖或脱氧核糖、磷酸和碱基(DNA中为腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或胞嘧啶；RNA中为腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶或胞嘧啶)组成。经修饰的核苷酸包含糖、磷酸和或碱基中的一个或多个的修饰。脱碱基假核苷酸不含碱基，因此不是严格的核苷酸。
[0134]其它修饰包括选自核苷酸、修饰的核苷酸、脂质、肽、糖和反向脱碱基部分的末端修饰。
[0135]在一些实施方案中，siRNA治疗剂包含封端部分。本文所用术语“封端部分”包括脱碱基核糖部分、脱碱基脱氧核糖部分、脱碱基核糖部分和脱碱基脱氧核糖部分的修饰，包括2’ O烷基修饰；反向脱碱基核糖和脱碱基脱氧核糖部分及其修饰物；C6-亚氨基-Pi ;镜像核苷酸包括L-DNA和L-RNA ;5’ O-Me核苷酸；和核苷酸类似物包括4’，5’ -亚甲基核苷酸；1-( β -D-赤呋喃糖基)核苷酸；4’ -硫代核苷酸；碳环核苷酸；5’ -氨基-烷基磷酸酯；1，3- 二氨基-2-丙基磷酸酯、3-氨基丙基磷酸酯；6_氨基己基磷酸酯、12-氨基十二烷基磷酸酯；羟丙基磷酸酯；1，5-无水己糖醇核苷酸；α -核苷酸；苏式-呋喃戊糖基核苷酸；无环3’，4’ -开环核苷酸；3，4- 二羟丁基核苷酸；3，5- 二羟基戊基核苷酸、5’ -5’ -反向脱碱基部分；1，4- 丁二醇磷酸酯；5’ -氨基；以及桥接或非桥接甲基磷酸酯和5’ -巯基部分。
[0136]某些优选的封端部分为脱碱基核糖或脱碱基脱氧核糖部分；反向脱碱基核糖或脱碱基脱氧核糖部分；C6-氨基-Pi ;镜像核苷酸，包括L-DNA和L-RNA。
[0137]在一些实施方案中，所述治疗性SiRNA包含除核苷酸之外的部分。本文所用术语“非常规部分”是指脱碱基核糖部分、脱碱基脱氧核糖部分、脱氧核糖核苷酸、修饰的脱氧核糖核苷酸、镜像核苷酸、非碱基配对核苷酸类似物和通过2’ -5’核苷酸间磷酸酯键连接到相邻核苷酸的核苷酸；桥接核酸(包括LNA)和亚乙基桥接的核酸。
[0138]“镜像”核苷酸为与天然存在的或通常使用的核苷酸具有反向手性的核苷酸，SP，在镜像核糖核苷酸和“镜像异构体(spiegelmer)”的情况下，天然存在的(D-核苷酸)的镜像(L-核苷酸)也称为L-RNA。核苷酸可为核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸并且还可包含糖、碱基和或主链修饰中的至少一种。参见美国专利号6，586，238。另外，美国专利号6，602, 858公开了包含至少一种L-核苷酸取代的核酸催化剂。镜像核苷酸包括例如L-DNA (L-脱氧核糖腺苷-3’ -憐酸(镜像dA) ;L_脱氧核糖胞苷-3’ -憐酸(镜像dC) ;L_脱氧核糖鸟苷_3’ -磷酸(镜像dG) ；L-脱氧核糖胸苷_3’ -磷酸(镜像dT))和L-RNA (L-核糖腺苷_3’ -磷酸(镜像rA) ；L-核糖胞苷-3’ -磷酸(镜像rC) ；L-核糖鸟苷_3’ -磷酸(镜像rG) ；L-核糖尿苷-3，-憐酸(镜像dU)。
[0139]修饰的脱氧核糖核苷酸包括，例如可用作5’末端位置(位置编号I)中的核苷酸的5’ OMe DNA (5-甲基-脱氧核糖鸟苷_3’ -磷酸)；PACE (脱氧核糖腺嘌呤3’膦酰基乙酸酯、脱氧核糖胞苷3’膦酰基乙酸酯、脱氧核糖鸟苷3’膦酰基乙酸酯、脱氧核糖胸苷3’膦酰基乙酸酯。
[0140]桥接的核酸包括LNA (2’ -O, 4’ _C_亚甲基桥接的核酸腺苷3’单磷酸、2’ -O, 4’ -C-亚甲基桥接的核酸5-甲基-胞苷3’单磷酸、2’ -O, 4’ -C-亚甲基桥接的核酸鸟苷3’单磷酸、5-甲基-尿苷(或胸苷)3’单磷酸)；和ENA (2’-0，4’-C-亚乙基桥接的核酸腺苷3’单磷酸、2’ -O, 4’ -C-亚乙基桥接的核酸5-甲基-胞苷3’单磷酸、2’ -O, 4’ -C-亚乙基桥接的核酸鸟苷3’单磷酸、5-甲基-尿苷(或胸苷)3’单磷酸)。
[0141]根据一个方面，本文提供了包含未修饰的和修饰的核苷酸的抑制性寡核苷酸化合物。所述化合物包含至少一种选自以下的修饰的核苷酸:糖修饰、碱基修饰和核苷酸间键合的修饰，并且可以含有DNA和修饰的核苷酸诸如LNA(锁核酸)包括ENA(亚乙基-桥接的核酸；PNA(肽核酸)；阿糖胞苷；PACE(膦酰基乙酸酯及其衍生物)、镜像核苷酸或具有6碳糖的核苷酸。在一些实施方案中，本文提供了用于抑制祀基因体内表达的方法和组合物。通常，所述方法包括施用递送-治疗剂缀合物。在特定实施方案中，所述缀合物包含小干扰RNA (即siRNA)，所述小干扰RNA以足以例如通过RNA干扰(RNAi)机制下调靶基因的表达(降低mRNA水平，降低蛋白质水平)的量靶向由靶基因转录的mRNA。特别地，可将主题方法用于抑制靶基因的表达以治疗疾病。针对靶基因的核酸分子可用作治疗剂以治疗各种病状。在一个实施方案中，所述核酸分子下调靶多肽，由此靶多肽的下调包括靶多肽功能的下调(这可以通过例如酶测定或与天然基因/多肽的已知交互子(interactor)的结合测定检查)、靶蛋白的下调(这可以通过例如Western印记、ELISA或免疫沉淀检查)和靶多肽mRNA表达的下调(这可以通过Northern印迹、定量RT-PCR、原位杂交或微阵列杂交、RACE检查)。
[0142]本文描述的核酸分子的合成在其中一种领域的技术范围内。除了别的以外，此类合成描述于 Beaucage SL 和 Iyer RP, 1992Tetrahedron ；48:2223-2311, Beaucage S.和Iyer RP, 1993Tetrahedron ;49:6123-6194 和 Caruthers MH 等，1987Methods Enzymol.；154:287-313,除了别的以外，硫酯的合成描述于 Eckstein F., 1985Annu.Rev.B1chem.；54:367-402, RNA 分子的合成描述于 Sproat B., Humana Press 2005, Herdewijn P.编辑；Kap.2:17-31和除了别的以外，各自的下游加工描述于Pingoud A等，IRL Press 1989，Oliver R.W.A 编辑；Kap.7:183-208 和 Sproat B., Humana Press 2005, Herdewijn P.编辑；Kap.2:17-31(见上文)。
[0143]基于靶mRNA的已知序列，针对任一靶基因的siRNA使用如以上描述本领域已知的方法合成并如本文描述通过各种修饰使其对血清和/或细胞核酸酶稳定。
[0144]靶某闵
[0145]本文公开的递送系统可用于将治疗剂和/或诊断剂递送至表达END0180的细胞。在一些实施方案中，所述治疗剂包括抗细胞增生剂。
[0146]在一些实施方案中，所述治疗剂包括抑制靶基因或靶基因的表达的核酸化合物，所述靶基因与选自增生性疾病、转移性疾病和纤维化的疾病或病症相关。
[0147]靶基因包括抗细胞凋亡基因、与基本细胞分裂机制相关的基因、与细胞周期调控/细胞增生相关的基因、与限速代谢(核苷酸/核酸合成、蛋白质合成、能量代谢)相关的基因、与蛋白质运输(如，分泌)相关的基因；促炎性基因、细胞因子、趋化因子、NFkB、生长因子 / 受体(TGF β I 和 2、CTGF、IGFl、PDGFl、PDGF2、VEGF、EGFR、HER2 等)、与纤维化相关的基因(HSP47、TGFP 1、IL-10)。
[0148]根据专用和公共可获得的方法和算法选择可用于合成siRNA的有义序列和反义序列。
[0149]以上提供的化学修饰可用于合成尤其表现出血清稳定性、活性、降低的免疫反应、降低的脱靶作用的核苷酸治疗剂。
[0150]技述
[0151]术语“抗体”尤其是指IgG、IgM、IgD、IgA和IgE抗体。定义包括多克隆抗体或单克隆抗体。该术语是指包含抗原结合结构域的完整抗体或抗体片段，例如不含Fe部分的抗体、单链抗体、微型抗体、基本上仅由可变区组成的片段、抗体的抗原结合结构域等。术语“抗体”也可以指针对通过cDNA接种获得的多核苷酸序列的抗体。术语还涵盖了保留与其抗原或受体选择性结合的能力并尤其如下例证的抗体片段:
[0152](l)Fab，含有抗体分子的单价抗原结合片段的片段，其可通过以下方式产生:用木瓜蛋白酶消化完整抗体以产生轻链和重链的一部分；
[0153](2) (Fab’)2，可通过用胃蛋白酶处理完整抗体无需随后的还原获得的抗体的片段；F(ab’ 2)为通过两个二硫键结合在一起的两个Fab片段的二聚体；
[0154](3)Fv，被定义为表达为两条链的含有轻链的可变区和重链的可变区的基因工程改造片段；以及
[0155](4)单链抗体(SCA)，被定义为含有由合适的多肽连接子连接为基因融合单链分子的轻链的可变区和重链的可变区的基因工程改造分子，包括scFv。
[0156]可以进行⑶R接枝(⑶R grafting)来改变抗体分子的某些特性,包括亲和力或特异性。⑶R接枝的非限制性实例公开于美国专利号5，225，539。
[0157]单结构域抗体分离自免疫的骆驼科(包括骆驼和美洲驼)的独特的重链抗体。小抗体非常稳健并且在单体状态下以高亲和力结合抗原。美国专利6838254描述了来源于骆驼科的重链免疫球蛋白的抗体或其片段的产生。
[0158]单克隆抗体(mAb)为对特异性抗原为基本上均一的抗体群体。单克隆抗体(mAb)通过本领域技术人员已知的方法获得。参见，例如Kohler等(1975);美国专利4，376，110 ；Ausubel 等(1987-1999) ;Harlow 等(1988);和 Colligan 等(1993),这些文献的内容通过引用整体并入本文。本文公开的mAb可以是任何免疫球蛋白类型，包括IgG、IgM、IgE、IgA及其任何亚类。产生的mAb杂交瘤可以在体外或体内培养。mAb的高滴度的在体内获得，例如其中将来自单个杂交瘤的细胞腹膜内注射入原始引发的(pristine-primed)Balb/c小鼠中以产生含有高浓度所需的mAb的腹水。可以使用本领域技术人员熟知的柱色谱法将同种型IgM或IgG的mAb从这种腹水或从培养上清液中纯化。
[0159] 所谓“特异性结合亲和力”意指在类似条件下抗体以比其结合于另一多肽较大的亲和力结合于END0180多肽或其片段。
[0160]术语“表位”意指能够被抗体结合也可被所述抗体识别的分子的部分。“抗原”为能够被抗体结合的分子或分子的一部分，其另外能够诱导动物产生能够结合该抗原的表位的抗体。抗原可以具有一个或不止一个表位。以上提及的特异性反应意图表明抗原将以高度选择性方式与其对应抗体反应且不与可以由其它抗原激发的多个其它抗体反应。
[0161]表位或抗原决定簇通常由分子(诸如氨基酸)的化学活性表面基团或糖侧链组成并且具有特定三维结构特征以及特定电荷特征。
[0162]在一个实施方案中，所述抗体为单克隆抗体。在一个实施方案中，所述单克隆抗体为IgG、IgM、IgD、IgA或IgE单克隆抗体。IgG亚类也为本领域技术人员熟知的并且包括但不限于人IgGl、IgG2、IgG3和IgG4。在一个实施方案中，所述单克隆抗体为IgG单克隆抗体。在一个实施方案中，所述单克隆抗体为人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。在一个实施方案中，所述抗体的部分为抗体的Fab片段。在一个实施方案中，所述抗体的部分包含抗体的可变结构域。在一个实施方案中，所述抗体的部分包含抗体的CDR部分。在其它实施方案中，所述抗体为scFv分子。可以通过重组产生抗体(一般参见Marshak等,1996〃Strategies for Protein Purificat1n and Characterizat1n.A laboratorycourse manual.^Plainview, N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996)并且可以通过翻译后加工产生类似物。糖基化的不同可提供多肽类似物。
[0163]抗体可以为人抗体或非人抗体。非人抗体可以通过重组方法人源化以降低它在人中的免疫原性。用于使抗体人源化的方法为本领域技术人员已知的。
[0164]本申请提供了上述抗体的人源化形式。如本文所用，“人源化”描述了其中CDR区外部的一些、大部分或全部氨基酸被来源于人免疫球蛋白分子的对应的氨基酸替换的抗体，如人框架区替换非人区。在人源化形式的抗体的一个实施方案中，CDR区外部的一些、大部分或全部氨基酸已经被来自人免疫球蛋白分子的氨基酸替换，但是其中一个或多个CDR区内的一些、大部分或全部氨基酸保持不变。氨基酸的少量添加、缺失、插入、取代或修饰是允许的只要它们不消除抗体结合抗原(END0180)的能力。
[0165]“人源化”抗体将保留与初始抗体类似的抗原特异性，即，结合END0180，特别是人ENDO180受体的能力并将由受体类似地内化。
[0166]本领域技术人员将知道如何制备本发明的人源化抗体。各种出版物描述了如何制备人源化抗体，其中一些出版物在此通过引用并入本申请。
[0167]例如，在美国专利号4，816，567和6，331，415中描述的方法包括具有一种抗体的可变区和另一抗体的恒定区的嵌合抗体的制备。
[0168]美国专利号5，225，539、6，548，640和6，982，321描述了使用重组DNA技术制备人源化抗体，其中一种免疫球蛋白的CDR被替换为来自具有不同特异性的免疫球蛋白的CDR，使得人源化抗体将识别靶抗原但不会引发免疫应答。具体地讲，使用定点诱变将CDR引入框架区上。
[0169]使抗体人源化的其它方法描述于WO 90/07861和对应的专利包括美国专利号5，585，089 ;5，693，761 ;6，180，370和7，022，500。这些专利描述了通过将小鼠单克隆抗体的CDR与人免疫球蛋白框架和恒定区组合来增加抗体对所需抗原的亲和力的方法。可选择人框架区以使与小鼠序列的同源性最大化。可使用计算机建模鉴定框架区中可能与CDR或特异性抗原相互作用的氨基酸，然后可在这些位置使用小鼠氨基酸以产生人源化抗体。
[0170]上述方法仅为本领域技术人员可以用于制备人源化抗体的一些示例性方法。
[0171]单克隆抗体E3-8D8表示用于本文公开的组合物和方法中的合适的抗END0180抗体。根据布达佩斯条约(Budapest Treaty)杂交瘤细胞E3-8D8被保藏在比利时微生物保藏中心(Belgian Co-ordinated Collect1ns of Micro-Organisms, BCCM)并且给出登记号 LMBP7203CB。
[0172]表位定位
[0173]表位定位研究鉴定了对于抗体结合重要的残基。用于表位定位的各种方法在本领域为已知的并且易于由本领域技术人员进行。某些方法描述于Epitope MappingiAPractical Approach (0.M.R.Westwood, F.C.Hay ；Oxford University Press, 2000),通过引用并入本文。
[0174]表位定位技术的一个实例为合成标记肽表位定位(Synthetic Labeled PeptidesEpitope Mapping),由此合成一组重叠的合成肽,每个对应于蛋白抗原的线性序列的一小段，即END0180的细胞外结构域，并排列在固相上。然后将肽的平面用测试抗体探测，并使用酶标记的第二抗体检测结合的抗体。
[0175]其它技术包括蛋白抗原的碎裂或裂解和凝胶分离、转移至膜上、通过测试抗体探测并使用酶标记的第二抗体检测结合的抗体。
[0176]抗体药物开发
[0177]通常单克隆抗体需要被设计成保持结合特性(选择性、内化等)并减少受体中的免疫应答。具体地讲，可以通过本领域技术人员已知的若干种方法中的一种将由杂交瘤3E-8D8分泌的单克隆抗体进行优化以用于人治疗剂。在一种方法中，对单克隆抗体的可变重链(Vh)和可变轻链进行测序。一旦已知氨基酸序列，鉴定互补决定区(⑶R)、重链和轻链⑶R3并使用简并寡核苷酸将合成的⑶R3克隆至载体以产生重组载体或构建体。该构建体可以为例如Fab片段、F(ab’)2片段、Fv片段、单链片段或完整的IgG分子。表达该构建体并分离多肽。在一些实施方案中，所述单克隆抗体可以通过诱变(最佳通过定点诱变)进一步优化以产生与原始⑶R3具有显著同一性的⑶R3结构域。
[0178]治疗剂
[0179]可用于制备和使用本文公开的组合物的治疗剂或活性剂包括核苷酸剂和非核苷酸剂，包括寡核苷酸诸如反义(AS)、miRNA和未修饰的和化学修饰的siRNA化合物。优选的治疗剂为siRNA化合物。
[0180]在一些实施方案中，所述siRNA通过RNA干扰靶向并降低靶基因的表达。
[0181]本文公开的组合物和方法可用于由异常细胞增生产生的或者说涉及异常细胞增生的疾病的治疗或诊断。作为术语在本文使用的治疗剂为药剂，当将其递送至靶细胞时，能使靶细胞以有助于治疗患有疾病的受试者的方式发挥作用，即减轻或改善接受者中疾病的症状。如本文所用，术语疾病的“治疗(treating)”或“治疗(treatment) ”包括预防疾病，即预防受试者中疾病的临床症状，所述受试者可能被暴露于、或易患疾病，但是还未经历或显示疾病的症状；抑制疾病，即，阻止疾病或其临床症状的发展；或缓解疾病，即，引起疾病或其临床症状的消退。治疗剂也可以为对疾病诊断或疾病进展有用或对治疗疾病有效的药剂。
[0182]在一个实施方案中，所述组合物被施用于在一个或多个器官中表现异常细胞增生的受试者。
[0183]有用的治疗剂包括核酸、小分子、多肽、抗体或其功能片段。可以进一步修饰作为治疗剂的这些核心组分以增强功能或存储(例如提高细胞摄取、增加对靶标的特异性、增加半衰期、有利于生成或存储)。核酸治疗剂包括单链和双链的DNA和RNA分子。不止一种治疗剂可以通过本文公开的组合物递送。
[0184]通过本文公开的方法递送的治疗剂包括小分子和肽以阻断细胞内信号级联、酶(激酶)、蛋白酶体、脂质代谢、细胞周期、膜运输。通过本文公开的组合物和方法递送的治疗剂包括化疗剂。
[0185]治疗剂可以通过技术人员已知的任何方法与脂质微粒缔合并且包括但不限于包封在内部、与分子的脂质部分缔合或与脂质微粒的外部缔合。可以将溶于水溶液的小分子药物包封在脂质微粒的内部。难溶于水溶液的小分子药物可以与脂质微粒的脂质部分缔合。基于核酸的治疗剂可以与脂质微粒的外部缔合。此类核酸可以与阳离子聚合物(例如，PEI)或阳离子肽(例如，鱼精蛋白)缩合并包封在脂质微粒的内部。可以将治疗性肽包封在脂质微粒的内部。可以将治疗性肽共价结合至脂质微粒的外部。
[0186]在其中治疗剂为核酸的实施方案中，脂质微粒特别适用于核酸运输。
[0187]在一个实施方案中，所述治疗剂为核酸，诸如RNA或DNA分子(例如双链RNA或单链DNA寡核苷酸)。有用的DNA分子为反义以及有义(例如编码和/或调节)DNA。反义DNA分子包括短寡核苷酸。有用的RNA分子包括RNA干扰分子，其中存在几种已知类型。RNA干扰分子的领域中最近几年已经得到大大地扩展。有用的RNA干扰分子的实例为dsRNA，包括 siRNA、siNA、shRNA 和 miRNA (例如，小时序 RNA 和小调节 RNA (Kim.2005.Mol.Cells.19:1-15)).如本文所用，“双链RNA”或“dsRNA”是指由两条链构成的RNA分子。本文公开的治疗性寡核苷酸通过本领域已知的针对核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸的任何方法合成。例如，可使用商业多核苷酸合成仪(例如Applied B1systems 380B DNA合成仪)。当使用片段时，可合成两个或更多个此类序列并连接在一起用于本文公开的组合物中。
[0188]在一些实施方案中，所述治疗剂选自烷化剂诸如塞替派和(..?TOXA Ν?κ)环磷酰胺；烷基磺酸酯类诸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan);氮丙卩定类诸如苯佐替派(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替哌(meturedopa)和乌瑞替派(uredopa)；乙撑亚胺(ethylenimine)和甲基蜜胺类(methylamelamine)包括六甲蜜胺、三乙撑蜜胺、三乙撑磷酰胺(trietyIenephosphoramide)、三乙撑硫代憐酉先胺(triethiyIeneth1phosphoramide)和三轻甲基蜜胺(trimethylolomelamine);多聚乙酉先(acetogenin)(特别是布拉他辛(bullatacin)和布拉它辛酮(bullatacinone)) ； δ -9-四氢大麻酷(屈大麻酷，
MAWN0L? ) ;β-拉帕醌(beta-lapachone);拉帕醇(Iapachol);秋水仙减；白禅脂酸；喜树碱(包括合成类似物托泊替康(topotecan) ( HYCAMTINf)')、CPT-1K伊立替康(irinotecan)，CAMPTOSAR? )、乙酰喜树碱(acetylcamptothecin)、东莧菪亭(scopole ctin)和 9_ 氨基喜树碱)；苔藓抑素(bryostatin) ；callystatin ；CC-1065 (包括它的阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；鬼白毒素；鬼白酸；替尼泊苷(teniposide);隐藻素类(cryptophycin)(特别为隐藻素I和隐藻素8);多拉司他汀(dolastatin);多米卡星(duocarmycin)(包括合成类似物 KW-2189 和 CB1-TM1);五加苷素(eleutherobin);水鬼蕉碱(pancratistatin) ;sarcodictyin ;海绵抑素(spongistatin);氮芥类，诸如苯丁酸氣芥(chlorambucil)、蔡氣芥(chlornaphazine)、胆憐酸胺(cholophosphamide)、雌氮芥(estramustine)、异环憐酸胺(ifosfamide)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆留醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲憐胺(trofosfamide)、尿啼唳氮芥；硝基脲(nitrosurea)类，诸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(1mustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimnustine);抗生素类，诸如烯二炔类抗生素(如，加利车霉素(calicheamicin)，特别为加利车霉素YlI和加利车霉素ω--(参见，如，Agnewj Chem Intl.Ed.Engl.1994.33:183-186) ;dynemicin，包括 dynemicin A ;埃斯波霉素(esperamicin);以及新制癌菌素发色团和相关的色蛋白烯二炔抗生素发色团)、阿克拉霉素(aclacinomysins)、放线菌素(actinomycin)、氨茴霉素(authramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博莱霉素(bleomycin)、放线菌素 C(cactinomycin)、carabicin、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycinis)、方文线菌素D (dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6_ 重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星(包括ADRIAMYCM⑩、吗啉代多柔比星、氰基吗啉代多柔比星、2-吡咯代多柔比星、盐酸多柔比星脂质体注射剂(DUXILp)和脱氧多柔比星)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcel1mycin);丝裂霉素类诸如丝裂霉素C、酶酷酸(mycophenolic acid)、诺加霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培来霉素(peplomycin)、potfiromycin、卩票呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑霉素(streptonigrin)、链脲霉素(streptozocin)、杀结核菌素(tubercindin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin);抗代谢物类，诸如氨甲噪呤、吉西他滨(gemcitabine) ( GEMZA.R? )、替加氟(tegafur) ( UFTORA.L?)、卡培他滨(capecitabine) ( XELODA? )、埃博霉素(epothilone)和 5_ 氟尿啼P定(5-FU);叶酸类似物诸如二甲叶酸(denopterin)、甲氨蝶呤、蝶罗呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate) ; 票呤类似物，诸如氟达拉滨(f Iudarabine)、6_巯基啼P定、硫咪_呤(thiamiprine)、硫鸟票呤；啼P定类似物，诸如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6_氮杂尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifIuridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(f 1xuridine);雄激素类，诸如卡普睾酮(calusterone)、屈他雄酮丙酸酯(dromostanolone prop1nate)、环硫雄酉享(epit1stanol)、美雄焼(mepit1stane)、睾内酪(testolactone);抗肾上腺类诸如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane);叶酸补充剂，诸如亚叶酸(frolinic acid);醋葡醒内酯(aceglatone);醒磷酰胺糖苷；氨基酮戊酸；恩尿啼唳(eniluracil);安卩丫卩定(amsacrine)；bestrabucil ;比生群(bisantrene);依达曲沙(edatraxate);地憐酸胺(defofamine)；地美可辛(demecolcine);地口丫酉昆(diaziquone);依洛尼塞(elfornithine);依利醋铵(elliptinium acetate);依托格鲁(etoglucid);硝酸镓；羟基脲；香燕多糖(Ientinan)；氯尼达明(1nidainine);美登木素生物碱类(maytansinoids)，诸如美登素(maytansine)和安丝菌素(ansamito cin);米托胍腙(mitoguazone);米托蒽酉昆(mitoxantrone);莫哌达醇(mopidanmol) ;二胺硝卩丫唳(nitraerine);喷司他丁 (pentostatin);蛋氨氮芥(phenamet);吡柔比星(pirarubicin);洛索蒽醌(1soxantrone) ;2_乙基酰肼；丙卡巴肼(procarbazine) ;PSIC? 多糖复合物；雷佐生(razoxane);根霉素(rhizoxin);西佐喃(sizofiran);锗螺胺(spirogermanium);细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid);三亚胺酉昆(triaziquone) ;2，2，，2"-三氯乙胺；单端孢霉烯(trichothecene)类(特别为T-2毒素、抚孢菌素(verracurin) A、杆孢菌素(roridin) A和蛇形菌素(anguidine));乌拉坦(urethan);长春地辛(HLDISINi;, Π?..ΠΠ8ΙΝ^ );达卡巴嗪(dacarbazine);甘露莫司汀(mannomustine) ;二溴甘露醇(mitobronitol) ;二溴卫矛醇(mitolactol);哌泊溴焼(pipobroman) ;gacytosine ;阿糖胞苷(〃Ara_C〃)；塞替派(thi1tepa);紫杉焼类如，紫杉醇(ΤΛΧΟ?...# )、紫杉醇的白蛋白-工程化的纳米微粒组合物(ABRAXANE.TM.)和多西他赛(doxetaxel) ( ΛΧ(.)? [Rl.:卩':);苯丁酸氮芥(chloranbucil) ;6-硫代鸟_呤丨巯^1 票呤；甲氨蝶呤；钼类似物诸如顺钼和卡钼；长春碱(VELBAN? );钼；依托泊苷(etoposide)(VP-16);异环磷酰胺；米托蒽醌(mitoxantrone);长春新碱(OMCOVTN? );奥沙利钼(oxaliplatin);亚叶酸(Ieucovovin);长春瑞滨(vinorelbine) ( NAVliLBINH^
);米托蒽酉昆(novantrone);依达曲沙(edatrexate);道诺霉素(daunomycin)；氨基蝶呤；伊班膦酸盐(ibandronate);拓扑异构酶抑制剂RFS 2000 ; 二氟甲基鸟氨酸(dif luorometIhylornithine) (DMFO);类维A酸诸如视黄酸；上述任一项的药学上可接受的盐、酸或衍生物；以及上述两种或更多种的组合诸如CHOP(环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松龙的组合治疗的缩写)和FOLFOX(用与5-FU和亚叶酸组合的奥沙利钼(ELOXATTN? )的治疗方案的缩写)。
[0189]在本定义中还包括用以调节、降低、阻断或抑制可促进癌症生长的激素的作用并且常常以系统的或全身治疗施用的抗激素剂。它们可以为激素本身。实例包括抗雌激素类和选择性雌激素受体调节剂(SERM)，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)(包括NOLVADEX?他莫昔芬)、雷洛昔芬(raloxifene) ( EVISTA? )、屈洛昔芬(droloxifene)、4_ 轻他莫昔芬(4-hydroxytamoxifen) > 曲沃昔芬(tr1xifene)、那洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮(onapristone)和托瑞米芬(toremifene)
(FARESTOMi);抗黄体酮类；雌激素受体下调剂(ERD);起到抑制或关闭卵巢功能的药剂，例如，促黄体素释放激素(LHRH)激动剂诸如醋酸亮丙瑞林( LUPRON?和ELIGARD...K.)、醋酸戈舍瑞林、醋酸布舍瑞林和曲普瑞林(tripterelin);其它抗雄激素类诸如氟他米特(fIutamide)、尼鲁米特(niIutamide)和比卡鲁胺(bicalutamide)；以及芳香酶抑制药诸如，例如，4(5) -咪唑类、氨鲁米特(aminoglutethimide)、醋酸甲地孕酮(MEGASEt))、依西美坦(exemestane) (:AROMASIN?—)、福美司坦(formestanie)、法倔唑(fadrozole)、伏氯唑(vorozole) ( RI VIS OR? )、来曲唑(Ietrozole) ( FEMARA? )和阿那曲唑(anastrozole) ( ARIMIDEX? )。另外，双磷酸盐类诸如氯膦酸盐(例如，BONEFOS?或OSTAC? )、依替膦酸(etidronate)(DIDROCAL? )、ΝΕ-58095、挫来膦酸(zoledronic acid)/唑来膦酸盐(zoledronate)(+ZOMETA?')、阿仑膦酸盐(alendronate) ( ；FOSAMAX0 )、氨羟二磷酸二钠(pamidronate) ( ARFJDIA?.)、替鲁膦酸(tiludronate) ( SKELID? )或利塞膦酸盐(risedronate) ( ACTONEL? )；以及曲沙他滨(troxacitabine) (I, 3_ 二氧戍环核苷胞嘧啶类似物)；siRNA、核酶和反义寡核苷酸类，特别为在牵涉异常细胞增生的信号转导通路中抑制基因表达的那些；疫苗类诸如THERATOPE?疫苗和基因治疗疫苗，例如ALLOVECTIN?疫苗、LEUVECTIN?疫苗和VAXID?疫苗；拓扑异构酶I抑制剂(如’LURTOTECAN?) ;rmRH(如’ ABARELIX?) ;二甲苯磺酸拉帕替尼(Iapatinibditosylate) (ErbB-2和EGFR双重酪氨酸激酶小分子抑制剂也称为GW572016) ;C0X_2抑制剂诸如塞来昔布(celecoxib) ( CELEBREX? ；4- (5-(4-甲基苯基)-3-(三氟甲基)-1H-吡唑-1-基)苯磺酰胺；以及上述任一项的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
[0190]如本文所用，术语“多肽”是指除了多肽之外的肽和全蛋白并包括分离的和重组多肽。如本文所用，“生物功能”是指分子的生物学特性并且在本文中意指体内效应物或抗原功能或活性，其直接或间接由天然存在的多肽或核酸分子进行。生物功能包括但不限于受体结合、任何酶活性或酶调节活性、任何载体结合活性、任何激素活性、内化分子或从一个室移位到另一个室的任何活性、在促进或抑制细胞粘附于细胞外基质或细胞表面分子的任何活性或任何结构作用以及具有编码功能性蛋白并且为可表达的核酸序列。抗原功能基本上意指具有能够与针对天然存在的蛋白产生的抗体进行交叉反应的表位或抗原位点。生物活性类似物共享天然多肽的效应功能，其可以但不需要另外具有抗原功能。
[0191]END0180多肽的水平的测量可以通过选自以下的方法确定:免疫组织化学、蛋白质印迹、ELISA抗体微阵列杂交和靶向分子成像。这些方法在本领域为熟知的，例如免疫组织化学、蛋白质印迹、抗体微阵列杂交和靶向分子成像。
[0192]ENDO180多核苷酸水平的测量可以通过选自RT-PCR分析、原位杂交、多核苷酸微阵列和Northern印迹确定。此类方法在本领域为熟知的。
[0193]反义分子
[0194]在一些实施方案中，所述治疗剂为反义寡核苷酸。术语“反义”(AS)或“反义片段”意指具有抑制性反义活性的多核苷酸片段(包含脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或两者的混合物)，所述活性引起对应基因的内源性基因组拷贝的表达下降。AS多核苷酸为包含具有足够长度并且与靶基因的序列内存在的序列同源以允许AS与基因杂交的序列的连续核苷酸的多核苷酸。许多综述已经涵盖了反义(AS)技术及其治疗潜力的主要方面(Aboul-Fadl T., Curr Med Chem.2005, 12(19):2193-214 ；Crooke ST, Curr MoIMed.2004, 4(5):465-87 ；Crooke ST, Ann Rev Med.2004, 55:61-95 ；Vacek M 等，Cell MoILife Sc1.2003，60(5):8 25-33 ;Cho-Chung YS, Arch Pharm Res.2003，26 (3): 183-91。存在AS 技术的化学(Crooke 等，Hematol Pathol.1995,9(2):59-72)、细胞(Wagner, Nature.199
4,372(6504):333-5)和治疗(Scanlon 等 FASEB J.1995，9 (13): 1288-96)方面的综述。在表达特定基因中反义干预可通过使用修饰的AS寡核苷酸序列实现(对于最近的报道参见Lefebvre-d' Hellencourt 等,1995 ；AgrawaI, 1996 ；LevLehman 等,1997)。
[0195]AS寡核苷酸序列可以为短的DNA序列，通常为15-30mer，但可以小至7-mer (Wagner 等，Nat.B1tech.1996, 14(7):840-4)，被设计与目标革巴 mRNA 互补并形成RNA:AS双链体。该双链体的形成可防止相关mRNA的加工、剪接、运输或翻译。此外，当与它们的靶mRNA杂交时，某些AS核苷酸序列可引发细胞RNA酶H活性，导致mRNA降解(Calabretta 等，Semin Oncol.1996，23 (I): 78-87)。在此情况下，RNA 酶 H 将裂解双链体的RNA组分并且可能释放AS以与靶RNA的其它分子进一步杂交。另外的作用方式由AS与基因组DNA的相互作用产生以形成三螺旋，所述三螺旋可为转录失活的。
[0196]选择反义寡核苷酸的序列靶标片段使得序列表现出对与其互补模板形成寡核苷酸双链体重要的合适的能量相关特性，并且对于自身二聚化或自身互补显示出低的可能性(Anazodo等，1996，BBRC.229:305-309)。例如，可使用计算机程序0LIG0 (引物分析软件，版本3.4)确定反义序列的解链温度、自由能特性并估计可能的自身二聚体形成和自身互补特性。所述程序允许确定这两个参数(可能的自身二聚体形成及自身互补)的定性估算并提供“不可能”或“一些可能”或“基本完全可能”的指示。使用该程序通常选择在这些参数中估算为不可能的靶向区段。然而，可以使用在类别中的一种中具有“一些可能”的区段。参数的平衡用于如本领域已知的选择。此外，也按需要选择寡核苷酸以便类似物取代基本上不会影响功能。
[0197]硫代磷酸酯反义寡核苷酸通常在有效的浓度处不示出显著的毒性并在动物中表现出足够的药效动力学半衰期(Agrawal等，PNAS USA.1997,94(6):2620-5)并且对核酸酶具有抗性。具有促有丝分裂和血管生成特性的碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的反义寡核苷酸抑制以可饱和的和特异性方式抑制80%的神经胶质瘤细胞的生长(Morrison, JB1l Chem.1991266(2):728-34)。疏水性反义寡核苷酸与磷脂膜相互作用良好(Akhter等，NAR.1991，19:5551-5559)。它们与细胞质膜相互作用之后，它们以预测涉及特异性受体的可饱和机制(Yakubov等，PNAS, 198986(17):6454-58)主动地(或被动地)转运入活细胞内(Loke 等，PNAS 1989，86 (10): 3474-8)。
[0198]siRNA 和 RNA 干扰
[0199]RNA干扰(RNAi)为涉及双链(ds) RNA依赖性基因特异性转录后沉默的现象。研究这种现象并实验性地处理哺乳动物细胞的初始尝试受到主动的、非特异性的抗病毒防御机制的阻止，所述抗病毒防御机制响应于长的dsRNA分子而被激活(Gil等，Apoptosis, 2000.5:107-114)。后来发现21个核苷酸RNA的合成双链体能在哺乳动物细胞中介导基因特异性RNAi，而不刺激通用抗病毒防御机制Elbashir等.Nat ure2001，411:494-498 和 Caplen 等.PNAS 2001, 98:9742-9747)。因此，小干扰 RNA (siRNA)，其为短的双链RNA，已被广泛用于抑制基因表达和理解基因功能。
[0200]RNA 干扰(RNAi)由小的干扰 RNA(siRNA) (Fire 等，Nature 1998, 391:806)或微小 RNA(miRNA) (Ambros V.Nature 2004, 431:350-355)；和 BartelDP.Cell.2004116(2):281-97)介导。当在植物中观察时，对应的过程通常被称为特异性转录后基因沉默，并且当在真菌中观察时，通常被称为抑制(quelling)。
[0201]siRNA为下调或沉默(即完全地或部分抑制)内源基因或外源基因/mRNA的表达的双链RNA。RNA干扰基于某些dsRNA物质能够进入特定的蛋白质复合物，在所述蛋白质复合物中dsRNA物质然后被靶向它们特异性地降解或裂解的互补细胞RNA(即mRNA)。因此，RNA干扰应答特征为含有siRNA的内切核酸酶复合物，通常被称为RNA诱导的沉默复合物(RISC)，所述内切核酸酶复合物介导具有与siRNA双链体的反义链互补的序列的单链RNA的裂解。靶RNA的裂解可能发生在与siRNA双链体的反义链互补的区域的中间(Elbashir 等，Genes Dev.，2001，15:188)。更详细地，较长的 dsRNA被 III 型 RNA酶(DICER、DROSHA等)消化成短的(17-29bp)dsRNA片段(也称为短的抑制性RNA或“siRNA”)(参见 Bernstein 等，Nature, 2001, 409:363-6 和 Lee 等，Nature, 2003, 425:415-9)。RISC 蛋白复合物识别这些片段和互补的mRNA。整个过程通过内切核酸酶裂解靶mRNA达到顶点(McManus 和 Sharp, Nature Rev Genet, 2002, 3:737-47 ;Paddi son 和 Hannon, Curr Opin MolTher.2003,5(3):217-24)。(对于这些术语和提出的机制的额外信息，参见例如Bernstein等，RNA.2001，7(11):1509-21 ；Nishikura, Cell.2001，107(4):415-8 和 PCT 公布号 WO01/36646)。
[0202] 研究已揭示siRNA在哺乳动物(包括人)体内为有效的。具体地讲，Bitko等示出当鼻内施用时，针对呼吸道合胞体病毒(RSV)病毒粒子N基因的特异性siRNA可有效治疗小鼠(Nat.Med.2005，11 (1):50-55)。对于siRNA的治疗应用的综述参见例如Barik (Mol.Med2005, 83:764-773)和 Chakraborty(Current Drug Targets 20078 (3):469-82)。另外，使用靶向VEGFRl受体以便治疗年龄相关性黄斑变性(AMD)的短siRNA的临床研究已经在人患者中进行(Kaiser, Am J Ophthalmol.2006142 (4):660-8)。关于将 siRNA 用作治疗剂的更多信息可以见于 Durcan, 2008.Mol.Pharma.5 (4):559 - 566 ；Kim&Rossi, 2008.B1Techniques 44:613-616 ；Grimm&Kay, 2007，JCI, 117(12):3633-41。
[0203]如本文公开的dsRNA为未修饰的、重组的或化学修饰的。可用于合成dsRNA，包括siRNA和siNA的化学修饰的实例公开于PCT专利公布号WO 2009/044392、WO2011/066475、WO 2011/085056并且据此通过引用整体并入。
[0204]对于本文目的的药学“有效量”因此通过如本领域已知的考虑因素确定。所述量必须有效以达到改善，所述改善包括但不限于如由本领域技术人员选择作为适当的量度的提高的存活率或更快的恢复、或改善或消除症状和其它指示。本文公开的组合物通过任何常规的施用途径施用。应该注意的是可单独施用该组合物或与药学上可接受的载体、溶剂、稀释剂、赋形剂、佐剂和媒介物一起施用。可口服、皮下或肠胃外包括静脉内、动脉内、肌内、腹膜内和鼻内施用以及鞘内和输注技术施用该化合物。化合物的植入物也是有用的。可以制备用于注射的液体形式，该术语包括皮下、经皮、静脉内、肌内、鞘内和其它肠胃外施用途径。液体组合物包括水溶液、含有和不含有机共溶剂、水或油悬浮液、含有食用油的乳液以及类似的药学媒介物。
[0205]另外，在某些情况下用于本发明的新型治疗的组合物可以形成为气溶胶用于鼻内类类似施用。所治疗的患者为温血动物并且特别为哺乳动物，包括人。药学上可接受的载体、溶剂、稀释剂、赋形剂、佐剂和媒介物以及植入载体通常是指惰性、非毒性固体或液体填充物、稀释剂或不与本文公开的活性成分反应的包封材料并且它们包括脂质体、脂质化糖胺聚糖和微球体。用于本发明递送系统的实例包括美国专利号5，225，182 ;5，169，383 ；5，167，616 ;4，959，2 17 ;4，925，678 ;4，487，603 ;4，486，194 ;4，447，233 ;4，447，224 ；4，439，196 ;和4，475，196。许多其它的这种植入物、递送系统和模块为本领域技术人员所熟知。
[0206]通常，在一次剂量/天或两次/天或三次/天或更多次/天持续1-2周或更长的时期，优选持续24-至48小时或通过在1-2周或更长时期连续输注的给药方案中，用于人的化合物的活性剂量的范围为lng/kg体重/天至约20-100mg/kg体重/天,优选为约0.01mg/kg体重/天至约2-10mg/kg体重/天。
[0207]此外，本文提供了与对照相比将靶基因的表达下调至少50%的方法，所述方法包括使基因的mRNA转录物与本文公开的组合物或核酸分子中的一种或多种接触。
[0208]在一个实施方案中，所述治疗制剂抑制靶基因，由此抑制选自基因功能的抑制、多肽的抑制和mRNA表达的抑制。
[0209]配制所述药物组合物以提供单剂量施用或多剂量施用。
[0210]在各种实施方案中，所述药物组合物通过静脉内、肌内、局部或皮下施用于受试者。
[0211]本文公开的药物组合物也可用于预防和/或治疗本文公开的疾病的方法，由此所述方法包括将本文公开的组合物或药物施用于有需要的受试者以用于治疗本文描述的任何疾病。
[0212]歷
[0213]本文公开的组合物可用于诊断生物样品中表达END0180的细胞。递送系统可以包括在正常或患病细胞中可检测的部分。本文预期的可检测部分包括但不限于荧光、金属、酶和放射性标记，诸如生物素、金、铁蛋白、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、过氧化物酶、脲酶、荧光素、若丹明和放射性同位素(包括氚)14C和碘。
[0214]递送
[0215]在一些实施方案中，本文公开的组合物通过全身施用被递送至靶组织。
[0216]根据良好的医学实践，考虑到各个患者的临床状况、待治疗的疾病、施用的位点和方法、施用的时间表、患者年龄、性别、体重和医疗从业者已知的其它因素对本文公开的组合物进行施用和给药。
[0217]对于本文目的的“治疗有效剂量”因此通过本领域已知的此类考虑因素确定。剂量必须有效以达到改善，所述改善包括但不限于如由本领域技术人员选择作为适当的量度的提闻的存活率或更快的恢复、或改善或消除症状和其它指不。
[0218]在一些实施方案中，所述组合物为“稳定的”并且在暴露于血清或细胞蛋白酶、月旨酶和或核酸酶之后不会发生显著降解。用于确定稳定性的合适的测定包括本领域已知的血清稳定性测定或细胞提取物测定。
[0219]如本文所用，“全身递送”是指引起组合物在受试者内广泛的生物分布的递送。本文公开的组合物的全身递送可通过本领域已知的任何方法实现，包括，例如，静脉内、皮下或腹膜内施用。在优选的实施方案中，所述组合物通过静脉内递送进行全身递送。
[0220]在优选的实施方案中，所述治疗的受试者为温血动物并且特别为哺乳动物，包括人。
[0221]用于将本文公开的组合物递送至分离的细胞的合适的方法包括，除了别的以外，转染、脂质转染和电穿孔。
[0222]组合治疗
[0223]在各种实施方案中，提供了组合治疗。在一个实施方案中，两种或更多种治疗剂的共同施用实现协同作用，即，大于组合的各个组分的治疗作用的总和的治疗作用。在另一个实施方案中，两种或更多种治疗剂的共同施用实现累加作用。
[0224]可以经由单一剂型或通过单独施用每种活性药剂来一起施用组成组合治疗的活性成分。在某些实施方案中，所述第一治疗剂和第二治疗剂以单一剂型施用。或者，所述第一治疗剂和第二治疗剂可以作为单独的组合物施用。所述第一活性剂可以与所述第二活性剂同时施用或所述第一活性剂可以与所述第二活性剂间歇施用。可以调整施用第一治疗剂与第二治疗剂之间的时长以实现所需的治疗效果。例如，在施用第一治疗剂之后仅几分钟(例如，1、2、5、10、30或60分钟)或几小时(例如，2、4、6、10、12、24或36小时)可以施用第二治疗剂。在某些实施方案中，可能有利的是在施用第二治疗剂之间施用多于一种剂量的治疗剂中的一种。例如，可以在施用第一治疗剂之后2小时,然后在10小时再次施用第二治疗剂。或者，可能有利的是在施用第二治疗剂之间施用多于一种剂量的第一治疗剂。重要地是，优选每种活性成分的治疗效果重叠每种治疗剂的至少一部分持续时间使得组合治疗的整个治疗效果部分归因于组合治疗的组合作用或协同作用。
[0225]本文公开了组合物和可用于将治疗货物(therapeutic cargo)和诊断货物(diagnostic cargo)祀向递送至细胞的组合物的用途并且所述组合物可以有益地用于治疗患有增生性疾病包括癌症和纤维化疾病的受试者。
[0226]治疗方法
[0227]本公开的另一个方面提供了治疗患有增生性疾病包括癌症、转移性疾病和纤维化的受试者的方法。提供了用于治疗与不受控制的、病变细胞生长例如癌症和器官纤维化相关的疾病和病症的方法。特别地，本文公开的组合物可用于治疗其中END0180在患病细胞和或组织的至少一部分中表达的增生性疾病，。还提供了用于治疗或预防有需要的受试者的疾病或病患的发生或严重性和/或用于减少有需要的受试者的疾病或病患的风险或严重性的方法，其中所述的疾病或病患和/或与其相关的症状和/或风险和与END0180的异常表达相关的基因的表达相关。在优选的实施方案中，所述受试者为人受试者。
[0228]癌症治疗
[0229]“癌症”或“肿瘤”是指细胞的异常增生。这些术语包括原发性肿瘤，其可以是良性的或恶性的，以及继发性肿瘤或扩散至体内其它部位的转移。增生性疾病的实例特别包括:癌(例如:乳腺癌、结肠癌和肺癌)、白血病(诸如B细胞白血病)、淋巴瘤(诸如B细胞淋巴瘤)、母细胞瘤(诸如神经母细胞瘤)和黑素瘤以及肉瘤。应当知道本文公开的药物组合物用于涉及不希望的脉管系统的形成或生长(包括血管生成)的任何疾病以及本文描述的任何疾病和病患，特别是表现出异常END0180表达的疾病和病症。
[0230]本文提供了用于治疗患有增生性疾病的患者的方法和组合物，所述增生性疾病包括癌性增生性疾病(例如，肺癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、胃癌、肾癌、白血病、肝癌、淋巴瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、直肠癌、肉瘤、皮肤癌、睾丸癌和子宫癌)，其中所述癌细胞表达END0180多肽。在一个特定实施方案中，所述癌症为肾癌，包括RCC和TCC。
[0231]“癌症”和“癌性疾病”可互换使用并且是指由不适当高水平的细胞分裂、不适当低水平的细胞凋亡或二者引起或导致不适当高水平的细胞分裂、不适当低水平的细胞凋亡或二者的疾病。癌性疾病的实例包括但不限于白血病(例如，急性白血病、急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性粒细胞白血病、急性早幼粒细胞白血病、急性骨髓单核细胞白血病、急性单核细胞白血病、急性红白血病、慢性白血病、慢性髓细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤(霍奇金氏病、非霍奇金氏病)、沃尔登斯特伦巨球蛋白血症(Waldenstrom’s macroglobulinemia)、重链病和实体瘤诸如肉瘤和癌(例如,纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏肉瘤(Ewing’s tumor)、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞瘤(hepatoma)、胆管癌(niIe duct carcinoma)、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、肾母细胞瘤(Wilm’s tumor)、宫颈癌、子宫癌、睾丸癌、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤(crail1pharyng1ma)、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤(oligodenrogl1ma)、神经鞘瘤(schwam1ma)、脑膜瘤、黑素瘤、神经母细胞瘤和视网膜母细胞瘤)。包括治疗原发性癌的转移。在一些优选实施方案中，所述组合物可用于治疗肾癌、乳腺癌、卵巢癌及其在各种器官(包括肺和骨骼)中的转移。
[0232]如本文所用，术语“增生性疾病”是指其中恶性或良性的细胞增生导致病患的病变的任何疾病。这种不想要的增生为癌症和许多慢性炎性疾病的标志，因此“增生性疾病”的实例包括上文所列的癌症和慢性炎性增生性疾病诸如银屑病、炎性肠病和类风湿性关节炎；增生性心血管疾病诸如再狭窄；增生性眼部病症诸如糖尿病性视网膜病变；和良性的过增生疾病诸如血管瘤。
[0233]纤维化疾病
[0234]纤维化疾病为一组慢性疾病，其特征在于过量产生被称为细胞外基质的纤维材料，所述纤维材料导致组织结构的异常变化并干扰正常器官功能。全世界数百万人患有这些慢性疾病，它们通常危及生命。不幸的是，尽管纤维化相当普遍、使人虚弱并且通常危及生命，但是当前没有可用的有效治疗。
[0235]人体通过瘢痕形成响应于创伤和损伤。当正常的伤口愈合响应被干扰时会发生纤维化，所述纤维化为以过量瘢痕形成为特征的一种病症。在纤维化期间，伤口愈合响应持续引起胶原的过量生成和沉积。
[0236]尽管纤维化病症可为急性的或慢性的，但是当正常组织被疤痕组织替换时，该病症共享过量胶原积聚和相关功能丧失的共同特征。
[0237]纤维化由不同原因引起并且可以在各种器官中形成。硬化、肺纤维化、结节病、瘢痕瘤、高血压和肾纤维化均为能诱导引起组织功能持续丧失的逐渐纤维化的慢性疾病。
[0238]在一些实施方案中，优选的适应症包括肝纤维化和肺纤维化，例如由于肝移植后丙型肝炎或非酒精性脂肪性肝炎(NASH)引起的肝硬化；特发性肺纤维化；导致肺纤维化的辐射性肺炎；糖尿病性肾病；与连续非卧床腹膜透析(CAPD)相关的腹膜硬化和眼部瘢痕性类天疱疮。以对各种形式的创伤的常见响应发生急性纤维化(通常具有突然的和严重的发作和短的持续时间)，所述创伤包括意外损伤(特别是对脊柱和中枢神经系统的损伤)、感染、外科手术(在心脏病发作后的心脏瘢痕形成)、烧伤、环境污染物、醇和其它类型的毒素、急性呼吸窘迫综合征和辐射和化学疗法治疗。由创伤损伤的所有组织易于结疤并且变得纤维化，特别是如果重复损伤。深层器官纤维化常常极其严重因为器官功能的逐渐丧失导致发病、住院、透析、残疾并且甚至死亡。纤维化疾病或其中纤维化明显的疾病包括肺纤维化、间质性肺病、人纤维化肺病、肝纤维化、心脏纤维化、黄斑变性、视网膜和玻璃体视网膜病变、心肌纤维化、Grave眼病、药物诱发的麦角中毒、心血管疾病、动脉粥样硬化/再狭窄、瘢痕瘤和肥大性疤痕、汉森病(Hansen’ s disease)和炎性肠病，包括胶原性结肠炎。
[0239]关于不同类型的纤维化的更多信息可以见于例如Yu等(2002)，“Therapeuticstrategies to halt renal fibrosis，，，Curr Opin Pharmacol.2 (2): 177-81 ；Keane 和 Lyle(2003)， “Recent advances in management of type 2diabetes andnephropathy: lessons from the RENAAL study”，Am J Kidney Dis.41 (3 增刊 2):S22-5 ;Bohle 等(1989), “The pathogenesis of chronic renal failure，，，Pathol ResPract.185(4):421-40 ；Kikkawa 等(1997)，“Mechanism of the progress1n ofdiabetic nephropathy to renal failure，，，Kidney Int 增干丨J 62: S39-40 ;Bataller 和Brenner (2001), “Hepatic stellate cells as a target for the treatment of liverfibrosis”，Semin Liver Dis.21 (3):437-51 ；Gross 和 Hunninghake (2001) “Id1pathicpulmonary fibrosis，，，N Engl J Med.345(7):517-25 ；Frohlich (2001) “Fibrosis andischemia:the real risks in hypertensive heart disease^, Am J Hypertens ；14(6Pt2):194S-199S0
[0240]糖尿病性肾病
[0241]糖尿病性肾病(其标志为肾小球硬化症和肾纤维化)为现代世界晚期肾病的单个最普遍的原因，并且糖尿病患者构成了透析的最大群体。此种治疗昂贵并且非常不理想。移植提供较好的结果，但是经受供体的严重紧缺。针对糖尿病性肾病(以及针对其它类型的肾病变)的更多靶向治疗未得到开发，因为这些病变的潜在分子机制大部分为未知的。基本功能性靶基因的鉴定具有高的诊断以及治疗价值，所述基本功能性靶基因在疾病中得到调节并影响糖尿病性肾病的结果的严重性。
[0242]本领域已知的是肾中的许多病理过程最终以类似的或相同的形态变化，即肾小球硬化症和纤维化达到顶点。人肾疾病可能演化自各种来源，包括肾小球肾炎、与全身性红斑狼疮相关的肾炎、癌症、物理障碍物、毒素、代谢疾病和免疫疾病，所有这些在肾纤维化中达到顶点。这种现象的意义为不同类型的损伤会聚在相同的单个遗传程序上，产生纤维化的两个标志:成纤维细胞的增生和由它们过量产生结缔组织的各种蛋白组分。另外，肾小球中基膜的增厚伴随间质纤维化并在肾小球硬化症中达到顶点。不希望受到理论的束缚，编码参与肾纤维化和肾小球硬化症的蛋白质的基因可以大致分为两组:
[0243]1.其表达引发成纤维细胞的增生和它们过量产生结缔组织的各种蛋白组分的基因。这些对于不同病理状况可能为特异的；和
[0244]2.其表达导致“纤维化或硬化程序”的执行的基因。这些对于导致纤维化和肾小球硬化症的所有肾病理学可能为常见的。
[0245]属于第二组的基因的鉴定应当有助于理解伴随成纤维细胞以及系膜细胞增生和分泌过多的分子机制并可建立针对预防肾衰竭的药物开发的基因靶标。预期应用此类药物来阻遏、延迟、防止、抑制或减弱纤维化和肾小球硬化症的进展。
[0246]试剂盒
[0247]还提供了包括全部或部分组合物的试剂盒。“试剂盒”是指包括组合物或组合物的组分的任何产品(如，包装或容器)。可以将该试剂盒用于进行本文公开的方法，包括治疗性处理和诊断。另外，试剂盒可以含有描述试剂盒、其内容物和使用方法的包装说明书。
[0248]本发明已经以示例性方式得到描述，并且应当理解已经使用的术语旨在描述词语的本质而非限制。
[0249]本文引用任何文献并不旨在承认此类文件与现有技术相关或将材料考虑为本申请的任何权利要求的专利性。关于任何文件的内容或日期的任何陈述基于在提交时 申请人:可用的信息并且不构成承认关于此类陈述的正确性。
实施例
[0250]分子生物学中的一般方法
[0251]本领域已知的并且未具体描述的标准分子生物学技术一般遵循Sambrook等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor LaboratoryPress, New York (1989),和 Ausubel 等，Current Protocols in Molecular B1logy, JohnWiley and Sons, Baltimore, Maryland(1989),以及 Perbal, A Practical Guide toMolecular Cloning, John ffiley&Sons,New York (1988),和 Watson 等，RecombinantDNA, Scientific American Books, New York 和 Birren 等(编辑)Genome Analysis:ALaboratory Manual Series,第 1-4 卷 Cold Spring Harbor Laboratory Press, NewYork(1998)和如在美国专利 4，666，828 ；4, 683，202 ；4, 801，531 ；5, 192，659 和 5，272，057中列出的方法并通过引用并入本文。聚合酶链式反应(PCR) —般如在PCR Protocols:AGuide To Methods And Applicat1ns, Academic Press, San Diego, CA(1990)中进行。可使用原位(细胞中)PCR结合流式细胞术检测含有特定DNA和mRNA序列的细胞(Testoni等，1996，Blood 87:3822.)
[0252]免疫学中的一般方法:在本领域已知的并且未具体描述的免疫学中的标准方法一般遵循 Stites 等(编辑)，Basic and Clinical Immunology (第 8 版)，Appleton&Lange, Norwalk, CT (1994)以及 Mishell 和 Shiigi (编辑)，Selected Methods in CellularImmunology, ff.H.Freeman and C0., New York (1980)。
[0253]免疫测定:ELISA免疫测定为本领域的技术人员所熟知。多克隆抗体和单克隆抗体均可用于所述测定。在适当的情况下，如本领域技术人员所已知，可使用其它免疫测定诸如放射性免疫测定(RIA)。可用的免疫测定在专利和科学文献中广泛描述。参见，例如，美国专利号 3，791，932 ;3，839，153 ;3，850，752 ;3，850，578 ;3，853，987 ;3，867，517 ；3，879，262 ;3，901，654 ;3，935，074 ;3，984，533 ;3，996，345 ;4，034，074 ;4，098，876 ；
4,879, 219 ;5， 011, 771 和 5, 281, 521 以及 Sambrook 等,Molecular Cloning:A LaboratoryManual, Cold Springs Harbor, New York, 1989。
[0254]杭体产牛
[0255]本文所用术语“抗体”意指多克隆完整抗体和单克隆完整抗体及其片段，诸如Fab、F(ab’)2、scFv和Fv，它们能够结合表位决定簇。这些抗体片段保留了与其抗原或受体选择性结合的能力并尤其如下例证:
[0256]Fab，含有抗体分子的单价抗原结合片段的片段可通过以下产生:用木瓜蛋白酶消化完整抗体以产生轻链和重链的一部分；
[0257]’(Fab’) 2，可通过用胃蛋白酶处理完整抗体无需随后的还原获得的抗体片段；F(ab’ 2)为通过两个二硫键结合在一起的两个Fab片段的二聚体；
[0258]Fv，被定义为含有表达为两条链的轻链的可变区和重链的可变区的基因工程改造片段；以及
[0259]scFv片段(即单链抗体(“SCA”)，被定义为含有由合适的多肽连接子连接为基因融合单链分子的轻链的可变区和重链的可变区的基因工程改造分子。
[0260]具有抗体功能活性的此类片段可通过本领域技术人员已知的方法制备(Bird等.(1988) Science 242:423-426)。(Mab或mAb在本文被用作单克隆抗体的缩写。MB在本文被用作微型抗体的缩写。)
[0261]方便地，可以制备针对免疫原或其部分的抗体，所免疫原或其部分例如基于序列或通过克隆技术重组制备的合成肽，或者可以分离天然基因产物和/或其部分并将它们用作免疫原。可通过本领域技术人员熟知的标准抗体产生技术使用免疫原产生抗体，如通常描述于 Harlow 和 Lane (1988)，Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring HarborLaboratory, Cold Spring Harbor, NY,以及 Borrebaeck (1992)，Antibody Engineering-APractical Guide, W.H.Freeman and C0.，NY。
[0262]为了制备多克隆抗体，用通常含有佐剂并且，如果需要，偶联至载体的免疫原或免疫原片段免疫宿主诸如兔或山羊；从血清收集免疫原的抗体。此外，多克隆抗体可以被吸附使得抗体为单特异性的；即，血清可针对相关免疫原被吸附从而血清中不含交叉反应性抗体，使得所述抗体为单特异性的。
[0263]为了产生单克隆抗体，所述技术包括用免疫原使适当的供体(通常为小鼠)超免疫，和分离产生抗体的脾细胞。将这些细胞与永生细胞(诸如骨髓瘤细胞)融合以提供永生的并且分泌所需抗体的融合杂种细胞。然后将细胞大量培养并从培养基中收获单克隆抗体以便使用。
[0264]对于产生重组抗体，通常参见Huston 等(1991) "Protein engineering ofsingle-chain Fv analogs and fus1n proteins〃在Methods in Enzymology(JJ Langone编辑，Academic Press, New York, NY) 203:46-88 中;Johnson 和 Bird (1991) "Construct1nof single-chain Fvb derivatives of monoclonal antibodies and their product1nin Escherichia coli in Methods in Enzymology (JJ Langone编辑；Academic Press, NewYork, NY)203:88-99 ；Mernaugh 和 Mernaugh(1995)"An overview of phage-displayedrecombinant antibodies〃在 Molecular Methods In Plant Pathology (RP Singh 和 USSingh编辑；CRC Press Inc., Boca Raton, FL:359-365)中。另外，可将来自动物的抗体生成B淋巴细胞或杂交瘤的信使RNA反向转录以获得互补DNA(cDNA)。扩增抗体cDNA并克隆至噬菌体或质粒，所述抗体cDNA可为全长或部分长度。所述cDNA可为重链和轻链cDNA的部分长度，可为分离的或通过连接子连接。使用合适的表达系统表达所述抗体或抗体片段以获得重组抗体。也可通过筛选相关的表达文库获得抗体cDNA。
[0265] 如本领域所熟知可将所述抗体结合于固体载体基底或与可检测部分缀合或结合且缀合。(对于荧光或酶部分的缀合的综述性讨论，参见Johnstone和 Thorpe(1982.)，Immunochemistry in Practice,Blackwell ScientificPublicat1ns, Oxford)。抗体与固体载体基质的结合也为本领域熟知的(对于综述性讨论，参见 Harlow 和 Lane (1988)Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring HarborLaboratory Publicat1ns, New York ；和 Borrebaeck(1992)，Antibody Engineering-APractical Guide, ff.H.Freeman and C0.)。本文涵盖的可检测部分或标记包括但不限于突光、金属、酶和放射性标记，诸如生物素、金、铁蛋白、碱性磷酸酶、β -半乳糖苷酶、过氧化物酶、脲酶、荧光素、若丹明、氚、14C和碘。
[0266]重组蛋白纯化:对于标准的纯化，参见Marshak等(1996)，"Strategies forProtein Purificat1n and Characterizat1n.A laboratory course manual.^CSHLPress。
[0267]实施例1:杭ENDO180杭体
[0268]ENDO180也称为C型甘露糖受体2前体。人END0180mRNA的多核苷酸序列列于登记号NM_006039中。该多核苷酸序列的3:5983碱基中，开放阅读框(ORF)为4439个碱基(从117-4441) ;1479个氨基酸(aa)的多肽序列列于登记号NP_006030中，其中基因标识号为G1: 110624774。小鼠mRNA序列为5818个碱基，登记号为MMU56734，其中ORF为1479
个氨基酸。
[0269]END0180包含如下若干蛋白质结构域:1-31个氨基酸的SP(信号肽)；41_161个氨基酸富含半胱氨酸的N末端结构域；180-228个氨基酸的FNII (纤连蛋白类型II)结构域、8个CDR(碳水化合物识别结构域)结构域1CRD-8CRD(235-360个氨基酸的1CRD、382-505个氨基酸的2CRD、521-645个氨基酸的3CRD、669_809个氨基酸的4CRD、825_951个氨基酸的5CRD、972-1108个氨基酸的6CRD、1161-1244个氨基酸的7CRD、1261-1394个氨基酸的8CRD) ; 1413-1435个氨基酸的ITM(跨膜结构域)、1437-1479个氨基酸的细胞质结构域。在一些实施方案中，所述END0180多肽与列于SEQ ID N0:2的氨基酸序列(NCBI标iK: gi 1110624774 | ref | NP_006030.2 |)基本相同，所述氨基酸序列由与列于SEQ ID NO:1的核酸序列(NCBI标识:gi 1110624773 | ref | NM_006039.3 |)基本相同的多核苷酸编码。
[0270]以下提供本文公开的多核苷酸和氨基酸序列:具有FLAG序列(pcDNA3-5’hEND0180-FLAG构建体，SEQ ID NO: 3)的人END0180的细胞外结构域的多核苷酸序列(氨基酸1-522) ；SEQ ID NO:3(SEQ ID NO:4)的多肽序列；scFv克隆G7V的多核苷酸序列(SEQ ID NO:5) ;scFv克隆G7V的多肽序列(SEQ ID N0:6 ;也称为微型抗体或“MB”)；G7V 的重链 CDR3 (SEQ ID NO: 7) ;G7V 的轻链 CDR3 (SEQ ID NO: 8)。
[0271]由杂交瘤细胞系E3_8D8(在本文中也称作8D8或e3b3或8d8e3b3 ;以登记号LMBP7203CB保藏于BCCM)产生的抗体和本文公开的重组抗END0180抗体描述于PCT专利公布W02010/111198，在此通过引用整体并入。在一些实施方案中，所述优选的END0180靶向剂选自
[0272]a.分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其由以登记号BCCM LMBP 7203CB保藏的杂交瘤细胞系E3-8D8产生；
[0273]b.与(a)的抗体结合至相同的表位的抗体或其抗原结合片段；
[0274]c.(a)的抗体或其抗原结合片段的人源化形式，或(b)的抗体或抗原结合片段的人源化形式；
[0275]d.(a)的抗体或其抗原结合片段的嵌合形式，或(b)的抗体或抗原结合片段的嵌合形式；
[0276]e.包含(a)中的抗体的抗原结合结构域的重组多肽或其抗原结合片段，其通过ENDO180受体被内化至细胞内；
[0277]f.抗体的抗原结合片段，其包含与SEQ ID NO: 6基本相似的多肽；以及
[0278]g.重组多肽，其包含具有与列于SEQ ID NO:7和8的氨基酸序列基本相似的氨基酸序列的⑶R。
[0279]实施例2.脂质组合物
[0280]目标:本研究的主要目标为开发将包括小分子和寡核苷酸的货物(诸如反义和dsRNA)选择性地递送至靶细胞的平台。具体地讲，所述货物被递送至表达内吞END0180受体的细胞，所述受体在纤维化组织和肿瘤中活化的肌成纤维细胞上、肿瘤细胞的侵袭性亚群上并且特别是在肉瘤上以及新血管内皮上过度表达。
[0281]用抗END0180抗体修饰的基于脂质的纳米微粒(“脂质微粒”、“脂质NP”)的细胞摄取的特异性使用被稳定转染以表达END0180 (NRK-END0或NRK-END0180)的NRK52 (也称为NRK)细胞系来实现。作为对照，使用由pIRESPuix)空载体稳定转染的NRK52细胞系。
[0282]材料和方法:
[0283]鉬合物和物理化学表征:
[0284]如下开发包含用于靶向递送治疗货物或诊断货物的脂质和END0180靶向部分的组合物:
[0285]1-携带小分子的脂质微粒(例如包括多柔比星或丝裂霉素作为小的亲水性模型药物的癌症治疗剂)；
[0286]2-携带dsRNA的脂质微粒(例如Cy3_siRNA作为模型dsRNA)。
[0287]Cy3标记的siRNA包括在位置2、4、6、8、10、12、14、16和18中具有未修饰的核糖核苷酸，和在位置1、3、5、7、9、11、13、15、17和19中具有2’O-甲基糖修饰的核糖核苷酸以及共价连接至反义链的3’末端的Cy3部分的反义链；以及在位置1、3、5、7、9、11、13、15、17和19中具有未修饰的核糖核苷酸和在位置2、4、6、8、10、12、14、16和18中具有2’O-甲基糖修饰的核糖核苷酸的有义链。材料:高纯度氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)、胆固醇(Chol)、二油酸憐脂酸乙醇胺(DOPE)购自 Avanti Polar lipids Inc., (Alabaster, AL, USA)。大豆磷脂酰胆碱(大豆-PC)和1，2-双(二苯基膦基)乙烷(DPPE)购自Avanti polarlipids, (Alabaster, AL, USA)。NHS-PEG-DSPE[3-(N_琥拍酰亚氨氧基戍二酰基)氨基丙基，聚乙二醇-氨基甲酰基二硬脂酰磷脂酰-乙醇胺]购自NOF cooperat1n, Tokyo, Japan。高分子量透明质酸来自Genzyme Corporat1n (Cambridge, MA, USA)。细胞培养板和培养皿来自Corning Glass Works (New York, NY, USA)。聚碳酸酷膜来自
Nucleopore (Pleasanton, CA, USA)。总 RNA 用来自 Qiagen (Valencia, CA, USA)的 RNeasy?
微型试剂盒提取并通过来自Invitrogen(Carlsbad, CA, USA)的Superscript III进行逆转录。用于定量RT-PCR的引物获自Syntheza, Inc.(Rehovot, Israel)。多柔比星和丝裂霉素购自Sigma-Aldrich C0.(St.Louis, MO，USA)。所有其它试剂为分析级。
[0288]用Alexa Fluor 488对8D8mAb讲行费光染料标记。
[0289]使用Alexa Fluor 488和647蛋白标记试剂盒(Invitrogen目录号A10235),将Img E3-8D8单克隆抗体(8D8)用于标记。根据制造商的说明书进行标记程序并在脱盐柱上纯化以分离未结合的染料。
[0290]组合物1.基于脂质的纳米微粒制剂-PEG-间隔基，涂覆有抗END0180抗体并携带多柔比星作为治疗剂(货物)。
[0291]组合物I 包含摩尔比为约 75:20:4.5:0.5 (HSPC: cho1: DOPE: NHS-PEG-DSPE)的氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)、胆固醇(Choi)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)和NHS-PEG-DSPE[3-(N-琥珀酰亚氨氧基戊二酰基)氨基丙基，聚乙二醇_氨基甲酰基二硬脂酰磷脂酰-乙醇胺](N0F c ooperat1n, Tokyo)。
[0292]简言之，多层囊泡(MLV)通过脂质-膜方法制备并使用步琪-旋转蒸发器(buch1-rotovap)蒸发至干燥(Peer 和 Margalit, 2000，Arch B1chem B1phy383(2): 185-90 ；Peer 和 Margalit, 2004，Neoplasia6 (4):343-53 ；Peer 等，2008，Science319(5863):627-630) ο将该脂质膜用在pH7.4的盐水中重悬的多柔比星水合以产生MLV。如先前描述测量脂质质量(Peer等，2008)。在60°C于300至550psi的氮气压力下将所得 MLV 用 Thermobarrel Lipex 挤出机(Lipex B1membranes Inc., Vancouver, BritishColumbia, Canada)挤出至小的单层纳米级囊泡(SUV)中。使用逐渐减小孔径尺寸的膜(从1、0.8、0.6、0.4、0.2 至 0.1 μ m) (Nucleopore, Whatman)用 10 个循环 / 孔尺寸以逐步的方式进行挤出。
[0293]涂覆有抗END0180的脂质纳米微粒和同种型对照微粒的表面修饰和纯化
[0294]使用Amicon管(MW截留值为10KDa)将抗END0180 (克隆8D8)或同种型对照(非结合小鼠IgG2a)抗体浓缩至终浓度为10mg/mL,如通过使用NanoDrop 1000分光光度计(Thermo Scientific)在280nm处IgG的吸光度所确定的。
[0295]抗体与脂质的共价缔合用EDC-NHS交联剂在ImL反应小瓶中的PBS中于室温下过夜进行，所述反应小瓶含有50 μ L mAb (10mg/mL)和950 μ L 10mg/mL的脂质微粒。
[0296]过量8D8mAb的纯化使用pH 7.4下用HEPES缓冲盐水平衡的琼脂糖凝胶CL-4B柱进行。
[0297]使用针对每个实验新鲜绘制的标准曲线通过荧光定量多柔比星(DOX)。
[0298]组合物2基于脂质的纳米微粒制剂-透明质酸间隔基，涂覆有抗END0180抗体并携带标记的siRNA
[0299]包含均来自Avanti Polar Lipids, Inc., (Alabaster, AL, USA)摩尔比为约4:2:1 (DOPE: D0TMA:Chol)的二油酰磷脂酰乙醇胺(D0PE)、1，2-二-0-十八烯基-3-三甲基铵丙烷(DOTMA)和胆固醇(Chol)的多层囊泡(MLV)通过脂质-膜方法制备(Peer和Margalit 2004)。将该脂质膜用在DEPC-水中悬浮的Cy3标记的siRNA水合以产生MLV。
[0300]siRNA包封的功效:货物负载根据Landesman-Milo等公开的方法(2012，CancerLett, pi1: S0304-3835 (12) 00512-5)进行，所述文献通过引用整体并入。简言之，siRNA
包封功效由Quant-1T? RiboGreeil? RNA测定试剂盒(Invitrogen)确定并在存在和不存在去污剂的情况下通过比较LNP (脂质纳米微粒)中结合染料RiboGreen的RNA和HA-LNP(透明质酸结合脂质纳米微粒)样品中的荧光进行。在未经处理的样品中，由未包封的siRNA(游离siRNA)测量荧光，而在去污剂处理的样品中，由总siRNA测量荧光。如下计算包封％:
[0301]siRNA 包封％= [1_(游离 siRNA 浓度 / 总 siRNA 浓度)]x 100。
[0302]脂质质量如先前描述测量(Peer等，2008)。在室温下于300至550psi的氮气压力下将所得MLV用Thermobarrel Lipex挤出机(Lipex B1membranesInc., Vancouver, British Columbia, Canada)挤出至单层纳米级囊泡(ULV)中。使用逐渐减小孔径尺寸的膜(从 1、0.8、0.6、0.4、0.2 至 0.1 μ m) (Nucleopore, Whatman)用 10 个循环/孔尺寸以逐步的方式进行挤出。
[0303]涂覆有抗END0180的脂质纳米微粒和同种型对照微粒的表面修饰和纯化。
[0304]将ULV用高分子量透明质酸(HA)涂覆,所述透明质酸使微粒稳定并充当mAb结合的支架(Peer等，2008)。简言之，将HA溶解于水并在37°C于pH 4.0下用EDC预活化2h。将所得活化的HA添加至含有DOPE的ULV在0.1M硼酸盐缓冲液(pH 8.6)的悬浮液中并在37°C在轻微搅拌下温育过夜。将所得HA-ULV通过离心(1.3x 105g, 40C, Ih)分离并洗涤四次。最终 HA/脂质比通常为 57-70 μ g HA/μ mol 脂质，如通过 3H-HA (ARC, Saint Louis, MI)测定。
[0305]将HA-修饰的纳米微粒(NP)使用胺-偶联方法偶联至抗END0180或抗IgGmAb。简言之，于室温在轻微搅拌下，将50 μ L HA-修饰的脂质微粒(40mg/mL)与200yL400mmol/Ll_ (3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDAC, Sigma-Aldrich, SaintLouis, MI)和 200 μ LlOOmmol/L-N-羟基玻拍酸亚胺(NHS, Fluka, Sigma-Aldrich, SaintLouis, MI)温育 20 分钟。将所得 NHS-活化的 HA-NP 与 50 μ L mAb (在 HBS (pH 7.4)中 1mg/mL的抗END0180克隆8D8或其同种型对照小鼠IgG2a)混合并于室温在轻微搅拌下温育过夜。然后添加20微升IM乙醇胺HCl (pH 8.5)以封闭反应性残基。将所得免疫-NP使用填充有琼脂糖凝胶CL-4B珠(Sigma-Aldrich，St.Louis, Ml)的尺寸排阻柱纯化并用HBS (pH
7.4)平衡以除去未结合的mAb。
[0306]图1不出用于广生涂覆有HA的脂质微粒的不意图。
[0307]组合物3基于脂质的纳米微粒制剂-透明质酸间隔基，涂覆有抗END0180抗体
[0308]包含60%的大豆磷脂酰胆碱(大豆-PC)、20%的DPPE和20%的胆固醇(mol/mol)浓度为40mg/ml (大豆PC 273mg、DPPE 81.2mg、胆固醇145.4mg在1ml乙醇中)的多层囊泡通过脂质-膜方法制备并如上所述在旋转蒸发器(BUCHI R-210)中蒸发至干燥。在蒸发后，将干燥的脂质膜在10ml HBS(150mM NaCl、20mM Hepes) (pH7.4)中水合并振摇所述溶液(2小时65°C )以产生MLV。如先前描述测量脂质质量(Peer等，2008)。如上所述，将所得 MLV 用 Thermobarrel Lipex 挤出机(Lipex B1membranes Inc., Vancouver, BritishColumbia, Canada)挤出至平均尺寸为约150nm(Zetasizer Nano ZS系统)的单层纳米级囊泡(ULV)。
[0309]涂覆有抗END0180的脂质纳米微粒和同种型对照微粒的表面修饰和纯化。
[0310]将高分子量的透明质酸(HA)(700Kda Lifecore)溶解于0.2M MES缓冲液(pH 5.5)至5mg/ml的终浓度，并以1:1:6的摩尔比用EDC和磺基-NHS活化。在活化30分钟后，添加ULV并将pH调节至7.4。将溶液在室温温育(2小时)。通过3次超速离心循环除去游离的HA。所得HA-ULV的平均尺寸为130nm。
[0311]mAb结合和纯化
[0312]将抗END01808D8mAb浓缩至终浓度为10mg/ml (Centricon离心过滤器装置(Centricon Centrifugal Filter units))。将 20 μ I 抗体用 1.2 μ gEDC 和 1.44 μ gr 横基-NHS (pH 5.5)活化。在室温下温育30分钟之后，添加0.8mg脂质微粒并将pH调至pH7.4。将所述脂质微粒在4°C下温育过夜。将脂质微粒和游离抗体在CL-4B柱上分离。
[0313]实施例3:组合物的分析
[0314]荧光激活细胞分选(FACS)研究。
[0315]对于结合分析，将3.5x10s个细胞用胰蛋白酶消化、离心沉淀、用FACS缓冲液(于IxPBS中的I %的胎牛血清)重悬，与抗END0180mAb (I μ g)在冰上温育30分钟并用ImlFACS缓冲液洗涤。将mAb样品与50 μ I FACS缓冲液中的第二 FITC缀合的山羊抗小鼠IgG抗体(115-095-072) (1:100，150 μ g/ml)的在冰上温育30分钟，重悬于Iml FACS缓冲液并使用FACS Calibur流式细胞仪分析。
[0316]粒度分布和ζ电势测量。
[0317]NP或涂覆有8D8的NP的粒度分布和平均直径使用自动算法模式在MalvernZetasizer Nano ZS ζ 电势和动态光散射仪器(Malvern Instruments, Southborough, MA)上测量并用PCS 1.32a分析。所有测量在室温下于0.01mol/l NaCl (pH 6.7)中进行。
[0318]涂覆有8D8的NP与细胞的结合。
[0319]每个FACS 管收集约 0.5x 16 个表达 END0180 的 NRK52 细胞(NRK-END0180)，在 ImLDMEM培养基中离心沉淀并再悬于ImL FACS缓冲液(99% PBS+1 % FCS)中。离心沉淀细胞。丢弃上清液并将沉淀用Alexa 488标记的涂覆有8D8的NP或IgG-NP (以1:25-1:75稀释对应于10-30 μ g/mL)重悬并在4°C下温育30分钟。添加ImL FACS缓冲液并离心沉淀细胞。丢弃上清液。然后将细胞重悬于200uL FACS缓冲液(用于立即分析)。在FACScan (BDB1sciences, San Jose, CA, USA)上进行流式细胞术分析并使用flowjo软件(Tree StarInc., Ashland, OR, USA)分析。
[0320]共聚焦显微镜分析
[0321]为了检测细胞中siRNA递送，使用包埋在涂覆有8D8的NP中的Cy5_标记的siRNA(组合物2)。使用Zeiss LSM 510META的扫描模块进行综合的共聚焦分析。
[0322]独特的扫描模块为LSM 510META的核心。它含有电动准直器、扫描镜、单独可调节且可定位的销孔以及包括META检测器的高灵敏检测器。设置所有这些部件被以确保最佳的标本照明和反射光或发射光的高效收集。高效的光学光栅提供了分离META检测器中荧光发射的新方法。光栅将整个荧光光谱投射在META检测器的32个信道上。因此，获得对于每个像素的扫描图像的光谱特征并随后可将所述光谱特征用于数字分离成组分染料。
[0323]内化研究
[0324]内化测定在24孔板中进行。将IxlO5个A549或NRK-ENDO180或NRK初始细胞分别接种在补充有抗生素、L-谷氨酰胺和10%胎牛血清(B1logical Industries, BeitHaemek, Israel)的RPMI或DMEM培养基中的盖玻片上。
[0325]对于膜染色，将细胞用CellTracker? DilC18(5)_DS溶液(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)染色,所述溶液用PBS以1:5000稀释。对于细胞膜标记，使用伴刀豆球蛋白 A, Alexa fluor 647 缀合物(10 μ g/ml) (C21421, Invitrogen) ? 对于核染色，用Hoechst (在PBS中为1:10,000) (33258, Sigma)对细胞染色。在37°C下于含有5%CO2的湿润气氛中将细胞暴露于含缀合于抗END0180mAb的组合物3的脂质微粒(50 μ I来自储备溶液，根据制备方法)或单独组合物3的脂质微粒(50 μ I来自制备的脂质体储备溶液)的无血清培养基中持续I小时。随后，将细胞使用冷的PBS洗涤两次，用4%多聚甲醛(PFA)固定并再用冷的PBS洗涤。固定之后进行膜和核染色。
[0326]将细胞使用突光封片液(fluorescentmounting medium) (Golden Bridgeinternat1nal, Mukilteo, WA, USA)固定并使用 Andor 转盘共聚焦显微镜(Andor Spinningdisc confocal microscope)和 Meta 510Zeiss LSM 共聚焦显微镜测量突光。将在 405、488、561和650nm处的激光束分别用于UV、若丹明、Concavaline A和CellTrackerTM突光团激发。记录每种处理的细胞的连续光学部分(serial optical sect1n)并使用ZeissLSM Image浏览器软件处理图像。
[0327]用包埋于8D8-NP中的多柔比星对表汰ENDO180的NRK细朐讲行诜择件杀伤。
[0328]为了检查靶向递送系统的特异性和选择性地递送小分子实体的能力，如以上实验部分所详述，将DOX包埋在8D8-NP或IgG-NP中。在37°C下(在含有5%0)2的湿润气氛下)将表达END0180受体的细胞(NRK-END0180+细胞)和缺乏所述受体的细胞(NRK-END0180-/-细胞)温育在0.5 μ M不含DOX或包埋DOX的8D8-NP或IgG-NP中(浓度相同)持续0.5h。然后，洗涤细胞并与不含药物的培养基温育另外72h(在37°C培养箱中)，随后进行XTT测定。
[0329]
[0330]脂质组合物的结构和物理化学表征。
[0331]表1示出了组合物I和2在所有mAb-缀合的NP中的直径和表面电荷特性。
[0332]表1
[0333]
【权利要求】
1.一种组合物，其包含a)基于脂质的载体部分；b)END0180靶向部分；和c)有效量的治疗剂或诊断剂或它们的组合；其中所述载体部分和所述靶向部分共价结合。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述载体部分和所述靶向部分经由用合成聚合物、天然聚合物或半合成聚合物对所述载体部分进行的表面修饰共价结合。
3.根据权利要求2所述的组合物，其中所述合成聚合物包含PEG部分。
4.根据权利要求3所述的组合物，其中所述PEG部分包括NHS-PEG-DSPE[3- (N-琥珀酰亚氨氧基戊二酰基)氨基丙基，聚乙二醇-氨基甲酰基二硬脂酰磷脂酰-乙醇胺]。
5.根据权利要求2所述的组合物，其中所述天然聚合物包括多糖或糖胺聚糖。
6.根据权利要求5所述的组合物，其中所述糖胺聚糖包括透明质酸。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的组合物，其中所述END0180靶向部分包含ENDO180结合蛋白，所述END0180结合蛋白结合存在于细胞上的END0180多肽的细胞外结构域并通过所述END0180多肽被内化至细胞内。
8.根据权利要求7所述的组合物，其中所述END0180结合蛋白包括END0180抗体或其能够结合END0180的功能片段。
9.根据权利要求8所述的组合物，其中所述END0180抗体或其能够结合END0180的功能片段选自:完整的IgG、单克隆抗体、多克隆抗体、人抗体、人源化抗体、人源化抗原结合片段、Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、其重链和/或轻链的可变部分、Fab微型抗体、和scFv或它们的组合。
10.根据权利要求8或9所述的组合物，其中所述END0180抗体或其功能片段选自: a.分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其由以登记号LMBP7203CB保藏于BCCM的杂交瘤细胞系E3-8D8产生； b.与(a)的抗体结合至相同的表位的抗体或其抗原结合片段； c.(a)的抗体或其抗原结合片段的人源化形式，或(b)的抗体或抗原结合片段的人源化形式； d.(a)的抗体或其抗原结合片段的嵌合形式，或(b)的抗体或抗原结合片段的嵌合形式； e.包含(a)的抗体的抗原结合结构域的重组多肽或其抗原结合片段，其通过所述ENDO180受体被内化至细胞内； f.抗体的抗原结合片段，其包含与SEQID N0:6基本相似的多肽；以及 g.重组多肽，其包含具有与列于SEQID N0:7和8的氨基酸序列基本相似的氨基酸序列的CDR。
11.根据权利要求8至10中任一项所述的组合物，其中所述END0180抗体或其功能片段包含所述分离的单克隆抗体的人源化形式的抗原结合片段。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的组合物，其中所述基于脂质的载体部分包含脂质微粒。
13.根据权利要求12所述的组合物，其中所述脂质微粒包含选自以下的一种或多种脂质:磷脂酰胆碱或其衍生物、磷脂酰甘油或其衍生物、和磷脂酰乙醇胺(PE)或其衍生物、或它们的组合。
14.根据权利要求12或13所述的组合物，其中所述脂质微粒还包含一种或多种阳离子脂质。
15.根据权利要求12至14中任一项所述的组合物，其中所述脂质微粒还包含胆固醇。
16.根据权利要求15所述的组合物，其中所述脂质微粒包含二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)和胆固醇。
17.根据权利要求16所述的组合物，其中所述脂质微粒还包含氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)。
18.根据权利要求17所述的组合物，其中所述脂质微粒包含摩尔比为约4.5:20:75:0.5 (DOPE: HSPC: Cho1: NHS-PEG-DSPE)的 DOPE、氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)、胆固醇(Chol)和 PEG 部分 NHS-PEG-DSPE。
19.根据权利要求16至18中任一项所述的组合物，其中所述脂质微粒还包含D0TMA。
20.根据权利要求19所述的组合物，其中所述脂质微粒包含摩尔比为约4:2:1 (DOPE:DOTMA:Chol)的二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、1，2-二 -O-十八烯基-3-三甲基铵丙烷(DOTMA)和胆固醇(Choi)。
21.根据权利要求15所述的组合物，其中所述脂质微粒包含DPPE和胆固醇。
22.根据权利要求21所述的组合物，其中所述脂质微粒还包含大豆PC。
23.根据权利要求22所述的组合物，其中所述脂质微粒包含摩尔比为约3:1:1(大豆PCiDPPE:胆固醇)的大豆PC、DPPE和胆固醇。
24.根据权利要求1至23中任一项所述的组合物，其中所述脂质微粒的直径为约85至约200nM，优选为约85至约130nm。
25.根据权利要求1至24中任一项所述的组合物，其中所述脂质微粒包含约(-7)至约(-40)的ζ电势。
26.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物包含诊断剂，所述诊断剂为选自放射性同位素、荧光团、发光剂、磁性标记和酶标记的显像剂。
27.根据权利要求1的组合物，其中所述组合物包含至少一种选自核酸化合物和非核酸化合物或它们的组合的治疗剂。
28.根据权利要求27所述的组合物，其中所述非核酸化合物选自小分子、肽、多肽、肽模拟物、糖脂和抗体或它们的组合。
29.根据权利要求28所述的组合物，其中所述治疗剂包括多柔比星或丝裂霉素。
30.根据权利要求28所述的组合物，其中所述核酸选自反义化合物、化学修饰的双链RNA化合物、未修饰的双链RNA化合物、化学修饰的shRNA化合物、未修饰的shRNA化合物、化学修饰的miRNA化合物和未修饰的miRNA化合物、化学修饰的siRNA、未化学修饰的siRNA和核酶或它们的组合。
31.根据权利要求30所述的组合物，其中所述治疗剂为选自化学修饰的siRNA化合物和未修饰的siRNA化合物的dsRNA分子。
32.—种治疗患有增生性病症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求1至31中任一项所述的组合物。
33.根据权利要求1至31中任一项所述的组合物，其用于治疗。
34.根据权利要求33所述的组合物，其中所述治疗包括增生性病症的治疗。
35.根据权利要求32至34中的任一项所述的方法或组合物，其中所述组合物为全身施用。
36.根据权利要求32或34所述的方法或组合物，其中所述增生性病症选自实体瘤、造血系统肿瘤、转移、纤维化和巨噬细胞相关的病症。
37.根据权利要求36所述的方法或组合物，其中所述增生性病症为实体瘤或造血系统肿瘤。
38.根据权利要求37所述的方法或组合物，其中所述肿瘤选自卵巢肿瘤、乳腺肿瘤、成骨性癌/骨细胞癌、前列腺癌、头颈癌、白血病、肾细胞癌和移行细胞癌。
39.根据权利要求36所述的方法或组合物，其中所述巨噬细胞相关的病症包括炎症或动脉粥样硬化。
40.一种用于诊断受试者的增生性病症的方法，所述方法包括使来自所述受试者的身体样品与包含a)载 体部分；b)END0180靶向部分和c)诊断剂的组合物接触；并将所述生物样品中诊断剂的水平与来自健康受试者的参考样品中诊断剂的水平或与已知标准进行比较。
【文档编号】A61P35/00GK104080480SQ201280068167
【公开日】2014年10月1日 申请日期:2012年12月31日 优先权日:2012年1月1日
【发明者】埃琳娜·费因斯坦, 丹·培尔 申请人:奇比艾企业有限公司, 雷蒙特亚特特拉维夫大学有限公司