专利名称：人源抗鼻咽癌LMP2A胞外区抗体Fab及其应用的制作方法
技术领域：
:本发明属于免疫学或分子生物学技术领域，涉及利用基因重组技术，提供一种人源抗鼻咽癌LMP2A胞外区抗体Fab及其应用。
背景技术：
:鼻咽癌是来源于鼻咽上皮的高度恶性肿瘤，肿瘤进展极易侵犯颅底等重要结构，并较早发生颈部淋巴结转移和远处转移。鼻咽癌表现为种族和地区分布的特点，是我国十大高发恶性肿瘤之一，其发病率为20/100,000，已引发严重健康问题。鼻咽癌是由Epstein-Barr病毒(EBV)的潜伏感染、环境因素和宿主的基因遗传因素共同参与的多步骤交互作用而逐步形成的复杂性疾病。所有的鼻咽癌细胞都含有EBV基因组，并表达EBNA1，EBERl, EBER2， 和LMP1，LMP2A，LMP2B，这使得这些病毒蛋白成为理想的肿瘤标志物，其中latent membrane protein2A(LMP2A)在鼻咽上皮细胞的转化、癌变和复发的过程中的作用倍受关注，是目前公认的病毒癌基因。它以其独特的蛋白分子结构参与鼻咽癌发生和发展的全过程。
发明内容
解决的技术问题:本发明目的是提供一种人源抗鼻咽癌LMP2A胞外区抗体Fab及其药物用途，为鼻咽癌中表达的LMP2A的检测提供检测工具及为鼻咽癌的靶向治疗奠定基础。技术方案:人源抗鼻咽癌LMP2A胞外区抗体Fab，所述抗体的'链的互补决定区具有以下的⑶Rs氨基酸序列:SEQ ID N0.3 所示的 L-CDR1 ；SEQ ID N0.4 所示的 L-CDR2 ；SEQ ID N0.5 所示的 L-CDR3 ；并且所述抗体的Vh链的互补决定区具有以下的⑶Rs氨基酸序列:SEQ ID N0.8 所示的 H-CDR1 ；SEQ ID N0.9 所示的 H-CDR2 ；SEQ ID N0.10 所示的 H-CDR3。所述抗体的八链的可变区氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示，Vh链的可变区氨基酸序列如SEQ ID N0.7所示。所述抗体的'链的可变区核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，Vh链的可变区核苷酸序列如SEQ ID N0.6所示。人源抗鼻咽癌LMP2A胞外区抗体Fab在制备治疗鼻咽癌药物中的应用。人源抗鼻咽癌LMP2A胞外区抗体Fab在治疗鼻咽癌中的应用。SEQ ID N0.1轻链可变区核酸序列GAGCTCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATC
TATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTC
ACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGAGTTACAGTACCCCGTACACTTTT
GGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAASEQ ID N0.2轻链可变区氨基酸序列ELQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNffYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPYTFGQGTKLEIKSEQ ID N0.3L-CDR1 =QSISSYSEQ ID N0.4L-CDR2:AASSEQ ID N0.5L-CDR3:QQSYSTPYTSEQ ID N0.6重链可变区核酸序列CAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCGTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATGGTATGATGGAAGTAATAAATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGATTGGAAACAGCACTGGTACTTCGATCTCTGGGGCCGTGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCASEQ ID N0.7重链可变区氨基酸序列QLLESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHffVRQAPGKGLEffVAVIffYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAYYYCARDffKQHWYFDLffGRGTLYTYSSSEQ ID N0.8H-CDR1:GFTFSSYGSEQ ID N0.9H-CDR2:1WYDGSNKSEQ ID N0.10H-CDR3 =ARDffKQHWYFDL有益效果:本发明提供了一种既具有抗体特异性又具备较好亲和力的抗鼻咽癌作用的ant1-LMP2A人源抗体，该抗体可用于免疫荧光、免疫组化和免疫共沉淀实验。该人源抗体能为鼻咽癌的靶向治疗提供一个新的靶向抗体。
图1为LMP2A胞外区 融合基因在大肠杆菌系统中的表达纯化和SUNE、CNE中LMP2A蛋白的鉴定:A.LMP2A胞外区融合基因在大肠杆菌系统中的表达I空菌2诱导后全菌3超生上清4超生沉淀(SDS-PAGE) ；B.纯化后的胞外融合蛋白LMP2A12KD (SDS-PAGE ;纯度>95%) ；C.LMP2A 在细胞内表达的鉴定 1SUNE2CNE55KD (Western Bloting)；图2为噬菌体抗体库筛选的ELISA检测结果和抗LMP2A人源抗体Fab29的鉴定、纯化:A.差减法阳性克隆的挑选；B.Fab29在ToplO空菌中表达I空菌对照2超生上清3超生沉淀(Western Bloting) ；C.Fab29 纯化结果(SDS-PAGE ;纯度 >95%)；图3为纯化的Fab29与细胞株SUNE/CNE以及不相关抗体与SUNE结合的细胞ELISA测定结果和Fab29与SUNE/CNE细胞结合的FACS结果以及SUNE细胞与CNE细胞裂解液与Fab29免疫共沉淀结果:A.纯化的Fab29与细胞株SUNE/CNE以及unrelated Fab与SUNE的结合测定；B.流式细胞计数显示Fab29与SUNE细胞结合(I)而unrelated Fab不与SUNE
(2)细胞结合而且Fab29不能与CNE细胞结合；C.免疫共沉淀结果显示Fab29能够捕获LMP2A蛋白图4为Fab29和细胞株SUNE/CNE以及不相关抗体Fab与SUNE结合的细胞免疫荧光图:A.Fab29(l-4)和 unrelated Fab (5_8)与肿瘤细胞株 SUNE 以及 Fab29 (9-12)与 CNE的结合-免疫荧光，4，8，12分别是普通光学显微镜检视；图5为Fab与重组蛋白LMP2A的亲和力和动力学测试结果:Fab29在不同浓度下与重组LMP2A蛋白的亲和力和动力学分析结果。结果显示Fab29对重组LMP2A的亲和力是1.79E-0.9 ；图6为Fab29与Rat ant1-EBV LMP2A和不相关Fab做鼻咽癌患者免疫组化的差别:1是经商业化Rat ant1-EBV LMP2A抗体鉴定的阳性鼻咽癌患者的肿瘤切片；2是Fab29与该阳性患者切片孵育结果；3是unrelated Fab与鼻咽癌患者肿瘤切片孵育的结果.4-6是鼻咽癌LMP2A阴性切片结果。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。实施例中如无特别说明，各物质浓度均为质量百分比浓度 :实施例1人源抗LMP2A胞外区抗体Fab的制备与鉴定:一、潜伏膜蛋白2A(LMP2A)胞外区抗原的制备与纯化1.LMP2A胞外区的基因序列来源于B95-8细胞系，通过GenBank公布数据(AJ507799.2)确认，LMP2A 二段胞外区LMP2A由南京佰杰斯生物公司进行全基因合成，并将LMP2A胞外区重组基因克隆到pET28a+载体中而构建成质粒pET28a+_LMP2A。2.His-LMP2A胞外肽段质粒的构建(I).用限制性内切酶BamH I和Xho I双酶切质粒pET28a+_LMP2A，将LMP2A胞外基因片段使用TAKARA公司胶回收试剂盒切胶回收；(2).使用T4DNA连接酶联接到pET28a+表达质粒；3.Hi S-LMP2A胞外肽段融合蛋白的表达(I).将含有重组质粒pET28a+-LMP2A和空载体pGEX_4T_2的BL21菌株接种到含卡纳霉素(50ug/mL)的LB中，37°C震荡过夜；(2).次日转接，37 °C培养至菌液吸光度㈧值600约0.6时，加异丙基硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-thiogalactoside, IPTG)诱导表达蛋白，至终浓度为 lmmol/L,25 °C 190r/min 震荡；(3).诱导12小时，以未转质粒的空菌作对照。用12 % SDS-PAGE电泳分析His-LMP2A融合蛋白表达。4.His-LMP2A融合蛋白的纯化(I).离心收集表达His-LMP2A膜外肽段融合蛋白菌液。用PBS45mL重悬细菌，超声碎菌。4°C收集上清过滤；(2).将含有His_LMP2A膜外肽段融合蛋白的上清经亲和层析柱，用洗脱液(500mmol/L 咪唑，0.5M/L NaCl, 20mmol/L NaH2PO4)洗脱，收集蛋白；(3).经SDS-PAGE分析蛋白表达含量与纯度，样品于_70°C贮存。
二、交替固相法与差减法的筛选抗体Fab1.本发明采用基于固相抗原的筛选与基于细胞的筛选，差减筛选法选择人鼻咽癌细胞CNE为阴性细胞(由南京医科大学卫生部抗体重点实验室保存)，天然在膜表面表达LMP2A的鼻咽癌细胞株SUNE为阳性细胞(上海诺华诺华制药有限公司)；固相筛选时His-LMP2A胞外肽段融合蛋白为抗原；2.基于细胞表面的差减筛选(I)抗体库滴度测定:将_80°C保存的噬菌体库于冰上解冻后用pH7.4的PBS稀释至1X10—9，取14 1^稀释的抗体库与5(^1^对数生长期的乂1^1-1311^ (OD6tltl约1.0)于室温下混合30min后铺板，于第二天通过菌落数测滴度，公式如下:每微升噬菌体数=稀释倍数X菌落数首轮准备约1013phage ;筛库加入的phage数按需要的曬菌体数+每微升phage数计算；如噬菌体滴度低，则将几个不同离心管内的噬菌体混合后加入1/5体积20%wt的PEG, 15%wt NaCl 溶液沉淀后用 lmLl%wt 的 BSA-PBS 溶解；(2)筛库前一天接种单克隆XLl-blue于含10mL30 μ g/mL四环素SB培养液的50mL烧瓶中，37°C，250r/min，过夜，第二天按体积比1: 100用含10 μ g/mL四环素的SB培养液转接，注意OD6tltl不要超过1.0 ;(3)准备CNE细胞(为消除部分非特异性结合的阴性细胞)与SUNE细胞(为细胞表面高表达抗原的阳性细胞，用于结合特异性抗体)各100万个，即150cm2的细胞培养瓶70%长满后1-2瓶；(4)首先移去CNE细胞培养瓶内的培养基，用IOmL pH7.4的PBS洗三次，移去PBS，再向每个培养瓶中移入IOmL细胞解离液，37°C孵育IOmin ；(5)此时大部分细胞应已经从瓶壁分离，少量仍贴壁者可用细胞铲将细胞从培养瓶壁中缓慢刮下，收集至一个1.5mL的聚丙烯离心管内，1800r/min离心5min ；(6)仔细吸去上清，再加入ImL pH7.4PBS吹打重悬，按前述转速及时间离心，用pH7.4PBS洗涤三次；(7)最后一次洗涤后移去PBS，用溶于lmL5%wt脱脂牛奶-PBS的噬菌体抗体库重悬CNE细胞，37°C混合30min ;在此同时按照相同方法准备SUNE细胞；(8)离心，1800r/min，5min，然后将上清转移至SUNE细胞(注意不要将CNE细胞带出)，与SUNE细胞37°C混合30min ；(9)离心，1800r/min, 5min,弃去上清，再用 ImL0.l%wt BSA-PBS 洗漆,共 8 次；(10) 50 μ L0.25%wt trypsin, 0.53mmol EDTA 重悬细胞沉淀，37°C 20min;把以上液体再加入 2mL XLl-blue (OD600 约 1.0)，37°C 30min ；(11)向装有感染了洗脱噬菌体细菌的离心管中补加事先预热至37°C的6mL SB培养液，向其中补充1.6 μ L羧苄霉素(0.lg/mL)保存液，吸取2 μ L加入200 μ L SB，混匀。取IOyLUOOy L铺板，计算洗脱噬菌体产量为第一轮产出(output);洗脱噬菌体产量=菌落数X稀释倍数XlO3 ;剩余菌液转到50mL三角瓶中，250r/min，37°C Ih ；(12)补充2.4μ L羧苄霉素保存液，相同条件再培养Ih ；(13)加入100yL1013VCSM13辅助噬菌体 ，将整个培养液转移至含91mL预热(37°C)SB培养液的500mL烧瓶中，补充46 μ L羧苄霉素保存液与184 μ L四环素保存液，继续前述条件培养2h ；(14)加入14(^1^卡那霉素保存液(0.058/1^)，过夜培养；(15)将培养液转移至500mL离心瓶中，室温离心3000g，15min ；(16)上清中加入4g PEG，3g NaCl，摇晃混匀后于冰上静置Ih ；(17)4。〇离心，1500(^\151^11;(18)弃上清，将离心瓶口朝下置于纸上，将剩余的液体清除；(19)用lmLl%wt BSA-PBS溶解噬菌体，用前述方法测定滴度，取IO13噬菌体用于下一轮筛选，共筛选5轮；剩余保存于_80°C。3.固相筛选法方法(I)包被抗原:在两个1.5mL的离心管中，将纯化的His_LMP2A溶于ELISA coatingbuffer使终体积达到400 μ L, LMP2A浓度为3 μ g/mL,每孔中分别加入50 μ L,每次筛库每个浓度用8孔，4°C过夜；筛库前一天及当天按前述方法准备细菌；(2)次日，将被His-LMP2A蛋白结合的孔加入pH7.4PBST洗三次，每孔加入300mL脱脂牛奶37 °C Imin，pH7.4PBST洗三次；(3) Fab 抗体库 250 μ L 与 5%wt 脱脂牛奶 250 μ L, 37°C 30min ；
(4)将上步所得液体以每孔50 μ L加入His-LMP2A包被的ELISA8孔板中，S卩(2)中，盖上塑料膜，37 °C 2h ；(5)甩去噬菌体，0.5%wt TffEEN-TBS 洗涤:向孔中加满 0.5%wt TffEEN-TBS,用 ImLTip头反复吹打10次，静置约5min，待气泡完全消失，甩去孔中洗涤缓冲液，孔顶朝下拍打3次，反复10次后再用装于无菌塑料瓶中的洗涤缓冲液冲洗，甩去缓冲液后再拍打3次，反复5次；(6)向每孔中加入约50 μ L0.25%胰酶一 EDTA，37°C 30min，用Tip头猛烈吹打10次；剩余转移到2mL当日接种培养的XLl-blue (OD600L O左右)的12mL聚丙烯培养管中，室温孵育20min ；(7)向装有感染了洗脱噬菌体细菌的离心管中补加事先预热至37°C的6mL SB培养液，向其中补充1.6μ L羧苄霉素保存液(0.lg/mLXUyL四环素保存液(0.2g/mL)，于37°〇，25017/11^11，111;同时取24 1^加入20(^1^ SB，混匀。取 10 μ L、100 μ L 于 LB-Agar/羧苄青霉素(0.lX10_3g/mL)，37°C过夜生长后数单菌落数目，计算产出噬菌体(output)；(8)补充2.4μ L羧苄霉素保存液，相同条件再培养Ih ；(9)加入1013VCSM13辅助噬菌体，将整个培养液转移至含91mL预热(37°C) SB培养液的500mL烧瓶中，补充46 μ L羧苄青霉素保存液与184 μ L四环素保存液，继续前述条件培养2h ；(10)加入140 μ L卡那霉素保存液(0.05g/mL)，过夜培养；(11)将培养液转移至250mL离心瓶中，4°C离心,3000g, 15min ；(12)上清中加入4gPEG，3gNaCl,37°C，250r/min, 15min摇晃混匀完全溶解后于冰上静置Ih ；(13) 4°C离心，15000g, 30min ；(14)弃上清，将离心瓶口朝下置于纸上，将剩余的液体清除；(15)用500 μ Ll%wtBSA-TBS溶解噬菌体，用前述方法测定滴度，取IO13噬菌体用于下一轮筛选；剩余保存于_80°C。4.噬菌体ELISA挑选阳性克隆(I)本过程需新鲜准备的包被抗原。用ELISA coating buffer稀释纯化的His-LMP2A至浓度为3 μ g/mL,每孔中加入50 μ L，4°C过夜；(2)第二天甩去每板中的包被缓冲液,每孔中加满ELISAwashing buffer,甩去，于纸上拍打三次洗涤，反复三次；(3)每孔中加新鲜配制的 1% wt BSA_PBS，37°C，1.5h ；(4)最后一轮产出噬菌体2mL铺四块板，37°C孵箱中过夜培养；(5)次日晨用tip头挑选58个单菌落分别接种于ImL SB培养基(内含100 μ g/mL氨苄青霉素和l%wt葡萄糖)，于12mL聚丙烯培养管中37°C震荡培养；(6)约8-10h后，0D_达到0.3，此时向每个培养管中加入109VCSM13辅助噬菌体，继续37°C震荡培养2h ；
(7)每管中加入1.4 μ L50mg/mL的卡那霉素至终浓度为70 μ g/mL,摇床中37°C过夜培养。(8)次日，将每根培养管标号,3000g离心,15min,每管中剩余的曬菌体暂存于4 0C ；(9)甩去ELISA板中的封闭牛奶，吸取出50μ L过夜培养液上清与50 μ Ll%wtBSA-PBS混匀，按顺序加入实验孔(LMP2A)中，一孔加入一个克隆的噬菌体，留至少两对孔加入含相同浓度抗生素及葡萄糖的SB培养液作为空白对照，37°C，2h ；(10)弃去噬菌体培养液，拍打三次后再用IOmL移液管吸取0.l%wt TffEEN-PBS冲洗后再拍打三次，用此方法共洗涤五次；(11)每孔中再加入50μ Ll:3000稀释的HRP标记的羊抗M13 二抗(Amersham codenumber: 27-942-01)，室温 Ih ；(12)用(3)中的溶液再次洗涤；(13)显色，每孔中加入100 μ L显色底液(TMB与H2O2按1:1体积比混合)，20min后加入IM H2SO4停止显色；(14)于波长450nm读数记录；(15)取ELISA读值最高的29号克隆为最佳阳性克隆。5.阳性克隆的测序(I) 2mL过夜培养菌，12000r/min离心2min,弃上清；(2)加入 250μ L 的 Solution I (含 RNaseAl)，充分重悬细菌；(3)加入250 μ L的Solution II，轻轻地上下翻转混合5_6次，使菌体充分裂解，形成透明溶液；(4)加入400 μ L4°C预冷的Solution III，轻轻地上下翻转混合5_6次，直至形成紧实凝集块，室温静置2min;(5) 12000r/min 离心 lOmin，取上清；(6) Spin Column 安置于 Collection Tube,上清置于 Spin Column 中；(7) 12000r/min 离心 lmin,弃滤液；(8)将 500 μ L 的 Rinse A 加入 Spin Column 中，12000r/min 离心 30s,弃滤液;
(9)将 700 μ L 的 Rinse B 加入 Spin Column 中，12000r/min 离心 30s,弃滤液;(10)重复上一步,然后再12000r/min离心lmin,弃滤液；(11)将Spin Column安置于新的1.5mL离心管,在Spin Column膜的中央处加入60 μ L经60°C预热的洗脱液，室温静置Imin ；(12) 12000r/min 离心 lmin,洗脱 DNA,测序。二、Fab29 的表达1.ToplOF’接种于含30 μ g/mL四环素的LB-Agar中，取单菌落于37°C震荡培养过夜；2.将过夜培养的ToplOF’培养液以1:100体积比接种于含30 μ g/mL四环素的SB培养液中，37°C震荡培养至0D600约为0.8 ；3.吸取I μ L阳性克隆的噬菌体与50 μ L对数生长期的ToplOF’混合，于室温下孵育15mins,然后铺板生长于含100 μ g/mL氨节青霉素的LB-Agar, 37°C过夜生长；4.次日，挑选单菌落接种于含100 μ g/mL氨苄青霉素，2%wt葡萄糖的SB培养液中，37°C震荡培养过夜；5.用含100 μ g/L氨苄青霉素，l%wt葡萄糖的SB培养液按1:100体积比转接过夜生长的细菌，37°C震荡培养直至0D600达到1.0 ；6.5000r/min, 5min, 37°C离心，弃上清,用ImL含100 μ g/L氨节青霉素的SB重悬
细菌；7.加入IPTG至终浓度为0.1mM,加入蔗糖浓缩液至终浓度为4%wt，于25°C震荡培养过夜。三、阳性克隆表达的鉴定1.取100 μ L过夜诱导表达的细菌培养液，离心，IOOOOg;2.将上清与细菌沉淀分离，取10 μ L上清与相同体积的SDS2X 1adingbuffer混勻，100。。煮沸 5min ；3.向pH7.4PBS加入200mM PMSF至终浓度为ImM，用200 μ L重悬细菌沉淀，然后于冰水混合物中超声处理5min ；4.再离心，IOOOOgX5min ;5.取10 μ L上清与相同体积的SDS 1adingbuffer混勻，100°C煮沸5min ;6.上样，蛋白电泳，90V，大约Ih左右；7.转膜，150mA，2h ;8.封闭，5%wt牛奶-PBS，将膜完全浸泡于封闭液中，37°C Ih ；9.洗漆三次(洗漆方法为加入wash buffer,室温下于摇床上反复摇晃5min,然后弃去再加入wash buffer);然后加入1:3000体积比稀释的HRP标记的羊抗人IgG (Fab) ’ (catalog n0.A0293; Sigma)，室温下于摇床上摇晃 Ih ；10.按前述方法再洗涤三次，加入HRP底物冲洗硝纤膜，约45s后曝光。四、阳性克隆表达 产物的纯化1.按前述方法诱导表达Fab29 ;2.离心细菌培养液，IOOOOgX 15min ;3.细菌沉淀重悬于1/10细菌培养液体积的含ImM PMSF的pH7.4的20mM磷酸缓冲液；4.将重悬的液体分装于50mL的聚丙烯离心管中，于冰水混合物中超声处理，约12min ；5.将超声后的菌液再次聚集在一起，离心，15000gX30min ;6.弃沉淀，上清通过0.22 μ L滤器过滤；7.准备好AKTA-FPLC与ProteinL亲和层析柱，从柱中先后流过2倍柱体积的去离子水及10倍柱床体积的结合缓冲液，平衡Protein L亲和层析柱；8.取待纯化样品上柱，流速为0.5 lmL/min ； 9.然后以同样的流速依次用20倍柱床体积的结合缓冲液；10.上5mL洗脱缓冲液，在AKTA-FPLC上根据峰值收集洗脱蛋白，并用0.lmol/LTris碱中和收集的洗脱液至ρΗ7.0 7.5 ;11.用BCA法测蛋白质含量，置4°C保存备用。使用后的层析柱经双蒸水洗涤，再以20%的酒精冲洗、密封保存于4°C供再次使用；12.纯化的Fab29用SDS — PAGE鉴定其纯度。用0.12g/mL分离胶、0.04g/mL浓缩胶，设低分子量标准，恒压下电泳。考马斯亮蓝R250染色。纯化的Fab29的活性用上述ELISA法鉴定；13.经Centricon离心换缓冲液溶解于ρΗ7.4，PBS中浓缩保存。五、纯化的Fab29与LMP2A胞外区结合能力ELISA1.包被抗原及封闭:将纯化的His_LMP2A溶于ELISA coating buffer使终体积达到5mL，LMP2A浓度为600ng/mL，每孔中分别加入50 μ L，4°C过夜；2.次日，将被His-LMP2A蛋白结合的孔加入ρΗ7.4PBST洗三次，每孔加入300mL脱脂牛奶 370C lmin, pH7.4PBST 洗三次；3.将纯化的 Fab29 分别稀释为 10,5,2.5、1.25,0.625,0.313,0.156 μ g/mL,向每孔中加入50 μ L稀释的Fab29于室温下孵育Ih ；4.洗涤后加入1:2000体积比稀释的HRP标记的羊抗人二抗(catalogn0.A0293; Sigma),室温下 Ih ；5.洗涤后加入底物显色30min，加入IM硫酸中止显色，于波长450处读数。六、Fab29细胞 ELISA 检测1.用胰蛋白酶消化细胞培养瓶中的细胞；收集细胞并计数；离心，1500r/min，IOmin ；2.用完全培养基重悬细胞调整浓度4 X IO5个细胞/mL，分成三组，第一组鼻咽癌细胞株SUNE细胞，第二组对照组人鼻咽癌细胞株CNE细胞；第三组SUNE细胞和不相关的Fab蛋白；3.滴加到96孔培养板中，100 μ L/孔；37°C环境孵育过夜；4.用PBS洗板两次；5.每孔加125 μ L10% wt福尔马林缓冲液；于室温环境下固定15min ；6.用双蒸水洗涤三次；晾干；贮存于2_8°C ；7.用双蒸水洗涤ELISA板两次；8.每孔加 250 μ L 含 2% wtBSA 的 PBS ;37°C孵育 Ih ；
9.双蒸水洗板三次；10.每孔加50yLFab29(依次用含1% wt BSA的PBS稀释至浓度为50、25、12.5、
6.25,3.15、1.56,0.78,0.00 μ g/mL)，37。。孵育 2h ；11.0.1% wt PBST 洗板五次；12.每孔加50yL用含1% wt BSA的1:2000体积比稀释的HRP酶标羊抗人IgG (Fab) (catalog n0.A0293; Sigma) ;37°C鮮育 Ih ；13.TMB显色，显色前按TMB: H2O2=1:1体积比混合，100 μ L/孔，在室温下孵育20min ;加IM硫酸溶液50 μ L/孔;在酶标仪上测0D490波长的值。七、突光激动的细胞分类(fluorescence-activatedcell sorting, FACS)1.分别培养CNE与SUNE细胞至约IO6个；2.用pH7.4PBS洗涤三次:向每个培养瓶中移入10mLpH7.4，PBS后倒出；反复三次；3.向每个培养瓶中分别加入 2_3mL cell dissociation buffer, 37°C, IOmin ；4.用细胞刮将细胞刮落，再加入约lmLpH7.4PBS，转入15mL的聚丙烯离心管，1800r/min 离心，5min ；5.弃去上清,用lmLpH7.4PBS重悬细胞,再离心，1800r/min,5min,反复三次；6.用 10mLl%wtBSA-PBS 于 4°C封闭 30min ；7.离心，将两种细胞分别于50 μ g/mL Fab29的PBSlmL重悬，细胞均置于microtube 中,于 mixer 上 4V转动反应 45min ；8.1800r/min 离心，5min ;弃去上清；9.用 lmLpH7.4PBS 重悬细胞，再离心，1800r/min, 5min,反复三次；10.用 ImLl: 200 体积比稀释的 FITC-labeled anti human Fab IgG 重悬每份细胞，于4V转动反应30min，本步骤中就用铝箔包裹试管避光；11.1800r/min离心，5min ;弃去上清；再用pH7.4PBS洗漆三次；12.将每份细胞用200 μ LpH7.4PBS重悬，于流式细胞仪分析光强度。八、免疫共沉淀1.在非变性条件下收集SUNE和CNE细胞，去掉培养基，用4°C PBS清洗一次；2.将所有细胞刮下，收集到一个离心管中。冰浴中对样品用超声处理40秒，功率3W ；3.4°C,14000g离心10分钟。将上清转移到新的离心管中，即为细胞裂解物；4.取200 μ L的细胞裂解物，在其中加入50 μ g Fab29，4°C孵育过夜分钟；5.向4中加入20 μ L的蛋白L琼脂糖微球浆，4°C孵育60分钟；
6.4°C离心10分钟。弃上清，沉淀pH7.4PBS重悬洗3次；7.将 6 的沉淀加入 40 μ LpH7.4PBS 和 10 μ L 的 5 X loadingbuffer, 100°C 5 分钟；8.取7中的20 μ L Western免疫印迹分析(详见三、6-10)九、免疫荧光1.将上述两种细胞分别接种于6孔培养皿中，CNE细胞两孔，SUNE细胞四个孔(其中两个孔加入不相关Fab)，每孔约1500细胞，直到约80%长满，其中每种细胞培养I孔作为实验观察组，另I孔仅加入二抗作为阴性对照组；2.吸去培养液，用pH7.4PBS洗涤三次，方法为加入PBS后再吸去；3.加入按等体积混合的丙酮与甲醇混合液，室温下固定20min ；4.吸去固定液，再用去离子水洗三次，洗涤方法为加入去离子水后吸去；5.用新鲜配制的5%wt脱脂牛奶-PBS在37°C封闭Ih ；6.阴性对照组继续用封闭液处理，实验组中加入20 μ g/mL HLEAFab抗体，37 °C，Ih ；7.用ρΗ7.4PBS洗涤，方法为加入PBS后再吸去；8.在无光条件下加入1:200 (PBS)体积比稀释的FITC-1abeled羊抗人Fab (catalog n0.F5512; Sigma)，室温 0.5h ；9.洗涤后于显微镜下观察；FITC激发波长494nm。十、Fab的亲和力和动力学分析(fort6B10 c0.，LTD.上海分公司代做)^^一、免疫组化1.南京医科大学二附院病理科提供的鼻咽癌患者石蜡切片脱蜡至水；2.3%wt H2O2室温孵育5-10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性；
3.蒸馏水冲洗，pH7 .4PBS浸泡5分钟X 2次;4.5%wt小牛血清封闭，室温孵育30分钟，倾去血清，滴加纯化后PBS稀释的浓度为0.25 μ g/mL Fab29抗体蛋白，浓度为0.25 μ g/mL商业化Rat-EBV LMP2A抗体蛋白和浓度为0.25 μ g/mL不相关抗体Fab抗体蛋白工作液，37°C孵育2小时；5.PBS 冲洗，5 分钟 X 3 次;6.滴加1:1000 (PBS)体积比稀释后的HRP标记羊抗人IgG (catalogn0.A0293; Sigma), HRP 标记羊抗大鼠 IgG (112-035-003，Jackson ImmunoResearch)工作液，37 °C孵育I分钟；7.PBS 冲洗，5 分钟 X 3 次;8.显色剂显色3-15分钟(DAB)；9.自来水充分冲洗，复染，脱水，透明，封片。结果一、LMP2A胞外肽段融合蛋白的表达与纯化LMP2A胞外肽段的相对分子质量为11KD，加上0.84KD相对分子质量的His，融合蛋白预期的相对分子质量应为12KD。转化有重组质粒pET28a+-LMP2A的BL21经IPTG诱导后，在相应区域有浓染蛋白带一条，与预期大小相吻合。经SDS-PAGE分析，含有表达载体的BL21 (DE3)菌株经IPTG诱导，可表达与预期分子量相符蛋白带(图1)。二、阳性克隆的筛选、测序、表达与纯化1.phage ELISA的阳性克隆挑选我们于第6轮筛库结束后挑选单克隆噬菌体扩增进行phage ELISA selection.挑选29号信号最强的质粒送检，结果提示29号的基因型符合Fab基因型，且该Fab轻链为K链，提示特异性29克隆从抗体库中被挑选出来。挑选29号克隆命名为Fab29 (图2)。2.阳性克隆序列的测定表129号克隆的轻链可变区(上)及重链可变区(下)序列
权利要求
1.人源抗鼻咽癌LMP2A胞外区抗体Fab，其特征在于，所述抗体的\链的互补决定区具有以下的CDRs氨基酸序列:SEQ ID N0.3 所示的 L-CDRl ；SEQ ID N0.4 所示的 L-CDR2 ；SEQ ID N0.5 所示的 L-CDR3 ； 并且所述抗体的Vh链的互补决定区具有以下的CDRs氨基酸序列:SEQ ID N0.8 所示的 H-CDRl ；SEQ ID N0.9 所示的 H-CDR2 ；SEQ ID N0.10 所示的 H-CDR3。
2.根据权利要求1所述人源抗鼻咽癌LMP2A胞外区抗体Fab，其特征在于，所述抗体的Vl链的可变区氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示，Vh链的可变区氨基酸序列如SEQ ID N0.7所示。
3.根据权利要求1所述人源抗鼻咽癌LMP2A胞外区抗体Fab，其特征在于，所述抗体的Vl链的可变区核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，Vh链的可变区核苷酸序列如SEQ ID N0.6所示。
4.权利要求1 3任一人源抗鼻咽癌LMP2A胞外区抗体Fab在制备治疗鼻咽癌药物中的应用。
5.权利要求1 3任一人源抗鼻咽癌`LMP2A胞外区抗体Fab在治疗鼻咽癌中的应用。
全文摘要
人源抗鼻咽癌LMP2A胞外区抗体Fab及其应用，人源抗鼻咽癌LMP2A胞外区抗体Fab，所述抗体的VL链的互补决定区具有以下的CDRs氨基酸序列SEQIDNO.3所示的L-CDR1；SEQIDNO.4所示的L-CDR2；SEQIDNO.5所示的L-CDR3；并且所述抗体的VH链的互补决定区具有以下的CDRs氨基酸序列SEQIDNO.8所示的H-CDR1；SEQIDNO.9所示的H-CDR2；SEQIDNO.10所示的H-CDR3。该抗体可用于免疫荧光、免疫组化和免疫共沉淀实验。该人源抗体能为鼻咽癌的靶向治疗提供一个新的靶向抗体。
文档编号A61P35/00GK103102412SQ201310034700
公开日2013年5月15日 申请日期2013年1月29日 优先权日2013年1月29日
发明者陈仁杰, 曹清, 冯振卿, 朱进 申请人:陈仁杰