专利名称：一株人工弱化的鸡传染性支气管炎病毒及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株人工弱化的鸡传染性支气管炎病毒,并由此病毒制备的一种鸡传染性支气管炎活疫苗，属生物技术领域兽用生物制品行业。
背景技术：
鸡传染性支气管炎病毒(Infectious Bronchitis Virus, IBV)是引发鸡群急性、高度传染性呼吸道疫病的病原体，属于冠状病毒科。目前该病毒呈全球性分布，给各国及地区的养鸡业带来严重的危害。该疫病的临床特征主要有:咳嗽、打喷嚏、气管啰音；肾脏肿大、苍白，尿酸盐沉积，外观呈典型的“花斑肾”。不同日龄、品种和性别的鸡均易感，雏鸡常由于呼吸道或肾脏感染而引起死亡；IBV具有广泛的组织嗜性，可以在呼吸道组织，肾脏，输卵管及消化道的许多部位进行复制。
根据侵害部位的不同，目前已知的血清型有以侵害呼吸道为主的Conn、1wa97、JMK、Florida、Arkansas99等和以侵害肾脏为主的M41、Holte、Gray等30余种，而各个血清型之间不存在交叉免疫保护或仅存在微弱交叉免疫保护。1992年Gough等报道了英国一种新的793/B血清型的IBV，该毒株和其它血清型传支毒株之间无交叉血清学关系。
通过对我国多个地区进行流行病学调查和血清型鉴定分析(王秀英等，(2010)鸡传染性支气管炎病毒广西分离株血清型的分析。中国兽医学报；30 (2);徐怀英等，(2008)鸡传染性支气管炎病毒呼吸型和肾型毒株的血清交叉中和试验。畜牧与兽医；40(7);刘乔然，(2008)中国2007年部分地区鸡传染性支气管炎病毒分子流行病学研究。中国农业科学院硕士学位论文)，目前流行部分野毒株与疫苗株(Massachusetts血清型)的抗原性存在很大程度的差异，属于不同的血清型，故目前疫苗株不能完全有效的抵抗所有流行毒株的侵袭，而经常造成免疫失败。
对于病毒为病原的疫病，疫苗免疫是预防的最有效的方法，国内外市场上均有已商品化的鸡传染性支气管炎疫苗，其中既有灭活疫苗，同时也有弱毒株制备的冻干疫苗。但由于IBV的血清型众多，且各血清型之间不存在交叉免疫保护或仅存在微弱交叉免疫保护，主要体现在目前流行株与疫苗株相比存在较大的差异，致使目前已有的疫苗株(H52、H120等)不能完全有效的防制IB流行毒株的攻击。因此，本发明选取我国目前鸡传染性支气管炎流行毒株进行鸡胚内连续传代致弱，从而获得一株具有良好免疫原性的弱毒株，用该弱毒株所制备的冻干疫苗对目前中国鸡传染性支气管炎流行株产生较好的免疫保护效力。发明内容
鸡传染性支气管炎流行毒株一直处于不断的变异中，这给我国养鸡业带来了极大的危害。本发明的目的是为了解决现行流通的疫苗株不能对流行毒株产生足够免疫保护的问题。本发明对目前鸡传染性支气管炎流行毒株进行了分离和弱化，获得具有良好免疫原性的弱毒株，用该弱毒株所制备疫苗对目前中国鸡传染性支气管炎流行株产生较好的免疫保护效力。
本发明的技术方案
1.本发明涉及的一株人工弱化的鸡传染性支气管炎病毒，为793/B血清型弱毒株鸡传染性支气管炎病毒FN0-E55株,该毒株已于2013年03月08日送交北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为:CGMCC N0.7310。
2.该病毒鸡传染性支气管炎病毒FN0-E55株能够被793/B血清型鸡传染性支气管炎阳性血清中和，而不能被Massachusetts血清型鸡传染性支气管炎阳性血清中和。
3.该病毒鸡传染性支气管炎病毒FN0-E55株是由人工致弱，接种SPF鸡后不引起任何症状，并能够诱导靶动物产生针对793/B血清型鸡传染性支气管炎的特异性免疫应答，预防该血清型鸡传染性支气管炎的发生。
4.含有人工弱化的鸡传染性支气管炎病毒株的鸡传染性支气管炎疫苗，是应用鸡传染性支气管炎病毒FN0-E55株作为生产毒种制备的，该疫苗能够诱导靶动物产生针对793/B血清型鸡传染性支气管炎的特异性免疫应答，预防该血清型鸡传染性支气管炎的发生。
5本发明涉及的鸡传染性支气管炎疫苗的制备方法，是将鸡传染性支气管炎病毒FN0-E55株作为生产用毒种，接种10.5日龄SPF鸡胚，每胚尿囊腔接种0.2mL，置于37°C，继续孵育；接种后48小时照胚，弃去死胚；将活胚置于2 8°C冷却后，收获含毒鸡胚尿囊液，混合后与加入常用的冻干保护剂混匀，分装后进行冷冻真空干燥，即制成鸡传染性支气管炎活疫苗。
具体实施方式
本发明主要通过以下技术方案实施，且下文将结合具体实施例来辅助说明本发明，本领域一般技术人员可据此更好的理解本发明，但下述实施例仅作为技术示范，并不对本发明构成任何限制。
一、菌毒种的来源及特性1.病毒分离与鉴定
2009年，本申请人由浙江某鸡场分离得到一株鸡传染性支气管炎病毒，经分子生物学试验、血清学试验等方法，鉴定为鸡传染性支气管炎病毒793/B血清型，定名为FNO-E株。
2.鸡传染性支气管炎病毒(FNO-E株)的传代致弱
通过接种SPF鸡胚连续传代，将分离得到的鸡传染性支气管炎病毒FNO-E株进行了毒力弱化，实验结果表明，传代至第E25代时，病毒毒力开始下降，传代至P50代之后对雏鸡的感染率为0%。说明该病毒传代至E50代及E60代后已经致弱，对雏鸡已无致病力。选取E55代作为疫苗研制的候选毒株,为一株鸡传染性支气管炎弱化毒株，命名为FN0-E55株，该毒株已于2013年03月08日送交北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为=CGMCCN0.7310。
3.生产用鸡传染性支气管炎病毒弱毒株(FN0-E55株)的纯粹性检验
3.1无菌检验按《中华人民共和国兽药典》(中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典二〇一〇年版三部.中国农业出版社，2011.，本发明以下简称《中国兽药典》)规定的方法:对鸡传染性支气管炎病毒弱毒株(FN0-E55株)第55 60代毒种进行无菌检验，分别接种T.G、G.P小管和G.A斜面培养基各2支，每支0.2mL, 一支置37°C培养；一支置于25°C培养,观察3日，移植后的病毒培养物接种的T.G、G.P和G.A斜面培养基,观察五日均无细菌、霉菌生长，表明FN0-E55株毒种未受细菌与霉菌的污染。
3.2支原体检验按《中国兽药典》规定的方法对第55 60代毒种进行支原体检验，经过5日、10日、15日培养，观察液体培养基无颜色变化，再经移植后培养14日观察，支原体液体培养基仍然无颜色变化；接种毒种的琼脂平板上均未出现支原体菌落。表明FN0-E55株毒种无支原体污染。
3.3外源病毒检验按《中国兽药典》要求，对第55 60代毒种进行了外源病毒的检测，结果表明，FN0-E55株毒种无外源病毒污染。
4.免疫原性
将弱化出的毒株病毒含量稀释到103_ 5EID5tlA).1mL,接种10只7日龄SPF雏鸡，每只免疫IOOyL,免疫途径为滴鼻点眼，并设空白对照组。3周后，连同条件相同的空白对照组，用鸡传染性支气管炎病毒FNO-E株进行强毒攻击,攻毒剂量为104_5TOCID5ci/只,攻毒后4 5天进行剖杀，取出气管，分别在每只鸡的气管头、中、尾部取3、4、3段气管进行纤毛运动观察并评分，评分标准如下:
A)气管环组织内周边无一个纤毛运动，计为4分。
B)气管环组织内周边约75%纤毛停止运动，计为3分。
C)气管环组织内周边约50%纤毛停止运动，计为2分。
D)气管环组织内周边约25%纤毛停止运动，计为I分。
E)气管环组织内周边无纤毛停止运动，计为O分。
每只鸡气管纤毛评分总分为40分，当每只鸡气管纤毛评分总分低于20分，即纤毛损伤率低于50% (20/40)时，则判定为该只鸡被保护或未感染；若气管纤毛评分高于20分，即纤毛损伤率高于50% (20/40)时，则判定为该只鸡未被保护或感染。根据以上判定标准所得，免疫组应有8只以上的鸡被保护；对照组应至少有8只鸡未被保护。
5.鸡传染性支气管炎 病毒弱毒株(FN0-E55株)的稳定性
取FN0-E55株病毒，按103_ 5EID5tl剂量滴鼻接种SPF鸡，将病毒在靶动物体内连续传代5代，期间未观察到任何可疑鸡传染性支气管炎感染症状，证明该弱毒株在5代以内保持毒力稳定，并在保持遗传稳定性。
二、疫苗的制备
取鸡传染性支气管炎病毒弱毒株(FN0-E55株)生产代次种毒接种10.5日龄SPF鸡胚，每胚尿囊腔接种0.2mL。密封针口后，置于37°C，相对湿度60%继续孵育。接种后24小时照胚，弃去死胚；将活胚置于2 8°C冷却。将冷却后的鸡胚用碘酊消毒气室部位，然后以无菌剥除气室部卵壳，吸取鸡胚尿囊液，每若干个鸡胚的胚液混合为一组。收获后的鸡胚尿囊液置于灭菌瓶中，留样后冻存。经半成品检验合格后，与保护剂混合进行分装配苗，并进行冷冻真空干燥。即制成鸡传染性支气管炎活疫苗。
三、疫苗检验
(1)物理性状:制品为淡黄色海绵状疏松团块，易与瓶壁脱离，加稀释液后迅速溶解。
(2)纯粹检验:按《中国兽药典》中的规定进行检验，应纯粹。
(3)鉴别检验:通过血清中和实验进行，毒种应被抗鸡传染性支气管炎病毒(793/B血清型)阳性血清中和,不应被抗鸡传染性支气管炎病毒(Massachusetts血清型)阳性血清中和。
(4)安全检验:将疫苗以10羽份剂量，接种10只7日龄SPF雏鸡，每只免疫100 μ L，免疫途径为滴鼻点眼，并设空白对照组，免疫5天进行剖杀，取出气管，分别在每只鸡的气管头、中、尾部取3、4、3段气管环进行纤毛运动观察并评分，评分标准参考上述，计算纤毛损伤率，所有鸡气管纤毛评分结果应均未感染。
(5)效力检验:
将疫苗以I羽份剂量，接种10只7日龄SPF雏鸡，每只免疫100 μ L，免疫途径为滴鼻、点眼，并设空白对照组。3周后，连同条件相同的空白对照组，用鸡传染性支气管炎病毒FNO-E株进行强毒攻击,攻毒剂量为IO45TOCID5ci/只,攻毒途径为滴鼻,点眼。攻毒后5天进行剖杀，取出气管，分别在每只鸡的气管头、中、尾部取3、4、3段气管环进行纤毛运动观察并评分，评分标准参考上述。根据以上判定标准所得，免疫组应有8只以上的鸡被保护；对照组应至少有8只鸡未被保护。
(6)剩余水分测定:每批冻干制品任抽4个样品，各样品剩余水分均不应超过4%如果有超过时，可重检I次，重检后如有1个样品超过规定，该批制品应判为不合格(根据《中华人民共和国兽药典》规定)。
(7)真空度测定:包装前测定真空度，无真空的制品，应予剔除报废。(根据《中华人民共和国兽药典》规定。
图1PCR扩增产物电泳中泳道I，2分别为阳性对照和样品，泳道3为阴性对照，泳道4为DNA Marker DL2000。由图可见，样品在740bp和290bp处分别有一条特异的DNA条带，与阳性对照一致，判定样品为鸡传染性支气管炎病毒阳性。
本发明涉及的微生物资源
鸡传染性支气管炎病毒弱毒株是由本发明人分离的鸡传染性支气管炎病毒FNO-E株经人工致弱而成，该毒株的血清型为鸡传染性支气管炎病毒793/B血清型，命名为FN0-E55株,该弱毒株鸡传染性支气管炎病毒(Infectious Bronchitis Virus)已于2013年03月08日送交北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为=CGMCC N0.7310。
本发明的积极意义
本发明是利用本发明人分离得到的有较好免疫原性的鸡传染性支气管炎病毒(Infectious Bronchitis Virus)，进行传代致弱，获得弱毒株FN0-E55株做为生产用毒种，并可制备出安全、有效的鸡传染性支气管炎活疫苗。本发明弱化的毒株及其制备的活疫苗能够有效预防793/B血清型IBV引起的鸡传染性支气管炎的发生。
实施例
以下实施例为进一步对本发明进行阐述，但这些实施例不构成对本发明的限制。
实施例1
——病毒分离与鉴定
1.病毒盲传将采集到病鸡的气管、肺脏、肾脏及盲肠扁桃体等组织，加入预冷的PBS(含10000IU/mL青霉素和10mg/mL链霉素)，研磨制成匀浆后，加入一定量的含双抗PBS，制成体积分数为20%的组织悬液，冻融三次后，以3000r/min离心20min，取上清液，0.2 μ m滤膜过滤除菌后，接种气管环组织培养物，每管接种0.2mL，每个样品共接种10管，均置于37°C培养。逐日观察气管纤毛摆动活力情况，弃去阴性管。将所有感染阳性培养液混合，相同方法继续在气管环组织培养物内连续盲传二代，收获病毒液置_70°C保存备用。
2.PCR鉴定参考中国国家标准《GB/T23197-2008鸡传染性支气管炎诊断技术》中RT-PCR诊断方法，合成混合引物(4PS)，引物序列见表I。
表1-1引物序列
权利要求
1.一株人工弱化的鸡传染性支气管炎病毒，其特征在于该株病毒为793/B血清型弱毒株鸡传染性支气管炎病毒FN0-E55株,该毒株已于2013年03月08日送交北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为:CGMCC N0.7310。
2.如权利要求1所述的一株人工弱化的鸡传染性支气管炎病毒，其特征在于该株病毒能够被793/B血清型鸡传染性支气管炎阳性血清中和,而不能被Massachusetts血清型鸡传染性支气管炎阳性血清中和。
3.如权利要求1所述的一株人工弱化的鸡传染性支气管炎病毒，其特征在于该毒株是由人工致弱，接种SPF鸡后不引起任何症状，并能够诱导靶动物产生针对793/B血清型鸡传染性支气管炎的特异性免疫应答，预防该血清型鸡传染性支气管炎的发生。
4.含有权利要求1所述人工弱化的鸡传染性支气管炎病毒株的鸡传染性支气管炎疫苗，其特征在于该疫苗是应用鸡传染性支气管炎病毒FNO-E55株作为生产毒种制备的，该疫苗能够诱导靶动物产生针对793/B血清型鸡传染性支气管炎的特异性免疫应答，预防该血清型鸡传染性支气管炎的发生。
5.权利要求4所述的鸡传染性支气管炎疫苗的制备方法，其特征在于将该鸡传染性支气管炎病毒FNO-E55株作为生产用毒种，接种10.5日龄SPF鸡胚，每胚尿囊腔接种0.2mL,置于37°C，继续孵育；接种后48小时照胚，弃去死胚；将活胚置于2 8°C冷却后，收获含毒鸡胚尿囊液，混合后与加入常用的冻干保护剂混匀，分装后进行冷冻真空干燥，即制成鸡传染性支气 管炎活疫苗。
全文摘要
本发明涉及一株人工弱化的鸡传染性支气管炎病毒及其应用。本发明是利用本发明人分离得到的有较好免疫原性的鸡传染性支气管炎病毒(InfectiousBronchitisVirus,IBV)，进行传代致弱，获得弱毒株FNO-E55株做为生产用毒种，制备出安全、有效的鸡传染性支气管炎活疫苗。本发明采用的毒株能够针对目前国内鸡传染性支气管炎的流行情况，有效预防鸡传染性支气管炎病毒(793/B血清型)引起的鸡传染性支气管炎的发生。
文档编号A61P31/14GK103146654SQ20131009718
公开日2013年6月12日 申请日期2013年3月25日 优先权日2013年3月25日
发明者嵇康, 张鹏超, 沈元, 曹玉飞, 林志晓 申请人:浙江诺倍威生物技术有限公司