专利名称：Vegfr-2单克隆抗体与cpp联合修饰的普萘洛尔隐形脂质体的制备方法及其产品的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子克隆与生物医学领域，具体地说涉及VEGFR-2单克隆抗体与CPP联合修饰的普萘洛尔隐形脂质体的制备方法及其产品及应用。
背景技术：
血管瘤(Hemangiomas)为常见的良性肿瘤,其发病存在明显的种族及性别差异,且其在低出生体重儿和早产儿中的发病率可能更高。血管瘤对患者特别是患儿生理及心理的潜在危害不容忽视，尤其是特殊部位、特殊类型的血管瘤，必须在其增殖期采取积极的干预治疗。学者提出血管瘤发生的主要机制为促血管形成因子及抑制因子的失衡引起的。血管发生是血管瘤形成的重要因素，其主要的特征是毛细血管的内皮细胞增生。促血管形成因子中最主要的血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、喊性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, BFGF)被认为是促进血管内皮细胞增殖活跃的血管形成因子。在增殖期的血管瘤内皮细胞中，血管生成的分子标记物如VEGF等呈现过度表达。目前临床治疗血管瘤药物往往副作用较大，为了达到减毒增效的目的，靶向治疗成为目前血管瘤治疗的热点。祀向治疗的特点就在于采用载体将药物包裹，给药后在修饰材料的作用下，载体能够特异性地将药物输送到作用部位，从而实现给药效率的最大。大量的研究报道表面普萘洛尔是治疗血管瘤的有效药物。截止目前，已有关于应用普萘洛尔成功治疗颜面部、眼部、呼吸道、肝脏以及其他伴有并发症、多病变部位、甚至严重威胁患儿生命的重症血管瘤的大量报道，并证实了普萘洛尔能改变血管瘤的自然病史、阻滞其增殖、介导并促进IH的早期凋亡。进一步的研究表明:普萘洛尔对处于增殖期与消退期的血管瘤均有显著疗效。另外，单`独使用普萘洛尔治疗血管瘤也已经被证实有确切疗效，从而消除了对其治疗效果是由其他治疗手段所主导的疑虑。诸多学者推荐其取代皮质类固醇激素成为血管瘤的一线治疗手段，中华口腔医学会口腔颌面外科专业委员会脉管性疾病学组也已确定普萘洛尔为治疗血管瘤的一线药物,并纳入《口腔颌面部血管瘤治疗指南》。普萘洛尔虽然治疗血管瘤有效，但对普萘洛尔用药可能存在的心动过缓、低血压、低血糖等严重不良反应，亦不可掉以轻心。一般而言，血管瘤患儿采取普萘洛尔治疗时应已基本形成正常的食物摄取，且在治疗初期应频繁喂食，并加强对重要生命体征与血糖水平的监测力度，以尽量避免以上严重不良反应的发生。尤其值得注意的是，普萘洛尔用药的不良反应对于中国人来说可能有更高的发生率，因为华人对普萘洛尔的耐受能力较差，敏感性高。已有文献证明华人对受体阻断药的敏感性较白种人至少高2倍。普萘洛尔作为一种非选择性的β -受体阻断剂，有导致严重不良反应可能，盲目加大给药剂量往往会伴随更大的风险。此外，普萘洛尔的不良反应在很大程度上与给药途径有关，且口服给药已被证明生物利用度低(约为30%)、个体差异大，存在显著的首过效应，故真正到达患处并发挥疗效的药量有限。脂质体(liposomes)是目前TDDS中最受关注的载体之一，主要由磷脂和胆固醇等脂质材料组成，具有双分子层，能够包裹水溶性或脂溶性药物，在体内具有细胞亲和性和组织相容性，并且能够根据需要进行修饰。作为药物载体，脂质体在血管瘤治疗方面显示出良好的如景。隐形脂质体(stealth liposomes，又称为长循环脂质体)是目前抗肿瘤脂质体的主流。这种脂质体普遍采用二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000，通过提高脂质体表面的亲水性，减少调理素(opsonin)与脂质体的结合，避免被体内免疫系统识别从而延长在循环系统中滞留的时间，增加被靶细胞识别并特异性结合的几率。必须指出的是，目前的主动靶向脂质体大多在脂质体表面PEG链末端进行修饰，虽然可以实现长循环和主动靶向双重效果，但是PEG链的空间位阻和强极性并不利于脂质体快速、完全地进入靶细胞。因此，如果单独采用VEGFR单克隆抗体修饰隐形脂质体，虽然能够实现长循环(长时间滞留在血液循环里)并且靶向结合到血管瘤病变的血管表面，但由于脂质体表面PEG链的阻碍以及血管瘤部位血管内皮细胞往往异常增殖，血管壁增厚，导致无法将脂质体内部所载药物传递进入血管瘤内部发挥作用。在脂质表面采用相应的抗体进行主动靶向修饰可以特异性地将药物定向输送到血管瘤部位。如果能够选出一个制造一种专一抗体的淋巴细胞进行培养，就可以得到由单细胞经分裂增殖而形成的细胞群，即单克隆。单克隆将合成针对一种抗原决定簇的抗体，这样的抗体成为单克隆抗体。由于血管形成是一个相当复杂的过程，受多种因子的正负调控，其中VEGF是作用最强的正性调控因子之一，它通过与相应的血管内皮生长因子受体(vascularendothelial growt h factor receptor, VEGFR)结合刺激新生血管的形成。VEGFR-2 是分子量约210KD的III型跨膜酪氨酸蛋白激酶，是三种血管内皮生长因子受体之一。VEGFR-2是由一个含7个免疫球蛋白样结构域的胞外区，一个跨膜区和一个带有酪氨酸激酶结构域的胞内区组成。VEGFR-2胞外区的第I个Ig结构域是VEGF配体结合所必须的，配体的结合位点在第2和第3个Ig结构域上，第4个Ig结构域是受体活化后形成同源二聚体所必须的，而其余几个Ig结构域与配体的结合并无多大关系。在增殖期的血管瘤内皮细胞中，血管生成的分子标记物如VEGF及VEGFR等呈现过度表达。尿素治疗血管瘤是临床最常用的方法之一。但是由于尿素治疗血管瘤缺乏靶向治疗作用，难于在瘤体内形成高浓度聚集，需多次注射治疗，使治疗周期延长，增加患者痛苦；并且由于尿素浓度过高，单位时间内用药量过大，局部注射可引起皮肤组织坏死，亦可造成邻近正常组织器官的发育畸形。以VEGFR的单克隆抗体作为偶联抗体修饰尿素脂质体，使其主动靶向作用于血管瘤的血管内皮细胞,体外实验发现,空白脂质体本身对人血管瘤内皮细胞无任何伤害作用，2.6%尿素组的细胞杀伤率为27.94%，2.6%尿素脂质体组的细胞杀伤率为84.01%，采用单克隆抗体主动修饰后的尿素免疫脂质体组的细胞杀伤率为99.91%，可见采用主动靶向修饰载体包裹尿素后，对靶细胞的杀伤作用显著提高。细胞穿透肽(cell-penetrating peptide, CPP)是一类能够快速穿透细胞脂质膜的小于30个氨基酸的短肽。CPP可以携带难以穿透细胞膜的大分子生物活性物质甚至纳米载体进入细胞，并且毒性低，不会损伤细胞膜，因而被广泛应用于肿瘤靶向治疗。CPP与大分子的结合物是通过能量依赖性的内吞作用进入细胞的。CPP的应用极大地提高了从药物分子到纳米载体通过细胞膜的效率。大量研究表明，CPP具有很强大的运载潜能，关于其内化穿膜机制一直以来存在争议，但CPP与膜相互作用中，CPP所带正电荷使其易于与细胞膜中的诸如磷脂类通过静电作用相互结合。目前认为CPP穿膜作用的主要三方面机制为:A.通过静电作用直接渗透到细胞膜；B.通过易位形成的一个暂时性的结构促进渗透；C.通过内吞作用介导入膜。目前报道的主要CPP如下表所示:常见的细胞穿膜肽氨基酸序列
权利要求
1.VEGFR-2单克隆抗体与CPP联合修饰的普萘洛尔隐形脂质体的制备方法，其特征在于包括以下步骤: 1)脂质体复合磷脂组成与比例的确定； 2)CPP修饰的普萘洛尔隐形脂质体制备: a)pNP-PEG-DPPE 的合成； b)CPP-PEG-DPPE 的合成； c)CPP修饰的普萘洛尔隐形脂质体制备； 3)VEGFR-2单克隆抗体与CPP修饰的 普萘洛尔隐形脂质体表面连接即得到VEGFR-2单克隆抗体与CPP联合修饰的普萘洛尔隐形脂质体。
2.根据权利要求1所述的VEGFR-2单克隆抗体与CPP联合修饰的普萘洛尔隐形脂质体的制备方法，其特征在于:所述脂质体复合磷脂采用二硬脂酰磷脂酰胆碱、氢化大豆卵磷脂作为高相变温度磷脂；采用二棕榈酰磷脂酰胆碱以及二肉豆蘧酰磷脂酰胆碱为低相变温度磷脂，两两组合制备复合磷脂脂质体，共有4种组合。
3.根据权利要求1所述的VEGFR-2单克隆抗体与CPP联合修饰的普萘洛尔隐形脂质体的制备方法，其特征在于:所述脂质体复合磷脂组成为二棕榈酰磷脂酰胆碱与氢化大豆卵磷脂。
4.根据权利要求3所述的VEGFR-2单克隆抗体与CPP联合修饰的普萘洛尔隐形脂质体的制备方法，其特征在于:所述二棕榈酰磷脂酰胆碱与氢化大豆卵磷脂比例为6:4。
5.根据权利要求2所述的VEGFR-2单克隆抗体与CPP联合修饰的普萘洛尔隐形脂质体的制备方法，其特征在于:在上述4中组合制备的一种复合磷脂与DSPE-PEG2000的摩尔比为95:5，得到DSPE-PEG2000复合磷脂。
6.根据权利要求4所述的VEGFR-2单克隆抗体与CPP联合修饰的普萘洛尔隐形脂质体的制备方法，其特征在于:选定含5%摩尔比的DSPE-PEG2000复合磷脂与普萘洛尔制成普萘洛尔隐形脂质体，于37°C水浴中温浴2h，将步骤2)中合成得到的CPP-PEG-DPPE按照5%的摩尔比定向地插入到普萘洛尔隐形脂质体的外层膜上得到CPP修饰的普萘洛尔隐形脂质体。
7.根据权利要求1所述的VEGFR-2单克隆抗体与CPP联合修饰的普萘洛尔隐形脂质体的制备方法，其特征在于，所述步骤3) VEGFR-2单克隆抗体与CPP修饰的普萘洛尔隐形脂质体表面的连接方法如下:先将VEGFR-2单克隆抗体溶解于HEPES pH8.0缓冲液中，与6.25mg/ml的SPDP溶液混合，反应生成PDP-1gG，充分反应后，超滤离心去除未偶联的SPDP及副产物，收集roP-1gG，加入DTT使其终浓度为50 mmol/L，搅拌25°C反应25min，使抗体上的PDP硫醇化，形成IgG-SH ;将硫醇化的抗体IgG-SH溶液与CPP修饰的普萘洛尔隐形脂质体混合，摩尔比范围为1:1000-1:50,暗处室温搅拌过夜,超滤离心去除去未结合的IgG-SH,即得到VEGFR-2单克隆抗体与CPP联合修饰的普萘洛尔隐形脂质体。
8.权利要求1-3任意一项所述的制备方法得到的VEGFR-2单克隆抗体与CPP联合修饰的普萘洛尔隐形脂质体，其特征在于:VEGFR-2单克隆抗体与CPP联合修饰的普萘洛尔隐形脂质体的包封率为80%，释放度:10h的累积释放度约为15%，放样稳定性:放样70d稳定，靶向效率:60%。
9.权利要求1-3任意一项所述的制备方法得到的VEGFR-2单克隆抗体与CPP联合修饰的普萘洛尔隐形脂质体在制备 用于治疗血管瘤药物上的应用。
全文摘要
本发明公开了VEGFR-2单克隆抗体与CPP联合修饰的普萘洛尔隐形脂质体的制备方法，包括以下步骤1)脂质体复合磷脂组成与比例的确定；2)CPP修饰的普萘洛尔隐形脂质体制备3)VEGFR-2单克隆抗体与CPP修饰的普萘洛尔隐形脂质体表面连接即得到VEGFR-2单克隆抗体与CPP联合修饰的普萘洛尔隐形脂质体。本发明具有高稳定性、长循环、主动靶向、高效入胞等特性，能够保证抗血管瘤药物的减毒增效。本发明的研究成果将为抗血管瘤药物的临床靶向治疗提供制剂技术平台。
文档编号A61K31/138GK103239405SQ20131020236
公开日2013年8月14日 申请日期2013年5月24日 优先权日2013年5月24日
发明者李俊 申请人:南京市妇幼保健院