PPP3CC基因或其表达产物在治疗j11崎病中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了PPP3CC基因或其表达产物在治疗川崎病中的应用。具体地，涉及一种钙调神经磷酸酶3催化亚基Y亚型蛋白（proteinphosphatase3，catalyticsubunit,gammaisozyme,PPP3CC)基因、蛋白、或其促进剂的用途，用于制备⑴提高1，4，5三磷酸肌醇3激酶C(1，4，5-trisphosphate3-kinaseC,ITPKC)的表达量和/或活性；和/或（ii)治疗川崎病(Kawasakidisease)的药物组合物。本发明有益于了解川崎病的发病机制和路径，并开发治疗川崎病的药物。
【专利说明】PPP3CC基因或其表达产物在治疗川崎病中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及自身免疫系统疾病领域。具体地，本发明涉及PPP3CC基因、蛋白或其 促进剂对ITPKC表达量和/或活性的促进作用，从而有助于治疗川崎病。
【背景技术】
[0002] 川崎病（Kawasaki diseasa)，川崎病是1967年日本川崎富作医师首选报道，并 以他的名字命名的疾病，又称皮肤黏膜淋巴结综合征（MCLS)，临床多表现：发热、皮疹、颈 部非脓性淋巴结肿大、眼结合膜充血、口腔黏膜弥漫充血、杨梅舌、掌跖红斑、手足硬性水肿 等。
[0003] 川崎病是一种免疫介导的血管炎，在急性期存在明显的免疫失调。主要影响5岁 以下的儿童，如果未进行干预，将有20-25%的病例发生冠状动脉损伤。
[0004] ITPKC(inositol-trisphosphate3_kinase C)是由 Onouchi Y 等首次发现的川崎 病的易感基因，由SNP引发的ITPKC表达失调可引发川崎病。然而ITPKC基因在川崎病发 病过程中的机制尚不清楚，因此，本领域迫切需要研究开发基于ITPKC作用机制的治疗川 崎病的药物和方法。
【发明内容】
[0005] 本发明提供了 PPP3CC与ITPKC的相互作用机制，并能作为ITPKC的稳定剂治疗川 崎病的用途。
[0006] 本发明的第一方面，提供了一种钙调神经磷酸酶3催化亚基Y亚型蛋白（protein phosphatase 3，catalytic subunit，gamma isozyme，PPP3CC)基因、蛋白、或其促进剂的 用途，用于制备（i)提高1，4,5三磷酸肌醇3激酶C(l，4,5-trisphosphate 3-kinase C， ITPKC)的表达量和/或活性；和/或（ii)治疗川崎病（Kawasaki disease)的药物组合物。
[0007] 在另一优选例中，所述的药物组合物包括（a)PPP3CC基因、蛋白、或其促进剂；和 (b)药学上可接受的载体。
[0008] 在另一优选例中，所述的促进剂包括PPP3CC的基因表达产物、促进型miRNA、促进 型转录调控因子、或促进型靶向小分子化合物。
[0009] 在另一优选例中，所述的PPP3CC蛋白是携带PPP3CC编码序列的质粒所表达的，或 转染了 PPP3CC编码序列的宿主细胞所表达的。
[0010] 在另一优选例中，所述的PPP3CC来源于哺乳动物；较佳地，来源于人、小鼠；更佳 地，来源于人。
[0011] 本发明第二方面，提供了一种用于治疗川崎病的药物组合物，所述的药物组合物 包括（a)PPP3CC基因、蛋白、或其促进剂；和（b)药学上可接受的载体。
[0012] 本发明第三方面，提供了一种筛选制备PPP3CC促进剂的候选化合物的方法，包括 以下步骤：
[0013] (Pl)在测试组中，向ITPKC表达量和/或活性低的细胞培养体系中，添加测试化合 物，并观察ITPKC的表达量和/或活性；在对照组中，向相同细胞培养体系中不添加测试化 合物，并观察ITPKC的表达量和/或活性；
[0014] 其中，如果测试组中ITPKC表达量和/或活性大于对照组，则表明测试化合物是可 用于制备PPP3CC促进剂的化合物。
[0015] 在另一优选例中，还包括步骤（p2):对步骤（pi)中获得的候选化合物进一步测定 其对IP3 (inositol 1，4, 5-triphosphate，IP3,三磷酸肌醇）表达量的抑制作用。
[0016] 在另一优选例中，所述的步骤（p2)中，若测试化合物对IP3的表达量有显著抑制 效果，则认为测试化合物是可用于制备PPP3CC促进剂的化合物。
[0017] 在另一优选例中，所述的显著抑制为表达量下降至少20-50%。
[0018] 本发明第四方面，提供了一种PPP3CC抑制剂的用途，用于制备降低ITPKC表达量 和/或活性的制剂。
[0019] 在另一优选例中，所述的抑制剂包括PPP3CC抗体、反义核酸、SiRNA以及PPP3CC活 性抑制剂。
[0020] 本发明第五方面，提供了一种ITPKC稳定剂的用途，用于制备治疗川崎病的药物。
[0021] 在另一优选例中，所述的ITPKC稳定剂包括PPP3CC基因、蛋白、或其促进剂。
[0022] 本发明还提供了一种治疗川崎病的方法，给需要的对象施用有效剂量的如本发明 第二方面所述的药物组合物。
[0023] 应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文（如实施例）中具 体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【专利附图】
【附图说明】
[0024] 图1显示了 PPP3CC和ITPKC在模式生物酵母中存在相互作用。
[0025] 图IA显示了 LacZP半乳糖苷酶报告基因检测，其中a.pDBLeu_ITPKC+pPC86共 转化酵母；b. pDBLeu+pPC86-PPP3CC 共转化酵母；c. pDBLeu-ITPKC+pPC86-PPP3CC 共转化酵 母；Control A-E :酵母对照菌株A-E，由弱到强，E为最强。
[0026] 图IB显示了 HIS3报告基因检测，其中a. pDBLeu_ITPKC+pPC86共转化酵母； b. pDBLeu+pPC86-PPP3CC 共转化菌株；c. pDBLeu-ITPKC+pPC86-PPP3CC 共转化菌株；酵母对 照菌株A-E。
[0027] 图2显示了 PPP3CC与ITPKC在体内体外均存在相互作用。
[0028] 图2A显示了 GST-Pul I Down实验验证PPP3CC与ITPKC在原核大肠杆菌体外表达 水平上存在相互作用。其中，上层条带：重组表达的GST-PPP3CC和GST的空载蛋白均从大 肠杆菌中纯化得到；下层条带：重组表达的GST-PPP3CC能够与ITPKC蛋白结合，但空载蛋 白不能与ITPKC结合。
[0029] 图2B显示了过表达的PPP3CC蛋白与ITPKC蛋白在HEK293T细胞中相互结合， HA-ITPKC能够与Myc-ITPKC免疫共沉淀，通过Myc抗体沉淀，HA抗体检测；而不能与Myc空 载免疫共沉淀。
[0030] 图2C显示了 PPP3CC蛋白与ITPKC蛋白在细胞内源表达水平上存在相互作用；在 不转染质粒过表达的条件下，通过anti-PPP3CC特异性抗体免疫沉淀，anti-ITPKC检测，结 果表明ITPKC可与PPP3CC在内源表达水平上相互结合。
[0031] 图2D显示了 PPP3CC与ITPKC共定位于细胞质中，绿色荧光表征PPP3CC蛋白，红 色荧光表征ITPKC蛋白。
[0032] 图3显示了 PPP3CC促进ITPKC的表达水平。
[0033] 图3A显示了通过转染pCMV-Myc_PPP3CC，过表达PPP3CC可以提高ITPKC的蛋白表 达量。
[0034] 图3B显示了过表达PPP3CC不影响ITPKC的mRNA的表达水平（*表示p〈0. 05，** 表示 p〈0. 01)。
[0035] 图3C显示了通过转染siRNAs，下调PPP3CC的表达量，ITPKC的蛋白表达量也随之 减低。
[0036] 图3D显示了 siRNAs干扰下调PPP3CC，并不影响ITPKC在mRNA水平上表达水平， (** 表示 p〈0. 01)。
[0037] 图4显示了 PPP3CC通过稳定ITPKC的表达量调节IP3_Ca2+信号通路的活性。
[0038] 图 4A 显示了 PPP3CC 能过延长 ITPKC 蛋白半衰期，pCMV-Myc 或 pCMV-Myc_PPP3CC 分别转染细胞，并用亚胺环己酮（cycloheximide CHX)和MG132(蛋白酶体抑制剂）处理， 处理时间如图所示。Western blot检测表明：PPP3CC能够延长抑制ITPKC蛋白的衰减，延 长其半衰期。GAPDH蛋白作为检测内参。
[0039] 图 4B. PPP3CC 抑制 ITPKC 的泛素化，Myc-PPP3CC，FLAG-ITPKC 和 HA-Ubiqutin(HA-Ub)共转染细胞，且用MG132处理，如图所示，PPP3CC过表达的细胞中， ITPKC偶联泛素 Ub的量降低，表明PPP3CC能够抑制ITPKC的泛素化。
[0040] 图4C. PPP3CC抑制ITPKC的磷酸化水平，过表达PPP3CC的细胞中，ITPKC蛋白总 量增加，ITPKC的磷酸化水平降低。
[0041] 图4D.PPP3CC能降低IP3在细胞中含量。分别在细胞中过表达Myc-PPP3CC或 siRNA干扰抑制PPP3CC表达，通过ELISA检测IP3的含量。
[0042] 结果表明过表达PPP3CC能够降低IP3的含量，反之依然，siRNA干扰抑制PPP3CC 后，IP3的含量上升。
[0043] 图5显示了 PPP3CC通过稳定ITPKC蛋白抑制川崎病发病的模式图。
【具体实施方式】
[0044] 本发明人通过广泛而深入的研究，首次意外地发现，PPP3CC能够在蛋白水平上稳 定ITPKC的表达量，PPP3CC可能降低ITPKC的磷酸化水平，抑制其进入泛素化一蛋白酶体 降解途径。因此PPP3CC及其表达产物可用于增加或增强ITPKC表达量和/或活性，从而治 疗川崎病。在此基础上，完成了本发明。
[0045] PPP3CC
[0046] 在本发明中，术语"本发明蛋白"、"本发明多肽"、"PPP3CC蛋白"、"PPP3CC多肽" 可互换使用，都指具有人蛋白PPP3CC氨基酸序列的蛋白或多肽。应理解，所述术语还包括 PPP3CC的活性片段和衍生物。
[0047] 在本发明中，术语"本发明基因"、"本发明多核苷酸"指编码PPP3CC蛋白或其 活性片段和衍生物的核苷酸序列，包括正义和反义核酸。PPP3CC基因定位于细胞染色体 8p21.3，Genbank ID:5533。可用于本发明PPP3CC基因的序列之一如SEQ ID NO. :1所示， CDS为441-2006位，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO. :2所示。
[0048] 如本文所用，术语"分离的"是指物质从其原始环境中分离出来（如果是天然的物 质，原始环境即是天然环境）。如活体细胞内的天然状态下的多核苷酸和多肽是没有分离纯 化的，但同样的多核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化 的。
[0049] 如本文所用，"分离的PPP3CC蛋白或多肽"是指PPP3CC蛋白基本上不含天然与其 相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯 化PPP3CC蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。在本发 明中，PPP3CC蛋白包括融合蛋白和非融合蛋白。
[0050] 本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多 肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。
[0051] 本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA 或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。
[0052] 编码PPP3CC的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽 的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列（和任选的附加编码序列）以及非 编码序列。术语"编码多肽的多核苷酸"可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包 括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
[0053] 本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多 肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或 非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本 领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、 缺失或插入，但不会从实质上改变其编码多肽的功能。
[0054] 本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段，包括正义和反义的核酸片段。如本 文所用，"核酸片段"的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个 核苷酸，最好是至少1〇〇个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术（如PCR)以确定 和/或分离编码PPP3CC蛋白的多核苷酸。
[0055] 本发明的人PPP3CC核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人 工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据已公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框 序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA 库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后 再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
[0056] -旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将 其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
[0057] 此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通 过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
[0058] 应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的基因。用于PCR的引 物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方 法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。
[0059] 本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或PPP3CC蛋 白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。
[0060] 通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多核苷酸序列可用来表达或生产重组 的PPP3CC蛋白。一般来说有以下步骤：
[0061] (1).用本发明的编码人PPP3CC蛋白的多核苷酸（或变异体），或用含有该多核苷 酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；
[0062] (2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；
[0063] (3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
[0064] 本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含人PPP3CC编码DNA序列和合适的转 录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组 技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表 达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
[0065] 此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的 宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋 白（GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。
[0066] 包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适 当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
[0067] 宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高 等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属的细菌细胞；真菌细胞 如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、C0S、或293细胞的动物细胞等。
[0068] 用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原 核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaC12法处理， 所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgC12。如果需要，转化也可用电穿孔的 方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方 法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
[0069] 获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用 的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下 进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法（如温度转换或化学诱导） 诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
[0070] 在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如 果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这 些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用 蛋白沉淀剂处理（盐析方法）、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析（凝胶过滤）、 吸附层析、离子交换层析、高效液相层析（HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结 合。
[0071] ITPKC
[0072] 1，4, 5 三憐酸肌醇 3 激酶 C (1，4, 5-trisphosphate 3-kinase C，ITPKC)，Genbank ID :80271, ITPKC的cDNA如SEQ ID NO. :3所示，CDS :34-2085,以及其编码的氨基酸序列 如 SEQ ID NO. :4 所示（NP 079470.1)。
[0073] ITPKC是一种IP3磷酸激酶，其底物IP3是重要第二信使分子，可以刺激细胞内储 存的Ca2+释放，并引起细胞外的Ca 2+进入胞内，胞内Ca2+浓度升高。胞内Ca2+结合钙调蛋白 并激活1丐调磷酸激酶，后者使得NFAT (nuclear factor of activated T cells,活化T细 胞核因子）去磷酸化，促进其进核并激活包括IL-2在内的若干免疫反应相关的基因表达。
[0074] ITPKC能够将IP3磷酸化成为IP4,从而阻断了 IP3所开启的IP3_Ca2+通道，抑制 了钙离子浓度的升高，阻断了胞质中的钙离子通过与钙调蛋白结合形成复合物，抑制激活 钙调磷酸酶活化，进而抑制了 NFAT的去磷酸化及下游基因的转录激活。
[0075] 当ITPKC表达量下降时，IP3分子积累增多，细胞内的IP3_Ca2+通路被激活，导致 自身免疫反应的亢进，最终造成川崎病的发病。
[0076] ITPKC缺失或功能异常的原因而言，目前多为与基因多态性相关的推测，对于具体 的致病分子机制尚不清楚。
[0077] 研究发现，丝氨酸和苏氨酸的磷酸化可以使底物蛋白迅速经泛素蛋白酶体途径降 解，磷酸化使得泛素化机器能够识别磷酸化底物并对其进行泛素化标记，从而启动蛋白降 解。
[0078] 促进剂和药物组合物
[0079] 利用本发明蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与PPP3CC蛋白发生相互作用 的物质，尤其是促进剂等。
[0080] 本发明PPP3CC蛋白的促进剂，当在治疗上进行施用（给药）时，可促进PPP3CC蛋 白的表达和/或活性，进而抑制ITPKC的泛素化降解。通常，可将这些促进剂配制于无毒的、 惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中PH通常约为5-8,较佳地pH约为6-8,尽管 pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过 常规途径进行给药，其中包括（但并不限于）：瘤内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、或局 部给药。
[0081] 本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明PPP3CC蛋白或其 促进剂以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括（但并不限于）：盐水、缓冲液、 葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可 以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行 制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、 溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微 克-10毫克/千克体重。
[0082] 筛选方法
[0083] 本发明还提供了基于PPP3CC进行药物筛选的方法。一种方法是先筛选影响（促 进）PPP3CC表达或活性的化合物，然后对筛选出的化合物进一步测试其对ITPKC的表达和 /或活性有无抑制作用。
[0084] 具体的步骤为：
[0085] (pi)在测试组中，向ITPKC表达量和/或活性低的细胞培养体系中，添加测试化合 物，并观察ITPKC的表达量和/或活性；在对照组中，向相同细胞培养体系中不添加测试化 合物，并观察ITPKC的表达量和/或活性；
[0086] 其中，如果测试组中ITPKC表达量和/或活性大于对照组，则表明测试化合物是可 用于制备PPP3CC促进剂的化合物。
[0087] 以及任选的（p2):对步骤（pi)中获得的候选化合物进一步测定其对IP3表达量 的抑制作用，其中，若测试化合物对IP3的表达量有显著抑制效果，则认为测试化合物是可 用于制备PPP3CC促进剂的化合物。在另一优选例中，所述的显著抑制为表达量下降至少 20-50%〇
[0088] 本发明还提供了一种ITPKC稳定剂的用途，用于制备治疗川崎病的药物。在另一 优选例中，所述的ITPKC稳定剂包括PPP3CC基因、蛋白、或其促进剂。
[0089] 此外，本发明还提供了一种PPP3CC抑制剂的用途，用于制备降低ITPKC表达量和 /或活性的制剂。
[0090] 在另一优选例中，所述的抑制剂包括PPP3CC抗体、反义核酸、SiRNA以及PPP3CC活 性抑制剂。
[0091] 本发明所述PPP3CC的抑制剂可用于川崎病动物模型的制备以及细胞研究。
[0092] 本发明的有益效果
[0093] 1.本发明PPP3CC基因或蛋白或其促进剂可以有效地抑制ITPKC蛋白的降解，从而 提高ITPKC表达量和/或活性。
[0094] 2.本发明PPP3CC基因或蛋白或其促进剂可以用于治疗川崎病。
[0095] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本 发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照 常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否 则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
[0096] 实施例1酵母双杂交筛选获得PPP3CC蛋白
[0097] 利用酵母双杂交系统，我们对ITPKC(GeneID :80271)的作用蛋白进行了筛选成人 肝cDNA酵母双杂交文库。经测序及BLAST分析后发现其中含有PPP3CC (GeneID :5533)基 因的片段。
[0098] 为确证ITPKC与PPP3CC在酵母内的相互作用，将PPP3CC全长基因装入pPC86载 体中，与PDBLeu-ITPKC回转酵母MaV203进行验证。
[0099] 结果如图1所示，可见ITPKC与PPP3CC在酵母中存在相互作用。
[0100] 实施例2 ITPKC和PPP3CC在体内外均具有相互作用
[0101] 图2A显示了 GST-Pul I Down实验验证PPP3CC与ITPKC在原核大肠杆菌体外表达 水平上存在相互作用。其中，上层条带：重组表达的GST-PPP3CC和GST的空载蛋白均从大 肠杆菌中纯化得到；下层条带：重组表达的GST-PPP3CC能够与ITPKC蛋白结合，但空载蛋 白不能与ITPKC结合。
[0102] 为了在细胞水平上验证ITPKC和PPP3CC的相互作用，构建了 pCMV-HA-ITPKC和 p⑶EF-Myc-PPP3CC真核表达质粒，转染HEK293T细胞，进行免疫共沉淀实验。
[0103] 利用Myc单克隆抗体将细胞裂解液中的Myc_PPP3CC蛋白沉淀下来的泳道中，用 anti-HA抗体检测到HA-ITPKC蛋白；而只转染Myc空载质粒和HA-ITPKC蛋白的体系中，使 用anti-Myc抗体进行免疫沉淀后，无法检测到HA-ITPKC蛋白（图2B)。表明ITPKC和PPP3CC 在细胞中确实存在特异的相互作用。
[0104] 我们进一步验证细胞内源表达水平下，ITPKC和PPP3CC是否存在相互作用。结 果显示，当使用anti-PPP3CC的特异性抗体沉淀细胞裂解液中的内源性PPP3CC蛋白时， 可以利用anti-ITPKC的抗体检测到内源性ITPKC蛋白；而在同样的裂解液中加入非特异 anti-IgG抗体时，则不能检测到内源性ITPKC蛋白（图2C)。结果表明，在内源表达水平下， 细胞中的ITPKC和PPP3CC之间存在相互作用。
[0105] 实施例3 ITPKC和PPP3CC在细胞内的荧光共定位
[0106] 为了解ITPKC和PPP3CC在细胞内的定位情况，把PPP基因构建到pEGFP-Cl质粒 载体上。将PEGFP-C1-PPP3CC转染HeLa细胞，并对ITPKC蛋白进行免疫荧光标记。荧光显 微镜下观察发现，GFP-PPP3CC蛋白主要定位于细胞质内；ITPKC蛋白在细胞核和细胞质中 广泛分布；它们能共定位于细胞质中，如图2D所示。因此，ITPKC和PPP3CC在细胞内的共 定位提示其在空间上有相互作用的可能性。
[0107] 实施例4 PPP3CC能够促进ITPKC的蛋白表达
[0108] 在实施例2中，转染了 Myc_PPP3CC表达载体的细胞，ITPKC的蛋白表达量高于 对照。对应的当通过siRNA干扰了 PPP3CC的表达后，ITPKC的蛋白表达量也下降；而在 mRNA水平上，PPP3CC的表达量改变不影响ITPKC的转录水平，如图3所示；进一步通过 eyeloheximide (CHX)处理细胞，中止其蛋白翻译，检测PPP3CC对ITPKC蛋白半衰期的影响。 [0109] 在转染空载的细胞中，由于CHX蛋白阻断了蛋白的翻译，ITPKC在两小内逐步 减少，而转染了 PPP3CC的细胞中ITPKC的减少程度降低，且ITPKC的表达量降低能够被 MG132(蛋白酶体抑制剂）所抑制，提示其降解可能是通过了蛋白酶体途径，如图4A所示。 以上结果显示PPP3CC对于ITPKC蛋白量的影响发挥在翻译后修饰，促进了其蛋白稳定性， 抑制了 ITPKC的降解。
[0110] 实施例5 PPP3CC抑制了 ITPKC的泛素化降解
[0111] ITPKC的降解可以被MG132所阻断，提示ITPKC可能是通过泛素化蛋白酶体途径被 降解的，为了研究PPP3CC是否通过抑制其泛素化降解而发挥稳定其蛋白表达量的作用，在 HEK293T中检测PPP3CC过表达对ITPKC泛素化水平的影响。
[0112] 在 H293T 细胞中，共转染 FLAG-ITPKC，Myc-PPP3CC 和 HA-taged ubiquitin (HA-Ub)，并用MG132刺激，结果如图4B所示，在转染了 Myc_PPP3CC的实验组中， ITPKC蛋白的泛素化程度降低。
[0113] 结果显示PPP3CC能够抑制ITPKC的泛素化水平，从而阻止其降解。
[0114] 实施例6 PPP3CC降低ITPKC的磷酸化水平，阻止其进入泛素-蛋白酶体降解途径
[0115] 由于PPP3CC的磷酸酯酶活性，本实施例检测其是否能够影响ITPKC的磷酸化水 平。
[0116] 在细胞中梯度转染Myc-PPP3CC，检测ITPKC和p-ITPKC的表达量变化。
[0117] 结果如图4C所示，随着PPP3CC表达量的上升，ITPKC蛋白量增加，而其磷酸化程 度降低。
[0118] 由上可见，随着PPP3CC表达量的增加，ITPKC表达量增加，而p-ITPKC的量减少。 以上结果提示我们PPP3CC可能抑制了 ITPKC的磷酸化。
[0119] 实施例7 PPP3CC可能通过ITPKC负调控胞内IP3的表达量
[0120] 分别转染Myc_PPP3CC和siRNAs，上调或下调细胞中PPP3CC的表达量，然后通过 ELISA的方法检测胞浆中IP3的含量。
[0121] 结果如图4D所示：在过表达PPP3CC的细胞中其胞浆中所含IP3量降低，反之亦 然，在RNAi抑制PPP3CC表达的实验组中，胞浆中IP3含量增高。
[0122] 由上可见，在过表达组中，上调PPP3CC的表达量，胞浆中的IP3含量下降；在RNAi 组中，下降PPP3CC的表达量，胞浆中的IP3相对于Mock和SiNC上升。提示我们PPP3CC的 确可以影响胞浆中IP3的含量。PPP3CC可能通过影响IP3的含量，影响IP3-Ca 2+信号传导， 如模式图所示（图5)。
[0123] 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独 引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可 以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范 围。
【权利要求】
1. 一种|丐调神经磷酸酶3催化亚基Y亚型蛋白（protein phosphatase 3, catalytic subunit, gamma isozyme, PPP3CC)基因、蛋白、或其促进剂的用途，其特征在于，用于制备 (1)提高1，4,5三磷酸肌醇3激酶0(1，4,541^?11〇8?11&七6 3-1^11&86(：，打?1(〇的表达量 和/或活性；和/或（ii)治疗川崎病（Kawasaki disease)的药物组合物。
2. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的药物组合物包括（a)PPP3CC基因、蛋 白、或其促进剂；和（b)药学上可接受的载体。
3. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的促进剂包括PPP3CC的基因表达产物、 促进型miRNA、促进型转录调控因子、或促进型靶向小分子化合物。
4. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的PPP3CC来源于哺乳动物。
5. -种用于治疗川崎病的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物包括（a) PPP3CC基因、蛋白、或其促进剂；和（b)药学上可接受的载体。
6. -种筛选制备PPP3CC促进剂的候选化合物的方法，其特征在于，包括以下步骤： (Pl)在测试组中，向ITPKC表达量和/或活性低的细胞培养体系中，添加测试化合物， 并观察ITPKC的表达量和/或活性；在对照组中，向相同细胞培养体系中不添加测试化合 物，并观察ITPKC的表达量和/或活性； 其中，如果测试组中ITPKC表达量和/或活性大于对照组，则表明测试化合物是可用于 制备PPP3CC促进剂的化合物。
7. 如权利要求6所述的方法，其特征在于，还包括步骤（p2):对步骤（pi)中获得的候 选化合物进一步测定其对IP3(inositol l，4,5-triphosphate，IP3,三磷酸肌醇）表达量 的抑制作用。
8. 如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的步骤（p2)中，若测试化合物对IP3的 表达量有显著抑制效果，则认为测试化合物是可用于制备PPP3CC促进剂的化合物。
9. 一种PPP3CC抑制剂的用途，其特征在于，用于制备降低ITPKC表达量和/或活性的 制剂。
10. -种ITPKC稳定剂的用途，其特征在于，用于制备治疗川崎病的药物。
【文档编号】A61P27/02GK104208720SQ201310217292
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2013年5月31日 优先权日:2013年5月31日
【发明者】霍克克, 李璞, 林颖 申请人:霍克克, 李璞